AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE
DIFERENTES CERVEJAS APLICANDO OS MÉTODOS
ABTS E DPPH*
Gisele Laisa de FREITAS** Eugenia Marta KUSKOSKI** Luciano GONZAGA** Roseane FETT***
RESUMO:Os compostos fenólicos são substâncias presentes naturalmente nos vegetais que podem atuar como antioxidantes. Na cerveja desempenham um papel importante nas características sensoriais (cor, aroma e sabor) e nutricionais da cerveja. O objetivo deste trabalho foi determinar o conteúdo de compostos fenólicos totais e flavonóis em diversos tipos de cervejas comercializada no Brasil, assim como determinar a capacidade antioxidante in vitro realizada por dois métodos, o radical ABTS•+ (ácido
2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin 6-sulfônico) e o radical DPPH• (2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo). Para determinar os polifenóis totais foi utilizado o método de Folin-Ciocalteau e o método DMACA para os flavanóis. Os resultados mostraram que o conteúdo de compostos fenólicos nas cervejas analisadas variou de 249,73 ± 8,44 a 808,58 ± 7,42 mg/L. A cerveja escura de trigo, apresentou os maiores valores de polifenóis totais, seguida das cervejas escura de cevada, da clara de trigo e das cervejas clara de cevada. Foram encontrados resultados significativos para atividade antioxidante aplicando o método ABTS, valores de 911,79 ± 2,21 a 3857,66 ± 6,07 Mol TEAC/L dependendo do tipo de cerveja e pelo método DPPH, de 2840,12 ± 1,09 a 4290,77± 6,19 Mol TEAC/L. O conteúdo de flavanóis (equivalente a mg catequina/L de amostra.), variaram em média de 1,93 ± 0,07 mg/L a 2,79 ± 0,08 mg/L para as cervejas claras e de 2,14 ± 0,04 mg/L a 5,09 ± 0,08 mg/L para as cervejas escuras.
PALAVRAS-CHAVE: Cervejas; atividade antioxidante; compostos fenólicos.
INTRODUÇÃO
A cerveja é uma bebida milenar originária da cultura Mediterrânea clássica, vinculada desde a antiguidade a fins terapêuticos. As primeiras referências históricas existem há mais de 6.000 anos, e demonstram que a cerveja por ser uma bebida fermentada, era consumida pela civilização com o
*Trabalho elaborado com auxilio financeiro do CAPES (bolsa mestrado).
** Pós-graduação-Mestrado em Ciência - UFSC - 88034-001 - Florianópolis - SC - Brasil.
***Departamento Ciência e Tecnologia de Alimento CAL Universidade Federal de Santa Catarina 88034 001 Florianópolis SC -Brasil.
objetivo de evitar enfermidades infecciosas adquiridas ao beber água não higienizada.18, 23
Produzida da fermentação alcoólica do mosto de cereal malteado, geralmente malte de cevada, sendo facultativa a adição de outra matéria-prima amilácea ou de lúpulo, com teor alcoólico baixo, de 3 a 8%.17
O consumo moderado de bebidas alcoólicas, em particular o vinho e a cerveja, está associado à diminuição de mortalidades causadas por doenças cardiovasculares.11
Álcool, em baixas doses, e os compostos fenólicos têm papel importante na proteção da agregação plaquetária, além do mais o etanol tem efeito direto nas plaquetas, no metabolismo HDL e na fribrinolisis, e apresenta papel importante na absorção de compostos fenólicos.8
Alguns dados publicados indicam que os polifenóis da cerveja inibem a oxidação das LDL in vitro.19As calconas
procedentes da cerveja apresentam atividade antioxidante e protegem a peroxidação lipídica induzida em ensaios com ratas.22
Bobak et al.3 analisaram os possíveis efeitos
protetores do consumo moderado de cerveja, eliminando os fatores relacionados com os hábitos de consumo de álcool. Os mesmos concluíram que o efeito protetor da cerveja é similar ao do vinho, devido à redução da coagulação sangüínea e aumento do colesterol de lipoproteínas de alta densidade - o HDL - e confirmaram os estudos prévios em que se assinala o efeito cardioprotetor limitante a pessoas que bebem moderadamente.
