PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALINE CRISTINE MAGALHÃES COSTA MESSIAS
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR DE CRIANÇAS COM TONSILITE
RECORRENTE
Goiânia
2021
ALINE CRISTINE MAGALHÃES COSTA MESSIAS
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR DE CRIANÇAS COM TONSILITE
RECORRENTE
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Dra. Lilian Carla Carneiro
Goiânia
2021
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluna: Aline Cristine Magalhães Costa Messias
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Lilian Carla Carneiro
Membros:
1. Prof.ª Dr.ª Lilian Carla Carneiro
2. Prof.ª Dr.ª Mônica de Oliveira Santos
3. Prof.ª Dr.ª Ieda Maria Sapateiro Torres
OU
3. Prof.ª Dr.ª Lívia do Carmo Silva
4. Prof. Dr. Andre Moreira
‘’Portanto, quer vocês comam, quer bebam, quer façam qualquer outra coisa, façam para a glória de Deus.’’ 1Co 10:31
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus que na missão dEle confiou que eu seria capaz de concluir essa etapa.
Ao professor doutor Ruffo de Freitas Júnior, coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Ao meu esposo Waldo Messias que sempre acreditou que eu conseguiria mesmo diante das adversidades.
Aos meus pais José de Arimatea e Jupira Cristina e irmãs Nathalle e Daniele que sempre estiveram presentes.
Aos amigos que adquiri ao longo da caminha do LBMic, cada um de vocês de forma singular me ajudou a concluir esse desafio e me presentou com boas companhias nesses últimos anos.
A minha comunidade de fé Luz Bueno que me apoiou em oração o tempo todo. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro fornecido.
À minha orientadora professora doutora Lilian Carla Carneiro que me acolheu, me compreendeu e me respeitou nesse processo de mestrado, você sempre terá minha gratidão.
SUMÁRIO
FIGURAS, QUADROS, TABELAS E ANEXOS ... XI LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS ... XIII RESUMO ... XV ABSTRACT ... XVI
1 INTRODUÇÃO ... 17
1.1. MICROBIOTA DO SISTEMA RESPIRATÓRIO ... 17
1.2. INFECÇÕES DAS VIAS RESPIRATÓRIAS ... 20
1.2.1. Bactérias colonizantes mais incidentes em IVR... 21
1.2.2. Tonsiliterecorrente em crianças ... 22
1.2.3. Características gerais doS. aureuse as tonsilites recorrentes .... 23
1.3. BIOFILME BACTERIANO E TONSILITES RECORRENTES ... 26
1.3.1. Controle de biofilme nas tonsilites recorrente ... 28
1.4. ANTIBACTERIANOS: CLASSIFICAÇÃO E MECANISMO DE AÇÃO ... 28
1.4.1. Antibacterianos: mecanismos de resistência ... 31
1.4.2. Mecanismos de resistência doS. aureus aos antibacterianos .... 33
2 OBJETIVOS ... 38 2.1OBJETIVO GERAL ... 38 2.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 38 3 MÉTODOS ... 39 4 SUBMISSÕES... 40 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 96 7 REFERÊNCIAS ... 97 ANEXOS ... 109
FIGURAS, QUADROS, TABELAS E ANEXOS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Corte sagital da via respiratória superior em humano...18
Figura 2. Via respiratória inferior em humano...19
Figura 3. Principais gêneros bacterianos que compõem a microbiota da cavidade nasal, nasofaringe e orofaringe humana...20 Figura 4. Microscopia de Staphylococcus aureus, após coloração de gram. Observa-se a forma de cocos, corados em gram positivo (aumento em 100x) ...24 Figura 5. Cinco estágios da formação de biofilme em uma superfície...28 Figura 6. Ação da ß-lactamase no anel ß-lactâmico...33
Figura 7. A estrutura do SCCmec...34
Figura 8. Staphylococcus aureus susceptibility profile to the most commonly used antibacterials in medical practice..…………...54 Figure 9. The alignments (A) show that the sequences have strong homology, the dendogram of genetic similarity (B) of bacterial isolatesbased on 16S rRNA genetic sequences ...56 Figure 10. Schematic representation of an (a) HSI of multiple bacterias culture in a Petri dish and (b) a spectral signature of two different pixels on hypercube image...76 Figure 11. Average spectrum of HSI of MRSA samples and test samples...82
Figue 12. Samples and PCA results...83
Figure 13. Load line of first vector for the score image showing variables contributing for the separation of resistance and sensitivity...84
Figure 14. PLS-DA imagem showing calibration samples used to build the model and test samples that were excluded for model validation (a). The predictions show test samples assigned to resistance that correspond to the generated images (b)...85 LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Classe de antibacterianos de acordo com a estrutura química ...29
Quadro 2. Mecanismos de ação e sítio alvo dos principais antibacterianos de importância médica...30 Quadro 3. Mecanismo de resistência adquirido do S. aureusàs principais classes dos antibacterianos utilizados na clínica médica...36
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais fatores de virulência associados ao S. aureus...24
Table 2. Biochemical evidence used to identify isolated colonizers...46
Table 3. Sequenced bacterial strains...51
Table 4. Isolation of staphylococcus aureus according to the sites of the urt, in the studiedatients...52 Table 5. Colony forming unit (cfu) count at each evaluated site………53
Table 6. Identity of staphylococcus aureus deposited on database and Staphylococcus aureus of this study………..………55 LISTA DE ANEXOS
Anexo A. Parecer do comitê de ética...110
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS
SIGLAS
ABCs:
Active Bacterial Core surveillance
Bap:
Proteina associated with biofilm
BHI:
Brain heart infusion
CA-MRSA: Community-associatedmethicillin resistant Staphylococcus
aureus
CDC Center for Disease Control and Prevention
ClfB: Clumping factor B
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CREBIO: Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EPS: Matrizexopolissacarídica
Fnbs: Fibronectin-binding protein
H. influenza: Haemophilus influenza
HA-MRSA: Hospital associated methicillin resistant Staphylococcus
aureus
IRA: Infecções respiratórias agudas
MRSA: Methicillin resistant Staphylococcus aureus
MSCRAMMs: Microbial surface components reorgnizing adhesive matrix
molecules
PBP: Penicillin-binding protein
PBS: Phosphate Buffered Saline
PCR: Reação Em Cadeia Da Polimerase
PDR: Pandrug-resistant
PIA: Polyssacharide Intercellular Adhesin
rRNA: Ácido ribonucleico ribossômico
S. aureus: Staphylococcus aureus S. pneumoniae: Streptococcus pneumoniae S. pyogenes: Streptococcus pyogenes S. viridans: Streptococcus viridans
SasG: Sufarce protein G
SCCmec: Staphylococcal cassette chromosome mec
TSB: TrypticSoyBroth
VRI: Via respiratória inferior
VRS: Via respiratória superior
RESUMO
Introdução: As infecções das vias respiratórias são responsáveis por alta morbidade e mortalidade em crianças e idosos, sendo a tonsilite recorrente comumprincipalmente em crianças. No contexto, determinar o local correto de coleta do espécime clínico para um diagnóstico adequado é importante, porque desta forma terá o conhecimento certo de qual microrganismo está sendo responsável pela tonsilite e a partir dai executar um tratamento eficaz. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi avaliar a
presença de Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae,
Moraxellacatarrhalis, Haemophilus influenza e Staphylococcus aureus (S. aureus) em
três sítios distintos da via respiratória superior, em crianças com tonsilite recorrente. Métodos: Foram colhidas amostras da cavidade nasal, orofaringe e nasofaringe em 30 crianças, antes da realização da tonsilectomia, totalizando 90 amostras. Realizou-se a caracterização morfocolonial e morfotintorial, contagem, isolamento de colônias, identificação bacteriana e sequenciamento do 16S rRNA. Foi realizada também a análise da produção de biofilmes por teste em microplaca e teste de sensibilidade aos antibacterianos. Resultado: Dentre os microrganismos pesquisados, só foi possível recuperar S. aureus em 36,6% (11/30) dos pacientes, com variação de colonização entre os três locais de coleta. Em cada sítio avaliado, foi observada uma maior concentração de S. aureus na orofaringe. Dos 20 S. aureus isolados, 95% foram resistentes à eritromicina e 85% à penicilina. Quanto á produção de biofilme, 100% das amostras foram positivas. Conclusão: Este estudo demonstra que o S. aureus pode ser isolado nos três sítios estudados. A resistência identificada, bem como a capacidade de formação de biofilme, sugere que o S. aureus pode contribuir para os quadros de tonsilite recorrente.
