Documentos 41. ISSN Dezembro, Dekkera e Brettanomyces: Leveduras não Competitivas que Deterioram Vinhos

ISSN 1516-8107

Dezembro, 2005

41

Dekkera e Brettanomyces:

Leveduras não Competitivas

que Deterioram Vinhos

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Roberto Rodrigues

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Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa

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Centro Nacional de Pesquisa de Uva e Vinho Ministério da Agricultura e do Abastecimento

Documentos

41

Dekkera e Brettanomyces:

Leveduras não Competitivas que

Deterioram Vinhos

Gildo Almeida da Silva

Bento Gonçalves, RS 2005

Rua Livramento 515 Fone: (54) 3455-8000 Fax: (54) 3451-2792

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Tratamento de ilustrações: Gildo Almeida da Silva Foto da capa: Daiane Sganzerla

Editoração eletrônica: Gildo Almeida da Silva

1ª edição

1ª impressão (2005): 100

Todos os direitos reservados.

A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº9.610).

Ficha catalográfica

Gildo Almeida da Silva

Ph.D., Pesquisador, Embrapa Uva e Vinho, gildo@cnpuv.embrapa.br

Características morfológicas dos gêneros

Dekkera . . . 9

Brettanomyces . . . 9

Espécies do gênero Dekkera . . . 9

Espécies do gênero Brettanomyces . . . 19

Distribuição na natureza

Ocorrência

Problemas de ordem geral

Problemas específicos potenciais e condições para a síntese

microbiológica de fenóis

Detecção e identificação

Detecção por processo microbiológico clássico . . . 29

Isolamento . . . 29

Exame macroscópico . . . 30

Exame microscópico . . . 30

Métodos Convencionais de Detecção e de Identificação de

Dek-kera e Brettanomyces

Condições . . . 31

Testes bioquímicos . . . 31

Chaves para identificação . . . 36

Brettanomyces . . . 36

Dekkera . . . 36

Dificuldades referentes ao cultivo de Dekkera e Brettanomyces em meio sólido . . 44

Métodos Cromatogáficos para Detecção de Dekkera e

Bretta-nomyces

GC/MS - Sniffing . . . 44

HS-SPME- GC/Capilar/FID ou MS . . . 45

HPLC/MS . . . 50

HPLC/UV - GC/DIC . . . 50

Dificuldades referentes à detecção de Dekkera e Brettanomyces

por monitoramento analítico de 4-etil-fenol e 4-etil-guaiacol

Métodos não Convencionais de Detecção e de Identificação de

Dekkera e Brettanomyces

PCR (Polymerase Chain Reaction) - Reação de Polimerização em Cadeia . . . . 52

A rejeição contra Dekkera e Brettanomyces é unânime?

Controle e precauções

Procedimentos de controle

Referências bibliográficas

Deterioram Vinhos

Gildo Almeida da Silva

Introdução

Leveduras estão presentes em vários ambientes. As uvas usadas para a elaboração de vinhos trazem consigo, além de Saccharomyces cerevisiae, diversos outros gêneros e espécies de leveduras. Entre as leveduras de interesse enológico, embora não sejam da flora normalmente encontrada na uva, destacam-se os gêneros Dekkera e

Brettanomyces. Sua importância enológica repousa no potencial que possuem as espécies representantes destes gêneros em deteriorar vinhos já elaborados. Possuem características metabólicas diferentes daquelas apresentadas por Sacch. cerevisiae, contribuindo para seu comportamento não competitivo, durante o processo de

fermentação, mas bastante oportunista. Por ser oportunista e por apresentar um caráter não competitivo, estes gêneros permitem que as demais leveduras atuem no processo fermentativo. Após esta fase, entram lenta e progressivamente em atividade, causando sérios danos ao vinho.

Devido ao metabolismo, estes microrganismos podem provocar aumento da acidez volátil e a formação do 4-etil-fenol no vinho, levando à depreciação o produto final. A ação deteriorante dos gêneros Dekkera e Brettanomyces é de efeito retardado.

O presente trabalho se propõe a apresentar suas características morfológicas, mostrar suas habilidades e deficiências sob ponto de vista nutricional, abordar formas

convencionais de detecção, descrever a ação destes microrganismos deteriorantes e, por fim, revelar as formas de se evitar a presença destes microrganismos nos vinhos.

Características morfológicas dos

gêneros

O gênero Brettanomyces já era conhecido, segundo Smith et al. (1990), desde 1904, quando Claussen, conseguiu isolar esta levedura a partir de cerveja inglesa no final da fermentação. O nome Brettanomyces é uma alusão ao termo "British"devido ao uso de espécies deste gênero na elaboração de cerveja de aroma forte (Franson, 2001). Segundo Smith et al. (1990), só em 1940 Custer revelou os detalhes desta levedura e descreveu sua morfologia e fisiologia. O vigor na formação de ácido acético, o

crescimento lento em ágar malte ou extrato de malte, o curto período de sobrevivência, a freqüência de células ogivais e a ausência de ascosporos, permitiram agrupar os

integrantes deste gênero em quatro espécies e duas variedades (linhagens). Van der Walt & van Kerken (1958), ao estudar a ocorrência de Brettanomyces, citam a presença

de outros gêneros de leveduras menos a presença de Dekkera. Isto se deve ao fato de, naquela época, se pensar que o gênero Brettanomyces não possuía a forma perfeita, ou seja, não formava ascosporos. No entanto, Van der Walt & van Kerken (1960), citados por Van der Walt (1964), mostraram a formação destas estruturas (ascosporos) em algumas leveduras classificadas como Brettanomyces. Van der Walt (1964), com esta descoberta, transferiu as linhagens ascosporógenas para o gênero teleomórfico Dekkera, criando assim outro gênero.

Dekkera

Este gênero apresenta, ao microscópio, células esferoidais a elipsoidais, muitas vezes ogivais. Células ogivais são aquelas que mostram uma estrutura semelhante à chama de uma vela nas extremidades. Podem também ser cilíndricas ou alongadas. A reprodução vegetativa se dá por brotamento e exibe pseudomicélio. As Figuras 1 a 4 mostram algumas das características da reprodução vegetativa descritas.

Na reprodução sexuada, os ascos são evanescentes e possuem um a quatro ascosporos. Os ascosporos apresentam um formato de chapéu ou esférico com uma borda

tangencial. Quando liberados, os esporos tendem a se agrupar. Como características gerais, além das citadas, podem ainda ser listados seu lento crescimento, curta duração de vida em placas, aroma característico, forte produção de ácido acético a partir de glicose, estímulo da fermentação pelo oxigênio molecular e exigência de fonte externa de vitaminas. As Figuras 5 e 6 mostram algumas das características descritas.

Brettanomyces

Este gênero não forma asco, ou seja, se trata da forma imperfeita do gênero Dekkera. Apresentam-se como células esferoidais, subglobosas a elipsoidais, ogivais, cilíndricas e alongadas. Sua reprodução se dá por brotamento. Por se tratar da forma imperfeita do gênero Dekkera, não possui fase sexuada e, portanto, não forma ascosporos. Pode formar pseudomicélio e micélio ramificado dando uma visão unicelular por não apresentar septos e nem invaginações. Esta estrutura é denominada de blastese, é uma

característica de Brettanomyces anomalus. As células, a exemplo do gênero Dekkera, também apresentam, em geral, crescimento lento e possuem tempo de vida curto. As demais características são as mesmas definidas para o gênero Dekkera. As Figuras 7 a 10 mostram as características gerais deste gênero.

Espécies do gênero Dekkera

Como pode ser observado na Tabela 1, as espécies deste gênero não são definidas de forma consensual. Segundo van der Walt (1984a), com base na morfologia e fisiologia, Campbell (1973), por análise numérica e Clark-Walker (1987), citado por Smith et al. (1990), por análise de DNA mitocondrial, este gênero possui apenas duas espécies. Smith et al. (1990), por comparação eletroforética de enzimas e por homologia DNA-DNA, concluíram se tratar de três espécies. Barnett et al. (1990), com base em estudos morfológicos e fisiológicos, e Molina et al. (1993), por meio de análise de

restrição de genes que codificam o rRNA, consideram como quatro o número de espécies deste gênero.

Fig. 1. Células alongadas de Dekkera naardenensis (Fonte: Barnett et al., 1990).

Tabela 1. Espécies de Dekkera segundo diferentes autores.

Campbell (1973) Análise numérica Van der Walt (1984a) Morfologia / Fisiologia Clark-Walker (1987) Análise de mtDNA Smith (1990) Homologia / Enzima Barnet et al. (1990) Morfologia / Fisiologia Molina et al. (1993) Análise de rRNA D. anomala - - - + + + D. bruxellensis + + + + + + D. intermedia + + + + - -D. custersiana - - - - + + D. naardenensis - - - - + +

Fig. 2. Células alongadas e esferoidais de Dekkera bruxellensis (Fonte: Barnett et al.,

1990).

