COLONIZAÇÃO, ESPORULAÇÃO E
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E
MOLECULAR DE FUNGOS MICORRÍZICOS
ARBUSCULARES MANTIDOS EM CULTURA
CÂNDIDO BARRETO DE NOVAIS
CÂNDIDO BARRETO DE NOVAIS
COLONIZAÇÃO, ESPORULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE FUNGOS MICORRÍZICOS
ARBUSCULARES MANTIDOS EM CULTURA
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Ciência do Solo, para a obtenção do título de “Mestre”.
Orientador
Prof. Dr. José Oswaldo Siqueira
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL 2008
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central da UFLA
Novais, Cândido Barreto de.
Colonização, esporulação e caracterização fenotípica e molecular de fungos micorrízicos arbusculares mantidos em cultura / Cândido Barreto de Novais. -- Lavras : UFLA, 2008.
73 p. : il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2008. Orientador: José Oswaldo Siqueira.
Bibliografia.
1.Formononetina. 2.Esporulação. 3.PCR-DGGE. 4.Caracterização genotípica. 5.Caracterização fenotípica. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD – 631.46
CÂNDIDO BARRETO DE NOVAIS
COLONIZAÇÃO, ESPORULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE FUNGOS MICORRÍZICOS
ARBUSCULARES MANTIDOS EM CULTURA
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Ciência do Solo, para a obtenção do título de “Mestre”.
APROVADA em 27 de março de 2008
Dr. Francisco Adriano de Souza Embrapa
Dra. Fernanda Covacevich FIBA
Prof. Dr. José Oswaldo Siqueira UFLA
(Orientador)
Aos meus pais Clodoaldo† e Maria e aos meus irmãos por
serem meu refúgio, meu alicerce, meu porto seguro.
OFEREÇO
A minha irmã Jackelyne Novais e a meu querido amigo Evandro
Costa, por todo apoio, carinho, respeito e cumplicidade.
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal de Lavras, em especial ao Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo, pela oportunidade de realização do curso;
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos;
Ao CNPq pelo financiamento do projeto;
Ao professor José Oswaldo Siqueira, pela orientação, apoio e confiança durante o Mestrado;
Aos professores do Departamento de Ciência do Solo;
A professora Fátima Maria de Souza Moreira pela colaboração e cordialidade durante todo o mestrado;
Ao pesquisador Francisco Adriano de Sousa pela co-orientação e por ter possibilitado o suporte para as realizações das análises moleculares na Embrapa Agrobiologia;
Aos funcionários Marlene Aparecida de Souza e Manuel Aparecido da Silva, por toda amizade e colaboração para a execução deste trabalho;
Ao pesquisador Orivaldo José Saggin Júnior pela orientação na iniciação científica, pelo direcionamento, apoio, e principalmente pela amizade, oportunidades, confiança e consideração;
A pesquisadora Eliane Maria Ribeiro por todo apoio e carinho; Ao técnico Itamar Garcia por toda amizade e colaboração;
Aos amigos da Embrapa Agrobiologia: Isabel, Fernanda Carvalho, Glória, Francys, Carol, Veralú, Paulo Ivan e em especial a Fernanda Covacevich por toda ajuda e atenção e a meus grandes amigos Wardsson e Gabriel por todo apoio que me deram;
Aos amigos Levy, Jonas, Fabiano Freire e Fabiano Duarte, companheiros de república, por toda convivência e amizade;
Aos amigos adquiridos durante o curso, Lucélia, Cléide, Silvia, André, Eduardo, Silvio, Douglas, Taís, Michele, Ligiane, Plínio, José Geraldo, Alice, Adriana,
Éderson, Yvonei, Pedro, Maíra, Paulo, Bruno Dias, Évio, Euzelina, Ênio, Rogério, Leandro, Paula, Valdete, Vitória, Jerusa, Sheila, Daniela, Maurício, Josinaldo, Cris, Daiane, Naty, Marlon, Gra, Gil, Alexandre, Douglas e Rossi; As grandes amigas Krisle, Meire, Gláucia e Amanda, que foram minha família durante esse tempo, enchendo minha vida de alegria, sem dúvida alguma vocês são o mais precioso presente de Deus em minha vida, amo vocês;
Aos grandes amigos e amigas, Carlos (Bahiano), Carlos (Lambari), Paulo, Khalil, Hernandes, Alexandre, Afrânio, Wallace, Ronan, Roberto, Carla, Priscila, Prescila, Ana Amélia, Galzerano, Fernando e Alexandre;
Às pessoas mais importantes em minha vida, Renata e Michelle, por cada minuto de cumplicidade que construímos, e por todos os momentos felizes e também árduos nos quais vocês estiveram sempre ao meu lado, tenham a certeza de que amo muito vocês;
Aos grandes amigos, Rafaell, Leonardo e Wardsson por toda convievência e amizade durante e posterior a graduação;
A família 513, em especial ao Evandro, Patusso, Erick, Deivison, Cayrê, Mauricio, André, Rafael, Renato e Wilmar por ter me acolhido durante todo esse tempo, e principalmente por toda amizade e consideração;
Agradecimento especial a meu grande amigo Evandro que durante todos esses anos tem sido um grande irmão, com quem tenho compartilhado cada momento de minha vida, saiba que é imensa a minha consideração e admiração por você. Agradecimento especial a meu amigo Paulo Boa Sorte por todo apoio, amizade e consideração;
Aos meus pais, Clodoaldo† e Maria, e a meus irmãos, Jackelyne, Karina, Cida,
Célia, Neidelene, Reinaldo, Luiz e Renan por todo apoio, carinho e por serem responsáveis por tudo que sou, amo vocês;
A minha irmã Jackelyne, por sempre acreditar em mim, me apoiando e dando suporte para cada etapa da minha vida, por proporcionar-me entusiasmo e confiança. Com certeza irei compartilhar contigo cada conquista, amo você; A Deus por ter colocado todas essas pessoas maravilhosas em meu caminho e por todas as oportunidades de minha vida;
SUMÁRIO
RESUMO... i
ABSTRACT... ii
1 INTRODUÇÃO... 1
2 REFERENCIAL TEÓRICO... 4
2.1 Os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs)... 4
2.2 Colonização e esporulação em vasos de cultivo... 5
2.3 Identificação e classificação do FMAs... 8
2.4 Emprego de técnicas moleculares em estudos de FMAs... 16
3 MATERIAL E MÉTODOS... 20
3.1 A Multiplicação dos FMAs... 20
3.2 Caracterização morfológica dos isolados... 23
3.3 Caracterização molecular dos isolados... 24
3.4 Análises... 27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 28
4.1 Esporulação dos isolados de FMAs ... 29
4.2 Caracterização morfológica dos isolados de FMAs... 33
4.2.1 DCS 02 e 30-Isolados de Acaulospora delicata (Walker, Pfeiffer e Bloss, 1986) 37 4.2.2 DCS 23 – Acaulospora morrowiae (Spain & Schenck)………. 39
4.2.3 DCS 03 -Kuklospora colombiana (Spain & Schenck) Oehl & Siever ding……….. 40
4.2.4 DCS 11, 12 e 13 -Glomus etunicatum (Becker & Gerdemann, 1977) .. 43
4.2.5 DCS 09 e 10 -Glomus clarum (Nicolson & Schenck, 1979) ... 45
4.2.6 DCS 06, 24, 31 e 32 - Isolados de Glomus diaphanum (Morton & Walker, 1984)... 47
4.2.7 DCS 08 - Gigaspora margarita (Becker & Hall, 1976)... 49
4.2.8 DCS 22 - Gigaspora albida (Schenck & Smith, 1982)... 51
4.2.9 DCS 05 - Gigaspora gigantea (Nicolson & Gerdemann) Gerdemann & Trappe, 1974……….. 52
4.2.10 DCS 19- Scutellospora heterogama (Koske & Walker, 1985)... 54
4.2.11 DCS 18- Scutellospora gregária (Schenck & Nicolson) Walker & Sanders (1986)………... 14
4.2.12 DCS 27- Scutellospora rubra (Stürmer & Morton, 1999)... 57
4.3 Analise de PCR-DGGE... 58
5 CONCLUSÕES... 63
i RESUMO
NOVAIS, Cândido Barreto de. Colonização, esporulação e caracterização fenotípica e molecular de fungos micorrízicos arbusculares mantidos em cultura. 2008. 73p. Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG1.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação do isoflavonóide formononetina na colonização e esporulação, e caracterizar fenotipicamente e genotipicamente por meio de PCR-DGGE 36 isolados de fungos micorrízicos arbusculares mantidos em vasos de cultivo na coleção do Laboratório de Microbiologia do Solo do Departamento de Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras, Minas Gerais, Brasil. O estudo foi conduzido em vasos de cultivo (500g) com Brachiaria decumbens em mistura desinfestada de solo e areia (2:1). O efeito da formononetina foi avaliado pela aplicação de 1mg por
vaso de MycoformTM (produto comercial da PHC, Inc) ao solo por ocasião da
repicagem das plantas e inoculação e aos dois meses de crescimento, em comparação a um tratamento sem a aplicação do produto. Os tratamentos foram dispostos em delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições. A colonização das raízes e a densidade de esporos em amostras coletadas diretamente dos vasos foram avaliadas após cinco meses de crescimento. A caracterização fenotípica e molecular foi conduzida para os isolados que foram capazes de multiplicar. A analise molecular foi feita com base na discriminação específica da região V9 do 18S rDNA. A colonização e esporulação variou muito dentre e entre as espécies e os isolados puderam ser agrupados em aqueles que esporularam abundantemente, moderadamente e fracamente. Treze isolados demonstraram sucesso na multiplicação e 31% destes isolados responderam a
aplicação de MycoformTM aumentando a taxa de colonização em até 27% e 54%
tiveram sua esporulação aumentada em até 54%. A caracterização morfológica dos esporos está de acordo com as descrições originais das respectivas espécies. A avaliação molecular por PCR-DGGE também permitiu a diferenciação das espécies e não revelou qualquer diferença entre os isolados da mesma espécie corroborando com a identificação fenotípica.
