UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUA ÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONA L DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, INTERDISCIPLINA R, ACERVO, PIBIT, EBTT E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período : Agosto/2016 a Fevereiro/2017 ( x ) PARCIAL
( ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): ESTUDO IN VITRO E IN VIVO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE PRODUTOS OBTIDOS A PARTIR DE IMOBILIZAÇÃO DE FUNGOS LIQUENIZADOS DA AMAZÔNIA: UMA ALTERNATIVA PARA A PRODUÇÃO DE FÁRMACOS
Nome do Orientador: Solange do Perpetuo Socorro Evangelista Costa
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade: Biomedicina
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório: Micologia
Título do Plano de Trabalho: Avaliação antifúngica de extratos liquênicos sobre fungos filamentosos e leveduras.
Nome do Bolsista: Marcicleide Costa da Silva
Tipo de Bolsa: (x) PIBIC/UFPA-AF
INTRODUÇÃO
Ao longo da história houve uma busca por medicamentos para a cura de doenças infecciosas. O primeiro a ser utilizado foi “salvarsan”, produto que usava as arsfesnamina, para o tratamento da sífilis em 1907, sendo este descoberto por Paul Ehrlich e Hata. Entretanto, tal medicamento entrou em desuso após a descoberta da penicilina em 1928 por Alexander Fleming. Atualmente há uma grande quantidade de antibióticos de origem natural, sintética ou mista, onde há a modificação estrutural de compostos obtidos naturalmente, que visam, em si, aumentar atividade e especificidade do fármaco (GOODMAN & GILMAN 1990). Porém, por muito tempo a classe médica possuía um número limitado de fármacos antifúngicos a que recorrer como, por exemplo, a anfotericina B, fluconazol e itraconazol. E apesar desses fármacos serem muito eficazes contra grande parte das infecções fúngicas, apresentavam o inconveniente de toxicidade e limitação devido a mecanismos de resistência desenvolvidos pelos fungos (BOUCHER et al, 2004; CARRILLO-MUÑOZ et al, 2006).
Segundo Cury, 2010, há um número razoável de antifúngicos comercialmente disponíveis e alguns estão sob investigação clínica, porém tem seus alvos muito restritos. E de acordo com Anderson (2005), esta restrição se deve às similaridades filogenéticas entre a célula animal e fúngica, já que ambos são seres eucarióticos.
Os liquens são associações simbióticas entre fungos (micobionte) e algas ou cianobactérias (fotobiontes) e produzem inúmeros metabólitos que exercem uma variedade de atividades metabólicas, dentre elas a atividade bacteriana, antimicótica, anti-inflamatória, antineoplasica, antiparasitária, anticoagulante e antitrombótica (MAIA et al, 2014). Além da aplicação farmacológica, as substâncias liquênicas também são amplamente empregadas nas indústrias têxteis e de alimentos (NOBREGA et al, 2012).
Levando em consideração as restrições que são atribuídas aos antifúngicos presentes no mercado, e tendo em vista os liquens têm uma ampla atividade biológica e ainda são relativamente pouco estudados, este trabalho tem por objetivo investigar a atividade antifúngica dos liquens frente à dermatófitos e fungos oportunistas.
JUSTIFICATIVA
Os líquens, bem como as plantas possuem as principais fontes de bioativos para produção de novos medicamentos e sintetizam vários componentes bioativos, que por vezes constituem mais de 30% da massa seca de seu talo (HOSTETTMANN et al, 1997; GALUN, 1988.). E Através de imobilizações celulares e enzimáticas é possível a obtenção contínua de compostos liquênicos a partir do talo in natura, impedindo a destruição de grande quantidade de biomassa (NOBREGA, 2002). O primeiro estudo sobre as propriedades antibióticas dos liquens foi feito por Burk-Holder em 1944 (e citado por Vartia em 1973). São conhecidas cerca de 20 mil espécies de liquens, em parte isto se deve à falta de conhecimento sobre suas “aplicações práticas” (SPIELMAN et al, 2006). Apesar disso, atualmente, a literatura mundial na área apresenta uma significativa quantidade de estudos que demonstram o conhecimento sobre as atividades destes micro-organismos. Há relatos sobre a eficácia de substancias liquênicas sobre bactérias (FALCÃO et al, 2004), protozoários que são a causa de zoonoses (URDAPILLETA, 2006), sobre vírus (COHEN et al, 1996; ASAHINA E SHIBATA, 1954), e além de apresentar atividade antitumoral (BOGO, 2012).