Palavras-Chave: Colonizantes; Infecção de Via Respiratória Superior; 16S rRNA; Biofilme; Resistência.
ABSTRACT
Introduction: Respiratory tract infections are responsible for high morbidity and mortality in children and the elderly, and recurrent tonsillitis is common, especially in children. In the context, determining the correct place to collect the clinical specimen for a proper diagnosis is important, because this way you will have the right knowledge of which microorganism is being responsible for tonsillitis and from there perform an effective treatment. Objective: The objective of this study was to evaluate the presence of Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Moraxella
catarrhalis, Haemophilus influenza and Staphylococcus aureus in three different sites
of the upper respiratory tract in children with recurrent tonsillitis. Methods: Samples from the nasal cavity, oropharynx and nasopharynx were collected in 30 children, before the tonsilectomy, totaling 90 samples. Morphocolonial and morphotintorial characterization, counting, isolation of colonies, bacterial identification and sequencing of 16S rRNA were performed. The analysis of biofilm production by microplate test and antibacterial sensitivity test was also performed. Results: Among the microorganisms researched, it was only possible to recover S. aureus in 36.6% (11/30) of the patients, with variation of colonization between the three collection sites. In each site evaluated, a higher concentration of S. aureus in the oropharynx was observed. Of the 20 S.
aureus isolated, 95% were resistant to erythromycin and 85% to penicillin. As for
biofilm production, 100% of samples were positive. Conclusion: This study demonstrates that S. aureus can be isolated in all three sites studied. The identified resistance, as well as the capacity of biofilm formation, suggests that S. aureus can contribute to recurrent tonsillitis.
Keywords: Colonizers; Upper respiratory tract infection; 16S rRNA; Biofilm; Resistance.
1
INTRODUÇÃO
1.1. Microbiota do sistema respiratório
A microbiota de um local é definida pela presença de microrganismos e seus metabólitos presentes nos diversos sítios do hospedeiro (GONÇALVES, 2014), sendo que cada sítio apresenta uma microbiota própria, com espécies específicas (TADDEI; BRANDT; CARNEIRO-SAMPAIO, 2015). Vários são os sítios anatômicos colonizados no hospedeiro, como pele e anexos, sistemas digestório, genitourinário e respiratório, sendo que cada local abriga uma microbiotaadaptada às condições disponíveis (PASCALE et al., 2018).
A microbiota presente no hospedeiro pode ser definida como transitória ou residente, sendo que a transitória permanece por pouco tempo no hospedeiro sem haver uma colonização significativa. A residente, no entanto, coloniza o hospedeiro de forma benéfica, com relação de simbiose e antagonismo microbiano, o que protege o hospedeiro impedindo a colonização por microrganismos potencialmente patogênicos (TADDEI; BRANDT; CARNEIRO-SAMPAIO, 2015).
O sistema respiratório é constituído por duas partes, a via respiratória superior (VRS) e via respiratória inferior (VRI). A VRS compreende a região acima da epiglote, onde se encontram a cavidade nasal, nasofaringe, orofaringe, laringe e faringe (Figura 1) (GUYTON; HALL, 2006).
Na VRI, tem-se parte inferior da traqueia, brônquios e pulmões, dentro dos quais estão os bronquíolos e alvéolos (HISTOREP, 2018) (Figura 2). A VRS tem por função aquecer, umidificar e filtrar o ar por meio de seus compartimentos antes que o mesmo atinja a VRI (SAHIN-YILMAZ; NACLERIO, 2011). As diversas áreas da VRS possuem diferenças de temperatura, secreção de muco e concentração relativa de oxigênio, o que permite regular a colonização de microrganismos em toda sua porção (RIGOTTIER-GOIS, 2013; SIEGEL; WEISER, 2015).
Figura 2: Via respiratória inferior em humano
Fonte: Extraído com adaptações de (A.D.A.M, 2020)
O ar, quando entra pela cavidade nasal, percorre toda a VRS até chegar aos pulmões. A presença do muco e dos pelos faz com que o ar seja aquecido e as impurezas retiradas. Porém, sabe-se que neste processo naturalmente pode ocorrer o transporte de microrganismos para os diversos sítios da VRS e VRI (KOPF; SCHNEIDER; NOBS, 2015).
A microbiota da VRS é distinta entre si e têm padrões de colonização e sucessão. Desde a primeira infância, a VRS é colonizada por espécies bacterianas de diversos gêneros, como Streptococcus spp., Haemophilus spp., Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus viridans (S. viridans), Haemophilus influenzae (H.
influenzae), Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Moraxella catarrhalis (M. catarrhalis) e Staphylococcus aureus (S. aureus) (Figura 3) (ROUND; MAZMANIAN,
2009; JOHNSTON; DOUGLAS, 2018). Apesar da presença de uma microbiota residente, na VRS observa-se grande concentração de IgA, presente no muco de
revestimento, anticorpo este que dificulta a adesão bacteriana na mucosa, além de proteger contra infecções virais (LOPES; AGNALDO; MAFORT, 2014).
Figura 3: Principais gêneros bacterianos que compõem a microbiota da cavidade nasal, nasofaringe e orofaringe humana
Fonte: Extraído com adaptações de (DE STEENHUIJSEN PITERS; SANDERS; BOGAERT, Debby, 2015)
Na parte inferior da traquéia, início da VRI, há presença de microrganismos como Streptococcus alfa-hemolíticos e não hemolíticos, Neisseria spp.,
Staphylococcus spp., difteróides, Haemophilus spp. e Mycoplasma spp. (TADDEI;
BRANDT; CARNEIRO-SAMPAIO, 2015). Os brônquios e alvéolos não são colonizados, mesmo com grande número de microrganismos potencialmente capazes de alcançar esta região durante a respiração (MADIGAN et al., 2016). A presença do epitélio ciliado faz com que as partículas retidas na laringe, traqueia e nos brônquios maiores sejam removidas para a garganta, por meio da ação dos cílios - ‘’elevador ciliar’’ (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Ao chegar na garganta, as partículas são
deglutidas e eliminadas (KOVACS et al., 2013).
Na VRI também se observa a presença do sistema imunológico, com ação das células de defesa, macrófagos alveolares e neutrófilos, que são recrutados da circulação. Além disto, encontra-se anticorpos IgG e IgA presentes em menor
quantidade em relação a VRS, mas que auxiliam no processo de fagocitose (LOPES; NORONHA; MAFORT, 2010).
Apesar da eficiência das barreiras mecânicas e imunológicas existentes nas VRS e VRI, as vias respiratórias estão em constante exposição às partículas, aos produtos químicos e organismos infecciosos presentes no ar o que pode, eventualmente, resultar em infecções das vias respiratórias (IVR) (FSRI, 2017).
1.2. Infecções das vias respiratórias
As IVR são uma grande preocupação no mundo, sendo responsáveis por alta morbidade e mortalidade, especialmente em crianças e idosos (DE STEENHUIJSEN
PITERS; SANDERS; BOGAERT, 2015). A Organização Mundial de Saúde define
como doenças respiratórias as infecções que ocorrem no trato respiratório, tanto superior quanto inferior, nas quais há obstrução da passagem do ar, tanto ao nível nasal quanto pulmonar (OMS, 2015).