________________________
ii ABSTRACT
NOVAIS, Cândido Barreto de. Colonization, sporulation and phenotypic and molecular characterization of arbuscular mycorrhizal fungi kept in host culture. 2008. 73p. Dissertation (Master degree in Soil Science) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG1.
The aim of this study was to evaluate the effect of the isoflavonoid formonometin on the colonization and sporulation, and characterize phenotypicaly and genotypically through PCR-DGGE 36 arbuscular mycorrhizal fungi isolates from the collection of Soil Microbiology Laboratory, Department of Soil Science of Federal Lavras University, Minas Gerais, Brazil. The study was conducted in pots (500g) with Brachiaria decumbens in a disinfested soil/sand mixture (2:1). The effect of formonometine was evaluated through the application of 1 mg of MycoformTM (commercial product of PHC, Inc) into the
soil in each pot at planting and inoculation and after two months of growth, comparing with a treatment without the product. The treatments were layed out in a completely random design with five replicates. it The root colonization and the spore density of samples collected directly from the pots were evaluated after five month of growth.Phenotypic and molecular characterization was conducted for the isolates that were able to multiply. The molecular analysis was made through the discrimination of the specific V9 region in the 18S rDNA. Colonization and sporulation varied a lot, both between and within the species and the isolates could be grouped on clusters that sporulated abundantly, moderately and sparsely. Thirteen isolates showed successful multiplication, 31% of these isolates responded to the application of MycoformTM, increasing
the colonization rate up to 27% and 54% had the sporulation increased up to 54%. The morphological characterization of the spores is in accord with the original descriptions of the species. The molecular evaluation by PCR-DGGE also allowed the differentiation of the species and did not reveled any differences between the isolates of the same species, in agreement with the phenotypic characterization.
_____________________
1
1 INTRODUÇÃO
Em decorrência da importância da biota e dos processos biológicos para a produção agrícola e da necessidade de se reabilitar ecossistemas degradados pela atividade humana, há grande interesse em estudos sobre a biologia e os efeitos benéficos da inoculação de Fungos Micorrízicos Arbusculares (FMAs), no crescimento e desenvolvimento de plantas. Entre os trabalhos pioneiros da micorrizologia moderna se destacam os estudos desenvolvidos por Mosse, Gerdeman e Nicolson nas décadas de 60 e 70, atualmente, numerosos trabalhos tem sido desenvolvidos em vários países. No entanto, grande parte destes tem sido redundantes, pois têm abordado apenas aspectos benéficos destes fungos no crescimento de plantas, havendo uma grande carência de estudos sobre caracterização de estirpes, e de ensaios comparativos de diferentes isolados geográficos, bem como dos aspectos filogenéticos e da natureza simbiótica destes organismos. Isto pode ser atribuído à impossibilidade de crescimento desses fungos em meios de cultura na ausência de raízes metabolicamente ativas e a não caracterização da fase sexuada em seus ciclos de vida o que dificulta, em muitas pesquisas com esse grupo de fungos. Com isso, a identificação e classificação destes fungos têm sido baseadas, quase que exclusivamente, nas características morfológicas e estruturais de seus esporos vegetativos (Morton & Benny, 1990). Entretanto, a identificação morfológica não possibilita uma fácil distinção das diferentes espécies de FMAs, e durante a fase simbiótica micelial nos tecidos radiculares não permite a distinção de espécies em comunidades complexas. Além disso, a identificação morfológica pode ser influenciada por condições locais e pela diferença de maturidade dos esporos introduzindo problemas para identificação precisa de FMAs e para a otimização da simbiose em campo, comprometendo assim, o desenvolvimento de estudos básicos, tais
2
como àqueles ligados à competição, sobrevivência, dispersão, e eficiência, quando executados em comunidades complexas, como as encontradas em solos tropicais (Salles & Souza, 1998).
Existe grande dificuldade na obtenção de inóculo básico de boa qualidade e em quantidade suficiente para estudos de identificação e trabalhos de pesquisa sobre fisiologia, eficiência simbiótica e dependência micorrízica, e principalmente para o desenvolvimento de inoculante comercial. A disponibilidade de diferentes espécies de FMAs em coleções de cultura é importante para o desenvolvimento tecnológico e para o estudo da biologia e aplicação dos FMAs. As estirpes são a base para o desenvolvimento de estudos básicos e aplicados. As dificuldades para multiplicação em grande quantidade e manutenção das culturas têm limitado a diversidade nas coleções, mesmo em vaso de cultivo (Juge et al., 2002). Espécies cuja multiplicação é tida como dominada, às vezes mostram problemas de multiplicação, havendo necessidade de estudos sobre os fatores que controlam a multiplicação destes fungos.
A descoberta de metabólitos vegetais estimulantes dos FMAs e da colonização micorrízica das plantas, como o isoflavonóide formononetina, que estimula o crescimento de hifas na fase de pré-infecção facilitando a penetração e colonização das raízes (Siqueira et al., 1991; Nair et al., 1991; Davies et al., 1999; Koide et al., 1999) pode representar uma alternativa para melhorar a multiplicação de FMAs em vaso de cultivo e possibilitar a multiplicação de diferentes espécies destes fungos.
O interesse pela taxonomia morfológica tem diminuído devido às dificuldades de compreensão das estruturas subcelulares, o que exige bom conhecimento taxonômico, e pelos avanços na aplicação de técnicas moleculares, havendo necessidade de aperfeiçoamento de métodos de caracterização e diferenciação de espécies rápidos e confiáveis, que despertem o interesse dos pesquisadores, pois à medida que os estudos com FMAs estão
3
avançando fica cada vez mais evidente a importância da filogenia para o entendimento destes fungos.
Com o advento dos métodos baseados nas moléculas de DNA e RNA, principalmente aqueles baseados no emprego da reação em cadeia da polimerase (PCR), a qual permite a amplificação do DNA a partir de uma pequena amostra, tornou-se possível a identificação de FMAs tanto em vida livre no solo como também durante a fase simbiótica micelial nos tecidos radiculares (Helgason et al., 1998; Tuinen et al., 1998a; Kjoller & Rosendahl, 2000; Kowalchuk et al., 2002).
Assim, o desenvolvimento de técnicas para a identificação taxonômica, associadas a novas ferramentas da biologia molecular são pontos de grande importância para sustentar às pesquisas com FMAs no país, que é um grande centro de biodiversidade destes fungos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação do isoflavonóide estimulante das micorrizas (formononetina) na colonização e esporulação, e caracterizar fenotipicamente e por meio de PCRDGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis -Eletroforese em gel com gradiente de denaturação) 36 isolados de fungos micorrízicos arbusculares mantidos em vasos de cultivo na coleção do Laboratório de Microbiologia do Solo do Departamento de Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras, Minas Gerais, Brasil.