No Brasil, poucos são os grupos de pesquisadores que desenvolvem estudos sobre as atividades biológicas de liquens e seus metabolitos. Maia, et al, 2012, realizou uma pesquisa em cinco bases de dados e encontrou apenas 21 artigos de pesquisadores brasileiros relacionando liquens e suas atividades biológicas no período de 2001 e 2011. Esses fungos liquenizados, de maneira geral, têm sido muito pouco estudados no Norte brasileiros, no que diz respeito à sua taxonomia e ecologia. Porém, recentemente, estudos mais completos sobre a diversidade de liquens em remanescente de Mata Atlântica e em algumas áreas da Amazônia resultaram no registro de uma grande quantidade de espécies novas para a ciência (CACERES et al, 2014).
O reino Fungi apresenta patógenos que podem causar infecções em seres humanos e também em animais, cujas infecções podem ser superficiais benignas, cutâneas, subcutâneas e sistêmicas. As micoses cutâneas estão entre as infecções fúngicas mais comuns, sendo principalmente causadas por fungos filamentosos queratinofílicos, que utilizam a queratina como nutriente durante a infecção de pele, cabelos e unhas. Esses fungos são denominados dermatófitos e estão classificados em três gêneros: Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Segundo a Organização Mundial da Saúde, os dermatófitos afetam cerca de 25% da população mundial. E estima-se que 30 a 70% dos adultos sejam portadores assintomáticos desses patógenos e que a incidência dessa doença aumente com a idade (PERES et al, 2010).
Fungos do gênero Aspergillus são filamentosos e encontrados em todas as estações do ano, dispersos no solo, em vegetais ou qualquer matéria em decomposição, o que garante a dispersão dos seus esporos (conídios), a forma infectante. E as espécies de Aspergillus flavus e Aspergillus niger são umas das responsáveis pela aspergilose pulmonar, podendo ser tratada com Anfotericina B, porém, esse medicamento apresenta toxicidade e sua administração, portanto, deve ser monitorada ou usar um antifúngico alternativo, no caso, o variconazol (Murray et al, 2006).
A zigomicose ou mucormicose é uma infecção fúngica incomum, causada por fungos do subfilo Mucoromycotina, sendo Rhizopus o gênero mais frequente. O curso clínico da doença e a evolução costumam ser fulminantes, devido ao crescimento rápido do fungo e a destruição paralela dos tecidos, o que demanda diagnóstico precoce e pronto tratamento clínico e cirúrgico (SEVERO, 2002). O tratamento de escolha é anfotericina B, mas não tem uma dosagem definida. Os antifúngicos azólicos não têm atividade comprovada na zigomicose, mas a terapia oral com posaconazol parece ser promissora em pacientes com doenças hematológicas malignas (ROGERS, 2008).
Scedosporium apiospermum é um fungo filamentoso ubíquo capaz de causar doença
invasiva. A infecção causada por este agente é rara, mas está associada a alta mortalidade. O diagnóstico precoce por cultura é importante, já que este fungo é resistente à anfotericina B, rotineiramente utilizada na terapia empírica de infecções fúngicas invasivas. O tratamento mais eficaz para essa infecção é a com a combinação de um antifúngico e cirurgia (CASTIGLIONE, 2002).
Segundo ROCHA & SIDRIM, 2004, o arsenal terapêutico antifúngico tem aumentado, mas ainda é restrito se for comparado ao de antibacterianos. E além das restrições, ainda há as limitações que inclui desde biodisponibilidade, eficácia e feitos colaterais. Levando em consideração todos esses fatores, a busca por fatores antifúngicos em organismos pouco estudados, como os liquens, pode acelerar e abrir caminhos para a descoberta de antibióticos. Já que é de conhecimento que os micro-organismos, como as bactérias e os fungos, têm apresentado mecanismos de resistências às drogas utilizadas atualmente.
Neste contexto, pesquisas que envolvam a busca de substâncias em micro-organismos ainda pouco explorados, podem acelerar o processo de descoberta de novos antibióticos importantes num cenário de rápido desenvolvimento de resistência por bactérias e fungos aos agentes terapêuticos disponíveis.