Fig. 4. Células alongadas, esferoidais e ogivais de Dekkera bruxellensis (meio extrato de

malte) (Fonte: Van der Walt, 1984a)

Para van der Walt (1984a), D. bruxellensis representa a espécie típica deste gênero. A classificação apresentada por este autor é mais simples mas nem por isso menos problemática. A discrepância não está apenas no número de espécies. As espécies Dekkera custersiana e Dekkera naardenensis, segundo a descrição de Barnett et al. (1990), não apresentam reprodução sexuada. Assim, estas duas espécies deveriam ser consideradas como pertencentes à Deuteromycotina da família das Cryptococcaceae e do gênero Brettanomyces. De fato, van der Walt (1984b) apresenta estas duas espécies como Brettanomyces, ou seja, Brettanomyces custersianus e Brettanomyces

naardenensis. Convém salientar que o nome da primeira espécie difere daquela citada por Barnett et al. (1990). Assim, considerando as informações de van der Walt (1984a) e de Barnett et al. (1990), o número de espécies para o gênero Dekkera mostrada por Barnett et al. (1990) se resume a D. bruxellensis. O gênero Dekkera, segundo van der Walt (1984a), como já citado anteriormente, apresenta apenas duas espécies. A

assimilação de galactose e de celobiose é uma característica bioquímica importante para diferençar D. bruxellensis da espécie D. intermedia porque apenas esta última assimila estes dois açúcares (van der Walt, 1984a). É de se esperar que, com o refino na

composição química dos meios de cultura aliado às condições de cultivo, outras espécies de Brettanomyces sejam incluídas no gênero Dekkera. Jong & Lee (1986) obtiveram a forma perfeita da espécie Br. naardenensis e a denominaram de D. naardenensis. Lee & Jong (1986a) observaram que Br. custersianus também exibia a forma perfeita e a nova espécie foi denominada Dekkera custersiana. O mesmo aconteceu com Brettanomyces abstinens. Esta espécie formou ascosporos e a nova espécie foi chamada Dekkera abstinens (Lee & Yong, 1986b).

Fig. 5. Ascos de Dekkera bruxellensis com 1 a 4 ascos com ordas tangenciais (meio Ym

Fig. 6. Ascos de Dekkera intermedia com 1 a 4 ascosporos com formato de chapéu (meio

Fig. 7. Células de Brettanomyces bruxellensis em brotamento com pequenas ca-deias(meio extrato de malte. Fonte: Van der Walt, 1984b).

Fig. 8. Pseudomicélio de Brettanomyces bruxellensis com e sem blastosporos

Fig. 9. Pseudomicélio de Brettanomyces custersianus com ou sem blastosporos.

Podem-se obPodem-servar blastosporos em cadeias curtas ou em verticílios ramificados (meio- "corn meal agar"Fonte: Van der Walt, 1984b).

Fig. 10. Brettanomyces anomalus mostrando blastese. Células filamentosas longas sem

septos e sem invaginações com ou sem blastosporos. Podem-se observar blastosporos ao longo do micélio mas nunca em cadeias curtas e nem em verticílios (meio- "corn meal agar"Fonte: Van der Walt, 1984a).

Tabela 2. Espécies de Brettanomyces definidas por diferentes métodos e por diferentes autores. Campbell (1973) Análise numérica

Van der Walt (1984a) Morfologia / Fisiologia Clark-Walker (1987) Análise de mtDNA Smith (1990) Homologia / Enzima Barnet et al. (1990) Morfologia / Fisiologia Br. abstinens +∗∗ + + + -Br. anomalus + + + + +∗ Br. bruxellensis + + - + +∗∗ Br. clausenii + +∗ + + -Br. custersianus + + + + + Br. custersii + +∗∗ + + -Br. intermedius + +∗∗ - + -Br. lambicus + +∗∗ + + -Br. naardenensis + + + + +

Espécies do gênero Brettanomyces

Enquanto o gênero Dekkera apresenta apenas duas espécies (van der Walt 1984a), o gênero Brettanomyces possui nove espécies (van der Walt 1984b) (Tabela 2). Para

Barnett et al. (1990) e Molina et al. (1993), o gênero Brettanomyces possui apenas quatro espécies (Tabela 2). Barnett et al. (1990) consideram quatro das espécies definidas por van der Walt (1984b), marcadas com dois asteriscos (∗∗), como sinônimos de

Brettanomyces bruxellensis(∗∗). A espécie Brettanomyces claussenii, marcada com um asterisco (∗), é tida como sinônimo de Br. anomalus(∗).

É interessante observar que todas as espécies que Barnett et al. (1990) consideram como sinônimo, podem ser distinguidas da espécie referência. Neste caso há duas espécies referência, ou seja, Br. bruxellensis com quatro outras espécies como sinônimo e Br. anomalus com apenas uma espécie como sinônimo. As espécies Br. abstinens e Br. bruxellensis, que para Barnett et al. (1990) são o mesmo microrganismo, diferem entre si no que diz respeito à fermentação e assimilação de alguns açúcares. A sacarose e a maltose, por exemplo, não são assimiladas e nem fermentadas por Br. abstinens mas são assimiladas e fermentadas pela espécie referência Br. bruxellensis. A espécie

Brettanomyces custersii difere da espécie referência Br. bruxellensis porque a celobiose e a lactose não são assimiladas por esta última mas são pela Brettanomyces custersii. A espécie Brettanomyces intermedius pode ser distinguida da espécie referência Br. bruxellensis pela fermentação e assimilação da galactose. Este açúcar não é utilizado pela espécie Br. bruxellensis mas o é pela Brettanomyces intermedius. A espécie

Brettanomyces lambicus pode ser diferenciada da espécie referência Br. bruxellensis em virtude da capacidade de assimilação da rafinose. Apenas a primeira não assimila este açúcar. Além disso, a galactose, que não é assimilada pela Br. bruxellensis, é assimilada pela Brettanomyces lambicus.

Com relação à espécie referência Br. anomalus e à espécie Br. claussenii, é, de fato, praticamente impossível, pela utilização dos açúcares, se determinar a diferença entre elas. No entanto, morfologicamente, as duas espécies são distintas. Enquanto Br.

encontrada. Desta forma, todas as espécies que são consideradas sinônimo da espécie referência apresentam formas de diferenciação. Quando não são discernidas por meios bioquímicos, distinguem-se por aspectos morfológicos. A discrepância entre estes

autores na diferenciação das espécies de Brettanomyces está no critério de interpretação dos resultados relacionados com a fermentação, assimilação de açúcares e ainda com a morfologia. Para Barnett et al. (1990), a espécie Br. anomalus pode ou não fermentar a . Para van der Walt (1984b), a espécie que não fermentar este açúcar não pode ser

considerada Br. anomalus.

Há ainda um outro microrganismo, o gênero Eeniella, muito discutido quanto ao seu parentesco com os gêneros Dekkera, Brettanomyces, Hanseniaspora e Kloeckera . Considerando o brotamento, observa-se que Dekkera e Brettanomyces são gêneros que apresentam brotamento multipolar enquanto Hanseniaspora e Kloeckera são

microrganismos que exibem brotamento bipolar . O gênero Eeniella mostra brotamento bipolar como Hanseniaspora e Kloeckera. Para Smith et al. (1990), Eeniella divide características enzimáticas e fenotípicas com estes quatro gêneros. Boekhout et al. (1994), no entanto, pela seqüência de nucleotídeos do DNA ribosomal 26S, verificaram, apesar do brotamento bilateral, se tratar de um gênero relacionado com Brettanomyces e não com Hanseniaspora e nem com Kloeckera. Algumas características importantes que Dekkera e Brettanomyces exibem, também são observadas em Eeniella. Entre elas estão a formação de ácido acético, a presença do efeito Custer, também chamado de efeito Pasteur negativo (Scheffers, 1966; Smith et al., 1981), a coenzima Q com nove unidades

de isopreno (Q-9) (Yamada, 1980) e a similaridade do DNA mitocondrial (Hoeben et al., 1986; Hoeben et al., 1993). Como Eeniella apresenta brotamento bipolar semelhante às espécies Hanseniaspora e Kloeckera, este microrganismo é classificado como um gênero aparte (Smith et al., 1981; Smith et al., 1990). Tendo similaridade genética e fisiológica com o gênero Brettanomyces, a levedura Eeniella pode, muito provavelmente, também estar relacionada com deterioração de vinho. O termo”Efeito Pasteur Negativo” não é

apropriado para o fenômenoCuster (Scheffers, 1966; Scheffers & Wikén, 1969). O termo ”Efeito Custer” é utilizado para definir a inibição da fermentação em condições

anaeróbicas. Em determinadas situações, algumas linhagens de Sacch. cerevisiae também apresentam efeito Custer (Wikén & Richard, 1954), além disso, nem todas as espécies de Brettanomyces mostram tal efeito, como é o caso da espécie Br.

custersianus (Scheffers & Wikén, 1969). A taxa de fermentação em condições aeróbicas de Br. claussenii depende também da concentração de determinados íons como potássio e sódio . A fermentação em condições anaeróbicas desta espécie é estimulada por

substâncias formadas por Sacch. cerevisiae durante a fermentação da glicose Sacch. cerevisiae. Ou seja, o O2 pode ser substituído, no efeitoCuster , por moléculas formadas

durante a fermentação da glicose (Scheffers, 1961). Isto explica o desenvolvimento de Dekkera e Brettanomyces em vinhos onde a concentração de O2 é praticamente nula. Se

o metabolismo da levedura dependesse apenas do O2, sua atividade estacionaria no

momento em que o O2 fosse completamente utilizado. Observa-se que em garrafas de

vidro, onde a troca de oxigênio entre o vinho e o ambiente se restringe à rolha, a

fermentação ocorre de forma persistente com acúmulo de CO2 no espaço livre da garrafa.