4
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs)
A micorriza arbuscular é uma simbiose mutualística entre raízes da maioria das plantas e fungos do filo Glomeromycota (Schüßler et al., 2001a). Esta simbiose se caracteriza pela penetração inter e intracelular das células do córtex radicular e formação de estruturas intracelulares denominadas arbúsculos (Douds & Millner, 1999). É uma das simbioses mais importantes entre microrganismos e plantas (Smith & Read, 1997) e é tida como a mais abundante na natureza, ocorrendo na maioria das plantas, inclusive inúmeras espécies de grande valor econômico e ecológico, e na maioria dos ecossistemas vegetais, apresentando ampla distribuição geográfica ocorrendo desde regiões polares até os tropicais úmidos ou desertos. A maioria das angiospermas, pteridófitas e numerosas briófitas formam micorrizas arbusculares (Trappe, 1987). Isto se deve ao fato dos FMAs terem sido fundamentais para o estabelecimento das plantas no ambiente terrestre (Pyrozynski & Malloch, 1975; Simon et al., 1993; Simon, 1996). O registro fóssil mais antigo de esporos de FMAs data de 460 milhões de anos, com base nesse registro a origem dos FMAs foi estimada para 600 milhões de anos (Redecker et al., 2000), no entanto, existem outras estimativas que datam de 1200 a 1400 anos atrás (Heckman et al., 2001).
Os FMAs são componentes importantes dos sistemas vegetais terrestres, apresentando também grande potencial para produção agrícola. Esses organismos podem favorecer o crescimento, e a capacidade reprodutiva das plantas (Lu & Koide, 1994), bem como tolerância ao estresse hídrico (Gupta & Kumar, 2000) e resistência a doenças (Declerck et al., 2002), competição inter e intra-específica (Fitter & Garbaye, 1994). O benefício principal para a planta hospedeira nesta simbiose é o aumento da absorção de nutrientes, especialmente os de baixa mobilidade no solo como o fósforo, isto devido a um aumento de sua
5
capacidade em explorar o solo, tanto em área de superfície de contato quanto em volume (Moreira & Siqueira, 2006; Jakobsen, 1999). Estes fungos também interagem com outros organismos do solo, tais como rizóbios envolvidos em importantes ciclos de nutrientes, desta forma, a fixação biológica de nitrogênio por leguminosas pode ser aumentada pela co-infecção com FMAs (Xavier & Germida, 2002).
2.2 Colonização e esporulação em vasos de cultivo
Os FMAs são biotróficos obrigatórios, dependentes de raiz metabolicamente ativa para o fornecimento de carboidratos e para completar seus ciclos de vida (Siqueira et al., 1985). Os esporos são unidades biológicas em estado de quiescência que precisam ser ativados para desencadear os processos normais da biologia celular e as funções metabólicas que sustentam sua germinação e crescimento subseqüente da fase filamentosa (Moreira &
Siqueira, 2006). Eles persistem no solo e germinam espontaneamente usando
suas próprias reservas, que são metabolizadas pelo metabolismo catabólico. Entretanto, o crescimento da hifa é limitado pela utilização destas baixas quantias de carbono armazenado (Bécard & Piché, 1989; Bago et al., 1999; Bago et al., 2000), assim, após certo período de crescimento, começa a formar septos na hifa a partir do ápice, o citoplasma recua e o esporo entra em dormência novamente, evidenciando sua necessidade obrigatória às células vivas do hospedeiro. Contudo, em algumas espécies, o esporo contém reservas suficientes para realizar múltiplas germinações aumentando as chances de encontrar um hospedeiro apropriado (Koske, 1981). Segundo Moreira & Siqueira (2006) não se conhece o mecanismo exato pelo qual esses esporos são ativados a germinar. No entanto, já se tem evidencias de que antes da colonização ocorre uma troca de sinais moleculares, “o fungo reconhece seu hospedeiro, e lhe responde de modo positivo em potencial, produzindo e
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diferenciando seu micélio assimbiótico, mesmo sem o contato físico com o hospedeiro. Do mesmo modo, o fungo é capaz de produzir sinais difusivos que elicitam expressão específica nas raízes, como o gene regulado MtENOD11, que atua na síntese da parede celular e pode facilitar a penetração do fungo (Kosuta et al., 2003)”. Desta forma, indicando a existência de esporos “receptores responsivos” às alterações na composição química do ambiente (Giovanetti & Sbrana, 1998; Bécard et al., 2004; Harrison, 2005).
Várias substâncias que estimulam os propágulos dos FMAs têm sido encontradas nos exsudados das raízes de plantas suscetíveis à micorrização. Contudo, os exsudados de plantas deficientes em fosfato são mais estimulantes para os fungos micorrízicos que aqueles de plantas bem supridas em P, indicando a presença de substâncias estimulantes nas plantas deficientes, que serão mais suscetíveis à micorrização. Neste sentido, foi identificado a partir de raízes de trevo cultivadas em condições de deficiência de fosfato, o isoflavonóide formononetina (7- hidroxi, 4’-metoxi isoflavona) (Nair et al., 1991), que devido a sua baixa solubilidade em água é de difícil aplicação. No entanto, com o aperfeiçoamento da rota de síntese foram desenvolvidas as
formulações MyconateTM e MycoformTM que são mais apropriadas a aplicação
da formononetina em larga escala no solo (Nair et al., 1991).
Com a produção sintética da formononetina pôde-se observar o seu desempenho na comunicação e sinalização nas relações entre plantas e microrganismos, assim, através de estudos realizados in vitro verificou sua atuação como fator químico ativo capaz de estimular o crescimento assimbiótico de esporos de FMAs, crescimento de hifas na fase de pré-infecção ou indução do desenvolvimento de apressório e/ou formação de arbúsculo (Davies et al., 1999; Koide et al., 1999; Nair et al., 1997; Siqueira et al., 1991; Nair et al., 1991). Da mesma forma, Davies et al (2005) estudando a influência do flavonóide formononetina na atividade micorrízica e na produtividade de batata, relatou ter
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encontrado um grande aumento na esporulação de fungos micorrízicos indígenas quando aplicado a formononetina, expressando ainda mais a importância desse insumo biológico em aumentar a contribuição dos FMAs na produção agrícola.
A fase extra-radicular da simbiose está representada pela rede de micélio que cresce no solo, este micélio cresce simultaneamente à colonização intraradicular, funcionado como um sistema radicular complementar, muito efetivo na absorção de nutrientes e água além da zona de esgotamento do solo (Barea, 2000). É na fase extra-radicular que é produzido a maioria dos esporos, isoladamente ou em esporocarpos. Em algumas espécies, os esporos são também produzidos no interior das raízes como se dá em Glomus intraradices. Os estádios fenotípicos do ciclo da simbiose iniciam-se com a germinação dos esporos e são concluídos com a produção de novos esporos que garantem a sobrevivência do fungo. Verifica-se que para cada estádio ocorrem estímulos, respostas e mecanismos seqüenciados e fases distintas de controle específicos na planta (Moreira & Siqueira, 2006).
Os recentes progressos nos métodos de identificação e quantificação dos FMAs nos solos e dentro das raízes das plantas tem permitido esclarecer os fatores que influenciam sua distribuição e persistência no solo. O desenvolvimento da associação micorrízica vária com o pH, temperatura, tipo e profundidade do solo, vegetação e grau de perturbação do sistema (Wang et al., 1993), umidade, matéria orgânica do solo, práticas agrícolas como o uso de agroquímicos ou rotação de cultura (Jonson & Pfleger, 1993). A esporulação não tem influência direta do hospedeiro, mas têm relação com o grau de colonização, extensão de raízes e idade (ciclo) da simbiose e parece ser regulada pelo estado de senescencia da planta (Moreira & Siqueira, 2006).
8 2.3 Identificação e classificação do FMAs
A identificação das espécies de FMAs tem sido baseada na morfologia de seus esporos (Morton & Benny, 1990) que são as estruturas fúngicas que apresentam as melhores características para distinção de espécies, tais como a cor, forma, estruturas e ornamentações de paredes externas (Schenck & Perez, 1988). Entretanto, a caracterização morfológica pode ser influenciada por condições locais, tais como, maturidade e estado de conservação dos esporos. Dificuldade é somada pela ausência de chaves taxonômicas para espécies, assim como, por ter poucas informações detalhadas sobre as espécies e poucas fotos disponíveis no site do INVAM, e por geralmente os esporos coletados diretamente do campo estarem normalmente em baixa quantidade, parasitados e, em muitos casos, não possuírem todas as estruturas subcelulares intactas que permitem uma identificação das espécies.
A precisão das identificações morfológicas é muito dependente do nível de conhecimento taxonômico do técnico responsável pela analise, cada um dos gêneros dos FMAs esta definido por critérios relacionados com a forma em que se originam os esporos, sendo assim, cada um deles possui uma formação especial de esporos, e apresentam diferente morfologia nos pontos de conexão das hifas de sustentação ou de formação. O Quadro 1 apresenta as estruturas típicas dos esporos dos principais gêneros e algumas de suas características.
