MICROEXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DISPERSIVA ASSISTIDA POR VORTEX E ULTRASSOM APLICADA À DETERMINAÇÃO DE DIFERENTES CLASSES DE PESTICIDAS EM ÁGUA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

MICROEXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DISPERSIVA

ASSISTIDA POR VORTEX E ULTRASSOM APLICADA À

DETERMINAÇÃO DE DIFERENTES CLASSES DE

PESTICIDAS EM ÁGUA

Mestranda: Jaqueline da Silva Duarte Orientador: Dr. Ricardo Dalla Villa

Mestrado em Química, Área de Concentração em Química Analítica e Ambiental

CUIABÁ

MATO GROSSO – BRASIL

2015

JAQUELINE DA SILVA DUARTE

MICROEXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DISPERSIVA

ASSISTIDA POR VORTEX E ULTRASSOM APLICADA À

DETERMINAÇÃO DE DIFERENTES CLASSES DE

PESTICIDAS EM ÁGUA

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre em Química, Área de Concentração em Química Analítica e Ambiental.

CUIABÁ

MATO GROSSO - BRASIL

2015

JAQUELINE DA SILVA DUARTE

MICROEXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DISPERSIVA

ASSISTIDA POR VORTEX E ULTRASSOM APLICADA À

DETERMINAÇÃO DE DIFERENTES CLASSES DE

PESTICIDAS EM ÁGUA

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre em Química, Área de Concentração em Química Analítica e Ambiental.

APROVADA: 28/07/2015

____________________

Profª Drª Eliana Freire Gaspar de Carvalho Dores

______________________________

Profª Dr. Eucarlos de Lima Martins

______________________________

Prof. Dr. Ricardo Dalla Villa (Orientador)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Divisão do mercado mundial de pesticidas em 2010 (ANVISA-UFPR,

2012). ... 22

Figura 2 -Representação esquemática das técnicas de microextração líquido-líquido

dispersiva. (adaptado ANDRUCH et al., 2013). SE: solvente extrator; SD: solvente dispersor, S: surfactante, LI: líquido iônico. ... 28

Figura 4 - Representação esquemática do procedimento de extração dos analitos de

amostras de água por USVADLLME. ... 38

Figura 5 – Cromatograma de um padrão misto em tolueno a 5,00 μg mL-1 _{dos analitos} e 200 μg mL-1 _{do padrão interno. Acima, à direita, descrição e identificação dos picos} e íons monitorados, com os íons principais em negrito. ... 40

Figura 6 - Curvas analíticas para a avaliação da linearidade instrumental. ... 41 Figura 7- Recuperação dos analitos com diferentes solventes extratores. Condições

de extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _{de cada pesticidas; 100 µL} de solvente extrator; 10 minutos de sonicação a 40º C (n = 3). ... 42

Figura 8 - Correlação entre a recuperação e o logKow dos analitos. Condições de

extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _{com os analitos; 100 µL de} solvente extrator; 10 minutos de sonicação a 40º C (n = 3). ... 43

Figura 9- Recuperação dos analitos em ensaios com diferentes volumes de extrator.

Condições de extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _{com os analitos;} 10 minutos de sonicação a 40º C (n = 3). ... 44

Figura 10 - Recuperação dos analitos a partir de amostras com diferentes valores de

força iônica. Condições de extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _com os analitos; 100 µL de solvente extrator (tolueno); 1 minuto de sonicação a 40 ºC (n = 3). ... 45

Figura 11- Recuperação dos analitos a (11A) diferentes temperaturas e (11B) tempos

de sonicação. Condições da extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _com os analitos; 100 µL de solvente extrator tolueno, (n = 3). ... 46

Figura 12 – Cromatograma (A) do branco analítico contendo padrão interno a 200 μg

mL-1_{,(B) de um padrão em tolueno a 1,00 μg mL}-1 _{dos pesticidas e (C) de um extrato} de uma água ultra pura fortificada a 20,00 μg L-1 _{com os analitos. ... 48}