Distribuição na natureza

Os dois gêneros ocorrem em diversos ambientes na natureza. O vinho é, sem dúvida, um dos ambientes nos quais se encontram. Geralmente, células de microrganismos morrem

durante a maturação do vinho. No entanto, há leveduras que resistem ao processo de maturação e permanecem viáveis por longo tempo. Van der Walt & van Kerken (1958) relatam a presença de células de leveduras viáveis em vinhos Château Lafitte com idade de 72 e 88 anos. Mesmo com células viáveis de microrganismos nestes vinhos, poucos foram os que se achavam deteriorados e mesmo assim, a deterioração estava

relacionada apenas com a idade dos mesmos. Embora esta situação tenha sido

observada em vinhos renomados extremamente velhos e os problemas de deterioração não tenham sido de origem microbiológica, não é raro haver problemas em vinhos de qualquer tipo envolvendo microrganismos. Quando isto ocorre, invariavelmente, a qualidade do vinho é afetada. O vinho fica turvo ou forma sedimentos, podendo ocorrer estes dois problemas ao mesmo tempo. Outros microrganismos também podem efetuar estas alterações. Isto não é uma prerrogativa dos gêneros Dekkera ou Brettanomyces. Espécies de Zygosaccharomyces podem causar turbidez em vinhos. Em levantamento efetuado em um vinho tinto e 59 brancos da África do sul, os gêneros mais

freqüentemente encontrados foram Brettanomyces, Saccharomyces e Pichia (van der Walt & van Kerken, 1958) com uma incidência, respectiva, de 50%, 53% e 13%. Isto significa que Brettanomyces foi encontrado em 50% dos vinhos analisados e que, praticamente, está na mesma proporção do principal gênero, Saccharomyces,

responsável pela transformação do mosto em vinho. No vinho tinto, Brettanomyces foi o único gênero detectado.

Como características gerais, todas as linhagens de Brettanomyces isoladas nestes vinhos apresentaram crescimento lento, formaram pseudomicélio, as células se apresentaram em forma de ogivas e produziram uma marcante quantidade de ácido acético em

condições anaeróbicas (van der Walt & van Kerken, 1958). No meio, preconizado por van der Walt & van Kerken (1958), pequenas colônias se formaram entre 5 e 6 dias. As

células se apresentaram em forma de ogivas e não foi observada, aos 3 dias de cultivo, a formação de pseudomicélio. As colônias se mantiveram pequenas, mostrando um

desenvolvimento realmente lento.

As espécies de Brettanomyces ou de Dekkera associadas com o vinho têm sido, quase que exclusivamente, isoladas de vinhos prontos ou em fermentação. Estas leveduras devem ter uma distribuição na natureza bem mais ampla do que até agora descrita. O estudo desta distribuição é importante para que esforços sejam desprendidos no sentido de exercer um maior controle e assim prevenir problemas de deterioração. Embora

extensivos estudos tenham fracassado em mostrar que Brettanomyces ou Dekkera sejam microrganismos da flora normal da fermentação primária, há casos citados por van der Walt & van Kerken (1961) onde duas das oitenta amostras de mosto tinto da Gironde possuíam Brettanomyces mas em nenhuma das trinta amostras de mosto branco este gênero foi detectado. Portanto, isto indica que esta levedura, dependendo das condições, pode estar presente na fermentação primária. Como os vinhos da África do Sul possuem trinta vezes mais incidência de Brettanomyces que os da Gironde, van der Walt & van Kerken (1961) se propuseram a investigar a presença desta levedura no mosto e nos equipamentos das cantinas. A presença de Brettanomyces foi pesquisada apenas em mosto branco uma vez que eram os vinhos destes mostos os mais acometidos. Numa primeira tentativa nenhum mosto branco possuía Brettanomyces. Do mesmo modo, os utensílios da cantina deram resultado negativo para a presença de Brettanomyces. Isto não significa dizer que este gênero não estivesse presente nos ambientes pesquisados. As técnicas e os meios de isolamento detectavam apenas espécies de Saccharomyces,

Saccharomycodes, Pichia e Candida, ou seja, as técnicas utilizadas estavam detectando apenas gêneros de crescimento rápido, como os descritos acima.

O antibiótico actidione (cicloeximida) inibe a síntese protéica de eucariotos mas não de procariotos. A inibição da síntese protéica em eucariotos não é um fenômeno universal. Há gêneros que são resistentes. Dekkera e Brettanomyces são exemplo de gêneros resistentes a este antibiótico. Van der Walt & van Kerken (1961) confirmaram a

resistência da levedura Brettanomyces isolada de vinho ao actidione (cicloeximida) e ao ácido sórbico descrita por Beech & Carr (1955, 1958). Isto facilitou a recuperação de Brettanomyces. Embora não se consiga inibição de todas as outras leveduras, pelo menos as que interferem no crescimento de Brettanomyces parecem ser eliminadas. Mesmo assim, representantes de dois outros gêneros estavam prejudicando o isolamento (Candida boidinii e Oospora lactis). Alterando a fonte de carbono do meio de cultura, os autores se livraram deste incômodo. Tomados estes cuidados, Brettanomyces foi

detectada em 13 das 50 amostras analisadas de cantinas (pisos, paredes, drenos) e de utensílios de cantina (tubos de madeira, vasos, equipamento para esmagar uva e tanques). De dez amostras de mosto, apenas uma apresentou Brettanomyces. Na superfície das uvas, os autores não conseguiram detectar a levedura. Pelo exposto, parece que Brettanomyces ou Dekkera são leveduras que têm uma relação mais estreita com a cantina e com os utensílios que com a própria uva. De acordo com os resultados de van der Walt & van Kerken (1961), esta levedura não faz parte da flora normal da uva madura, mas pode participar da fermentação primária devido a sua presença nos

equipamentos utilizados na vinificação. De fato, a levedura Brettanomyces foi encontrada no equipamento que esmaga a uva, o que reforça a hipótese de sua presença nos

estádios iniciais da fermentação primária se dever à contaminação do mosto com o microrganismo da cantina. Parece que ela necessita de vinho ou resíduo de vinho para que o ambiente lhe fique favorável.

Como agentes que deterioram o vinho, além de espécies fermentativas dos gêneros Brettanomyces e Dekkera, podem ser encontradas leveduras oxidativas como Pichia e Candida e espécies fermentativas dos gêneros Zygosaccharomyces e Saccharomycodes (Fleet, 1999). Silva, em 2002, dados não publicados, observou a presença de

Schizosaccharomyces japonicus em vinhos elaborados na região de Bento Gonçalves (RS). Brettanomyces é um gênero que tem sido encontrado não apenas em vinho mas também em cerveja, fermentado de maçã e mosto de uva.

Ocorrência

Entre os países onde a presença de Dekkera e Brettanomyces têm sido reportada, estão Alemanha, França, África do Sul, Espanha, Portugal, Uzbequistão, Nova Zelândia,

Inglaterra Austrália, Estados Unidos e Brasil (Licker et al., 1998).

Austrália

Os gêneros Dekkera e Brettanomyces estão presentes em regiões vinícolas. Na Austrália, até 1991 aproximadamente, a presença destes dois gêneros era tida como ocasional. Esta raridade não era devido à ausência de Dekkera e Brettanomyces mas se devia às

técnicas de detecção. Passou-se a empregar métodos de determinação de 4-etil-fenol e 4-etil-guaiacol e relacioná-los com a ação direta destes microrganismos. O "Australian Wine Research Institute"(AWRI) acredita que as contaminações estejam aumentando no país. O Instituto instrui os vinicultores sobre a ameaça dos referidos gêneros de levedura. Mesmo com toda a informação disponível, poucos são os vinicultores australianos que instituíram monitoramento intensivo para minimizar a ameaça (Franson, 2001).

Argentina

Recentemente foi detectada, na Argentina, a presença de Dekkera e Brettanomyces mosto aos dez dias de fermentação e antes do engarrafamento, sem evidenciar prejuízos organolépticos (Roccato et al., 2001). Segundo os autores, este foi o primeiro relato da ocorrência destes dois gêneros neste país.

Brasil

Análises microbiológicas realizadas em alguns vinhos comerciais brasileiros revelaram a presença de células típicas de Dekkera com ascosporos característicos. Se fosse

realizado um levantamento mais detalhado do problema, teríamos muito provavelmente a mesma surpresa que os australianos tiveram há cerca de uma década atrás. Se a

Austrália e outros países não monitoram adequadamente a contaminação por Dekkera e Brettanomyces, o risco de o vinho se tornar de baixa qualidade é elevado. O Brasil, efetuando tal monitoramento, estará dando um passo importante em busca da qualidade.