Os tipos e a organização das diversas estruturas subcelulares dos esporos de FMAs é a base para a identificação morfológica deste grupo de fungos. Walker (1983) propôs uma terminologia conceituando essas estruturas de “paredes” que foram definidas por fenótipos estáticos, como parede laminar, evanescente, unitária e membranosa, foram também definidas as paredes amorfa (Morton, 1986), expandida (Berch & Koske, 1986), coriácea (Walker, 1986) e parede entalhada (Koske & Gemman, 1995).
9
QUADRO 1 Esquema das estruturas típicas dos esporos dos gêneros dos FMAs e suas principais características.
Estrutura típica dos esporos
Características
*
Gênero Glomus (Tul. & C. Tul)
1. Os esporos formam-se terminalmente ou intercalado numa hifa fértil, cilíndrica ou alargada; 2. Organização subcelular:
. Parede do esporo (PE) com várias camadas (2 a 4) com fenótipos variáveis; . Esporos produzidos isolados, em agregados ou esporocarpos;
. Germinação pelo lúmen da hifa suspensora ou parede do esporo;
3. Presença de uma camada na PE com várias subcamadas (lâminas) continua com a parede da hifa suspensora;
4. Possui 104 espécies descritas
*
Gênero Acaulospora (Gerd. & Trappe emend. S.M. Berch) 1. Os esporos formam-se lateralmente no pescoço de um sáculo esporífero; 2. Organização subcelular:
. Parede do esporo com duas ou três camadas . Parede germinativa: sempre 2, com duas camadas cada; . Placa de germinação;
3. Esporos com ou sem ornamentação; 4. Possui 33 espécies descritas.
*
Gênero Entrofospora (Spain e Schenck)
1. Os esporos se desenvolvem dentro do pescoço de um sáculo esporífero e originam-se do conteúdo do sáculo.
2. Organização subcelular:
. Paredes do esporo com duas camadas.
3. O sáculo esporífero origina-se terminalmente ou intercaladamente numa hifa extraradicular. 2. Os esporos são encontrados isoladamente no solo.
4. Os esporos possuem duas cicatrizes.
*
Gênero Gigaspora (Gerd. & Trappe) 1. Esporos sem ornamentação;
2. Organização subcelular:
. Parede do esporo com duas camadas (L1 e L2); . Parede germinativa verrugosa ou nodosa 3. Células auxiliares “equinuladas”; 4. possui 9 espécies descritas
5. As espécies conhecidas apresentam grandes semelhanças morfológicas, as diferenças residem na cor e tamanho dos esporos (Bentivenga & Morton, 1995)
*
Gênero Scutellospora (C. Walker & F.E. Sanders) 1. Esporos com ou sem ornamentação;
2. Organização subcelular:
. Parede do esporo com duas camadas;
. Parede germinativa- 1 a 3, com duas camadas cada; . Escudo de germinação;
3. Células auxiliares “lobadas”; 4. Possui 33 espécies descritas
5. As diferenças entre espécies residem no fenótipo das camadas da parede do esporo (cor, ornamentação, etc.);
10 QUADRO 1, Cont.
Gênero Appendicispora (Spain, Oehl & Sieverd)
1. Esporos dimorficos, esporos são formados semelhantemente aos de Acaulospora e de Glomus; 2. Esporos do tipo Acaulosporoides se desenvolvem a partir de um “pedicel” formado no pescoço do sáculo esporífero.
3. Esporos do tipo Glomoides se desenvolvem terminalmente a partir de qualquer hifa desenvolvida da parede do “pedicel”.
4. Organização subcelular:
. Parede do esporo com três camadas
. Duas paredes germinativas uma com duas camadas firmemente aderidas e outra com três camadas;
. Germinação pelo tubo germinativo emergindo-se da segunda parede germinativa interna e saindo pelo poro do “pedicel”. Também foi encontrado estruturas germinativas formadas entre a primeira e a segunda pareede germinativa, diferente das estruturas germinativas de Acaulospora; 4. Possui 5 espécies descritas.
Gênero Archaeospora (Morton & Redecker)
1. Esporos dimorficos, esporos são formados semelhantemente aos de Acaulospora e de Glomus; 2. Esporos do tipo Acaulosporoides se desenvolvem diretamente do pescoço do sáculo esporífero. 3. Esporos do tipo Glomoides se desenvolvem intercaladamente em uma hifa fértil.
2. Organização subcelular:
. Uma parede do esporo e uma parede germinativa interna, consistindo em duas ou três camadas.
. Germinação através de um tubo germinativo emergindo de uma estrutura de germinação irregular;
4. Possui 1 espécie descrita.
*
Gênero Diversispora (Walker & Schuessler)
1. Os esporos se desenvolvem de uma hifa de sustentação semelhantemente aos esporos do gênero Glomus.
2.Os esporos são morfologicamente semelhantes aos esporos de Glomus sp. difereindo na micorriza, pois Diversispora não forma vesículas e cora menos com azul de tripano. 4. Possui 1 espécie descrita.
Gênero Intraspora (Sieverd. & Toro) Oehl & Sieverd
1. Os esporos se desenvolvem dentro do pescoço de um sáculo esporífero a uma certa distância do sáculo e originam-se do conteúdo do sáculo;
2. São globosos a subglobosos e frequentemente piriformes; 3. Organização subcelular:
. Parede do esporo composta por duas camadas;
. Parede germinativa interna semifléxivel e finamente lâminada 4. Os esporos são encontrados isolados no solo;
5. Os esporos possuem duas cicatrizes. 6. Possui 01 espécie descrita.
Gênero Pacispora (Oehl & Sieverding, 2004)
1. Os esporos formam-se terminalmente numa hifa esporogênica semelhantemente aos esporos do gênero Glomus.
3. Organização subcelular:
. Parede do esporo composta por 3 camadas; . Parede germinativa interna com três camadas;
. Na superfície da camada 1 da parede germinativa há a formação de um escudo germinativo, do qual emerge-se o tubo germinativo.
4. Os esporos são encontrados isolados no solo; 5. Os esporos possuem duas cicatrizes. 6. Possui 01 espécie descrita.
11 QUADRO 1, Cont.
*
Gênero Paraglomus (Tul. & C. Tul)
1. Esporos formam-se terminalmente numa hifa fértil semelhantemente aos esporos de Glomus sp.;
2. Organização subcelular:
. Parede do esporo com duas ou três camadas contínuas com a parede da hifa de sustentação; . Germinação pelo lúmen da hifa suspensora ou parede do esporo;
3. Esporos morfologicamente semelhantes aos esporos de Glomus sp. diferindo-se nas propriedades de suas micorrizas;
4. Possui 3 espécies descritas
Gênero Kuklospora (Spain e Schenck)
1. Os esporos se desenvolvem dentro do pescoço de um sáculo esporífero e originam-se do conteúdo do sáculo;
2. Organização subcelular:
. Parede do esporos com três camadas; . Duas paredes germinativas;
. Presença de uma camada “beaded” na parede germinativa;
3. O sáculo esporífero origina-se terminalmente ou intercaladamente numa hifa extraradicular; 2. Os esporos são encontrados isoladamente no solo;
4. Os esporos possuem duas cicatrizes; 5. Possui duas espécies descritas.
*Esquemas retirados do site http://bugs.bio.usyd.edu.au/Mycology/Plant_Inte ractions/Mycorrhizas/Arbuscular/sporeTypes.html
De acordo com a terminologia de Walker (1983) os esporos são formados por “grupos de paredes” e as espécies identificadas através do estudo dos esporos e da função de sua parede e grupos de camadas que a compõe, foram desenvolvidos uma série de representações esquemáticas (murogramas) simulando as possíveis características das paredes dos esporos (Quadro 2).
Posteriormente, Berch (1987) propôs que as estruturas discretas dos esporos fossem “camadas” que faziam parte de uma “parede do esporo”, tratando as estruturas subcelulares de forma equivalentes, assim, o termo “grupo de paredes” de Walker foi substituído por “parede”, parede do esporo e parede interna, por consistirem estruturas de origem independente nos esporos e por serem identificáveis por sua posição durante a ontogenia dos esporos (Franke & Morton, 1994). O termo “parede” de Walker foi substituído por “camada”, que é definida como uma estrutura fenotipicamente discreta que se origina dentro da parede do esporo e da parede interna.
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QUADRO 2 Representação esquemática das diferentes “paredes” que compõe o “grupo de paredes” de esporos de FMAs e suas principais características (Walker, 1983).
Tipos de Paredes (Walker, 1983) Murograma Foto
Parede Unitária
Parede rígida, com uma camada apenas, claramente distinta das outras e consistente entre esporos no mesmo estágio de maturidade dentro de uma espécie.