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação de pesticidas de acordo com o grupo de organismo que

controla... 19

Tabela 2 - Classificação dos pesticidas de acordo com os efeitos à saúde

humana. ... 2120

Tabela 3 - Pesticidas em águas superficiais, de poços artesianos (potável) e de chuva

em Lucas do Rio Verde, MT; amostras coletadas entre set.2007 a abr.2009. ... 2423

Tabela 4 - Exemplos de aplicação de USVADLLME. SE: solvente extrator, US:

ultrassom, C: centrifugação, LD: limite de detecção...24

Tabela 5 - Fórmulas estruturais, classe, grupo químico, logaritmo do coeficiente de

partição octanol/água (log Kow), solubilidade em água (SA) em mg L-1 a 20o _{C e} cologaritmo da constante de acidez (pKa) dos pesticidas estudados...34

Tabela 6 – Valores de LDI, LQI e CV da resposta instrumental para diferentes

concentrações dos analitos. ... 4139

Tabela 7 – Repetitividade (Rep), precisão intermediária (PIn), porcentagem de

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

AOAC- Associação Oficial dos Químicos Analíticos, do inglês Association of Official Analytical Chemists

AME - Ametrina ATZ- Atrazina C – Centrifugação

CE – Condutividade elétrica

CONAB – Conselho Nacional de Abastecimento CONAMA- Conselho Nacional do Meio Ambiente COT- Carbono Orgânico Total.

CV- Coeficiente de Variação.

GC - FPD – Cromatografia a gás acoplado ao detector fotométrico de chama, do inglês gas chromatography -flame photometric detector

GC-ECD – Cromatografia a gás com detecção de captura de elétrons, do inglês gas chromatography - electron capture detector

GC-MS- Cromatografia a gás acoplada ao detector de espectrômetro de massas, do inglês gas chromatography - mass spectrometry

GC-IT-MS- Cromatografia a gás acoplada ao detector de espectrômetro de massas de armadilha, do inglês gas chromatography - mass spectrometry ion trap

DLLME- Microextração líquido-líquido dispersiva, do inglês dispersive liquid liquid microextraction

DL50- Dose Letal, do inglês Lethal Dose EPA- Environmental Protection Agency FLU- Flutriafol

HEX - Hexazinona

INMETRO- Instituto Nacional de Metrologia e Tecnologia

HPLC- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência do inglês high performance liquid cromatography

LD – Limite de Detecção

LDI- Limite de Detecção Instrumental. LDM- Limite de Detecção do Método.

LLE – Extração líquido-líquido, do inglês liquid liquid extraction Log Kow- logaritmo do coeficiente de partição octanol/água LQ – Limite de Quantificação

LQI- Limite de Quantificação Instrumental. LQM- Limite de Quantificação do Método

m/z – Razão massa/carga, do inglês mass to charge ratio n – Número de medidas

SPE- Extração em fase sólida, do inglês solid phase extraction OMS- Organização Mundial da Saúde

pKa - cologaritmo da constante de acidez PI - padrão interno

PIn - precisão intermediária PRO - Prometrina

r – Coeficiente de correlação Rec% - Porcentagem de recuperação Rep - Repetitividade

Rs - resolução TER- Terbutilazina SA- solubilidade em água

SIM – monitoramento seletivo de íons do inglês selective ion monitoring S/N – Razão sinal ruído, do inglês signal to noise ratio

ST-DLLME - solvent-terminated dispersive liquid liquid microextraction

UA- DLLME – microextração líquida-líquida dispersiva – assistida por ultrassom do inglês dispersive liquid liquid microextraction ultrasound-assisted

UA- IL- DLLME – microextração líquida-líquida dispersiva com líquido iônico assistida por ultrassom do inglês ultrasound-assisted ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction

UASEME - microextração com emulsificação reforçada com surfactante assistida por ultrassom do inglês ultrasound-assisted surfactant-enhanced emulsification microextraction

UDSA-DLLME - up-and-down-shaker-assisted dispersive liquid–liquid microextrac-tion

USVADLLME – microextração com emulsificação assistida por vortex e ultrassom do inglês ultrasound-assisted emulsification microextraction

RESUMO

DUARTE, Jaqueline da Silva, Universidade Federal de Mato Grosso, julho de 2015.