França

Licker et al. (1998) afirmam ter sido, em Jura, em 1955, pela primeira vez que foi

detectada a levedura Brettanomyces na França. Posteriormente, foi encontrada em outras regiões como Midi e Gironde (Bordeaux). Análises efetuadas em vinhos engarrafados de safras diferentes (de 1979 a 1990), provenientes de diversas cantinas de Bordeaux, revelaram níveis de etil-fenóis acima do limiar de percepção (426 µg/L) em 36% dos vinhos (Chatonnet et al., 1992).

Problemas de ordem geral

Alguns problemas causados por leveduras são de fácil detecção quando o vinho está pronto. Entre estes estão:

• Turbidez e formação de névoa - as leveduras selvagens, além de causar turvação, podem formar sedimentos

• Formação de filme ou película - na presença de ar, algumas leveduras podem formar película sobre a superfície do vinho. Outras podem até mesmo ascender pelas paredes da garrafa.

• Atenuação - Leveduras selvagens podem crescer às custas de fontes de carbono que normalmente Sacch. cerevisiae não utiliza. Nestes casos, o teor de etanol pode aumentar e formar aromas indesejáveis.

Problemas específicos potenciais e

condições para a síntese microbiológica

de fenóis

Substâncias fenólicas são componentes clássicos do aroma de vinhos. Entre estes estão os vinil-fenóis, nos vinhos brancos, e os etil-fenóis, nos tintos (Dubois et al., 1971;

Etiévant, 1981; Boidron et al., 1988). Análises efetuadas em vinhos brancos revelaram que apenas determinados vinhos continham vinil-fenóis (Chatonnet et al., 1993). O 4-vinil-guaiacol, além de ser mais agradável, pois contribui para a intensidade aromática do vinho, conferindo-lhe nota floral, é mais facilmente percebido em vinhos que o

4-vinil-fenol. Mesmo em concentrações abaixo do limiar de percepção, este último mascara a nota frutada do vinho branco (Chatonnet et al., 1993).

Vinhos contaminados com Dekkera ou Brettanomyces apresentam elevadas concentrações de ácido acético e se tornam túrbidos. Nos casos mais graves, há

formação de derivados do tipo 2-acetil-2-etil-tetraidro-piridina e acetil-pirolina, resultando em forte cheiro conhecido como "odor de rato" (Chatonnet et al., 1999). Lactobacillus ou Pediococcus também formam tais moléculas mas não são capazes de formar

quantidades suficientes para provocar um odor perceptível (Chatonnet et al., 1997). Outros componentes de odor desagradável também são encontrados neste tipo de deterioração. Entre estes componentes estão os que apresentam odores fenólicos e animais, lembrando "couro" ou "urina de cavalo" em vinhos tintos. Licker et al. (1998) apresentam várias descrições para o aroma exalado pelo vinho devido à ação de Dekkera e Brettanomyces. Entre estas estão, estábulo, plástico queimado, suor de cavalo, couro molhado, band-aid e animal molhado. Há outras descrições como tempero forte, fumaça, cravo da índia, fenol e remédio. Na forma pura, enquanto o 4-etil-fenol exibe um aroma de Band-Aid, o 4-etil-guaiacol exala aroma de madeira queimada, sendo, a presença destes dois componentes, fortes indicadores da presença de Dekkera e Brettanomyces (Olsen, 2002).

Vinhos com estes atributos são considerados "Bretty". Este tipo de defeito tem sido qualificado como simplesmente de caráter fenólico dos vinhos tintos. Chatonnet et al. (1990) verificaram que este caráter era diretamente proporcional à quantidade de

etil-fenóis presentes nos vinhos tintos. Entre estes estão o 4-etil-fenol () e 4-etil-guaiacol (). Vinhos com concentrações mais elevadas destes componentes podem exibir odor desagradável de "estábulo" (Etiévant et al., 1989; Chatonnet et al., 1990). Em cerveja, o gosto fenólico também pode ser encontrado. Nestes casos, há presença de considerável quantidade de 4-vinil-guaiacol. Embora não seja o único componente a dar gosto

estranho à cerveja, sua produção é um sintoma da inaptidão da linhagem destinada ao processo de fermentação (Thurston & Tubb, 1981) ou sintoma de contaminação com linhagens de levedura que não pertencem à espécie Sacch. cerevisiae.

Os limiares de percepção (LP) dos compostos 4-etil-fenol e 4-etil-guaicol dependem da composição química do meio onde se encontram (Etiévant, 1991) e se alteram de acordo com a interação entre eles. Chatonnet et al. (1992) mostram o resultado destas

alterações considerando a água, a solução hidroalcoólica e o vinho (Tabela 3). Como em vinhos brancos são mais comumente encontrados 4-vinil-guaiacol e 4-vinil-fenol na proporção de 1:1, Chatonnet et al. (1993) mostraram ser de 725 µg/L (Tabela 3) o LP nesta proporção.

Fig. 11. Estrutura do 4-etil-fenol

Tabela 3. Limiares de percepção do 4-etil-fenol e 4-etil-guaiacol em

vinhos tintos e de 4-vinil-guaiacol e 4-vinil-fenol em vinhos brancos.

(Fontes: Chatonnet et al., 1992; Chatonnet et al., 1993). Compostos voláteis H2O Solução

Hidroalcoólica Modelo LP (µg/L) Vinho tinto 4-etil-fenol 130 440 620 4-etil-guaiacol 25 47 140 4-etil-fenol + 4-etil-guaiacol (10:1) . . . 426 Vinho branco 4-vinil-guaiacol 32 130 570 4-vinil-fenol 85 180 0 4-vinil-guaiacol + 4-vinil-fenol (1:1) . . . 725

Etiévant (1989), ao analisar a origem do odor de "couro", observou que a fermentação maloláctica conduzia a este odor, ou seja, bactérias lácticas também possuem potencial para provocar este tipo de defeito no vinho. No caso de bactérias lácticas, a formação de tais componentes está diretamente relacionada com o microrganismo e com a

composição química do vinho. Chatonnet et al. (1997) observaram que entre as bactérias Pediococcus damnosus, Lactobacillus plantarum e Leuconostoc oenos, apenas o

Lactobacillus plantarum formava uma quantidade apreciável de 4-etil-fenol, um fenol que, como já definido, confere ao vinho odor desagradável e descrito por estes autores como odor de "cavalo molhado". Mas a quantidade produzida por esta espécie de bactéria láctica era sempre muito mais baixa que aquela formada por Br. bruxellensis. Quando a bactéria era inoculada e determinados compostos fenólicos naturais da uva, como

procianidina, eram adicionados, a síntese, pela bactéria, de compostos fenólicos voláteis de odor desagradável era sensivelmente diminuída. O maior decréscimo na síntese de 4-etil-fenol foi conseguido quando 1 g/L de taninos do grupo das procianidinas foi

adicionado. A ação inibitória das procianidinas e de outros polifenóis do vinho tinto sobre a formação de 4-etil-fenol só é efetiva no metabolismo de bactérias. Daí a importância da composição química do vinho tinto diante da fermentação maloláctica. Vinhos com teores de compostos fenólicos naturais muito baixos podem apresentar um aumento no teor de 4-etil-fenol e 4-vinil-fenol. A qualidade do vinho pode não ser prejudicada porque a

quantidade formada por estas bactérias fica abaixo da concentração necessária para ser percebida (426 µg/L) mas pode contribuir para a baixa qualidade do produto final se for considerada a soma da quantidade de 4-etil-fenol formada por Sacch. cerevisiae e, em especial, Brettanomyces. Este fenol é formado por bactérias lácticas quando o teor de taninos no vinho é menor que 3 g/L (Chatonnet et al., 1997). Não apenas as bactérias lácticas podem afetar a qualidade do vinho quando a quantidade de compostos fenólicos naturais (catequinas e procianidinas) da uva são baixos, mas também Sacch. cerevisiae, agente da principal fermentação do mosto, pode ter seu metabolismo afetado de forma a aumentar a quantidade 4-vinil-fenol do vinho e assim comprometer a qualidade do

produto final. Na presença de (+)-catequina e procianidinas, Sacch. cerevisiae teve sua capacidade de formar 4-vinil-fenol reduzida em, respectivamente, 42% e 99%. O

metabolismo de Br. bruxellensis, com relação à síntese de 4-vinil-fenol e de 4-etil-fenol, não se altera de forma significativa com a suplementação de 1 g/L de catequina ou

procianidinas (Chatonnet et al., 1997).