Desta maneira justifica-se esta pesquisa que busca consolidar esta linha de pesquisa para a região, além de contribuir para a formação de recursos humanos e propiciar subsídios para busca
OBJETIVOS:
Objetivo geral
Promover o desenvolvimento de pesquisa em micologia aplicada, testando substâncias liquênicas oriundas da região amazônica e outras regiões sobre leveduras e fungos filamentosos com potencial patogênico, além de estimular a prática científica de discentes, buscando despertar o interesse e a formação de novos micólogos que possam vir a atuar na região Amazônica.
Objetivos Específicos
- Avaliar atividade antifúngica de extratos brutos de fungos liquenizados frente a espécies de
Candida e Cryptococcus, dermatófitos e outros fungos com potencial patogênico.
- Possibilitar treinamento de aluno de graduação em pesquisa na área de micologia básica e aplicada.
MATERIAL E MÉTODOS
Extrato liquênico
Foram utilizados os extratos éter-acetato de etila e clorofórmio-acetronitrila de Cladonia
substellata (Vain. 1887) imobilizado nas concentrações de 2mg/mL, provenientes da Campina do
Guajará no município de Acará, no estado do Pará, Brasil.
Fungos testados
Para a atividade antimicrobiana foram utilizadas amostras de origem clínica e ambiental, incluindo os fungos oportunistas Rhizopus com crescimento de 3 dias, Aspergillus flavus e A. níger com 5 dias de crescimento, além de Scedosporium apiospermum com um período de 20 dias de crescimento. E os dermatófitos Trichophyton mentagrophytes (197/12) com 7 dias de crescimento e
Microsporum canis (100/14) e Trichophyton rubrum (048/11), ambos 20 dias de crescimento. A
amostras fazem fazem parte da micoteca didática do laboratório de Micologia/ICB/UFPA.
- PROCEDIMENTO
Preparo do inóculo
Na condução do estudo, das cepas cultivadas em placa de Petri de 90x15mm, foram preparadas suspensões em 5 mL solução salina com Tween 80 a 1%., no padrão 0,5 da escala de escala de McFarland que corresponde a aproximadamente 1,5 x 106UFC/mL. Em seguida os tubos foram homogeneizados no agitador (Phoenix AP56).
Método da difusão em ágar- Técnica do poço
A atividade antifúngica foi avaliada através da técnica do poço. Foram coletadas 250µL das suspensões e adicionadas a frascos contendo 25 ml de ágar Sabouraud dextrose fundido e desaquecido. Em seguida, o meio contendo o inóculo foi vertido em placa de Petri de 90x15mm. Após a solidificação do meio, com auxílio de um furador metálico estéril foram realizados 4 furos de 8 mm de maneira equidistantes. Em cada poço foram adicionados 20 µL dos extratos liquênicos de Cladonia substellata imobilizados. Bem como 20µL de anfotericina B 250µg/mL (controle positivo) e dimetilsulfóxido (controle negativo). As placas foram incubadas à temperatura ambiente e observadas até 8 dias, de acordo com o desenvolvimento de cada espécie.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As análises das amostras foram feitas a cada 24 horas até o oitavo dia, sendo observado o crescimento microbiano em todas elas, porém, não foram observadas halos de inibição frente aos extratos liquênicos testados (Tabela 1).
Tabela 1: Halo de inibição do crescimento de dermatófitos e fungos oportunistas frente a cladonia substellata.
Fungos Cladonia substellata Controle + Controle -
Ext. éter-acetato de etila Ext. clorofórmio-acetonitrila Anfotericina B DMSO Microsporum canis 0 0 0 0 Microsporum mentagrofites 0 0 0 0 Trichophyton rubrum 0 0 0 0 Aspergillus flavus 0 0 10 mm 0 Aspergillus níger 0 0 12 mm 0 Rhizopus 0 0 17 mm 0 Scedosporium apiospermun 0 0 0 0
A análise do ensaio demonstrou que os extratos de Cladonia substellata proveniente do estado do Pará foram inativos contra todos os fungos testados. Resultados similares foram observados por Ribeiro et al., (2006) cujos resultados evidenciaram sensibilidade de dermatófitos frente ao extrato do mesmo líquen, proveniente de Minas Gerais, enquanto que extratos liquênicos oriundos do estado do Pará foram inativos, sugerindo que origem geográfica destes liquens pode influenciar na composição das substâncias liquênicas. Outros fatores também têm sido mencionados tais como variação de temperatura, umidade e luminosidade, os quais podem ter interferência na atividade fisiológica liquênica, afetando a síntese de seus metabólitos (HALE, 1983.; CUBERSON et al, 1983).