Microextração líquido-líquido dispersiva assistida por vortex e ultrassom aplicada à determinação de diferentes classes de pesticidas em água.

Orientador: Ricardo Dalla Villa.

Neste trabalho foi desenvolvido e validado um método de microextração líquido-líquido dispersiva com emulsificação assistida por vortex e ultrassom (USVADLLME) para determinação simultânea de quatro triazinas (ametrina, atrazina, prometrina e terbutilazina), duas triazinonas (metribuzina e hexazinona) e um triazole (flutriafol) em água. A quantificação dos analitos foi feita por cromatografia a gás com detector de massas (GC/EM). A condição experimental que proporcionou os melhores resultados foi: 5,00 mL de amostra, 100 µL de solvente extrator tolueno e 1 minuto de sonicação a 40º C. Com esta condições, os limites de detecção do método (LDM) variaram de 0,10 a 2,71 µg L-1 _{para o terbutilazina e} flutriafol respectivamente. A faixa linear de trabalho foi de 1,0 - 150,0 µg L-1_{. A} exatidão, medida em termos de porcentagem de recuperação, foi superior a 77,2%, para todos os analitos avaliados. A repetititividade e a precisão intermediária, variaram de 1,4 a 9,0% e 2,9 a 15%, respectivamente. A USVADLLME também foi aplicada em amostras de água de rio e de córrego, com diferentes propriedades físico-químicas e não foram observados efeitos de matriz sobre a exatidão e precisão do método. Estes resultados sugerem que a USVADLLME -CG/EM pode ser utilizada na determinação dos referidos analitos em água, com a vantagem de utilizar pequenas quantidades de solventes, ser de simples operação e de baixo custo.

ABSTRACT

DUARTE, Jaqueline da Silva, Universidade Federal de Mato Grosso, julho de 2015.

Liquid-liquid microextraction dispersive assisted by vortex and ultrasound applied to the determination of different classes of pesticides in water.

Advisor: Ricardo DallaVilla.

This study comprised the development and validation of a method of liquid-liquid microextraction dispersive with emulsification assisted by vortex and ultrasound (USVADLLME) for the simultaneous determination of four triazines (ametrina, atrazine, prometryne and terbuthylazine), two triazinones (metribuzin and hexazinone) and one triazole (flutriafol) in water. The analytes quantitation was performed by gas chromatography with mass detection (GC-MS). The experimental condition that provided the best results were: 5.00 mL of sample, 100 µL extractor solvent toluene and 1 minute of sonication at 40º C. At this conditions, the method detection limit (MDL) ranged from 0.10 to 2.71 μg L-1 _{for flutriafol to terbuthylazine,} respectively. The linear working range was 1.00 to 150 μg L-1_{. The accuracy,} measured in terms of percentage recovery was greater than 77.2% to all evaluated analytes. The repeatability and intermediate precision ranged from 1.4 to 9.0% and from 2.9 to 15%, respectively. The USVADLLME method was also applied to river water and stream water samples, with different physic chemical properties, and no matrix effects on the accuracy and precision of the method were not observed. These results suggest that USVADLLME -GC/MS may be used for the determination of these analytes in water, with the advantage of using small amounts of solvents, easy operation and low cost.

AGRADECIMENTOS

Inicialmente agradeço a Deus por mais esta vitória que alcanço em minha vida. Tudo é por Ele, com Ele e para Ele.

Agradeço a Jaime e Regina, meus maiores incentivadores, minha inspiração de garra e força. Se hoje consigo subir mais esse degrau, foi com ajuda deles, que mais que meus pais, são meus heróis.

Agradeço aos meus irmãos Rayane e Jaime Junior que sempre atendem os chamados da irmã mais velha.

Agradeço ao meu “pai científico” professor Dr. Ricardo Dalla Villa, pela sua paciência e dedicação quase que exclusiva a mim nos meses finas do término do trabalho, sem a sua colaboração este trabalho não alcançaria o mesmo nível de qualidade.

Agradeço a professora Dra _{Eliana Freire Gaspar de Carvalho Dores, Profª} Dra _{Marilza Castilho, e Prof. Dr. Eucarlos Lima, membros da banca examinadora.} Sem dúvida suas contribuições foram muito importantes para a continuidade e conclusão deste trabalho.