Parede Laminada
Parede rígida formada por várias camadas que vão sendo depositadas à medida que o esporo amadurece.
Parede Evanescente
Uma parede laminada ou unitária que vai se quebrando e cai à medida que o esporo amadurece.
Parede Membranosa
Parede muito fina, geralmente sem cor que freqüentemente fica enrugada e colapsa em soluções hipertônica. Sendo flexível, ela geralmente não se quebra quando o esporo é quebrado.
Parede Coriácea
Parede sem cor que é mais espessa que a parede membranosa, mas também é flexível e desta forma difícil de se quebrar. Tem uma aparência coriácea.
Parede Amorfa
Parede sem cor dentro dos esporos que é bastante plástica quando se aplica uma pressão para quebrar os esporos em PVLG. No Melzer torna-se vermelho púrpura (pode ser bem escuro).
Parede Germinativa
Parede mais interna que ocorre apenas nos esporos de Gigaspora. Fenótipo similar as camadas de uma parede laminada, mas possui protuberâncias em forma de verrugas ou papilas antes da germinação.
Parede Expansiva
Parede unitária que expande e produz estriações em PVLG.
Foto disponível no site: http://invam.caf.wvu.edu/
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“Embora as espécies de FMAs apresentem diferenças morfológicas, essas diferenças não são sempre evidentes, demandando tempo e conhecimento taxonômico do técnico responsável pela identificação, além disso é difícil interpretar as características fenotípicas dos esporos, tais como: tamanho, forma, cor e aparência, forma e comprimento da hifa de sustentação, ornamentação, estrutura e espessura da parede. No caso da composição das paredes, por exemplo, geralmente se enrugam, dobram ou sobrepõem-se, separam-se facilmente, ou permanecem aderidas entre si, o que dificulta sua caracterização” (Silva & Colozzi Filho, 2007).
As primeiras tentativas de classificar os FMAs foram feitas nofinal do século XIX e inicio do século XX, incluindo-os inicialmente na família Endogonaceae, dentro do Filo Zigomycota, devido à semelhança de seus esporos com os de Zigomycetos (Gerdemann & Trappe, 1974). Nos últimos anos a sistemática dos FMAs vem sofrendo inúmeras modificações, devido principalmente à incorporação de estudos moleculares na filogenia destes fungos. Segundo Morton & Benny (1990), aproximadamente 150 espécies de FMAs conhecidas estão incluídas na ordem Glomerales da classe zigomycota, distribuídos em seis gêneros e três famílias: Gigaspora e Scutellospora (Família Gigasporaceae), Glomus e Sclerocystis (Família Glomaceae) e Acaulospora e
Entrophospora (Família Acaulosporaceae).
A utilização de técnicas de biologia molecular têm superado as dificuldades da identificação in-situ dos FMAs, neste sentido, foram desenvolvidas várias estratégias baseadas em PCR, amplificando genes de rDNA para detectar FMAs em DNA extraído de raízes, solo, ou esporos (Helgason et al., 1998; Tuinen et al., 1998b; Kjoller & Rosendahl, 2000; Kowalchuk et al., 2002; de Souza et al., 2004; Ma et al., 2005; Renker et al., 2005). Tais estratégias permitem detectar esses fungos em todas as fases do ciclo de vida facilitando a compreensão da biologia e ecologia desse grupo de fungos.
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O uso de PCR-DGGE na identificação de espécies de FMAs tem representado um avanço na pesquisa com os FMAs, uma vez que abre possibilidades para usá-la de maneira rápida e segura para detecção de contaminação em vasos de cultivos e para identificação das espécies de FMAs. Entretanto, essa estratégia para a identificação de FMA é dependente da disponibilidade de padrões de bandas conhecidos de todas as espécies a serem identificadas.
Morton & Redecker (2001), considerando caracteres morfológicos e incluindo pela primeira vez evidências moleculares, propuseram duas novas famílias, que apresentam-se como basais na árvore filogenética dos FMAs: a primeira é a Archaeosporaceae, representada pelo gênero Archaeospora e que inclui espécies anteriormente consideradas como Acaulospora e Glomus (Glomus leptotichum), e a segunda Paraglomaceae representada pelo gênero
Paraglomus e que inclui espécies anteriormente consideradas como Glomus. Por
outro lado o gênero Sclerocystis foi extinto e todas as espécies foram reclassificadas para o gênero Glomus.
Estudos moleculares posteriores, também baseados no 18S rDNA, tem demonstrado a natureza monofilética, ou seja, um grupo de espécies derivadas de um único ancestral, deste grupo de fungos, o que tem permitido incluí-los em um novo filo, o Glomeromycota (Schussler et al., 2001a; Schussler et al., 2001b; Schwarzott & Schussler, 2001; Schwarzott et al., 2001), o qual é composto por uma única classe, Glomeromycetes, que por sua vez compreende quatro ordens: a) A orden Glomerales, que inclui a maioria dos membros da antiga família Glomaceae. b) A ordem Paraglomerales que possui uma única família Paraglomeraceae, antiga família Paraglomaceae. c) A ordem Archaeosporales que engloba a família Geosiphonaceae (não micorrízica), e as famílias Appendicisporaceae e Archaeoporaceae. d) A ordem Diversisporales que engloba as famílias Acaulosporaceae, Entrophosporaceae e Gigasporaceae,
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Diversiporaceae e Pacisporaceae. É importante ressaltar que devido o Gênero
Glomus apresentar características morfológicas e estruturais bem definidas,
mostra divergências filogenéticas importantes que tem implicado em sua subdivisão em pelo menos três grupos, nos quais inclui a ordem Glomerales: Glomeraceae Glomus-Grupo A (fungos agrupados junto a Glomus mosseae), e Glomeraceae Glomus-Grupo B (fungos agrupados junto a Glomus etunicatum) e um terceiro em Diversisporales (Glomus C) (Schwarzortt et al., 2001).
A identificação de espécies ou gêneros usando técnicas moleculares são dependentes da obtenção de primers que podem ser específicos ou universais. Os numerosos microrganismos que vivem em esporos de FMAs dificultam o estabelecimento de novos marcadores de seqüência para as subunidades ribossomais. Por outro lado o gene ribossomal por sua característica e função é muito conservado e devido a isso, a diferenciação de espécies utilizando esse gene, nem sempre é possível, o mesmo ocorre para a maioria dos organismos.
Para diferenciação de espécies outros genes ou regiões gênicas são mais indicadas. No entanto, os genes ribossomais tem sido largamente utilizados para reconstrução filogenética (Schüssler et al., 2001b; Schwarzott et al., 2001), citogenéticos (Harrison, 1999; Gianinazzi-Pearson et al., 2001), ecológicos (Helgason et al., 1998; Helgason et al., 2002; Husband et al., 2002a; Husband et al., 2002b; Kowalchuk et al., 2002), evolutivos (Sanders, 2002; Gandolfi et al., 2003) e funcionais desses organismos simbiônticos obrigatórios, pois permitem uma identificação dos FMAS.
Souza et al. (2004) constataram que algumas identificações feitas com base na morfologia dos esporos não correspondem com os padrões de bandas, das estirpes de referência para a espécie, obtidas via DGGE. Assim, as espécies
G. ramisporophora e G. candida que anteriormente foram consideradas pela
análise morfológica sinônimas de, respectivamente, Gigaspora margarita e
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verificou que essas espécies apresentam polimorfismo que as diferenciam claramente daquelas com as quais foram sinonimizadas. Baseado nesta análise, a espécie G. ramisporophora apresenta maior semelhança com G. albida do que com a G. margarita, apesar da morfologia não indicar isso. Indicando que a identificação via DGGE é mais confiável que a identificação morfológica, e que está ultima pode desencadear uma série de erros de identificação. Assim, os métodos ou estratégias que possam ser utilizadas para caracterizar FMAs sem o conhecimento prévio de sua morfologia serão certamente mais aplicáveis no futuro.
2.4 Emprego de técnicas moleculares em estudos de FMAs.
A maioria das técnicas moleculares empregadas na identificação de FMAs baseiam-se na utilização da reação em cadeia da polimerase (PCR), esta metodologia permite a amplificação exponencial e seletiva de um fragmento de DNA flanqueados por iniciadores, presentes em extratos de DNA em concentrações diminutas, ou seja, ela permite a amplificação do DNA a partir de uma pequena amostra do fungo. Esta técnica revolucionou o mundo científico e as suas aplicações são imensas: é usada no diagnóstico médico, mapeamento genético, detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade, identificação de “impressões digitais” genéticas, dentre outras. A PCR revolucionou várias áreas como a Biologia Molecular, Patologia, Farmácia, Botânica, Medicina Forense, Microbiologia e valeu o premio Nobel, em 1993, a Kary Mullis.