De acordo com a Sociedade Paulista de Pneumologia e Tisiologia, otite, sinusite, tonsilite, faringite estreptocócica, laringite, escarlatina e difteria são consideradas infecções das vias respiratórias superiores (IVRS), e bronquite, pneumonia, coqueluche e tuberculose como infecções das vias respiratórias inferiores (IVRI). Apesar de frequentes, normalmente as IVRS não causam óbito, mas interferem significativamente na qualidade de vida do indivíduo (OMS, 2015). As IVRI, no entanto, estão entre as causas mais comuns de morte em todo mundo (GBD, 2015).
Vários agentes patogênicos estão envolvidos na etiologia das IVR, sendo os vírus e as bactérias os mais comuns, podendo ocorrer isolada e/ou simultaneamente. Muitos vírus precedem a infecção bacteriana que, ao criar um ambiente favorável, permite a multiplicação de bactérias. Um exemplo é o vírus Influenza, capaz de necrosar o epitélio das VRS e favorecer a adesão bacteriana, o que resulta em infecção mista (OMS, 2014).
A presença desses patógenos nas VR podem ser a causa das chamadas infecções respiratórias agudas (IRA), as quais estão entre as doenças infecciosas de maior índice de morbimortalidade em todo o mundo (OMS, 2014). Fatores como o tipo de patógeno, hospedeiro, ambiente e terapia podem influenciar na epidemiologia e manifestações clínicas da doença (TONG; CHEN; FOWLER, 2012).
1.2.1. Bactérias colonizantes mais incidentes em IVR
Algumas bactérias são classificadas como mais incidentes em IVR, dentre elas podemos destacar oStreptococcus pyogenes (S. pyogenes) comoagente etiológico da faringite estreptocóccica, também conhecida por “tonsilite estreptocóccica” e também pode causar infecções associadas à orelha interna (otite média)(TORTORA; FUNKE; CASE, 2012), fatores de virulência associada a eles como a produção de exotoxina pirogênica estreptocóccicaque estimula a produção de citocinas pelas células T, desencadeando processos de febre e outros sintomas sistêmicos semelhantes ao da Sindrome do Choque Tóxico (MADIGAN et al., 2016).
Outra importante espécie patogênica de estreptococos incidente nas IVR é o
S. pneumoniae, muito incidente em infecções pulmonares invasivas que,
frequentemmaente, desenvolvem-se como infecções secundárias a outros distúrbios respiratórios (ALTERTHUM, 2015), produz pneumolisina que atinge as células alveolares e endoteliais e células ciliadas, formando poros nas membranas das células pulmonares, inibindo desta forma a atividade das células ciliadas, causando danos ao pulmão (XU et al., 2020).
Da mesma forma ocasionalmente o H. influenza também está presente nessas infecções, causandootite média, epiglotite e pneumonia, em casos mais severos e infecções mais profundas causam meningite, sua cápsula de polissacarídeo é importante para sua virulência e aexpressão da pilihemaglutinante faz aderência às células epiteliais respiratórias e ao muco respiratório, auxiliando na colonização do trato respriatório superior do hospedeiro (BAIR; CAMPAGNARI, 2019).
A M. catarrhalis também pode ser isolada em indivíduos acometidos de infecção respiratória, podendo ser isolada transitoriamente como parte da microbiota da nasofaringe ou do trato respiratório superior, sendo um agente frequente da otite média e sinusite podendo também causar broncopneumonia, pneumonia, endocardite e meningite. Os mecanismos de virulência da M. catarrhalis não são conhecidos (ALTERTHUM, 2015).
O S. aureus também presente nas IVR, causando otite média, infecção de garganta e sinusite. Apresença da proteína clumpingfactor B (ClfB), favorece a
queratinizado da região anterior das narinas (WEIDENMAIER; GOERKE; WOLZ, 2012).
Estudos publicados descrevem que as bactérias supracitadas possuem potencial patogênico para desenvolvimento de tonsilite recorrente em pacientes pediátricos (KALAIARASI et al., 2018; PRATES et al., 2018).
No Brasil, entre janeiro de 2010 e maio de 2020, 13.030.947 de pacientes foram internados em hospitais pelo SUS em decorrência de doenças respiratórias, dos quais se encontram indivíduos acometidos por doenças crônicas das tonsilas e/ou adenoides, sendo 553.511 no país e 18.651 no Estado de Goiás. Dentre os pacientes mais acometidos por tonsilite estão as crianças, que podem apresentar quadros agudos ou crônicos da doença (Brasil, 2020).
1.2.2. Tonsiliterecorrente em crianças
Tonsilas palatinas são agregadas de tecido linfóide, situados na orofaringe e têm como função a produção de linfócitos, os quais são responsáveis pelas defesas imunológicas que ajudam o organismo a se defender de microrganismos que invadem a cavidade nasal e oral (LIMA et al., 2015).
Em determinadas circunstâncias, pode ocorrer infecção viral nas VRS, que irá resultar em infecções das tonsilas, denominadas de tonsilites (GEORGALAS; TOLLEY; NARULA, 2014). Além dos quadros virais, as tonsilites também podem se desenvolver em decorrência de infecções bacterianas oportunistas, causadas por bactérias da própria microbiota como já descritas anteriormente (WANG et al., 2017). Dentre as características das bactérias oportunitas envolvidas nas tonsilites recorrentes, pode-se destacar a capacidade de produzir biofilme, o S. aureus está presente nesses quadros, sendo produtor de biofilme (TORRETTA et al., 2016). A presença desta bactéria na orofaringe também tem sido considerada um dos fatores contribuintes para IVRS, pois muitas cepas têm capacidade de formar biofilme, bem como enzimas β-lactamase, fatores que contribuem significativamente para ocorrência de tonsilite crônica, principalmente em crianças (ZAUTNER et al., 2010).
Várias são as opções de tratamento para os quadros de tonsilites, dentre as quais estão os analgésicos, antiinflamatórios, corticosteróides e a antibioticoterapia. No entanto, o aumento de volume das tonsilas nos casos crônicos pode ser indicativo
de cirurgia, com a retirada do órgão, denominada tonsilectomia (WONG CHUNG; VAN BENTHEM; BLOM, 2018).
1.2.3. Características gerais doS. aureuse as tonsilites recorrentes
Os Staphylococcus (do Grego staphylos [“uva”] e kokkos [“baga” ou “semente”]) são cocos Gram positivos, que podem apresentar-se isolados, aos pares, em cadeias curtas ou agrupados como em cacho de uva (Figura 4). Medem de 0,5 a 1,5 μm de diâmetro, são imóveis, não esporulados, anaeróbios facultativos e produtores de catalase, enzima esta importante na diferenciação do gênero na triagem laboratorial (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
Figura 4: Microscopia de Staphylococcus aureus, após coloração de Gram. Observa-se a forma de cocos, corados em Gram positivo (aumento em 100x)
Fonte: próprio autor
O gênero Staphylococcus contém 32 espécies, das quais 16 fazem parte da microbiota humana (GARCIA; GARCIA; SALAZAR, 2014) e dentre estes, o S.
aureusse destaca como a espécie de maior importância clínica devido aos seus
Tabela 1: principais fatores de virulência associados ao S. aureus
Fatores de virulência Ação dos fatores
Cápsula Protege contra a fagocitose pelos leucócitos polimorfonucleares.
Catalase Protege a bactéria contra o peróxido de hidrogênio, quebrando-o em oxigênio e água.
Hialuronidase Aumenta a disseminação da bactéria no organismo por meio da hidrólise/ quebra do ácido hialurônico.
Coagulase Converte o fibrinogênio em fibrina, o que protege a bactéria da fagocitose.
Leucotoxinas Citotoxinas que atigem os leucócitos. Enterotoxinas, Com ação localizada nas células linfóides do
intestino delgado e desencadeia quadros de vômito e diarreia, caracterizada como superantígeno.