Agradeço aos colegas da turma do mestrado pelo ótimo convívio que tivemos neste período. Todos sempre dispostos a ajudar uns aos outros.

Agradeço aos amigos, pelos momentos de distração, indiretamente vocês colaboraram com este trabalho, me ajudando nos momentos difíceis.

Enfim, agradeço a todos aqueles que mesmo aqui não nominados contribuíram de forma direta ou indireta para conclusão deste trabalho.

Não é a força, mas a perseverança que realiza grandes coisas.

SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO ... 16

2 - OBJETIVOS ... 18

2.1- Objetivo geral ... 18

2.2 - Objetivos específicos ... 18

3 - REVISÃO DE LITERATURA ... 19

3.1 – Definição e classificação dos pesticidas... 19

3.2 - Uso de pesticidas... 21

3.3 - Pesticidas em águas superficiais e subterrâneas ... 22

3.4 – Características gerais dos pesticidas estudados ... 25

3.5 - Métodos de preparo de amostras para determinação de

pesticidas em água ... 26

3.6 - Validação de métodos ... 29

3.6.1 - Seletividade ... 30

3.6.2 - Lineariedade ... 31

3.6.3 - Precisão ... 31

3.6.4 – Reprodutilidade ... 32

3.6.5 - Exatidão (Recuperação) ... 32

3.6.6 - Limite de detecção e quantificação ... 32

4 - PARTE EXPERIMENTAL ... 34

4.1 - Limpeza de vidrarias ... 34

4.2 - Solventes, padrões e reagentes ... 34

4.3 - Preparo das soluções padrão ... 35

4.4 - Instrumentação... 35

4.5 - Condições cromatográficas e avaliação dos parâmetros

instrumentais ... 36

4.6 - Coleta e caracterização das amostras de água... 37

4.7 - Extração e quantificação dos analitos ... 38

4.8 - Validação do método ... 39

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40

5.1 - Parâmetros instrumentais ... 40

5.2 - Avaliação dos parâmetros de extração ... 42

5.2.1 - Solvente extrator ... 42

5.2.2 - Volume de solvente extrator ... 44

5.2.3 - Avaliação da força iônica do meio ... 45

5.2.4 - Avaliação da temperatura e tempo de sonicação ... 46

5.2.5 -Validação do método proposto... 47

6 - APLICAÇÃO DO MÉTODO E AVALIAÇÃO DA

QUANTIDADE DE RESÍDUOS GERADOS ... 52

7 - CONCLUSÃO ... 53

8 - SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 54

1 – INTRODUÇÃO

A contaminação de recursos hídricos por pesticidas tem sido objeto de grande preocupação mundial e motivado o desenvolvimento de diversos métodos analíticos para a determinação destes compostos em água (FARAJZADEH et al., 2010; LIANG, WANG, WAN, 2013; CHEN, H., CHEN, R., LI, 2010). A diversidade de princípios ativos bem como as diferentes características físico-químicas das amostras são alguns dos fatores que podem limitar a aplicabilidade de muitos destes métodos. Além disso, para determinadas finalidades são necessários métodos com baixos limites de detecção, da ordem de ng L-1_{, o que pode requerer} etapas de extração e pré-concentração dos analitos. Estas etapas estão dentre as mais críticas do processo, pois delas dependem a exatidão, a precisão e o limite de detecção do método.