A finalidade da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima e para que isto ocorra, são necessários uma amostra de DNA que servirá de molde, quantidades adequadas de 2 oligonucleotídeos ou primers, que são as seqüências iniciadoras que determinarão as regiões a serem amplificadas, 4 deoxirribonucleotídeos,
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dATP, dGTP, dGTT e dCTP, que formarão a fita complementar; a enzima DNA polimerase termoestável, que promoverá a síntese das novas fitas e um tampão Tris contendo MgCl2 e KCl, que fornecerá as condições ideais para a atividade
desta enzima (Mullis, 1990; Mullis et al., 1994).
Bruns & Gardes (1993), afirmam que a região ideal para realizar amplificações de PCR devem cumprir com os seguintes critérios: a) Estar presente em todos os fungos de interesse: b) Serem fáceis de amplificar; c) Amplificar preferencialmente o DNA do fungo, quando este se encontra junto com o DNA da planta; d) Ser suficientemente variável para permitir desenhar primers para numerosas hierarquias taxonômicas.
Os genes que codificam para o rDNA atende muitos desses critérios, por isso tem sido comumente utilizado neste tipo de estudo. Dentre estes genes, as regiões codificadoras (18S, 5.8S e 28S) são as mais conservadas, as regiões internas (ITS) mostram um certo grau de variação, e as regiões intergênicas (IGS) são as mais variáveis (Figura 1) (Lanfranco et al., 1998).
FIGURA 1 Representação esquemática dos genes ribossomais no genoma eucarioto. As unidades do rDNA se encontram repetidas em seqüência e separadas entre si por regiões intergênicas (IGS). Em detalhe cada unidade de genes ribossomais é composta pelos genes 18S, 5.8S e 28S e a região contida entre estes é chamada de regiões internas (ITS). Adaptação de Lanfranco et al. (1998) feita por Salles & de Souza, (1998).
18
As seqüências da subunidade menor do gene ribossomal (18S rDNA) evoluíram muito lentamente, por isso são utilizadas para estudar a distancia evolutiva entre organismos que apresentam grande distâncias filogenéticas (White et al., 1990). No caso de FMAs Simon e colaboradores (1992a; 1992b; 1993a; 1993b) foram os primeiros a aplicarem técnicas de PCR ao estudo de genes nucleares codificadores da subunidade 18S rDNA, desenhando o primer (oligonucleotídeo) “especifico” de Glomales (atuais Glomeromicetos) capaz de amplificar o DNA fúngico em raízes colonizadas por este tipo de fungo. Estes autores realizaram também os primeiros estudos objetivando detectar polimorfismos neste grupo de fungos mediante SSCP (Polimorfismo Conformacional de Cadeia Simples).
Uma vez ampliado os fragmentos de DNA, existe uma variedade de técnicas para separar a mistura de seqüências ampliadas baseadas na desnaturação de fragmentos de DNA (Sanders et al., 1995; Speksnijder et al., 2001; Kowalchuk et al., 2002). A eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) é uma poderosa técnica de análise genética que pode ser usada para detectar diretamente modificações de uma única base e polimorfismos em DNA genômico, DNA clonal e DNA amplificado por PCR, trata-se de um método de separação eletroforético baseado em diferenças no comportamento de desnaturação de fragmentos de DNA de cadeia dupla. Esta separação se baseia em um princípio físico de que a mobilidade eletroforética do DNA em gel de poliacrilamida é sensível à estrutura secundária da molécula, com respeito à sua conformação, que pode ser, helicoidal, parcialmente desnaturada ou em fita simples. As moléculas parcialmente desnaturadas, compostas por partes em dupla hélice e partes em fitas simples, ao acaso, movimentam-se mais lentamente no gel do que as moléculas em fita dupla ou simples. Usando-se DGGE, pode-se detectar aproximadamente 50% das variações de seqüências em
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fragmentos com até 500 pares de bases (Myers et al., 1985). Esta porcentagem pode ser aumentada para quase 100% quando se acrescenta a um dos lados do fragmento de DNA um segmento rico em GC (“GC-clamp”). Esse “grampo de GC”, quando anexado à extremidade 5’ de um dos iniciadores, é amplificado por PCR juntamente com o DNA e introduzido no fragmento de DNA amplificado, agindo como domínio de alta temperatura de desnaturação, que impede a dissociação das duas fitas de DNA em fitas simples.
Seqüências de nucleotídeos obtidas podem ser comparadas com sequencias depositadas no GenBank. Os dados de sequencias podem ser usados então em análise filogenética para determinar relações evolutivas. Além disso, as seqüências podem ser usadas para refinar primers projetados para detectar uma gama de grupos taxonômicos a nível de gênero (para estudos de comunidade) para organismos isolados (para monitorar inóculo introduzido no solo).
Até obter mais conhecimento no campo da biologia molecular, a identificação dos FMAs ainda serão baseadas, fundamentalmente, na caracterização morfológica dos esporos. Isto torna a manutenção das coleções de espécies destes fungos de extrema importância para o avanço na identificação molecular em estudos futuros.
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3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 A multiplicação dos FMAs
Para a realização do presente estudo, primeiramente criou-se uma planilha reunindo todas as informações disponíveis de cada isolado pertencente a Coleção de Fungos Micorrízicos Arbusculares do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Ciência do Solo da Universidade federal de Lavras, a partir da qual selecionou-se 36 isolados (Tabela 1) dos quais foram coletadas amostras para avaliação de pureza e multiplicação dos isolados de FMAs. A avaliação da pureza foi feita mediante extração dos esporos de cada isolado selecionado, através do peneiramento úmido, conforme Gerdemann & Nicolson (1963). Após a extração dos esporos, estes foram transferidos para placa de petri e observados em microscópio estereoscópico, verificando se havia presença de mosfotipos diferentes. Uma vez constatado a pureza do isolado procedeu-se com uma nova extração, de forma que obtivéssemos no mínimo 3000 esporos para efeito da padronização e formação da suspensão de esporos de cada isolado para inoculação das plantas, conforme será descrito em seguida. Em decorrência da dificuldade de obtenção dos esporos em tempo hábil para a implantação do experimento no mesmo dia, os esporos ficaram mantidos em câmera fria a 4ºC.
Para o estudo, os isolados foram multiplicados em casa de vegetação do Departamento de Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras utilizando como planta hospedeira Brachiaria decumbens Stapf.. As plantas de Brachiaria
decumbnes foram inicialmente crescidas em vermiculita estéril e posteriormente
transplantadas, no momento da implantação do experimento, utilizando-se quatro plantas por vaso, colocadas na mesma cova.
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TABELA 1 Lista dos isolados da coleção de Fungos Micorrízicos Arbusculares da Universidade Federal de Lavras empregados neste estudo.
Código do vaso Novo código Espécie Origem do isolado
852 DCS 01 A. scrobiculata Café
29- 3SCFH3 DCS 02 A. scrobiculata Poços de Caldas-MG
253-UFLA DCS 03 K. colombiana Cerrado natural
J2-24* DCS 04 Glomus Thin green Amazonas- capoeira
789 DCS 05 G. gigantea B. decumbens
J2-24* DCS 06 Glomus Thin green Amazonas- mandioca
J3-38* DCS 07 G. etunicatum “Yellow” Amazonas -banana
527 DCS 08 G. margarita Milho
1 DCS 09 G. clarum U. Florida- B. decumbens
02-ULFA DCS 10 G. clarum Três Pontas-MG -Gramíneas
217-UFLA DCS 11 G. etunicatum Patrocínio - MG - café
64 DCS 12 G. etunicatum S. Seb. do Paraíso-MG-café
408 DCS 13 G. etunicatum Três Pontas – MG-café
212-UFLA DCS 14 G. etunicatum Lavras – MG-café
J4-50* DCS15 Glomus Thin green Amazonas - mandioca
95 DCS 16 A. spinosa Cerrado natural
28- CTOG3 DCS 17 A. spinosa Poços de Caldas-MG
4 DCS 18 S. gregaria U. Florida- algodão
108-UFLA DCS 19 S. heterogama U. Florida
812 DCS 20 S. pellucida Coleção do DCS - ESAL
J3-44* DCS 21 A. morrowiae Amazonas-floresta
03-UFLA** DCS 22 G. albida Três Marias -MG-gramíneas
14-UFLA** DCS 23 A. morrowiae Três Marias - MG-gramíneas
87-AM-UFLA* DCS 24 Glomus Thin green Amazonas-pastagem
864 DCS 25 G. manihotis CIAT-sorgo
870 DCS 26 G. calospora CIAT-sorgo
12-UFLA** DCS 27 G. rubiforme Três Marias -MG-gramíneas
133-UFLA DCS 28 G. mosseae Rio de Janeiro
47-UFLA DCS 29 A. longula Pimenta
260-UFLA DCS 30 A.. longula Capim gordura, bracatinga
07-AM-UFLA* DCS 31 A.delicata Amazonas-floresta
234-UFLA DCS 32 P. occultum Gramíneas
50- AM-UFLA* DCS 33 A. delicata Amazonas-mandioca
66-AM-UFLA* DCS 34 G. etunicatum “Yellow” Amazonas-agrofloresta
24-AM-UFLA* DCS 35 Glomus Thin green Amazonas-agrofloresta
38-AM-UFLA* DCS 36 G. etunicatum “Yellow” Amazonas-capoeira nova
∗Projeto Conservation and sustainable management of belowground biodiversity. ∗∗ Klauberg Filho (1999).