Deve se ressaltar que os fungos filamentosos são ainda pouco explorados em estudos de atividade antifúngica tendo em vista a dificuldade de métodos adequados para os ensaios e às
unicelulares, os filamentosos formam filamentos (hifas) que se ramificam e crescem em todas as direções e nem sempre esporulam. Neste estudo, observou-se que algumas cepas apresentaram resistência ao antifúngico utilizado. Em relação aos dermatófitos o que pôde ter ocorrido foi que algumas cepas não estão esporulando facilmente. As suspensões, neste caso, foram feitas com fragmentos do micélio, o que contribuiu para crescimento irregular e esparso sobre o meio e com isto interferindo na leitura. No entanto S. apiospermum cresceu uniformemente, porém igualmente, se apresentou resistente à anfotericina B. Trata-se um fungo oportunista, os quais em geral são refratários aos antifúngicos. Imagens do estudo são apresentadas nas Figuras 1 a 2).
Com base nessas informações, sugerem-se novas coletas e extração com diferentes solventes de liquens para novos testes sobre dermatófitos, fungos oportunistas e fitopatógenos cujas colônias estejam esporulando.
Figura 1: Teste de atividade liquênica sobre Trichophyton mentagrophyfites , Rhizopus e Scedosporium
apiospermun , respectivamente.
PUBLICAÇÕES
Pretende-se submeter um resumo do trabalho aoo 29º Congresso Brasileiro de Microbiologia, que será realizado no período de 22 a 25 de outubro de 2017, em Foz do Iguaçu – PR ou em outro evento na área de microbiologia.
ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES
Para os próximos meses propõe-se a aperfeiçoamento dos testes já realizados, corrigindo-se falhas e problemas ocorridos com o cultivo de algumas colônias de dermatófitos.
Realizar excursão visando coletar novas espécies de liquens da região Amazônica, realizar extração e novos contra dermatófitos, oportunistas incluindo as leveduras C. albicans e C. neoformans.
CONCLUSÃO
Considera-se há necessidade de ampliar os estudos com diferentes solventes, bem como realizar testes com maior número de espécies fúngicas, incluindo as leveduras.
Será dada continuidade aos ensaios testando-se extratos de espécies liquênicas oriundas da região Amazônica, contra fungos com potencial patogênico de interesse na medicina humana, veterinária e fitopatologia.
Embora o estudo preliminar não tenha sido detectada atividade antifúngica frente aos dos extratos de Cladonia substellata imobilizado sobre dermatófitos e fungos oportunistas, será dada continuidade aos ensaios, testando-se novos extratos contra fungos com potencial patogênico de interesse na medicina humana, veterinária e fitopatologia.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Amorim, D.S.; De Maria-Moreira, N.L.; Amorim, C.D.R.; Santos, S.S.; Oliveira, J.M.; Nunes, P.C.; Oliveira, P.C.; Gomes, P.A. Infecções por Aspergillus spp: aspectos gerais . PULMÃO RJ, Volume 13 , Nº 2 , Jun, 2004.
Asahina Y. & Shibata, S. 1954. Chemistry of lichen substances. Japan Society for the Promotion of Science.
BOGO, D. Avaliação da atividade antitumoral in vitro e in vivo de compostos de liquens. 2012. 110f. Doutorado. Programa de PósGraduação em Saúde e
Desenvolvimento na Região Centro-oeste. Universidade Federal do Mato Grosso do Sul. Mato Grosso do Sul.
Cáceres, M.E.S.; Nascimento, E.L.L.; Aptroot A., Lücking R. Liquens brasileiros: novas
descobertas evidenciam a riqueza no Norte e Nordeste do país . Bol. Mus. Biol. Mello leitão.
Outubro, 2014.
Castiglioni, B. M.D., Sutton, D.A PH.D., Rinaldi, M.G PH.D., Fung, J. M.D., PH.D., Kusne, S.
M.D. Pseudallescheria boydii (Anamorph Scedosporium apiospermum)
Infection in Solid Organ Transplant Recipients in a Tertiary Medical Center and Review of the Literature. 16f. Vol. 81, No. 5. 2002.
Cohen, P. A.; Towers, G. H. N. Biosynthetic studies om chlorinated anthraquinones in the
lichen nephroma laevigatum. Phttochemistry. v. 42, p. 1352-1329, 1996.