(SANTOS et al., 2007, TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, LEVINSON, 2016).
O S. aureus foi descrito pela primeira vez em 1880, pelo cirurgião escocês Alexandre Ogston, em abscesso purulento cirúrgico, sendo considerado um dos microrganismos mais comuns nas infecções piogênicas em todo o mundo (SANTOS
et al., 2007). Sua distribuição é ampla, sendo capaz de resistir à dessecação e ao frio,
podendo permanecer viável por longos períodos em partículas de poeira (LIMA et al., 2015) e estar presente na microbiota humana em vários sítios.
A colonização por S. aureus na VRS ocorre basicamente na cavidade nasal, sendo classificada de acordo com o estado do portador, podendo ser considerada de três tipos, persistente, intermitente e não portador. Os persistentes são indivíduos que possuem uma cepa específica por longos períodos. Os intermitentes são pessoas cujas cepas colonizadoras mudam com frequência, e o não portador se enquadram aqueles indivíduos que nunca entraram em contato com o S. aureus. Assim, indivíduos portadores são considerados reservatórios e, portanto, fonte importante de propagação da bactéria (SAHIN-YILMAZ; NACLERIO 2011; BIESBROEK et al., 2014).
Fatores como imunodepressão, capacidade bacteriana de evitar a imunidade inata do hospedeiro, hábitos alimentares e idade podem alterar a colonização por S.
aureus. Há evidências que apontam que a colonização persistente por S. aureus é
mais comum em crianças do que em adultos, o que pode ser atribuído às mudanças comuns da colonização microbiana na infância (BIESBROEK et al., 2014). Outro grupo de indivíduos que pode desenvolver uma colonização persistente por esta bactéria são os adultos que trabalham em ambiente hospitalar, devido à maior prevalência do patógeno neste tipo de recinto (OHADIAN; POURMAND;
DAVOODABADI, 2015; BLANCO; O’HARA; HARRIS, 2019).
Inicialmente, a colonização por S. aureus se inicia com a adesão bacteriana nos receptores celulares do hospedeiro. Há diversos fatores que favorecem a adesão e fixação de células planctônicas em uma superfície, muitos relacionados aos fatores de virulência da própria bactéria, como pili, fímbrias e flagelos, que permitem a locomoção e fixação das bactérias nas superfícies (BARBOSA, 2015).
O S. aureus possui proteínas de adesão importantes para essa fixação, denominada adesina intercelular polissacarídica (PIA: Polyssacharide Intercellular
Adhesin) (BOARI, 2008; BATISTÃO, 2014); componentes da superfície microbiana
que reconhecem moléculas da matriz adesiva (MSCRAMMs: microbial surface
components reorgnizing adhesive matrix molecules); proteína G de superfície (SasG: sufarce protein G ) (OTTO, 2009; LAVERTY; GORMAN; GILMORE, 2013); proteínas
ligadoras de fibronectina (Fnbs: Fibronectin-binding protein) e proteínas associadas ao biofilme (Bap: protein associated with biofilm), adesinas importantes na fase inicial da adesão e consequente processo de formação de biofilme (SHINJI et al., 2011).
Estudo mostra que a cavidade nasal de 20% da população é colonizada por S.
aureus de maneira persistente, sendo considerado um dos principais sítios para a
disseminação da bactéria na VRS (SIVARAMAN; VENKATARAMAN; COLE, 2009). Acredita-se que 30% dos indivíduos que desenvolvem infecção por S. aureus na nasofaringe é devido à migração bacteriana de um sítio para o outro (JIMÉNEZ-TRUQUE et al., 2016). A migração pode ainda alcançar a orofaringe, podendo ser detectada na superfície ou no núcleo de tonsilas (PEREIRA et al., 2008).
O S. aureus é um dos patógenos mais frequentes na etiologia das tonsilites e sua relevância se deve à sua resistência aos antimicrobianos e persistência nos tecidos internos das tonsilas, com a formação, sua a frequência do isolamento varia
entre 30% a 70% e é maior do que no caso de S. pyogenes e Haemophilus influenzae
(KATKOWSKA; GARBACZ, 2016).
A vigilância epidemiológica da colonização por Staphylococcus é essencial para reduzir a incidência de clones epidêmicos de S. aureus e para evitar a propagação dos mesmos. A diversidade genética e a distribuição clonal de S. aureus isolado de crianças com tonsilite recorrente ainda é pouco reconhecido (ILCZYSZYN
et al., 2016; GARBACZ et al., 2018)
Mesmo que o papel causador de S. aureus na ainda seja pouco reconhecido, a colonização do trato respiratório por S. aureus pode ter um efeito indireto, pois pode liberar a enzima β-lactamase em seu ambiente, protegendo assim as bactérias. Além disso, a colonização por S. aureus multirresistente aantibacterianos, especialmente S.
aureus resistente à meticilina, é um grande problema clínico, sendo uma das
principais causas do aumento da frequência de infecção recorrente (HOLMES et al., 2016)
A lactamase, enzima que quebra o anel lactâmico dos antibacterianos β-lactâmicos, como penicilina e cefalosporina e componentes associados à formação de biofilme favorecem a presença do S. aureus na orofaringe (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).
1.3. Biofilme bacteriano e tonsilites recorrentes
A produção de uma matriz exopolissacarídica (EPS) a qual permite que diferentes gêneros bacterianos se fixem em distintas superfícies e formem uma comunidade complexa, resulta em uma estrutura denominada biofilme, tendo sido descrito pela primeira vez em 1978 (ANDRE, 2015; BARBOSA, 2015).
Após a fixação bacteriana, o biofilme começa a ser formado em cinco estágios, sendo pré-adesão, adesão reversível, adesão irreversível, maturação e disseminação (ABDALLAH et al., 2014).
Na pré-adesão, células planctônicas recebem estímulo e iniciam a adesão em uma superfície biótica ou abiótica. Na adesão reversível, as células se fixam e formam microcolônias, entretanto ainda é possível observar células voltarem ao seu estado planctônico. No estágio de adesão irreversível, as células se aderem e não voltam ao estado anterior, são então denominadas de células sésseis, havendo formação de grande quantidade de microcolônias, produção de EPS e quorum sensing (QS). Após
esta etapa, ocorre a multiplicação celular e produção de matriz em grande quantidade, por proteínas secretadas pelas próprias bactérias. Nesta etapa, ocorre maior atividade de QS e o biofilme se encontra maduro. Na fase de disseminação, muitas células voltam ao estado planctônico e estas começam a se destacar, deslocar e fixar em outros locais (Figura 5) (BOARI, 2008; LISTER; HORSWILL, 2014; BARBOSA, 2015).
Figura 5: Cinco estágios da formação de biofilme em uma superfície
*QS: Quorumsensing
Fonte: Extraído com adaptações de (MACEDO; ABRAHAM,2009)
Os biofilmes bacterianos podem ser formados tanto em superfícies abióticas quanto em bióticas. Em superfícies bióticas, podem ser os responsáveis por infecções crônicas ou de repetição (THORNTON; COATES, 2012).
Em 2003, foi demonstrado pela primeira vez biofilmes nas criptas e dentro do
tecido amigdaliano de pacientes com tonsilite recidivante (CHOLE; FADDIS, 2003).
Acredita-se que a presença de criptas na anatomia da amígdala seja um fator que contribua para sua formação e, atualmente, este tem sido considerado nos casos de infecções respiratórias pediátricas, incluindo tonsilite recorrente (HAMILOS, 2019).
A presença do biofilme protege o microbioma que o compõe, pois cria uma barreira à ação dos antibacterianos por dificultar sua penetração através da matriz extracelular, o que reduz a sensibilidade bacteriana aos medicamentos (DONG et al., 2015). Bactérias localizadas nas camadas mais internas do biofilme utilizam determinados mecanismos para se protegerem da ação dos fármacos, como redução das taxas metabólicas e de crescimento. Outro fator importante é a distinção fisiológica entre as células bacterianas, as quais podem expressar fatores de proteção específicos, tais como bombasde efluxo (MEN et al., 2016). Assim, dificilmente
antibacterianos irão erradicar completamente os microrganismos presentes em um
biofilme (DUFOUR; LEUNG; LÉVESQUE, 2010).