22
Para a multiplicação empregou-se uma mistura, aqui chamada de substrato, preparada a partir de um Latossolo Vermelho distrófico coletado em área sob fragmento de mata nativa sub-caducifólia, no campus da UFLA na camada superficial (0-20cm). O solo foi seco ao ar e peneirado em malha de 2mm, em seguida misturado com areia lavada na proporção de 2:1 (kg/kg) e devido à baixa saturação de bases foi feita uma calagem para elevar V até 60% mediante a aplicação de calcário dolomitico, foi aplicado 50mg de fosfato de rocha por kg de solo. O substrato foi tratado com brometo de metila (98% de
brometo de metila + 2% de cloropicrina) na dosagem de 393cm3m-3 para
eliminar os propágulos de FMAs nativos, amostras de solo, após a aplicação de calcário, nutrientes e fumigação, foram submetidas a analise química e apresentou as seguintes características químicas: pH (em água 2:1), 5,7; Ca, 3,4
cmolc dm-3; Mg, 1,0 cmolc dm-3; P, 7,8 mg.dm-3; P
rem, 10,9 Mg L-1; K,
12mg.dm-3; V, 44,2% e MO 4,8 dag kg –1.
Após o preparo do substrato este foi distribuído em vasos de 500mL e
irrigados com solução de MycoformTM previamente preparada a partir da
diluição da substância em água levemente aquecida a no máximo 40ºC, de modo que estivesse colocando 1mg por vaso, em seguida irrigou-se os vasos com água até que estes atingissem sua capacidade de campo. A inoculação foi feita através da pipetagem da suspensão de esporos, inoculando em torno de 200 esporos sobre as raízes das plantas de Brachiaria decumbens.
Os tratamentos constaram da aplicação de 1mg por vaso de
MycoformTM no ato do plantio (Myc 1), duas aplicações de 1mg por vaso de
MycoformTM (Myc 2), uma no ato do plantio e a outra dois meses após o plantio,
e um controle (Myc 0), no qual não foi feita nenhuma aplicação de MycoformTM,
e 36 isolados da coleção de FMAs da Universidade Federal de Lavras (Tabela 1), dispostos em um delineamento inteiramente casualizado (DIC), com um esquema fatorial de 3x36 com 5 repetições, totalizando 540 vasos. Após 5 meses
23
do plantio, os vasos foram individualmente desmontados para que as raízes fossem coletadas. Em seguida o substrato foi seco a sombra e posteriormente homogeneizado, embalado em saco plástico e armazenado em câmera fria a 4ºC. Os esporos foram extraídos de 25mL de solo retirado de cada vaso após a homogenização, conforme descrito anteriormente. E em seguida foram contados sob microscópio estereoscópico. Avaliou-se também a percentagem de colonização das raízes pelo método da interseção em placa quadriculada em microscópio estereoscópico (Giovannetti & Mosse, 1980). Para isso, amostras de raízes foram coletadas de cada vaso, lavadas em água da torneira e conservadas em solução FAA até que fosse proceder com a coloração destas. Antes de iniciar a coloração das raízes, elas foram novamente lavadas para retirar a solução FAA, separando-se 1g de raiz de cada vaso e acondicionando-as em cápsulas plásticas, as quais foram mergulhadas em solução de KOH 10% e aquecidas a 60°C por 10 minutos, para clarificação; lavadas em água corrente; acidificadas com HCl 1% por 2 minutos; e aquecidas por 10 minutos em solução de glicerol ácido e azul de tripano 0,05% (Phillips & Hayman, 1970).
3.2 Caracterização morfológica dos isolados.
Para o estabelecimento de estudos na identificação morfológica os esporos dos isolados que multiplicaram com sucesso pelo menos um dos 15 vasos montados foram fixados com PVLG e PVLG + reagente de Melzer (1:1) em lâminas para microscopia. Cada lâmina possuiu duas lamínulas, uma com PVLG, na qual manteve-se os esporos inteiros, e outra com uma mistura de PVLG e reagente de Melzer (1:1), na qual rompeu-se os esporos mediante a aplicação de uma leve pressão sobre a lamínula. A caracterização das espécies foi feita com base em critérios morfológicos, descritos nos sites do INVAM 2007 e do Blaskowski 2007, com utilização das descrições originais das espécies publicadas na literatura especializada. As imagens foram capturadas
utilizando-24
se o software de operação da câmera Motic Images Plus 2.0, através do qual também foi determinada as dimensões dos esporos dos FMAs. As cores dos esporos foram determinadas com a ajuda da carta de cores do INVAM.
3.3 Caracterização molecular dos isolados.
Para a caracterização molecular, os esporos foram obtidos em uma nova extração conforme descrito anteriormente. Em seguida, os esporos foram cuidadosamente selecionados sob microscópio estereoscópico e submetidos a quatro sessões de ultra-som por 15 segundos, intercaladas por lavagens em água destilada estéril para eliminar partículas de solo e possíveis microrganismos aderidos superficialmente. Os esporos limpos, aparentemente perfeitos e sadios foram selecionados e transferidos para tubos de microcentrífuga de 1,5mL, separando-os em grupos de um e dez esporos por tubo, em seguida foram armazenados à -20°C. O DNA foi extraído mediante a quebra dos esporos em 2µL de água estéril com o auxilio de um micro-pestilo (Treff AG, Degershein, Suíça), garantindo a liberação de todo seu conteúdo na água para formação do extrato cru, e rapidamente acrescentado 40µL de tampão TE-tris edta 10:1mM, misturando bem com o micro-pestilo para que garantisse a quebra do esporo e em seguida adicionou 10μL de resina Chelex 100 (Bio-Rad, Hercules, Califórnia Estados Unidos da América) a 20% em água ultra-pura. Após esta etapa, os tubos foram imersos em nitrogênio liquido. Em seguida, os tubos foram incubados a 95°C durante 10 minutos, rapidamente resfriados em gelo, e centrifugados a 10000 x g por 1 minuto. O sobrenadante foi transferido cuidadosamente para um novo tubo e armazenados a -20°C até o momento da análise. Em decorrência da dificuldade de obtenção do DNA de algumas espécies a partir de poucos esporos, outros métodos de extração foram testados. Assim, através de adaptação do kit “Wizard Genomic DNA purification kit”, foi feita a extração de DNA mediante a quebra de grande quantidade de esporos
25
dentro do próprio microtubo de 1,5mL utilizando um micropestilo acoplado a uma microretificadora. Após a maceração dos esporos, foi utilizado o protocolo descrito pelo fabricante para extração de DNA de plantas, com modificações.
Após extração o pelete de DNA foi seco ao ar colocando os tubos em posição invertida sobre um papel absorvente a temperatura ambiente “overnight”. Após a secagem do pelete adicionou-se 50μL de solução de rehidratação e os tubos foram incubados por 1 hora a 65ºC, o DNA foi quantificado em “spectrophotometer Nano-Drop” e dividido em dois microtubos e armazenado um a 4ºC e o outro a -20ºC até o momento da análise.