Falcão, S.P.E, Da Silva N.H, Gusmão NB, Ribeiro, S.M, Pereira, E.P. Atividade antimicrobiana de derivados fenólicos do líquen Ramalina sorediosa (B. de Lesd.) Laundron. Acta bot. bras. 18(4):911-918. 2004.
Goodman, L.S. & A. Gilman. “The Pharmacological Basis of Therapeutic”, 8ª ed. p.1018. 1990. Galun, M. (1988): CRC Handbook of Lichenology. CRC Press, Boca Raton, Florida,
Hostettmann K, Wolfender JL, Rodriguez S. Rapid detections and subsequent isolation of bioactive
constituents of crude plant extracts. Planta Medica.1997; 63, p.2-10.
Moreira, M.I.M.C.G. Azoís: Farmacologia e interacções medicamentosas. Universidade Fernando Pessoa. Porto, 2010.
Murray, P. R., Rossenthal, K. S. e Pfaller, M. A. (2006). Microbiologia: Médica, 5º edição, Elsevier Editora Ltda, pp. 770-773.
MKosanić, M.; Ranković, B. screening of antimicrobial activity of some lichen species in vitro. Kragujevac J. Sci. 65-72. 2010.
Nóbrega, N.A.; Ribeiro, S.M.; Pereira, E.C.; Marcelli M.; Martins, M.C.B.; Falcão E.P.S.; Gusmão, N.B.; Silva, N.H. Produção de compostos fenólicos a partir de células imobilizadas do
líquen Parmotrema andinum (Müll. Arg.) Hale e avaliação de atividade antimicrobiana.
Acta Botânica Brasilica 26(1): 101-107. 2012.
Nóbrega, N.A. Produção de com postos fenólicos por células imobilizadas do líquen
Parmotrema andinum (Müll. Arg.) Hale. 2002. 53f. Mestrado em bioquímica. Centro de
Ciências biológicas, Universidade federal de Pernambuco. Pernambuco.
Oliveira, J.M.; Nunes, C.P.; Oliveira, P.C.; Aspergilose. In: Siqueira-Bastista R, Gomes AP, Santos SS, Almeida LC Figueiredo CES, Pacheco SJB. Manual de infectologia. Rio de Janeiro: Revinter; 2002. p.461-4.
PEREIRA, E.C.; FILHO, F.O.M.; MARTINS, M.C.B.; BURIL, M.L.L.; RODRIGUES, B.R.M. A
liquenologia Brasileira no inicio do século XXI. Pág. 185-192. CCS gráfica e editora
LTDA.Camaragibe. Pernambuco, 2012.
PERES, N.T.A., ROSSI, A., MARANHÃO, F.C.A., MARTINEZ-ROSSI, N.M., Dermatófitos:
interação patógeno-hospedeiro e resistência a antifúngicos. Anais Brasileiros Dermatologia.
2010
Ribeiro, M. S.; Pereira, C. E.; Gusmão, B. N.; Falcão, P. E.; Silva, H. N. Produção de metabólitos bioativos pelo líquen Cladonia substellata Vainio. Acta bot. bras. 20(2): 265-272. 2006.
Spielmann, A.A. Fungos liquenizados (liquens). Seção de micologia e liquenologia. 13f. Estágio. São Paulo, 2016.
Severo, C.B., Guazzelli, L.S.; Severo, L.C. Curso de Atualização – Micoses. Capítulo 7 – Zigomicose. J BRAZ PNEUMOL. 134-141. 2010.
Rogers, TR. Treatment of zygomycosis: current and new options. J Antimicrob Chemother. 2008;61 Suppl 1:i35-40.
DIFICULDADES
Os principais fatores negativos que interferiram na execução do projeto foram a dificuldade de se obter culturas esporulantes no caso dos dermatófitos, os quais que têm facilidade em sofrer pleomorfismo, além das contaminações que levam a sucessivos repiques para que trabalhemos com culturas puras.
PARECER DO ORIENTADOR:
A discente realizou as atividades propostas no plano com empenho, compromisso, e demonstrando interesse pela pesquisa. Neste sentido avalio que a bolsista alcançou os objetivos.
DATA, 06 de março de 2017
ASSINATURA DO ORIENTADOR
____________________________________________ ASSINATURA DO ALUNO