Igualmente, o sistema imunológico do hospedeiro também encontra dificuldades em penetrar um biofilme, sendo, no entanto, capaz de agir de forma eficaz em células na forma planctônica. Por esses motivos, após a pausa do tratamento com antibacterianos, as células persistentes e protegidas em um biofilme retomam seu crescimento, causando recidivas na infecção (MADIGAN et al., 2016).
1.3.1. Controle de biofilme nas tonsilites recorrente
Em superfícies abióticas, o controle do biofilme é feito a partir da remoção mecânica e posterior utilização de produtos químicos (ANGST; GOMES; OPPERMANN, 2015). No entanto, em superfícies bióticas, sua remoção nem sempre é possível, e o controle é baseado na interrupção do processo inicial da formação do biofilme, com estratégias para inibir a adesão do microrganismo à superfície (ABRAHAM; JEFFERSON, 2012).
O impacto da presença e a dificuldade do controle de biofilme nas IVRS fazem com que o conhecimento de terapias eficazes no controle de bactérias formadoras de biofilme seja primordial para o controle destas infecções (LACERDA; GOMES, 2013). Compreender os mecanismos de ação dos antibacterianos é essencial para o desenvolvimento de meios para potencializar a eficácia e minimizar o avanço da resistência bacteriana (NOGUEIRA et al., 2016).
1.4. Antibacterianos: classificação e mecanismo de ação
Os antibacterianos são classificados de acordo com a origem em naturais, quando obtidos a partir de microrganismos vivos; semissintéticos, quando os naturais são concluídos em laboratório; ou sintéticos produzidos exclusivamente em laboratório (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010). Os antibacterianos também são agrupados de acordo com a estrutura química em diversas classes, as quais estão contidas no quadro 1 (NOGUEIRA et al., 2016).
Quadro 1: Classe dos antibacterianos de acordo com sua estrutura química Principais classes de antibacterianos Exemplos de antibacterianos
Aminoglicosídeos Gentamicina
Ansamicina Rifampicina
Antagonista da via do folato Sulfonamida Trimetoprim Fenicóis Cloranfenicol Fluorquinolona Ciprofloxacina Glicopeptídeos Vancomicina Lincosamidas Clindamicina Lipoglicopeptídeo Teicoplanina Lipopeptídeo Daptomicina
Macrolídeos: possui anel macrocíclico de lactona Eritromicina Nitrofurantoinas Nitrofurantoim Nitroimidazol Metronidazol Outros Fosfomicina Oxazolidona Linezolida Streptogramina Quinupristin-dalfopristin Tetraciclinas: possui quatro anéis em sua
composição
Tetraciclina Oxitetraciclina Doxiciclina β-lactâmicos: possui como estrutura
química central o anel β-lactâmico
Penicilina Monobactâmicos Cefalosporinas Carbapenemas Cefamicina Fonte: (KATZUNG, 2014; CLSI, 2019)
Cada classe de antibacteriano possui um mecanismo de ação específico, que depende do sítio alvo. Após ligação do fármaco com o alvo, pode haver interferência com a síntese da parede celular, funcionamento da membrana citoplasmática, bem como com a síntese de lipídios, proteínas, material genético e folato (Quadro 2) (CANTO, 2010), o que pode resultar em uma ação bactericida, quando ocorre a morte bacteriana, ou bacteriostática, quando há inibição do crescimento bacteriano (TAVARES, 2014).
Quadro 2: Mecanismos de ação e sítio alvo dos principais antibacterianos de importância médica
Mecanismo de ação Sítio alvo Exemplo de antibacteriano Interferência com a
síntese da parede celular
Protein Building Penicillin - PBP
(transpeptidase) β lactâmicos - Penicilina - Cefalosporina - Monobactâmicos - Carbapenêmicos Último aminoácido da cadeia
peptídica
Vancomicina Proteína de membrana carreadora -
bactoprenol Bacitracina UDP-N-acetilglicosaminaenolpiruviltransfera se (MurA) Fosfomicina Interferência com o funcionamento da membrana citoplasmática Constituintes lipoproteicos da membrana Polimixina Despolariza a membrana
citoplasmática de bactérias Gram-positivas Daptomicina Interferência com a síntese proteica Se liga à subunidade 30S do ribossomo Tetraciclinas Aminoglicosídeos Interferência com a síntese proteica Se liga à subunidade 50S do ribossomo Anfenicóis Lincosamidas Macrolídeos Oxazolidinonas Interferência com a síntese de material genético
Liga-se a RNA polimerase DNA dependente
Rifampicina Inibição da DNA girase Fluorquinolona O produto da redução do
metronidazol tem propriedades citotóxicas que se ligam ao DNA
Metronidazol
Interferência com a via de síntese do folato
Inibe a diidropteroatosintetase Sulfonamida
Inibe a diidrofolato redutase Trimetoprim
FONTE: (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2011; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2010, ALTERTHUM, 2015; WANG, 2017)
Durante décadas, os antibacterianos se tornaram o principal meio de tratamento de doenças infecciosas de origem bacteriana. Mas, a partir de 1950, o
aparecimento das resistências começou a ser descritas na literatura e, atualmente, a ineficácia de vários tratamentos resulta na perda de vidas, pois não se tem um antibacteriano capaz de eliminar bactérias multirresistentes (MARQUIOTI; LANES; CASTRO, 2015).
A resistência bacteriana aos antibacterianos em casos de tonsilite recorrente está ligada principalmente à amoxicilina, considerada como primeira escolha para o tratamento das IVRS. A partir da década de 1970, registros de falha da terapia com amoxicilina já começaram a ser publicados, com taxa aproximada de 2 a 10%, sendo a causa mais provável a produção de enzimas que inativam a ação do antibacteriano, mecanismo de resistência comum relacionado ao S. aureus (PICHICHERO, 1995; KATKOWSKA; GARBACZ; STROMKOWSKI, 2016).
Na atualidade, a resistência bacteriana passou a ser um desafio para a saúde pública, sendo que bloquear ou impedir a disseminação das resistências é um desafio ainda maior, pois o problema envolve várias áreas ligadas à saúde, tanto humana quanto animal, bem como o ambiente (ANVISA, 2019).
1.4.1. Antibacterianos: mecanismos de resistência
Ao longo do tempo, as bactérias desenvolveram resistência aos antibacterianos no intuito de garantir a sobrevivência da espécie em seu habitat natural (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2011; TAVARES, 2014). A explicação para o surgimento de bactérias mais resistentes está na teoria da seleção natural das espécies, elaborada por Charles Darwin. Quando se expõem um pequeno grupo de bactérias às substâncias tóxicas, bactérias mais fortes podem sobreviver e posteriormente reproduzir-se. Isso significa que, a cada geração, as bactérias mais resistentes dão origem a outras bactérias que também são resistentes (ANVISA, 2018).
A resistência pode ser classificada em intrínseca ou adquirida, sendo a intrínseca um fenômeno natural, em que bactérias do mesmo gênero ou espécie compartilham do mesmo tipo de resistência, sendo transmitida de forma vertical. Pode ser caracterizada pela ausência de algum processo metabólico que sofre ação do antibacteriano, presença de enzimas que inativam o antibacteriano ou particularidades inerentes à morfologia bacteriana (ANVISA, 2007; BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2011).
A resistência adquirida, no entanto, ocorre a partir de mutações genéticas ou aquisição de genes de resistência, sendo esta aquisição impulsionada pela exposição bacteriana aos antibacterianos em locais como ambiente hospitalar, água e solo (HOLMES et al., 2016).