Os compostos polifenóis desempenham um papel importante nas características sensoriais (cor, aroma e sabor) e nutricionais da cerveja.9 Estes compostos são importantes
devido à sua influência na estabilidade coloidal da cerveja, sendo responsável pela turbidez originada pela interação com as proteínas.
Os principais polifenóis presentes na cerveja provêm essencialmente da casca de cevada malteada e do lúpulo. São ácidos fenólicos e flavonóides de três tipos: flavanóis (catequinas e epicatequinas); as antocianinas, entre elas estão a pelargonidina, malvidina, leucocianidinas e leucopelargonidina, e seus derivados produtos de oxidação Alim. Nutr., Araraquara
v.17, n.3, p.303-307, jul./set. 2006
(como as chalconas); e os flavonóis (quercitina, kampferol, mircetina). Também aparecem compostos mais complexos como os taninos, sendo os mais importantes as proantocianidinas de diversos graus de polimerização.6, 9,12
O principal objetivo deste trabalho foi determinar os compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante de diferentes cervejas consumidas no sul do Brasil. Assim como correlacionar a atividade antioxidante encontrada com seu conteúdo de polifenóis totais.
MATERIAL E MÉTODOS Amostras
Quatorze amostras de cerveja de diferentes tipos: cervejas de trigo clara e escura (n=2), cervejas de cevada clara e escura (n=10) e cerveja orgânica de cevada clara, de diferentes marcas foram examinadas neste estudo. Os diferentes tipos de amostras de cerveja, de diferentes lotes, foram adquiridos aleatoriamente no comércio de Florianópolis (SC) e outras amostras foram doadas por uma empresa de Blumenau (SC), todas dentro do prazo de validade. As amostras (alíquotas de 50 ml dos frascos recentemente abertos de cerveja) foram desgaseificadas por agitação mecânica e analisadas imediatamente.
Determinação de compostos fenólicos totais
O índice de polifenóis totais foi determinado pelo método espectrofotométrico desenvolvido por Folin-Ciocalteu. 24 Volume de 100 L da amostra de cerveja (diluída
adequadamente), 1,5 ml de solução de carbonato sódico 20% e 0,5 mL do reativo Folin-Ciocalteu foram misturados. A absorbância foi medida em 765 nm após 2 horas de repouso. Os resultados foram expressos em mg GAE/L (equivalente ácido gálico/L) de amostra.
Determinação de flavanóis
A determinação de flavanóis foi realizada aplicando o método DMACA (p-dimetilaminocinmaldeído), descrito por Arnous et al.2 A concentração total de flavanóis foi
estimada conforme a curva de calibração, preparada com solução de catequina (1-16 mg de catequina/L). Os resultados foram expressos CE (em equivalente a mg catequina/L) de amostra.
Determinação da atividade antioxidante
Método ABTS (ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico)
O método ABTS utilizado foi o método descrito por Re et al.21 e modificado por Kuskoski et al.14 O radical ABTS•+
é formado por uma reação química com persulfato de potássio em uma relação estequiométrica de 1: 0,5. Uma vez formado,
o radical ABTS•+ foi diluído em etanol até obter-se uma
medida de absorbância de 0,70 (± 0,02) a um comprimento de onda de 754 nm e a uma temperatura de equilíbrio de 30ºC. Alíquota de 980 L do radical diluído foi transferido para cubeta e 20 uL da amostra de cerveja diluída adequadamente foi adicionada. A absorbância foi medida em espectrofotômetro modelo Hewlett-Packard 8425A, nos tempos 1, 4 e 7 minutos após a adição da amostra. Preparou-se uma curva padrão com soluções de Trolox (antioxidante sintético similar a vitamina E) e vitamina C (ácido ascórbico). Os resultados foram expressos em TEAC, atividade antioxidante equivalente ao Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico) em mol TEAC/L de amostra.