A extração líquido-líquido (LLE - Liquid-Liquid Extraction) e extração em fase sólida (SPE - Solid Phase Extraction) são os métodos de preparo de amostra tradicionalmente utilizados na determinação de pesticidas em água (APHA,2005). Apesar de proporcionar resultados exatos e precisos, em geral, estes métodos são morosos, utilizam grandes quantidades de solventes orgânicos e possuem custos relativamente elevados (OZCAN, TOR, AYDIN, 2009). A microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME - Dispersive Liquid-Liquid Microextraction) tem sido proposta como uma alternativa a estes métodos devido à sua simplicidade, baixo custo, baixos limites de detecção e curto tempo de extração (SARAJI, BOROUJENI, 2014). Mais recentemente, também tem sido destacada a eficácia da microextração líquido-líquido com dispersão assistida por agitação em vortex e ultrassom (USVADLLME - ultrasound vortex assisted dispersive liquid–liquid microextraction) na determinação de diversos analitos em matrizes aquosas como refrigerantes e bebidas alcoólicas por cromatografia a gás (SU, JEN, 2010; REGUEIRO et al., 2008; SALEH et al., 2009). A agitação em vortex e a radiação ultrassônica intensificam o processo de dispersão do extrator e aumentam a eficiência do processo de transferência de massa dos analitos entre duas fases imiscíveis (CINELLI, NOTARDONATO, RUSSO, 2014; RUSSO et al., 2014). Com isso, a USVADLLME pode suprimir a utilização do solvente dispersor e

resolver um problema clássico da DLLME, que é a solubilização do extrator na amostra devido a este solvente (CASTRO, CAPOTE, 2007). A USVADLLME é uma técnica relativamente nova e sua aplicação na determinação de pesticidas em amostras ambientais ainda requer investigações.

Com isso em vista, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar um método para a determinação simultânea de pesticidas pertencentes a três classes químicas (triazinas, triazinonas e triazole) em água por USVADLLME e cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Depois de validado o método foi aplicado em corpos d’água da região de Campo Novo dos Parecis-MT, um importante polo agrícola brasileiro onde os referidos analitos são comumente utilizados em culturas de milho, soja e algodão.

2 - OBJETIVOS

Desenvolver e validar um método analítico para determinação dos pesticidas atrazina, ametrina, prometrina, terbutilazina, metribuzina, flutriafol e hexazinona em água, utilizando a USVADLLME e CG/EM.

2.2 - Objetivos específicos

 Avaliar os parâmetros que afetam o procedimento de extração: tipo e volume de solvente extrator, tempo e temperatura de sonicação e força iônica do meio.

 Validar (“in house”) o método proposto em termos de: seletividade, linearidade, exatidão, precisão e limites de detecção e quantificação.

 Avaliar o efeito da matriz.

3 - REVISÃO DE LITERATURA

3.1 – Definição e classificação dos pesticidas

Pesticidas são substâncias químicas, naturais ou sintéticas destinadas ao controle de pragas e doenças de plantas e recebem diversas denominações: agrotóxicos, defensivos agrícolas, pesticidas, veneno, entre outros (PERES, 2003; MARTINS, 2010).

Antes da publicação da Constituição de 1988, a legislação brasileira, tratava esse grupo de produtos químicos por “defensivos agrícolas”. No entanto, tal denominação, mascarava os efeitos negativos desses compostos (OPAS/OMS, 1996). Neste estudo adotou-se a denominação “pesticida” por ser a mais empregada na literatura científica mundial.

A lei 7.802 de 1989 (BRASIL, 1989), regulamentada pelo decreto 4.074 de 2002, no seu artigo 2, inciso I, define pesticidas como sendo (BRASIL, 2002):

“produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento.”

Os pesticidas apresentam diversas estruturas e funções químicas, podendo ser classificados de diferentes maneiras. As várias categorias de pesticidas classificados quanto à finalidade, estão listadas na Tabela 1 (TAUCHERT, 2006; OLIVEIRA, 2011).

Tabela 1 - Classificação de pesticidas de acordo com o grupo de organismo que

controla.

Tipo de pesticida Organismo alvo

Acaricida Ácaros Algicida Algas Avicida Aves Bactericida Bactérias Desinfetante Micro-organismos Fungicida Fungos Herbicida Plantas Inseticida Insetos

Larvicida Larvas de insetos

Moluscicida Caracóis, lesmas

Nematicida Nematoides

Piscicida Peixes

Raticida Roedores

Cupicida Cupins

Fonte: (BAIRD, 2011.)

As denominações das classes são formadas pela praga que é atingida pela substância, seguida do sufixo “cida”, do latim cadere, que significa matar (GUEDES, 2011).