Os taninos são substâncias biologicamente ativas. Apresentam potencial quelante,

precipitam proteínas e agem como antioxidante. Sobre as bactérias lácticas, sabe-se que os taninos inibem o crescimento desses microrganismos possivelmente por afetar a constituição lipídica do microrganismo. Neste sentido, o efeito dos taninos é mais forte que a do próprio etanol. Os taninos atuam sobre determinadas enzimas tanto da

membrana como da parede celular, inibindo-as. Se algumas das enzimas que participam da formação de 4-etil-fenol e 4-vinil-fenol em bactérias estiverem situadas na membrana celular, uma inibição destas enzimas se reflete imediatamente na produção destes compostos. A cinamato descarboxilase (CD) está, de fato, ligada à membrana celular do Lactobacillus plantarum. A redução na atividade desta enzima leva, sem dúvida, a uma diminuição na formação de 4-etil-fenol e 4-vinil-fenol no vinho. Em Sacch. cerevisiae, esta mesma enzima está dentro da célula e, portanto, a inibição direta dos taninos sobre esta enzima é mais difícil de ocorrer. Pode haver, no entanto, uma ação indireta. Sabe-se que a atividade desta enzima envolvida no processo de formação de vinil-fenóis é constitutiva, se expressa apenas durante a fermentação alcoólica e que é inibida pelos taninos

catéquicos. Desta forma, entende-se porque os vinhos tinto e rosé apresentam baixos níveis de destes compostos (4-vinil-fenol e 4-vinil-guaiacol), embora possuam níveis de precursores mais elevados (Chatonnet et al., 1993). Além disso, os autores mostraram uma influência direta de linhagens de Sacch. cerevisiae na síntese destes compostos. Os taninos podem estar envolvidos com a permeabilidade da membrana celular de Sacch. cerevisiae, dificultando a passagem de substâncias através da membrana. Estudos efetuados com frações fenólicas (Chatonnet et al., 1993) mostraram ser as catequinas e as procianidinas mais ou menos condensadas, com um peso molecular menor ou igual a 3000 daltons, as frações fenólicas inibidoras. As altamente condensadas são inativas. Infelizmente, a síntese de 4-etil-fenol e de 4-vinil-fenol por Brettanomyces não é afetada pelos taninos, sugerindo uma relação de distância virtual entre a célula desta levedura e os taninos. Assim, Br. bruxellensis difere das bactérias lácticas e de Sacch. cerevisiae com relação à interferência dos taninos no processo de síntese de componentes fenólicos indesejáveis.

A concentração da fonte de carbono pode exercer importante papel na formação de compostos fenólicos por microrganismos. Concentrações baixas de açúcares

fermentescíveis, como glicose e trealose, induzem à síntese de fenóis, atingindo

porcentagens de transformação do ácido trans-p-cumárico superiores a 42% (Chatonnet et al., 1997). No vinho fino seco, o baixo teor de açúcares fermentescíveis é um fato normal e desejável. Logo, isto favorece o aparecimento de componentes de odores indesejáveis em concentrações mais elevadas. Chatonnet et al. (1997) obtiveram, em quatro semanas, 4.225 µL/L de fenóis, formados por Br. bruxellensis, quando o teor de açúcar fermentescível era de 2 g/L.

Sabe-se que os ácidos fenólicos do mosto podem ser descarboxilados por Sacch.

cerevisiae, dando origem aos vinilfenóis. Algumas bactérias lácticas, como Lactobacillus brevis e Pediococcus pentosaceus, também são capazes de descarboxilar o ácido trans p-cumárico e formar 4-vinil-fenol de modo tão ativo como o faz Sacch. cerevisiae

(Chatonnet et al., 1995). Estas bactérias formaram também quantidades apreciáveis de 4-vinil-fenol a partir de ácido trans-ferúlico, chegando a superar Sacch. cerevisiae. Enquanto Sacch. cerevisiae formou 1.185 µg/L de 4-vinil-fenol, Lactobacillus brevis e Pediococcus pentosaceus produziram, respectivamente, 1.909 µg/L e 2.063 µg/L. Com

exceção da Lactobacillus plantarum, que, como vimos, produz 4-etil-fenol, nenhuma outra bactéria láctica formou concentrações significativas de etil-fenol. D. intermedia chegou a produzir, a partir do ácido trans-p-cumárico, 2.915 µg/L de 4-etil-fenol e 3.947 µg/L de 4-etil-guaiacol. A partir do ácido trans-ferúlico, no entanto, a quantidade de

4-vinil-guaiacol e 4-vinil-fenol produzida por esta levedura foi muito modesta, 25 µg/L e 15 µ g/L, respectivamente (Chatonnet et al., 1995). Convém salientar que os ensaios

efetuados por estes autores foram realizados em meio artificial. Portanto, neste meio não havia catequina e nem procianidina para inibir a formação destes fenóis por parte das bactérias lácticas e Sacch. cerevisiae.

É evidente que estas leveduras não formam apenas 4-etil-fenol e 4-etil-guaiacol. Embora o 4-etil-fenol seja o mais importante, outros produtos do metabolismo são liberados para o meio. Entre estes produtos estão os ácidos graxos voláteis, como ácido acético, e o acetato de etila, dando aroma de acetona (Olsen, 2002). Além disso, há formação de outros ácidos graxos voláteis como isovalérico (Franson, 2001; Olsen, 2002), isobutírico, 2-metil-butírico que podem causar impacto sobre a qualidade do vinho (Olsen, 2002). O limiar de percepção (LP), para o ácido isovalérico é de 1,2 mg/L (Franson, 2001).

As tetraidropiridinas, como já mencionadas, são responsáveis pelo aroma de rato ou cavalo, mas isto depende da concentração que está presente no vinho. Em baixas concentrações podem apresentar aroma de pão, pipoca, biscoito cracker (Olsen, 2002). Mas nem sempre estes aromas estão relacionados com a atividade metabólica de Dekkera e Brettanomyces, uma vez que as tretaidropiridinas podem também ser formadas por bactérias lácticas heterofermentativas como Lactobacillus brevis e

Lactobacillus hilgardii. O substrato usado para a síntese destes compostos voláteis são lisina, etanol ou propenol (Olsen, 2002).

No vinho pode haver mais de 1000 mg/L de açúcares, como glicose, sacarose, trealose, galactose e frutose. Dependendo da idade do vinho, a trealose pode chegar a mais de 200 mg/L. Quando Brettanomyces ou Dekkera atuam, os teores de açúcares residuais diminuem, especialmente os de trealose. Dos açúcares acima apresentados, quase todas as espécies de Brettanomyces e todas as espécies de Dekkera utilizam a glicose,

trealose e frutose. A galactose só não é metabolizada pela espécie Br. bruxellensis e a trealose só não é utilizada por Br. abstinens. Segundo van der Walt (1984b), esta espécie só metaboliza três açúcares, ou seja, a glicose, galactose e celobiose. Apenas duas espécies de Brettanomyces não assimilam o nitrato, as espécies Br. custersianus e Br. naardenensis. A sacarose só não é utilizada por Br. abstinens e Br. naardenensis. A quantidade de açúcares fermentescíveis de 275 mg/L é suficiente para que a

concentração de etil-fenóis atinja a cifra limiar, a partir da qual o vinho adquire

características desagradáveis, que está estipulada em 426 µg/L (Chatonnet et al., 1990). Chatonnet et al. (1995) consideram uma assimilação de 300 mg/L de açúcares

fermentescíveis o suficiente para atingir 3x103 células/mL e formar quantidade de 4-etil-fenol suficiente para ultrapassar o limiar de percepção (600 mg/L). Br. claussenii apresenta atividade histidina descarboxilase (Hernández, 1996), característica esta que pode ser usada na diferenciação. Esta atividade eleva os níveis de histamina dos vinhos. A histamina atua sobre os receptores H1, provocando a constrição da musculatura lisa e de vasos sangüíneos, podendo estar relacionada com dores de cabeça. Age também sobre os receptores H2, induzindo a secreção de HCl pelo estômago, contribuindo assim para a formação de úlcera estomacal.

Detecção e identificação

Detecção por processo microbiológico clássico

Uma forma de se detectar problemas causados por Dekkera e Brettanomyces se baseia no isolamento das espécies envolvidas. Embora pareça óbvia esta forma de detecção, não é a maneira mais simples, rápida e segura. Isto se deve a uma série de problemas relacionados com a característica fisiológica dessas leveduras. As dificuldades de identificação das espécies já se iniciam no momento do isolamento. As espécies

pertencentes a estes dois gêneros mostram, de um modo geral, exigências nutricionais importantes. Além disso, apresentam crescimento lento e, dependendo do meio de cultivo, possuem um curto período de vida. O aparecimento de colônias pode levar 30 dias. Zimogramas, devido a seu efeitoCuster, podem conduzir a resultados dúbios,

quando não negativos, e assim mascarar a capacidade de fermentação das diferentes espécies. Este fato dificulta ainda mais a identificação das espécies. Aliado a isto, deve-se considerar a condição de cultivo para os exames macro e microscópico. Os meios de cultura para identificação devem ser aqueles estabelecidos pelos taxonomistas. Há meios específicos para cada tipo de investigação, seja ela macroscópica ou

microscópica. Dependendo das características que se procuram observar, os meios podem ser de diferentes composições químicas. São meios geralmente caros porque exigem certa pureza. A não obediência destes requisitos pode levar à não formação de determinadas estruturas celulares ou mostrar habilidades fisiológicas que de fato não existem. O processo clássico de identificação exige, além de tudo, microscópios com baixo limite de resolução e recursos humanos com uma prática razoável em microbiologia para identificar as estruturas que caracterizam o indivíduo. À primeira vista, parece ser a forma mais indicada para detectar o agente causal do problema de deterioração

provocada por Dekkera e Brettanomyces, mas talvez seja a maneira mais lenta, dispendiosa e penosa de se identificar o problema.