Método DPPH (2,2- difenil-1-picrilhidrazilo)
Desenvolvido por Brand-Wiliams et al.4 o método
DPPH, com modificações de Kim et al.,13 tem como base a
redução da absorbância na região visível de comprimento de onda de 515 nm do radical DPPH• por antioxidantes.
A solução do radical de DPPH• 100 M (3,9 mL) dissolvido em metanol a 80%, foi preparada de forma a apresentar absorbância em 517 nm entre 0,6 e 0,7.Ao adicionar 0,1 mL da amostra ou padrão, se homogeneiza cuidadosamente e se mantém em local escuro, à temperatura ambiente, por 30 minutos. A medida de absorbância é realizada no comprimento de onda de 517 nm do radical, antes de adicionar a amostra (A0) e depois de adicionar amostra a 30 e 60 minutos de reação (Af). A concentração de DPPH• no meio de reação se calcula conforme a curva de calibração obtida por regressão linear. Os resultados também são expressos em TEAC, Trolox ( mol TEAC/L de amostra). Análise estatística
Todas as análises foram realizadas em triplicata, e todos os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP). Foram realizadas análises de variância (ANOVA) e o teste de Tukey para identificar diferenças significativas entre as médias, usando o programa Statistica 6.0. Diferenças entre as médias no nível de 5% (P < 0,05) foram consideradas significativas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nas diferentes cervejas os compostos fenólicos determinados neste estudo estão representados na Tabela 1, variando de 249,73 ± 8,44 a 808,58 ± 7,42 mg/L em conseqüência do tipo de cerveja. Observa-se que a cerveja escura de trigo, apresentou os maiores valores de polifenóis totais, sem diferença estatisticamente significativa entre as diferentes marcas (amostra 2B e 3C). Em seguida, as cervejas com maior conteúdo de polifenóis são as cervejas escuras de cevada, as cervejas claras de trigo e as cervejas claras de cevada.
Tipo Amostra Marca* IPTa (mg/L) ABTS – TEACb ( Mol/L) Cerveja de trigo clara 1A a 402,58 3,37 b 2829,89 1,38 Cerveja de trigo escura 2B a 808,58 7,42 l 3187,96 4,50 3C b 791,54 18,01l 3857,66 6,07 Cerveja de cevada clara 4D a 406,34 5,01 b,c 2693,04 8,23 5E a 431,44 3,53 d,e 2670,70 1,19 6F b 535,67 6,28 h 2846,87 1,14 7G c 249,73 8,44 a 911,79 2,21 Cerveja de cevada escura 8H a 429,35 6,22 c,d 2492,93 5,63 9I a 687,06 5,08 j 2892,30 11,73 10J a 727,67 4,17 k 3522,78 14,50 11K b 440,06 2,39 e,f 1585,68 4,75 12L c 458,70 1,20 f,g 1706,19 2,90 13M a 636,23 7,49 i 1928,87 3,96 Cerveja de cevada
clara orgânica 14N a 435,99 3,22 e,f 2617,03 4,55
Tabela 1 - Índice de polifenóis totais (IPT) e atividade antioxidante (ABTS) de diversos tipos de cervejas, (média ± DP, n=3).
*Marcas com a mesma letra foram fabricadas pela mesma empresa; a índice de polifenóis
totais expresso em equivalente em ácido gálico (GAE) mg/100g da amostra; bTEAC:
ativi-dade antioxidante equivalente ao trolox em 7 min. Letras diferentes na mesma coluna im-plicam diferença significativa (p<0,05) entre as amostras pelo Teste de Tukey.