Os pesticidas podem ainda ser classificados em quatro classes, segundo seu poder tóxico. A Tabela 2 relaciona as classes toxicológicas com a dose letal 50 (DL 50), que é a dose necessária do pesticida para matar 50% dos animais de teste utilizados naquela concentração. Por determinação legal, todos os pesticidas devem ser caracterizados por quatro cores distintas, de acordo com sua classe toxicológica (OPAS/OMS, 1996).

Tabela 2 - Classificação dos pesticidas de acordo com os efeitos à saúde humana. Classe

toxicológica Toxicidade DL50 (mg kg

-1₎ Faixa

colorida

I Extremamente tóxico ≤ 5 Vermelha

II Altamente tóxico Entre 5 e 50 Amarela

III Medianamente Tóxico Entre 50 e 500 Azul

IV Pouco tóxico Entre 500 e 5000 Verde

Fonte: (PERES, 2003)

Quanto à origem, a divisão envolve os compostos inorgânicos (compostos de mercúrio, bário, enxofre e cobre), os pesticidas de origem vegetal, bacteriana e fúngica (piretrinos, antibióticos e fitocidas), e os pesticidas orgânicos. De acordo com a sua classificação quanto ao grupo químico, os pesticidas são classificados como: organofosforados, organoclorados, organometálicos, carbamatos, fenóis, piretroides, morfolinas, cloronitrilas, anilinas, ureias/tioureias, azois, bipiridilos, dentre muitos outros (BAIRD, 2011).

3.2 - Uso de pesticidas

Desde o início desta década, o mercado mundial de pesticidas cresceu 93%, e no mesmo período, o mercado brasileiro cresceu 190%. Em 2008, o Brasil passou os Estados Unidos e assumiu o posto de maior consumidor mundial de pesticidas. Em 2010, eram consumidos 22% desse produto na América Latina, sendo 19% no Brasil (Figura 1) (ANVISA-UFPR, 2012).

Figura 1- Divisão do mercado mundial de pesticidas em 2010 (ANVISA-UFPR,

2012).

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, na safra 2010/2011, o consumo foi de 936 mil toneladas de produto formulado, movimentando US$ 8,5 bilhões entre dez empresas que controlam 75% deste mercado no país.

Apesar do consumo de pesticidas ter crescido ano após ano, a área plantada não tem aumentado proporcionalmente. Pode-se dizer então, que o aumento da quantidade de pesticidas sendo aplicados por hectare tem provocado o agravo da contaminação ambiental e elevado o risco de exposição de humanos e animais (ALVES FILHO, 2002).

3.3 - Pesticidas em águas superficiais e subterrâneas

Após a aplicação dos pesticidas, somente uma pequena parte atinge a peste alvo, enquanto o restante pode atingir outros compartimentos ambientais, como atmosfera, solo e recursos hídricos (SPADOTTO, 2006). Tal fato é corroborado pela forma de aplicação dos pesticidas nas monoculturas de Mato Grosso, que são feitas através de pulverizações por tratores ou por aviões agrícolas (PIGNATI et al., 2007).

No Estado de Mato Grosso foram detectados pesticidas em águas superficiais e subterrâneas nos municípios de Lucas do Rio Verde, Campo Verde, Primavera do Leste e também no Pantanal (LAABS et al., 2002; CARBO et al., 2008; NOGEIRA et al., 2012; POSSAVATZ et al., 2014).

Moreira et al. (2012) avaliaram a contaminação de águas superficiais, subterrâneas e de chuva por pesticidas dos municípios de Lucas do Rio Verde e Campo Verde. Nesse trabalho, foi observado que os pesticidas utilizados nas atividades agrícolas estão afetando o ambiente das áreas do entorno e próximas às zonas de plantio, principalmente as águas superficiais (incluindo as de consumo humano) e a água das chuvas (Tabela 3). Segundo o autor, mesmo nas regiões urbanas desses municípios foi possível detectar resíduos de pesticidas usados na produção agrícola em amostras de águas de poços artesianos, rios, córregos e água de chuva.

Flutriafol foi o pesticida presente num maior número de amostras, uma vez que foi detectado em 10 amostras de água superficial, 12 amostras de água de poço e 58 amostras de água de chuva. Já a atrazina foi o pesticida encontrado em maior valor de concentração, com o valor de 47,51 µg L-1 _{em água de chuva (Tabela} 3).