O DNA dos esporos foram amplificados com o par de iniciadores NS1-ITS4 (Tabela 2), que permitem amplificar o DNA ribossomal (rDNA) do inicio do gene 18S até o inicio do gene 25S, abrangendo as duas regiões intergênicas e o gene 5.8S (White et al., 1990) (Figura 2). Para a realização das reações utilizou-se um volume final de 50μL sendo 3μL do DNA molde. A mistura do PCR foi composta de 200μM de cada um dos quatros deoxinucleosídeos trifosfato (dNTPs), 1,5 mM de MgCl2, 0,28μM de cada primer e 3,5 unidades de
polimerase “Expand High Fidelity” (Roche diagnostics). O tampão de reação foi utilizado de acordo com as recomendações do fabricante. Todas as reações
foram feitas em termocicladores PCT-1148 MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler
(BIO RAD). Para a amplificação do DNA dos esporos para serem utilizados na analise de DGGE, primeiramente foi amplificado o DNA de esporos das espécies da família Gigasporacea de acordo com de Souza et al. (2004), assim, o DNA dos esporos foi amplificado inicialmente com o par de primers FM6 (de Souza et al., 2004) e GIGA5.8R (Redecker, 2000). As reações foram realizadas utilizando-se um volume total de 25μL sendo 2μL do DNA molde. A mistura do PCR foi composta de 200μM de cada um dos quatro deoxinucleosídeos
trifosfato (dNTPs), 1,5μM de MgCl2, 0,3μM de cada primer e 2,5 unidades de
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reação de acordo com as recomendações do fabricante e feitas em
termocicladores PCT-1148 MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (BIO RAD). O
produto deste ciclo de amplificações foi diluído de acordo com a intensidade das bandas formadas, as amostras que não apresentaram bandas ou as bandas eram fracas não foram diluídas, quando as bandas eram fortes a diluição foi de 1:500 e bandas extremamente fortes foram diluídas de 1:1000. Um segundo ciclo de amplificações (“nested”) foi realizado utilizando-se 4μL destas diluições como DNA molde, utilizou-se também diluições dos produtos de PCR realizados com os primers NS1 e ITS4. Para está segunda amplificação foi utilizado o primer senso NS7 (White et al., 1990) contendo um grampo GC em combinação com o anti-senso F1Ra (de Souza et al., 2004), a reação foi feita utilizando as mesmas condições descritas anteriormente para a enzima Taq DNA Polimerase Recombinante (Invitrogen), diferindo apenas no volume de reagentes que foi de 50μL, sendo 4μL do DNA molde. As analises de DGGE foram realizadas em aquário, utilizando-se géis com 7% de acrilamida e gradiente de 32 a 42% e 35 a 45% de desnaturante. A eletroforese foi realizada a 75v por 15 horas, utilizando-se um tampão 0,5 Tris-acetato-EDTA (TAE) a temperatura constante de 60ºC, com corrente variando de 46 (inicial) a 50mA (final).
TABELA 2. “Primers” para rDNA, combinação de “primers”, grampo de GC e combinações do PCR empregados neste trabalho.
Primers Seqüência Primer reverso
Grupo Alvo Condições para amplificação por
PCR
Tamanho esperado
(pb) NS1 5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’ ITS4 Eucaritos {94ºC(60s), 55ºC
(160s)}x30 2300 FM6 5’-ACCTGCTAAATAGTCAGGCTA-3’ GIGA5.8R Gigasporaceae {94ºC(60s), 59ºC
(45s)}x30 700 NS7-GCb 5’-GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC-3’ F1Ra Eucaritos {94ºC(60s), 60ºC
(28s)}x30 400 ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ - Eucariotos - - GIGA5.8R 5’-ACTGACCCTCAAGCAKGTG-3’ - Gigasporaceae - - F1Ra 5’-CTTTTACTTCCTCTAAATGACC-3’ - Fungos - -
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FIGURA 2 Representação esquemática do gene ribossomal (rDNA), focalizando no gene que codifica para o 18S. As posições aproximadas dos “primers” estão indicadas (setas), bem como as regiões variáveis analisadas via PCR-DGGE (colchetes). Setas quebradas indicam “primers” contendo grampo GC. (Retirada de de Souza et al., 2004.)
3.4 Análises
Em virtude da não multiplicação de todos os isolados inicialmente repicados, ou da contaminação de partes dos vasos, foram analisados apenas os dados dos isolados que obtiveram sucesso na multiplicação dos 15 vasos montados. Assim, após a contagem dos esporos e da determinação da taxa de colonização micorrízica radicular, os resultados foram submetidos ao teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa SISVAR.
Os géis de DGGE foram submetidos a analise de similaridade entre os perfis de bandas dos isolados de FMAs através do programa Gelcompar-Coeficiente de Jaccard (Tol 1.0% -1.0%) (H>0.0% S>0.0%)[0.05 – 100%].
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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Esporulação dos isolados de FMAs
Dos 36 isolados 19 multiplicaram em pelo menos um vaso, sendo que 3 isolados apresentaram contaminação, e 17 isolados não apresentaram nenhum sinal de colonização e esporulação, sendo então descartados. A contaminação restringiu-se aos isolados DCS 05 (Gigaspora gigantea), DCS 11 (Glomus
etunicatum) e DCS 22 (Gigaspora albida). Embora os vasos destes isolados
continham a espécie original, foi verificada a presença de Glomus clarum em um dos vasos do isolado DCS 05 e Glomus sp. nos vasos dos demais isolados.
A taxa de colonização radicular, independentemente do isolado fúngico
estudado e da aplicação ou não de MycoformTM, foram bem elevadas e
semelhantes, estando na faixa de 50% (Tabela 4), o que pode ser atribuído a utilização de uma única planta hospedeira, a Brachiaria decumbens, e pela baixa especificidade dos FMAs. Os isolados DCS 24 (Glomus thin green) e DCS 03 (K. colombiana) foram os isolados que promoveram os maiores valores de
colonização na ausência do MycoformTM e o isolado DCS06 (G. thin green) o
que proporcionou menor taxa de colonização. Apesar dos fatores que controlam a taxa de colonização serem bastante complexos e dependentes da relação entre número de propágulos infectivos iniciais os isolados DCS 24 e DCS 06 apesar de pertencerem a mesma morfoespécie apresentaram diferenças na taxa de colonização radicular.
Com relação ao nível de efeito das aplicações de MycoformTM, a
comparação das médias indicou que apenas os isolados DCS 02 (Acaulospora
SP.), DCS 06 (Glomus thin green) e DCS 09 e 10 (G. clarum) responderam a
aplicação de formononetina, obtendo um incremento de colonização micorrízica superior a 20%. Pereira & Siqueira (1997) verificaram que a formononetina
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aumentou a percentagem de colonização da soja por um desses isolados de G.
clarum indicando um efeito consistente na colonização dessa espécie,
independentemente da planta hospedeira. Entretanto, o efeito da formononetina sobre os isolados DCS 23 (A. morrowiae), DCS 19 (S. heterogama) e sobre um dos isolados de G. etunicatum não parece ser consistente, uma vez que estes isolados não responderam a aplicação da formononetina quando cultivados com brachiaria decumbens (Tabela 3), mas aumentaram a percentagem de colonização nas plantas da soja quando aplicada a formononetina (Pereira & Siqueira, 1997).
TABELA 3 Colonização radicular de Brachiaria decumbens aos 150 dias após plantio e produção média de esporos por isolados de FMAs na ausência e presença de formononetina.
Isolado % Colonização Nº Esporos
Myc0 Myc1 Myc2 Myc0 Myc1 Myc2
G. clarum - 09 54 Bb 71 Aa 71 Aa 2264 Ab 3358 Aa 3108 Aa G. clarum - 10 55 Bb 69 Aa 75 Aa 2552 Ab 3317 Aa 2288 Ab G. thin green - 06 38 Db 61 Ba 55 Ca 1591 Bb 2816 Aa 1369 Cb G. Thin Green - 24 61 Aa 57 Ba 58 Ba 1288 Ba 991 Da 1326 Ca G. etunicatum - 12 54 Ba 63 Aa 63 Ba 938 Cb 1753 Ca 954 Cb G. etunicatum - 13 55 Ba 59 Ba 60 Ba 1310 Ba 1453 Ca 1204 Ca P. occultum - 32 52 Ba 54 Ba 53 Ca 1703 Ba 1566 Ca 1460 Ca Acaulospora sp. - 02 48 Cb 60 Ba 60 Ba 1289 Ba 1178 Da 1775 Ba Acaulospora sp. - 30 52 Ba 57 Ba 64 Ba 1558 Bb 2071 Ba 2740 Aa A. delicata - 31 53 Ba 53 Ba 59 Ba 1579 Bb 1005 Db 2189 Ba A. morrowiae - 23 51 Ba 54 Ba 59 Ba 465 Ca 776 Da 782 Da K. colombiana - 03 60 Aa 66 Aa 70 Aa 1315 Bb 2490 Ba 2072 Ba S. heterogama - 19 45 Ca 47 Ba 41 Da 260 Ca 312 Da 274 Da
Médias seguidas de mesma letra maiúsculas na coluna e minúsculas na linha, não diferem entre si, ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Skott Knott.