As mutações contribuem para o aumento da variabilidade genética e podem dar origem às resistências bacterianas, podendo ocorrer de forma espontânea ou induzida. As espontâneas resultam da alteração, inserção ou remoção de bases, enquanto as induzidas ocorrem por ação de agentes químicos ou físicos, como as radiações. As mutações também ocorrem por rearranjos cromossômicos nomeadamente por duplicação, deleção, translocação e inversão (PADILLA; COSTA, 2015).
Quanto à resistência por aquisição genética, pode ocorrer a troca de genes específicos entre bactérias da mesma espécie ou de espécies diferentes, por meio de processos como conjugação, transformação, transdução ou transposição, e envolvem elementos genéticos móveis como plasmídeo, transposon ou genes carreados por bacteriófagos (BAPTISTA, 2013). A função dos genes de resistência em seus reservatórios ambientais pode ser distinta do papel desempenhado em ambientes clínicos. Alteração nos ecossistemas naturais, incluindo a liberação de grande quantidade de antimicrobianos no ambiente, pode alterar a dinâmica populacional microbiana, como a seleção de microrganismos resistentes, o que pode resultar em consequências imprevisíveis para a saúde humana (CAUMO et al., 2010)
Após a ocorrência do processo mutacional ou aquisição de genes de resistência, as bactérias podem expressar a resistência aos antibacterianos de várias formas, como alteração da permeabilidade da parede celular ou membrana citoplasmática, produção de enzimas que inativam os antibacterianos, bomba de efluxo, alteração do alvo ou proteção do sítio de ligação (BLAIR et al., 2015).
Dependendo dos processos mutacionais ocorridos e/ou aquisição de material genético, as bactérias podem apresentar resistência a um tipo ou às várias classes de antibacterianos existentes. Para fins epidemiológicos, as bactérias podem ser classificadas em multirresistente (MDR - do inglês multidrug-resistant), quando não são susceptíveis a pelo menos um agente em três ou mais classes diferentes de antibacterianos; como extensivamente resistente (XDR - do inglês extensively
drug-resistant), bactérias não suscetíveis a pelo menos um agente em todas as classes de
bactérias não suscetíveis a todos os antibacterianos de todas as classes (MAGIORAKOS et al., 2012).
A presença de cepas MDR, XDR ou PDR em infecções associadas a saúde pode ocasionar dificuldades no tratamento, podendo resultar em óbito dos pacientes (WHO, 2014). Em se tratando de tonsilites, a falha no tratamento devido à presença
de bactérias resistentes pode resultar em um quadro de tonsilite recorrente, sendo o
S. aureus um agente importante, seja pela facilidade em adquirir resistência aos
antibacterianos, seja pela capacidade de formação de biofilme (NEJASHMIKJ et al., 2017; CAVALCANTI; et al., 2019).
1.4.2. Mecanismos de resistência doS. aureus aos antibacterianos
A resistência do S. aureusaos ß-lactâmicos deve-se principalmente a dois mecanismos distintos, a produção da enzima extracelular ß-lactamase e a produção modificada da proteína de ligação à penicilina (MENDONÇA et al., 2012).
A enzima ß-lactamase é codificada pelo gene blaZ, que surgiu a partir do processo de transformação genética e geralmente está alocado em plasmídeos, mas também pode ser detectado no cromossomo. A resistência pode ser constitutiva ou regulada pela presença do antibacteriano por meio de dois genes adjacentes, blaI e
blaR1, sendo o primeiro um repressor da transcrição de blaZ e, o segundo, um
anti-repressor (SABAT et al., 2015).
A ß-lactamase é capaz de hidrolisar o anel ß-lactâmico na ligação CO-N (Figura 6), o que resulta na produção de um composto desprovido de atividade antibacteriana, o ácido penicilóico (ZEBA, 2005).
Figura 6: Ação da ß-lactamase no anel ß-lactâmico
Fonte: extraído com adaptações (ZEBA, 2005)
No final da década de 50, a indústria farmacêutica apresentou ao mercado penicilinas sintéticas resistentes à ß-lactamase, oxacilina e meticilina, as quais
passaram a ser alternativas de tratamento para infecções causadas por S. aureus
resistentes aos ß-lactâmicos (MOELLERING, 2012).
Logo após o uso constante das penicilinas sintéticas, resistência de S. aureus à meticilina (MRSA - do inglês methicillin resistant Staphylococcus aureus) foi relatada em 1961, sendo detectada de forma ampla a praticamente todos os ß-lactâmicos como penicilina, meticilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina e cefalosporinas (NADA
et al., 1996).
Esse outro tipo de resistência se deve à aquisição do gene mecA, responsável pela produção modificada da proteína de ligação à penicilina (PBP - do inglês
penicillin-binding protein), chamada de PBP2a ou PBP2´. A PBP2a é uma proteína
ligante de penicilina de baixa afinidade, o que impede a ligação dos ß-lactâmicos ao sítio alvo e consequente ineficácia do tratamento (LIU et al., 2016).
A expressão do gene mecA também pode ser constitutiva ou induzida pelos antibacterianos, tendo sido identificado o elemento regulador mecR1 e mecI, que tem
atividade repressora e anti-repressora, respectivamente (MENDONÇA et al., 2012).
O mecA está inserido em um elemento genético móvel cassilestafilocócico, chamado de SCCmec(do inglês staphylococcal cassette chromosome mec) (Figura 7) (LEE et al, 2018), e possui três elementos genéticos básicos em sua composição, dentre eles os complexos genéticos ccr e mec. Cada elemento contém genes que, quando inseridos no cassete, promoverá resistência específica aos antibacterianos, não só ß-lactâmicos, mas também de outras classes, bem como aos metais pesados (CHAMBERS; DELEO, 2009; LI et al., 2011).
Figura 7: A estrutura do SCCmec
RI*: repetição invertida RD**: repetição direta Fonte: extraído com adaptações de (Hiramatsuet al.,2014)
Atualmente, os elementos SCC mec são classificados nos tipos I a XI, com base na natureza dos complexos genéticos mec e ccr, e são ainda classificados em
diferentes subtipos, de acordo com os segmentos de DNA da região J. Encontram-se descritos também, além do gene mecA, os genes mecB e mecC, bem como os genes que controlam sua expressão (BERGLUND et al., 2008).
O SCCmec permitiu o avanço da resistência aos ß-lactâmicos para várias linhagens clonais de S. aureus suscetível à meticilina (MSSA - do inglês
methicillin-susceptibleS. aureus) (LIU et al., 2016). Durante os anos de 1961 a 1967, ocorreram
vários surtos esporádicos em hospitais relacionados ao MRSA na Austrália e Europa Ocidental. Nos Estados Unidos, o primeiro surto de MRSA foi relatado no Boston City Hospital em 1968. De 1968 a meados da década de 1990, a prevalência de infecções em hospitais causadas por MRSA aumentou continuamente, tornando-o um patógeno endêmico (UCHICAGO, 2010).
Do ponto de vista molecular, o SCCmec auxilia na classificação epidemiológica do MRSA associado à comunidade (CA-MRSA) e o MRSA associado ao hospital (HA-MRSA). Considera-se, para esta classificação, o tipo de complexo genético ccr e a classe do complexo mec que o SCCmec contém (SALMENLINNA; LYYTIKÄINEN; VUOPIO-VARKILA, 2002).
Em 2000, a rede de vigilância do Núcleo Bacteriano Ativo (ABCs) do Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC do inglês Center for Disease Control and
Prevention) propôs uma definição padronizada de CA-MRSA para MRSA isolado de
qualquer local do corpo de pacientes admitidos com menos de 48 horas em um hospital, o que indica infecção prévia ou colonização por MRSA externamente ao ambiente hospitalar, independentemente de os pacientes terem sido hospitalizados no último ano. HA-MRSA são definidos como aqueles que não atendem à definição de CA-MRSA, tendo os pacientes adquiridos à infecção bacteriana após 48 horas de admissão no hospital (MAREE et al.,2007).