A marcante variação nos teores de fenólicos entre as amostras, marcas ou tipos de cervejas observadas no presente trabalho (Tabela1), refletem a grande variação natural entre as amostras. Há, no entanto, uma diferença ainda maior e considerável entre os resultados de diferentes autores. Em estudo com cervejas Saura et al.24 determinaram os compostos
fenólicos e encontraram valores de polifenóis para a cerveja de cevada clara de 336 ± 8 mg/L e para a cerveja de cevada escura de 570 ± 10 mg/L. Comparadas com as cervejas brasileiras analisadas neste trabalho, encontram-se uma média de 405,8 ± 5,81 mg/L para as cervejas de cevada claras e de 563,18 ± 4,42 mg/L para as cervejas de cevada escuras. Observa-se que neste trabalho obtiveram-se valores maiores tanto para as cervejas claras de cevada como as cervejas escuras de cevada.
Os resultados obtidos da atividade antioxidante, determinadas pelo método ABTS, medidas no tempo de 7 minutos (Tabela 1), foram em média de 2347,89 Mol TEAC/L para as cervejas de cevada claras, enquanto que para a cerveja de cevada escura encontramos 2354,79 Mol TEAC/L, valores menores quando comparados com cervejas escuras de trigo (3522,81 Mol TEAC/L).
Pellegrini et al.20 ao avaliar a capacidade antioxidante
de diversas bebidas, plantas e azeites de consumo na Itália, encontraram valores de 1040 Mol TEAC/L em cervejas de cevada claras, aplicando método ABTS. Esses valores foram inferiores aos determinados em nosso estudo.
Em outros estudos, Gasowski et al.,7 avaliaram a
atividade antioxidante pelo método ABTS de cervejas e encontraram resultados expressos em equivalentes Trolox na faixa de 1650 a 2070 Mol TEAC/L.
Os resultados obtidos aplicando método DPPH para determinar a atividade antioxidante de nove tipos de cervejas encontram-se na Tabela 2. Entre as amostras de cervejas claras de trigo foi obtida uma média de 1364,48 Mol TEAC/ L, e 1370,14 Mol TEAC/L para as amostras de cervejas claras de cevada, seguidas de 1991,50 Mol TEAC/L para as cervejas escuras de cevada. Para as cervejas escuras de trigo, a média encontrada foi de 3015,29 Mol TEAC/L, com medidas no tempo de 30 minutos.
O conteúdo de flavanóis (equivalente à mg catequina/ L de amostra) variou em média de 1,93 ± 0,07 mg CE/L a 2,79 ± 0,08 mg CE/L para as cervejas claras e de 2,14 ± 0,04 mg CE /L a 5,09 ± 0,08 mg CE /L para as cervejas escuras (Tabela 2).
A correlação entre compostos fenólicos totais e atividade antioxidante pelos diferentes métodos (ABTS e DPPH) apresentou resposta linear significativa (Figura 1). Pelo método DPPH o coeficiente de correlação (r2 = 0,9229)
foi maior que o obtido com o método ABTS (r2 = 0,8959).
Estudos de Alonso et al.1 conduzidos com bebidas
encontraram também uma correlação positiva entre o índice do Folin-Ciocalteu e a atividade antioxidante medidos usando método eletroquímico e outros métodos.
y = 0,2589x - 21,561 R2 = 0,8959 0 200 400 600 800 1000 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Atividade antioxidante ABTS ( Mol/L)
P o li fe n ó is t o ta is ( m g /L ) y = 0,2135x + 161,94 R2 = 0,9229 300 400 500 600 700 800 900 900 1400 1900 2400 2900 3400
FIGURA 1 - Correlação entre o índice de polifenóis totais expressos em GAE..., com atividade antioxidante determinada pelo método ABTS e método DPPH nas cervejas.
Tabela 2 - Flavonóis e atividade antioxidante pelo método DPPH de cervejas.
*Marcas com a mesma letra foram fabricadas pela mesma empresa aTEAC: atividade
antioxidante equivalente ao trolox obtida em 30 min; bCE = equivalente à catequina.