Isolamento

O isolamento dos gêneros Dekkera e Brettanomyces é o passo mais importante no

processo de identificação do agente causal. Já foram anteriormente discutidas, com base nos relatos de Van der Walt & van Kerken (1961), as dificuldades que muitos

pesquisadores enfrentaram na tentativa de isolar estes dois gêneros em mosto de uva. Essas dificuldades levavam a crer que Dekkera e Brettanomyces não pertenciam à flora normal da fermentação primária. Hoje se sabe que estes dois gêneros podem estar presente durante o processo de vinificação, pois há relatos da presença de Dekkera e Brettanomyces em mosto tinto. É importante ressaltar que a não detecção de um

microrganismo num determinado ambiente não é prova de sua ausência. A não detecção se deve muitas vezes às características do microrganismo e às exigências nutricionais que exibem. As técnicas de isolamento de uma população heterogênea muitas vezes permitem apenas o aparecimento dos microrganismos predominantes. Entre estes microrganismos estão as bactérias (lactobacilos e bactérias acéticas) e as diversas espécies de Saccharomyces, Pichia, Candida, Saccharomycodes, Hansenula. Como estes microrganismos possuem taxas específicas de crescimento máximas (µmáx) várias vezes maiores que as de Dekkera e de Brettanomyces, parece óbvio que aqueles meios

de cultura que permitem o desenvolvimento mais rápido de microrganismo sejam inadequados para o isolamento destes dois gêneros.

Uma descoberta interessante reativou a esperança de superar a dificuldade de

competição entre Dekkera e Brettanomyces e as outras leveduras. Beech & Carr (1955, 1958) verificaram que, ao contrário das outra leveduras, Brettanomyces apresentava resistência à actidione (50 µg/mL) e ao ácido sórbico (500 µg/mL). A adição destes dois compostos, embora não tenha acarretado inibição completa de todas as outras leveduras, possibilitou seu isolamento de uma maneira mais segura. Espécies de Candida e

algumas bactérias podem ainda ser um obstáculo no processo de isolamento. Os

problemas com Candida podem ser resolvidos escolhendo fontes de carbono adequadas (sacarose e maltose). No entanto, como será visto adiante, nem todas as espécies de Candida são incapazes de fermentar e/ou assimilar a sacarose e a maltose. Portanto, a dificuldade de se obter um meio diferencial para Dekkera e Brettanomyces ainda existe. Bactérias lácticas e acéticas podem ser rechaçadas com o uso de aureomicina (25µg/mL) e a adição de actinomicina (2µg/mL) atua sobre as bactérias lácticas. O uso destes dois antibióticos inibe de forma mais eficiente tanto bactérias lácticas como acéticas (Beech & Carr, 1958). As bactérias acéticas também são afetadas pelo ácido sórbico (Beech & Carr, 1958). No isolamento de Dekkera e Brettanomyces, têm sido empregados os meios W.L.D. (Difco), D.H.S.A (Chatonnet et al.,1992) e W.L.D.S. (Chatonnet et al., 1999).

Exame macroscópico

Depois do processo de isolamento e purificação, o exame macroscópico deve ser

efetuado em meio líquido e em meio sólido. Em meio líquido, levam-se em consideração a formação de anel, a presença de película, ilhota, sedimento (flocoso, com mucosidade, empoeirado, aderente) e o tipo de aroma. Em meio sólido, levam-se em conta a cor (creme, marrom clara, salmão), o formato (liso, crespo, elevado, com cratera, ondulado, acolchoado), o brilho, o tipo de borda (lisa, ondulada, lobuloso) que a colônia apresenta. D. bruxellensis, em meio líquido, forma ocasionalmente um anel fino ou ilhotas ou ainda uma delgada película. O sedimento formado após dez dias de cultivo em temperatura ambiente é flocoso a mucoso. Em meio sólido, quando cultivadas em ágar malte, as colônias desta espécie são restritas, de cor que vai do creme ao marrom claro e algumas vezes apresentam coloração salmão. São, em geral, colônias lustrosas e elevadas, mas também podem se apresentar tanto lisas como crespas com margens onduladas. As margens podem ser tanto inteiras como onduladas ou lobulosas. Quando carbonato de cálcio é adicionado ao ágar malte, as colônias se apresentam com crateras. As margens podem ser inteiras ou onduladas a lobosas, como anteriormente descritas, e

ocasionalmente ornadas com franjas. Observa-se ainda a formação de ácido.

Exame microscópico

O exame microscópico é fundamental no processo de identificação. É preferível usar um microscópio de contraste de fase. Este microscópio transforma, por meio de seu sistema óptico, diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade. O olho humano não é sensível às diferenças de fase e sim às diferenças de intensidade. As diferentes fases na luz emergente são geradas pela diversidade de densidade das

estruturas celulares. Quanto maior a densidade da estrutura menor será o movimento da luz no interior desta estrutura. Como na célula há diversas estruturas com densidades distintas, haverá também diferentes fases na luz emergente. Por interferência, as fases são transformadas em diferenças de amplitude originando intensidade luminosa distinta para cada estrutura. Este tipo de microscópio é importante para observar células vivas, estruturas celulares como ascos de um ascosporo, as formas que estes ascos

apresentam, estudar as diferentes formas de micélio como pseudomicélio, micélio verdadeiro e blastese e distinguir os diferentes tipos de blastosporos.

O exame microscópico das células é de fundamental importância porque consegue separar gêneros pertencentes aos ascomicetos e deuteromicetos. Com esta técnica, é possível distinguir os gêneros Dekkera e Brettanomyces bastando para tal evidenciar a formação ou não de ascosporos, respectivamente, o formato e o tamanho das células (diâmetro, comprimento e largura). Células de Br. anomalus possui, por exemplo, uma medida de 2,0-5,5 X 3,0-19,0 µm enquanto que os valores obtidos para células de Br. bruxellensis e de D. bruxellensis são de 2,0-6,5 X 4,0-22,0 µm. Por estas medidas pode-se perceber que as células podem ser esféricas, cilíndricas a alongadas e que muito pouco pode-se extrair desta informação para se chegar a diferençar gêneros e muito menos espécies.

Métodos Convencionais de Detecção e

de Identificação de Dekkera e

Brettanomyces

Condições

Os testes bioquímicos levam em consideração o zimograma e o auxonograma de açúcares, clivagem das substâncias químicas, assimilação de nitrato, assimilação de nitrito, capacidade de crescer em condições de alta concentração de açúcares, relação GC, entre outros. Nestes testes, pressupõe-se, como condição básica, pureza tanto do microrganismo quanto das substâncias que serão testadas. Cuidados especiais também deverão ser tomados no preparo do meio de cultura. Dependendo da forma de preparo, substâncias mais complexas poderão ser decompostas e a identificação ficará

definitivamente comprometida. Por este motivo, os meios utilizados na identificação de microrganismos são caros e todo o processo de identificação exige experiência nesta área. Assim por exemplo, quando se deseja saber qual a capacidade de a levedura

fermentar a sacarose, esta deverá ser pura e a esterilização não poderá ser efetuada pelo uso do calor. Usando o calor, há a possibilidade de, no lugar da sacarose, se estar

testando a capacidade de a levedura fermentar a glicose e a frutose.

Testes bioquímicos

A Tabela 4 4 (incluir) mostra a capacidade que possuem as duas espécies de Dekkera e as demais espécies de Brettanomyces de fermentar açúcares, segundo van der Walt (1984a).