Com relação à diferença molecular das cepas HA-MRSA e CA-MRSA, as primeiras carregam um SCCmec de tamanhomaior, geralmente os tipos I, II e III, incluindo genes que codificam resistência aos antibacterianos não β-lactâmicos. As outras possuem um SCCmec de tamanho menor, dos tipos IV e V, e não possuem outro gene de resistência além do mecA (PANTOSTI; MONACO; SANCHINI, 2007).
Antes da década de 1990, a maioria das cepas de MRSA era relatada como HA-MRSA. A partir dos anos 90, as cepas de CA-MRSA têm sido cada vez mais encontradas entre grupos de pacientes sem conexão aparente com hospitais. Vale
representa uma ameaça à disseminação latente de MRSA altamente virulentas (STEFANI et al., 2012).
Além da resistência aos ß-lactâmicos, o S. aureus pode apresentar resistência aos outros antibacterianos, conforme descrição contida no quadro 3.
Quadro 3. Mecanismos de resistência adquiridos do Staphylococcus aureus às principais classes de antibacterianos utilizados na clínica médica
Classe dos
antibacterianos
Mecanismo de
resistência S. aureus Gene envolvido
Localização do gene Aminoglicosídeos Produção de enzimas
modificadoras de aminoglicosídeos (AME)
aac(6’)-aph (2’’) ant(6)-Ia, ant6, aadE ant(9)-Ia, aad(9), spc ant(4’)-Ia, aadD2, aadD, ant(4’ ,4’’)-I aph(3’ )-IIIa Ia, aph(2’’)-bifunctional Plasmídeo Plasmídeo ou cromossomo Plasmídeo Plasmídeo Plasmídeo Plasmídeo Ansamicina Modificação no sítio
alvo de ligação RpoB Cromossomo Antagonistas do folato Inibição da via do folato
sul1, sul2, dfrA, dfrG e dfrK
Cromossomo ou plasmídeo
Fluorquinolonas Modificação no sítio alvo de ligação Expressão da bomba de efluxo
gyrA, gyrB e parE NorA, NorB e NorCparC e IV
Cromossomo Cromossomo
Lincosamidas Modificações no alvo de ligação
Produção de enzimas que alteram o alvo de ligação
Cfr
ermA, ermB ou ermC
Cromossomo Plasmídeo
Macrolídeos Modificações no alvo de ligação
Produção de enzimas que alteram o alvo de ligação
Expressão de bomba de efluxo
Inativação enzimática
Cfr
ermA, ermB ou ermC msrA mph Cromossomo Plasmídeo Plasmídeo Plasmídeo
Oxazolidinonas Modificações no alvo de ligação
Cfr Cromossomo
ß-Lactâmicos Inativação enzimática Modificação do sítio alvo blaZ mecA Plasmídeo SCCmec Tetraciclinas Expressão de bomba
de efluxo Proteína de proteção ribossomal tet(K) ou tet(L) tet(M) ou tet(O) SCCmec Plasmídeo
Fonte: (ANVISA, 2007; UNIFAP, 2007; MELO et al., 2012; CATANHEIRA, 2013; FOSTER, 2017; VESTERGAARD; FREES; INGMER, 2019)
Sendo assim, compreender a dinâmica da colonização das bactérias mais incidentes, as rotas de transmissão, os fatores de risco para a progressão da infecção e as condições que promovem o surgimento de resistência bacteriana aos antibacterianos, permitirá a otimização de estratégias para controlar efetivamente as tonsilites recorrentes em crianças, contribuindo para a melhoria significativa na qualidade de vida dos pacientes afetados.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
• Analisar a presença de colonizantes incidentes de superfície nos três sítios distintos da VRS em crianças com tonsilite recorrente
2.2 Objetivos específicos
• Avaliar a presença de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza e Moraxella catarrhalis nas
três regiões distintas da VRS: fossas nasais, orofaringe e nasofaringe;
• Avaliar qual o melhor sítio de coleta para detectar a presença de colonizantes em crianças com tonsilite recorrente;
• Comparar a quantidade do gênero isolado nas três regiões de coleta; • Realizar teste de sensibilidade aos antibacterianos dos isolados; • Classificar a capacidade bacteriana de formar biofilme;
• Realizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação do gene 16S rRNA seguida de sequenciamento do mesmo gene para confirmação da identificação de gêneros/espécies.
3 MÉTODOS
A dissertação é composta por dois artigos observacional transversal, que irão abordar bactérias isoladas de pacientes com tonsilite recorrente.
4 SUBMISSÕES
Artigo 1 -Characterization of upper respiratory tract isolates from children with recurrent tonsillitis
Aline Cristine Magalhães Costa Messias, Thaís Alves de Oliveira, Carolina Rodrigues Andrade, Raylane Pereira Gomes, Célia Regina Malveste Ito, Aline Rodrigues Gama, Marcos Antonio Batista de Carvalho Júnior, Thaís Reis Oliveira, Letícia Suriano de Almeida Prado, José Daniel Gonçalves Vieira, Melissa Ameloti Gomes Avelino, Lílian Carla Carneiro.
Characterization of upper respiratory tract isolates from children with recurrent tonsillitis
Running headline: Colonizing from respiratory tract
Aline Cristine Magalhães Costa Messias2, Thaís Alves de Oliveira1, Carolina
Rodrigues Andrade2, Raylane Pereira Gomes1, Célia Regina Malveste Ito1, Aline
Rodrigues Gama1, Marcos Antonio Batista de Carvalho Júnior1, Thaís Reis Oliveira2,
Letícia Suriano de Almeida Prado2, José Daniel Gonçalves Vieira1, Melissa Ameloti
Gomes Avelino2, Lílian Carla Carneiro1.
1Pathology Tropical and Health Public Institute- Federal University of Goiás - Brazil
2Medicine Faculty - Federal University of Goiás - Brazil
Objective: To analyze the profile ofairwayUpper Respiratory Tract isolates from children with recurrent tonsillitis. Methods: Samples were taken using nasal cavity, oropharynx and nasopharynx swabs from 30 children before amigdalectomy.
Counting, isolation, identification and sequencing of the 16S rRNA, biofilm production and antimicrobial sensitivity investigation were performed. Results: S. aureus was the only microorganism recovered in 36.6% of patients, being more present in the
oropharynx and with greater resistance to erythromycin 95%, penicillin 85% and cefoxitin 85%. All isolates were formed by biofilm, 20% formed by strongly adherent biofilm. Conclusion: S. aureus resistant and biofilm formed, were isolated in the three studied sites, suggesting that this species contributes to recurrent tonsillitis. Impact of the study: The ability of S. aureus to acquire resistance and its other associated factors such as biofilm formation, can make this microorganism recover more easily
in the microbiota of patients, taking into account the other microorganisms present there after the use of antibacterial.
Keywords: recurrent tonsillitis, Staphylococcus aureus and otorhinolaryngology.
INTRODUCTION
The microbiota of a site is defined by the presence of microorganisms and their metabolites present in the different sites of the host (Thursby and Juge2017). Each site has its own microbiota, with specific species (Foster et al. 2017). The airway Upper Respiratory Tract (URT) is divided into two parts, the upper and the lower and, each of these sites has a specific microbiota, the URT microbiota is distinct from each other and has patterns of colonization and succession. Since early childhood, URT has been colonized by bacterial species of different genera, such as Streptococcus spp.,
Haemophilus spp., Coagulase negative Staphylococcus, Streptococcus viridans, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis and Staphylococcus spp. (Round and Mazmanian 2009; Johnston and Douglas 2018).