Tipo Amostra Marca* Flavanóisb
(mg/L)
DPPH - TEACa ( Mol/L)
cerveja de trigo clara 1A a 2,79 0,08 3294,91 17,26 cerveja de cevada clara 4D a 2,67 0,12 3010,68 12,88 5E a 1,91 0,04 3007,94 8,32 6G b 2,41 0,09 3234,39 11,45 cerveja de cevada escura 8H a 2,14 0,04 2840,12 1,09
9I a 4,51 0,12 3317,64 5,29 3C b 5,09 0,08 4290,77 6,19 10J a 4,66 0,05 3957,97 2,97 cerveja orgânica de cevada clara 14N a 1,93 0,07 3012,87 5,40
Atividade antioxidante ABTS ( Mol/L)DPPH
P o li fe n ó is t o ta is ( m g /L ) P o li fe n ó is t o ta is ( m g /L )
Diversos estudos relativos à atividade antioxidante da cerveja têm correlacionado esta propriedade com sua composição em ésteres, aldeídos, dicetonas vicinais, ácidos orgânicos, fenóis e outros compostos diretamente relacionados com a qualidade 5, 10,16 em que a reação de
Maillard forma produtos no malte.15
Wei et al.25 realizaram uma pesquisa estabelecendo
relação entre os compostos voláteis da cerveja e atividade antioxidante; no entanto, os mesmos autores descrevem a dificuldade em atribuir estas habilidades antioxidantes somente a compostos voláteis isolados.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos demonstraram que a cerveja pode ser fonte de compostos fenólicos. A cerveja escura de trigo apresentou os maiores valores de polifenóis totais, seguida da cerveja escura de cevada, cerveja clara de trigo e cervejas clara de cevada. Os resultados de atividade antioxidante foram elevados tanto na determinação pelo método ABTS como DPPH, embora o método DPPH tenha
apresentado os maiores valores. Observa-se uma correlação positiva entre a média do conteúdo de polifenóis totais com a média dos valores de TEAC, o que indica uma forte influencia dos compostos fenólicos sobre a atividade antioxidantes das cervejas.
AGRADECIMENTOS
A Cervejaria Sudbrack - Eisenbahn Blumenau/SC, pelo fornecimento das amostras de cerveja, para realização deste estudo.
FREITAS, G.L.; KUSKOSKI, E.M.; GONZAGA, L.; FETT, R. Antioxidant evaluation of different types of beers by ABTS and DPPH methods. Alim.Nutr., Araraquara, v.17, n.3, p.303-307, jul/set. 2006.
ABSTRACT: Phenolic compounds are components with an important antioxidant activity occurring naturally in
vegetables, although not acting as nutrients. In beer, they play an important role in sensorial (colour, aroma and taste) and nutritional characteristics. The aim of this work was to determine the total phenolic content and flavonoids in several types of beer commercialized in Brazil as well as to determine the antioxidant capacity in vitro through two methodologies: ABTS•+ (ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin
6-sulfônico) and DPPH• (2,2- Difenil-1-picrilhidrazilo). In order to determine the total poliphenols, the Folin-Ciocalteu method was used; for flavonoids analysis, the DMACA method was used. Results showed that the phenolic content in analyzed beer can range from 808.58 ( ±7.42) to 249.73 (± 8.44) mg/L. Wheat dark beer, presents the highest total poliphenol values, followed by barley dark beer, wheat pale beer and barley pale beer. Significative results were found for antioxidant activities determined by ABTS: values ranging from 911.79 ( ± 2.21) to 3857.66 ( ± 6.07) Mol TEAC/L according to the type of beer. The results for DPPH were: from 3007.94 ( ± 8.32) to 4290.77 (± 6.19) Mol TEAC/L. Flavonoids contents (equivalent mg of catechin/L of sample), ranged from 1.93 mg CE/L to 2.79 mg CE/L for pale beers and from 2.14 mg CE/L to 5.09 CE mg/L for dark beers.
KEYWORDS : Beer; phenolic compounds; antioxidant activity.
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