Esta tabela é especialmente importante se um kit comercial de açúcares for utilizado. Há, no mercado, vários kits disponíveis destinados à identificação de leveduras. Entre estes estão:

1. Albicans ID (BioMerieux) (Krajewska-Kulak et al., 1999)

2. API 20C (Analytab Products, Plainview, New York) (Control Calidad Seimc, 1999; Meis et al., 1999; Moghaddas et al., 1999; Verweij et al., 1999)

3. API 50 CHL (H.L.S. Scientific Pty. Ltd., South Australia) (Heresztyn, 1986) 4. API Candida (Verweij et al., 1999)

5. API ID 32C (bioMérieux) (Control Calidad Seimc, 1999; Verweij et al., 1999) 6. Auxacolor (Sanofi Diagnostics Pasteur) (Control Calidad Seimc, 1999;

Krajewska-Kulak et al., 1999; Meis et al., 1999; Verweij et al., 1999; Romney et al., 2000)

7. Candifast (Oxoid) (Control Calidad Seimc, 1999)

8. Fongiscreen 4H (Sanofi Diagnostics Pasteur) (Krajewska-Kulak et al., 1999) 9. Microscan (Dade) (Control Calidad Seimc, 1999)

10. RapID Yeast Plus System (Innovative Diagnostic) (Control Calidad Seimc, 1999; Moghaddas et al., 1999; Verweij et al.,

1999)-11. Uni-Yeast-Tek System (Remel, Lenexa, Kansas)(Moghaddas et al., 1999)

12. Vitek System (BioMerieux Vitek, Inc., Hazelwood, Missouri),( Control Calidad Seimc, 1999; Moghaddas et al., 1999; Verweij et al., 1999)

13. Yeast Star (Verweij et al., 1999)

Segundo relatório Control Calidad Seimc (1999) entre os kits, o API 20C é um dos mais utilizados. Romney et al. (2000) observaram que, com relação ao método convencional, o Auxacolor System teve um acerto de 94% na identificação de leveduras. Os erros foram cometidos com Candida albicans (de 15 linhagens apenas uma não foi corretamente identificada), Candida kefyr (de sete linhagens apenas duas não puderam ser

identificadas), Candida parapsilosis (de 17 apenas uma não foi identificada) e Sacch. cerevisiae (de três uma não pode ser identificada). Entre os kits Vitek, Api ID 32C, Api 20C AUX, Yeast Star, Auxacolor, RapID Yeast Plus system, and Api Candida, a

porcentagem de acerto variou de 59,6% a 80,8%. Os kits que mais proporcionou acerto foram Api Candida com 78,8% e Auxacolor com 80,8% (Verweij et al., 1999).

A Figura 13 mostra o kit auxacolor na identificação de Candida glabrata. Esta levedura é patogênica, pois causa vulvovaginite, e responde ineficientemente à ação dos azóis, como fluconazol, e da nistatina (Kwon-Chung & Bennett, 1992). Cada poço do kit possui diferentes açúcares. A levedura é transferida para cada poço e seu crescimento é

visualizado pela alteração da cor que passa de púrpura para amarelo. Neste caso, a levedura testada (Figura 13) só assimila a glicose e a trealose. Observe que nem todos os açúcares mostrados na Tabela 5 5 estão contemplados no auxacolor. Não há poços com a ramanose e nem com a eritrose, por exemplo. Também, nem todos os 16 poços possuem açúcares. Enumerando os poços de 1 a 16, onde na fileira mais acima estão os

Tabela 4. Fermentação de açúcares pelos gêneros Dekkera (van der Walt, 1984a) e Brettanomyces (van der Walt, 1984b).

Leveduras Gli* Gal Sac Mal Lac Raf

D. bruxellensis + - + + - -D. intermedia + +L +L + - V Br. abstinens + +L - - - -Br. anomalus + + + V + + Br. bruxellensis + - + + - -Br. claussenii + + + +F + V Br. custersianus +L - - - - -Br. custersii + +L + + - +L Br. intermedius + +L + +L - -/+F Br. lambicus + -/+F + + - -Br. naardenensis +L -/+F - - - -*

Gli= glicose; Gal= galactose; Sac= sacarose; Mal= maltose; Lac= lactose; Raf= rafinose; (-) = negativo; (+)= positivo rápido; (+F)= positivo fraco; (V)= variado; (+L)= positivo lento; (-/+F)= negativo ou positivo fraco.

Fig. 13. Identificação de leveduras pelo kit auxacolor. C.Neg- Controle negativo;

CEL- Celobiose; GLU- Glicose; TRE- Trealose; MAL- Maltose; ADO- Adonitol (Ribitol); SAC- Sacarose; MEL- Melezitose; GAL- Galactose; XYL- Xilose; LAC- Lactose; ARA-Arabinose; RAF- Rafinose; ACT- Actidione (cicloeximida); INO- Inositol; POX- Atividade fenol oxidásica. Os poços positivos alteram sua cor de púrpura para amarelo (Sanofi Diagnostics Pasteur).

poços 1 a 8 e na segunda fila os poços 9 a 16, os poços 15 e 16 contêm respectivamente, actidione (ACT) (cicloeximida) e reativo para detectar atividade fenoloxidásica (POX) . As condições necessárias para que seja efetuado o teste de assimilação de açúcares, em soluções preparadas em laboratório, são dadas a seguir:

1. Usar sempre produtos de qualidade garantida.

2. Usar produtos livres de qualquer contaminação química. Por exemplo, para a assimilação da maltose, esta não deve possuir traços de glicose ou outra fonte de carbono.

3. Garantir a não degradação de polissacarídeos, quando estes estiverem sendo utilizados como substrato para a identificação.

4. A levedura precisa ser pura. Isolar a levedura por meio de diluições em série e efetuar o isolamento em meio sólido.

5. A levedura a ser testada deve apresentar crescimento ativo. Para que isto ocorra: • multiplicar a levedura, devidamente isolada, em meio YM a 28°C

• repetir a operação, transferindo uma alíquota da suspensão de levedura do YM para um novo YM após 2 a 3 dias de crescimento. As células, assim

preparadas, estarão prontas para ser transferidas para os poços do kit de identificação. Alternativamente, a levedura pode ser removida do meio sólido e diluída em 3 mL de H2O estéril ou em meio "yeast nitrogen base" num tubo de

16 mm de diâmetro.

6. A solução de levedura a ser transferida para o kit deverá ser diluída em H2O estéril

de modo que quatro ou cinco linhas pretas com ¾ mm de largura traçadas em cartão branco sejam vistas através da solução como bandas turvas. Quando se tratar de detecção de Dekkera ou Brettanomyces, no lugar da água deve-se utilizar uma solução de vitaminas para se efetuar a diluição.

7. A solução de leveduras assim preparadas será transferida para cada poço do kit de identificação segundo informações do fabricante.

8. A placa diagnóstico deverá ser incubada a 28°C por 24, 48 e 72 horas. 9. Se a levedura for retirada diretamente do meio sólido e inoculada nos poços,

cuidados deverão ser tomados para que ágar e outros produtos prontamente assimiláveis não sejam transferidos junto com a levedura.

Além destes testes, estes dois gêneros mostram variação na assimilação do nitrato, não crescem em meios sem vitaminas, não crescem a 50% de glicose, crescem a 37°C e produzem ácido. Deve ser considerado ainda que a fermentação é estimulada pelo

oxigênio molecular, ou seja, apresenta efeito Custer. Outra característica destes gêneros

são a presença do sistema coenzima Q-9 (van der Walt, 1984a; van der Walt, 1984b). A coenzima Q-9 difere da coenzima Q-10, mais comum em mamíferos, por possuir nove unidades de isoprenóides (C5H8)9-H) em sua cadeia lateral. Ambas estão envolvidas no

Tabela 5. Assimilação de açúcares pelas espécies Dekkera (van der Walt, 1984a) e

Brettanomyces (van der Walt, 1984b).

Leveduras Gal* Sac Mal Cel Tre Lac Raf Amisol Dxilo

D. bruxellensis - + + - + - +F - -D. intermedia + +L +L + + - V - -Br. abstinens + - - + - - - - -Br. anomalus + + + + + + +L - -Br. bruxellensis - + + - + - +F - -Br. claussenii - + + + + + +F - -Br. custersianus -/+F +F -/+F - + - - - -Br. custersii + + + + + +L +L - -Br. intermedius + + + + + - V - -Br. lambicus +L + + - + - - - -Br. naardenensis +L - + + + - - +L +

Leveduras Larab Dribo Rama Eritr Ribi Dmani Succ Citr Inosi

D. bruxellensis - V - - V - V - -D. intermedia - V - - V - V - -Br. abstinens - - - -Br. anomalus - V - - V - V - -Br. bruxellensis - V - - V - V - -Br. claussenii - V - - V - V - -Br. custersianus - V - - V - + - -Br. custersii - +L - - V - +L - -Br. intermedius - V - - V - V - -Br. lambicus - - +L - - - V - -Br. naardenensis - - V - V + + - -*

Gal= galactose; Sac= sacarose; Mal= maltose; Cel= celobiose; Tre= trealose; Lac= lactose; Raf=

rafinose; Amisol= Amido solúvel; Dxilo= D-xilose; Larab= L-arabinose; Dribo= D-ribose;. Rama=

ramanose; Eritr= eritritol; Ribi= Ribitol; Dmani= D-manitol; Succ= ácido succínico; Citr= ácido cítrico; Inosi= inositol; (-) = negativo; (+)= positivo rápido; (+F)= positivo fraco; (V)= variado; (+L)= positivo lento; (-/+F)= negativo ou positivo fraco.

processo de transporte de elétrons. Linhagens de Metschnikowia koreensis sp. nov também possuem ubiquinona Q9 e Q8 (Hong et al., 2001). Coenzima Q existe nas

diversas formas de vida, desde bactérias a mamíferos. As coenzimas Q-6, Q-7 e Q-8 são mais comuns em leveduras e bactérias. A coenzima Q-9 é mais comumente encontrada em ratos (Tran et al., 2001).