Respiratory tract infections are described when they affect the respiratory tract, both upper and lower, in which there is obstruction of the air passage, both at the nasal and pulmonary levels (World Health Organization 2014) being a major concern worldwide, as they are responsible for high morbidity and mortality, especially in children and the elderly (de SteenhuijsenPiterset al. 2015). Although frequent, when infection occurs in URT, they usually do not cause death, but significantly interfere with the individual's quality of life, in addition to generating costs for the country's health (World Health Organization 2014).
The Department of Information Technology of the Unified Health System (DATASUS) recorded that during 10 years (2009 to 2019), 13,030,947 patients were
hospitalized due to respiratory diseases. Of this, 553,511 were individuals affected by chronic diseases of the tonsils and / or adenoids. Children are the patients most affected by tonsillitis and may have acute or chronic illness (Brazil 2020).
Palatine tonsils are aggregates of lymphoid tissue, located in the oropharynx (Lima et al. 2015), in certain circumstances, infections called tonsillitis can occur (Georgalaset al. 2014). In addition to viral conditions, tonsillitis can also develop as a result of opportunistic bacterial infections, caused by bacteria from the microbiota itself: ß-hemolytic Streptococcus of group A, S. aureus and Haemophilus influenzae (Wang
et al. 2017).
Repetitive tonsillitis can occur due to the predominance of Gram-positive bacteria, which produce biofilm, among which is S. aureus (Torrettaet al. 2016). In addition to treatment failure due to the presence of resistant bacteria and, the acquisition of resistance to antibacterials (Nejashmikjet al. 2017; Cavalcanti et al. 2019).
A study conducted in Belgium showed that the nasal cavity of 20% of the population is persistently colonized byS. aureus, considered one of the main sites for the spread of the bacteria in URT (Sivaraman 2009). It is believed that 30% of individuals who develop infection with S. aureus in the nasopharynx, are due to bacterial migration from one site to another (Jiménez-Truqueet al. 2016). Migration can also reach the oropharynx and can be detected on the surface or in the nucleus of tonsils (Pereira et al. 2008).
S. aureus have factors associated with virulence: capsule, catalase,
leukotoxins, cytotoxins, enterotoxins (Levison 2016), coagulase, hyaluronidase (Tong
formation (Murray et al. 2009). These factors make the presence of S. aureusin the oropharynx, stimulating the development of tonsillitis in children (Zautneret al. 2010).
Understanding the colonization dynamics of the most incident bacteria, transmission routes, risk factors for infection progression and conditions that promote the appearance of bacterial resistance to antibacterials; will allow the optimization of strategies to effectively control the bacteria present in recurrent tonsillitis in children, contributing to significant improvement in the quality of life of affected patients. Thus, the objectives of this study were to analyze the profile of URT isolated from children with recurrent tonsillitis.
MATERIALS AND METHODS Obtaining of the samples
The study was a cross-sectional observation from January to December of 2019, submitted to and approved by the Ethics Committee of the Clinical Hospital of the Federal University of Goiás (CEP/HC/UFG), under number 84908818.3.00005083. To obtain the test samples, children who already had surgical indication for tonsil removal were selected who attended the Otorhinolaryngology Clinic of the Federal University of Goiás Hospital. The number of children chosen was based on the flow of surgeries that occurred in this clinic for tonsil removal per year. The sample number of was thirty patients. The samples were collected in three different sites of the URT, nasal cavity, oropharynx and nasopharynx; the samples were obtained before the surgical procedure of tonsillectomy, however, with one patient already sedated. As the children in the test group had undergone recent antibiotic therapy due to recurrent infections, four children who had not used antibacterial for ninety days and had surgical
indication for adenoid hypertrophy only, with no infection present for a control group, were selected. Both samples were processed in the same way.
The clinical specimen of the oropharynx was obtained with a swab, after opening the oral cavity, using a mouth opener, next to one of the anterior tonsillar pillars. The material of the nasal cavity was obtained with a swab, close to the inferior nasal concha, with the aid of a nasal speculum, to prevent contact with the nasal vestibule. In the nasopharynx, the sample was collected with a swab, through the mouth, moving the palate away. The swabs, duly identified, were introduced into Stuart transport medium, later; they were stored at room temperature and transported immediately for processing.
Sample processing and standard plate counting
For processing, the swabs containing the clinical specimens were inserted in
3mL of brain heart broth (BHI). A 101 dilution was performed, transferring an aliquot of
1 mL of BHI with the sample, to a test tube containing 9 mL of peptone water and subsequently homogenized.
An aliquot of 100µL of each dilution was sown, containing salt mannitol agar, GC (gonococcal) base agar, chocolate agar and blood agar. Samples shown on mannitol agar were incubated in aerobiosis at 37 °C for 24 to 48 hours and samples in the other culture media were incubated in CO2 at 37 °C for 24 to 48 hours.
After growth, morphocolonial characterization, counting and isolation of colonies on nutrient agar was carried out, with subsequent incubation. Then, the morphotintorial characterization and the 3% potassium hydroxide test (3% KOH) were performed. Identification of the most incident URT bacteria
After the morphotintorial analysis, the bacteria were subjected to biochemical tests for identification (Table 2), according to the National Health Surveillance Agency (2013) and Konemanet al. (2008).
Table 2. Biochemical evidence used to identify isolated colonizers. Staphylococcus aureus identification
Catalase Oxidase Coagulase DNAse Hemolysis Novobiocin sensitivity Nitrate Acetoin Ureia Arginine Mannitol Maltose Glucose Lactose Sucrose NaCl 10% and 15% BHI a 15°C and 45°C
Streptococcus pyogenes identification
Catalase Hemolysis Bile esculina NaCl 6,5% Bacitracin Sensitivity Sensitivity to TMP-SMZ* CAMP/Hippurate hydrolysis
Streptococcus pneumoniae identification
Catalase Hemolysis Optochin Sensitivity Bile esculina NaCl 6,5% Haemophilus influenzae identification
Catalase Oxidase Motility Índole Ureia Sucrose Blood agar Hemolysis MacConkey agar Lactose Glucose
Moraxella catarrhalis identification Catalase Oxidas
e
Motility Blood agar FO/Glucose DNAse
*TMP-SMZ: trimethoprim sulfamethoxazole
Plaque counting was performed to estimate the number of bacteria in the original sample at each site studied. The calculation used was to take the number of
colonies on the plate and multiply by the sample dilution index = number of bacteria / mL (Tortora et al. 2012).
Antibacterial sensitivity test
Antibiogram tests were performed using the disk diffusion method. The choice of antibacterials was based on recommendations by the Institute of Clinical and Laboratory Standards (CLSI 2019).
At first, a bacterial suspension in 0.85% saline solution was performed until turbidity, corresponding to the 0.5 MacFarland scale. A swab was embedded in this suspension and the sample was seeded on the surface of Mueller Hunton agar. Paper disks containing the selected antibiotics were placed on the agar surface. Subsequently, the plates were incubated at 37 °C for 18 hours. For the reading of the tests, the diameter of the inhibition halos was measured and the results were interpreted according to the CLSI (2019).
For S. aureus, Ciprofloxacin (CIP) 5 µg, Cefoxitin (CFO) 30 µg, Gentamicin (GEN) 10 µg, Penicillin (PEN) 10 µg, Clindamycin (CLI) 2 µg, Erythromycin (ERI) 15 µg, Sulfamethoxazole and associated trimethoprim (SUT) 30 µg, Linezolid (LNZ) 30 µg, Rifampicin (RIF) 5 µg and Tetracycline (TET) 30 µg. The clindamycin resistance induction test, called the D test, was performed to detect resistance to macrolides, lincosamides and streptogramins. For this, the erythromycin and clindamycin discs were placed 15 mm apart and the result was considered positive when there was a flattening of the clindamycin inhibition halo, in the space among the erythromycin discs. To evaluate the activity of β-lactamase resistance, mediated by the blaZ gene, the measure of the penicillin halo was considered. The isolates were indicative of enzymatic activity, with the formation of an inhibitory halo ≤ 29 mm in the penicillin disc,