Chaves para identificação

Brettanomyces

A chave indicada para a identificação das espécies do gênero Brettanomyces estabelecida por van der Walt (1984a) segue a rotina: (entrar com o diagrama)

Dekkera

A chave para as espécies de um determinado gênero serve para facilitar o trabalho e orientar os passos no processo de identificação. A complexidade da chave depende da quantidade de espécies que possui o gênero. Assim, poderá haver diferentes chaves de acordo com os diferentes critérios de agrupamento das espécies no gênero Dekkera (Tabelas 1 e 2). Para este gênero, a chave mais simples corresponde àquela determinada por van der Walt (1984a):

Como Molina et al. (1993) e Barnett et al. (1990) consideram quatro espécies para o gênero Dekkera (D. bruxellensis, D. anomala, D. naardenensis e D. custersiana), a chave sugerida para as espécies é mais complexa. Molina et al. (1993) estabeleceram a

seguinte rotina para a identificação:

Dificuldades referentes aos testes bioquímicos

Considerando apenas as provas bioquímicas, seriam estes os testes mais simples para se caracterizar as espécies dos gêneros Dekkera e de Brettanomyces. No entanto, alguns inconvenientes podem surgir especialmente com aquelas espécies que se mostram fraco positivo (+f) e, pior ainda, os casos variáveis (v) e nos casos "negativo, podendo ser fraco positivo"(-/+f). Ainda assim, há diferença de interpretação dos resultados entre os divulgados por van der Walt (1984b) e Barnett et al. (1990). Por exemplo, Br. naardenensis, segundo Barnett et al. (1990), não fermenta a galactose. Para van der Walt (1984b), esta espécie pode apresentar resposta negativa ou positiva fraca (-/+F). Os testes bioquímicos devem ser acompanhados das características macroscópicas e especialmente microscópicas. Este acompanhamento deverá ser realizado por pessoas experimentadas e com conhecimento de estruturas celulares. Além disso, são necessários microscópios e pessoal treinado para operar e reconhecer as características fundamentais que levem à complementação da identificação. Mesmo demorados, Mitrakul et al. (1999) ressaltam ser os testes fisiológicos úteis mas que, para diversas linhagens, é uma técnica que dá resultados ambíguos. A prática mostra e os relatos confirmam ser o trabalho e o tempo gasto em obter os resultados e a ambigüidade de características fisiológicas observadas, as maiores desvantagens deste método de identificação de levedura.

Fig. 14. Identificação de Brettanomyces. F+, fermentação positiva; F-, fermentação negativa; A+, assimilação positiva; A-, assimilação negativa .

Fig. 15. Identificação de Dekkera segundo van der Walt (1984a). C+, crescimento; C-, não

Fig. 16. Identificação de espécies do gênero Dekkera . F+, fermentação positiva; F-,

Metabólitos específicos - Teste VPR

A capacidade de uma cultura de levedura de formar etil-fenóis a partir de ácido p-cumárico é uma característica dos gêneros Dekkera e Brettanomyces e se deve à atividade da enzima vinil-fenol redutase (VPR) (Chatonnet et al., 1999). A formação de 4-etil-fenol por uma determinada colônia de leveduras se dá em 24 horas e pode ser detectada por cromatografia gasosa. Este teste permite confirmar a presença de células viáveis destes dois gêneros.

Engarrafar vinhos sem células viáveis de Dekkera e Brettanomyces não é uma tarefa simples. O importante é não permitir que seu número atinja valores que ponham em risco a qualidade do vinho. O número de células que pode estar presente sem que afete

significativamente o vinho vai se alterar de vinho para vinho. Acompanhar a evolução mensal de etilfenóis nos vinhos é uma importante medida para avaliar a atividade destes microrganismos e permitir que se tomem decisões para impedir o aumento da

concentração deste metabólito. Um aumento nos teores de etil-fenóis é um forte indicativo de que o microrganismo está encontrando condições de aumentar sua população e que, se não forem tomadas as devidas providências, a qualidade do vinho será severamente afetada. Quando houver aumento no teor de etil-fenol, é necessário medir a concentração de SO2 e corrigi-la se necessário. Chatonnet et al. (1999) mostraram que, dependendo

da concentração de etil-fenol, é suficiente corrigir a quantidade de SO2 livre para se deter

o avanço na formação de etil-fenol. Um vinho armazenado em barricas iniciou um ligeiro aumento no teor de etil-fenóis. O teor de etil-fenóis, neste vinho, passou, em um mês, de quase zero para 100 µg/L. Ao mesmo tempo, a concentração de SO2 neste vinho era de

15 mg/L. A correção para 25 mg/L foi suficiente para parar o aumento na formação de etil-fenol. Um outro vinho apresentou um forte aumento na concentração de etil-fenol. Dentro de um mês, a concentração de etil-fenóis passou de aproximadamente 100 µg/L para 430 µg/L. A concentração de SO2 neste vinho era de 12 mg/L. Neste caso, além de

aumentar o teor de SO2 para 30 mg/L, outros tratamentos foram efetuados, entre os quais

a desinfecção da barrica. Dois meses após, a concentração de etil-fenol tinha se estabilizado em 430 µg/L. O mesmo vinho tinha permanecido na barrica sem sofrer intervenção. No mesmo período, este vinho atingiu a concentração de etil-fenóis de 1.780 µ g/L e mostrou uma alteração profunda em seu perfil aromático.

Meios de cultura

A procura por meios diferenciais para detectar Dekkera e Brettanomyces é uma constante. As exigências nutricionais e as características fisiológicas das espécies pertencentes a estes dois gêneros não são uniformes. Sulfato de amônio acima de 2 g/L inibe o crescimento de Brettanomyces bruxellensis e extrato de levedura estimula o crescimento (Uscanga et al., 2000). Os autores mostraram haver até mesmo alteração morfológica das células da referida levedura quando o extrato de levedura era omitido. Rodrigues et al. (2001) avaliaram diversos meios de cultura para a detecção de Dekkera e Brettanomyces e verificaram que os meios bacteriológicos não permitiam o crescimento das linhagens de Dekkera testadas e que a adição de fucsina não proporcionava a

diferenciação esperada.

Na verdade, esta levedura parece preferir ambientes ricos em etanol e açúcares fermentescíveis, habitar locais com adequada quantidade de biotina e tiamina ou viver

onde microrganismos formadores e doadores de vitaminas costumam se desenvolver. Brettanomyces por exigir determinados ingredientes nutricionais e por apresentar crescimento lento, não deve ser um microrganismo de distribuição na natureza tão

abrangente quanto Saccharomyces e outros gêneros. Embora van der Walt & van Kerken (1961) tenham tido êxito no isolamento de Dekkera e Brettanomyces, outros

pesquisadores verificaram ser o meio preconizado por van der Walt & van Kerken (1961), contendo actidione (50 µg/mL), sorbato de potássio (500 µg/mL) ou etanol (0-16%), inadequado para o crescimento destes dois gêneros (Wright & Parle, 1974; Licker et al., 1998).

Wright & Parle (1974) desenvolveram um meio de cultura seletivo para o crescimento rápido de espécies Dekkera e Brettanomyces, conseguindo crescimento de

Brettanomyces intermedius depois de 1 a 4 semanas. O meio possui a seguinte composição em 100 mL de meio: • 20 g sacarose • 0,7 g (NH4)2HPO4 • 0,4 g (NH4)2SO4 • 0,4 g K2SO4 • 0,3 g de extrato de levedura

• ajustar o pH para 4,0 com ácido tartárico

Com este meio de cultivo, Wright & Parle (1974) observaram uma porcentagem mais elevada de vinhos tintos de híbridos (14%) com Dekkera e Brettanomyces que de viníferas (10%). O mesmo ocorreu com vinhos brancos. A porcentagem de vinhos brancos com Dekkera e Brettanomyces foi maior nos vinhos brancos elaborados com híbridos (22%) que com viníferas (18%). Isto talvez se deva ao maior cuidado que se tem ao elaborar e conservar os vinhos de viníferas.

O tempo para se detectar Dekkera e Brettanomyces é um dos fatores limitantes no processo de detecção. Wright & Parle (1974) obtiveram colônias depois de 14 dias de incubação. É possível detectar colônias de Dekkera e Brettanomyces em menos tempo. Com um meio denominado BretII, foi possível observar o aparecimento pequenas

colônias de uma espécie de Brettanomyces em vinhos brasileiros (dados não publicados, G. A. da Silva Embrapa Uva e Vinho) em três dias. Este meio, que ainda está sendo objeto de estudo, foi incubado a 25 °C.

Quanto à fonte de carbono, Rodrigues et al. (2001) testaram, com o meio mineral definido por van Uden (1967), a glicose (2% p/v) com 10 mg/L de cicloeximida e 250 mg/L de ácido sórbico, a sacarose (2% p/v) com 10 mg/L de cicloeximida e 250 mg/L de ácido sórbico, a maltose (0,5% p/v) com 50 mg/L de cicloeximida e 500 mg/L de ácido sórbico e o etanol (0,6% v/v) com 10 mg/L de cicloeximida. O ácido p-cumárico foi adicionado a todos os meios. O meio mineral independentemente da fonte de carbono não resultou em diferenciação satisfatória. No meio GYP com glicose, etanol e ácido p-cumárico e no meio GYP com apenas etanol em diferentes concentrações (0,6%, 6,0% e 10%) e ácido