Tabela 3 - Pesticidas em águas superficiais, de poços artesianos (potável) e de

chuva em Lucas do Rio Verde, MT; amostras coletadas entre set.2007 a abr.2009.

FONTE: (MOREIRA et al., 2012)

Pesticidas

Água superficial Poços artesianos

(potável) Água da chuva

Amostras positivas (n=34) Conc. (µg L-1₎ Amostras positivas (n=62) Conc. (µg L-1₎ Amostras positivas (n=104) Conc. (µg L-1₎ Atrazina 3 0,02-4,92 2 0,01-0,02 45 0,01-47,21 Deetilatrazina (produto degradação da atrazina) - ND 1 0,02 22 0,01-13,84 Deltametrina - ND - ND - ND Deisopropilatra zina (produto degradação da atrazina) - ND - ND - ND Cipermetrina - ND - ND 5 0,02-0,53 Clorpirifós 4 ND 3 0,01-0,04 31 0,01-0,88 Endossulfan α 9 0,02-0,12 13 0,01-0,82 40 0,01-1,15 Endosulfan β 7 0,72-0,82 12 0,02-0,26 43 0,01-0,87 Endosulfan sulfato 5 0,01 – 0,21 - ND 40 0,01-0,58 Flutriafol 10 0,01-0,10 12 0,03-0,34 58 0,02-0,93 Malation 3 0,02-8,83 - ND 25 0,01-3,36 Metilparation - ND - ND 8 0,02-2,45 Metlacloro 11 0,01-0,24 8 0,01-0,59 43 0,01-2,43 Monocrotofós - ND - ND 29 0,01-41,35 Permetrina 1 1,40 1 0,19 1 0,13 Trifluralina - ND - ND - ND

3.4 – Características gerais dos pesticidas estudados

Os pesticidas selecionados para este trabalho foram atrazina, ametrina, prometrina, terbutilazina, metribuzina, flutriafol e hexazinona, tendo em vista sua utilização em culturas de algodão, milho e soja no Estado de Mato Grosso. Cabe ressaltar que estudos feitos em municípios do estado detectaram a presença de alguns destes compostos em águas superficiais e subterrâneas, como foi descrito no item 3.3. Algumas propriedades destes compostos, assim como sua classificação estão listadas na Tabela 4.

Tabela 4 - Fórmulas estruturais, classe, tipo, logaritmo do coeficiente de partição

octanol/água (log Kow), solubilidade em água (SA) em mg L-1 _{a 20}o _{C e} cologaritmo da constante de acidez (pKa) dos pesticidas estudados.

AME Classe: Triazina Tipo: Herbicida log Kow: 2,63 SA: 200 pKa = 10,0 ATZ Classe: Triazina Tipo: Herbicida log Kow: 2,70 SA: 35 pKa = 1,7 PRO Classe: Triazina Tipo: Herbicida log Kow: 3,34 SA: 33 pKa = 2,3 TER Classe: Triazina Tipo: Herbicida log Kow: 3,40 SA: 6,6 pKa = 2,2 MET Classe: Triazinona Tipo: Herbicida log Kow: 1,65 SA: 1165 pKa = 1,0 HEX Classe: Triazinona Tipo: Herbicida log Kow: 1,17 SA: 33000 pKa = 4,1 FLU Classe: Triazole Tipo: Fungicida log Kow: 2,30 SA: 95 pKa = 1,9 FONTE: (ANVISA, 2014)

3.5 - Métodos de preparo de amostras para determinação de pesticidas em água

O preparo de amostra é uma etapa crucial do procedimento analítico, pois a maioria dos instrumentos de determinação analítica não consegue determinar diretamente os analitos nos diferentes tipos de amostras. Além disso, pode haver um possível efeito da matriz, bem como a concentração dos analitos ser muito baixa. Sendo assim, o principal objetivo da etapa de preparo da amostra é eliminar possíveis interferentes e concentrar os analitos de interesse (ANDRUCH et al., 2013; SARAJI; BOROUJENI, 2014).

A extração líquido-líquido tradicional (cuja sigla em inglês é LLE) foi utilizada por muitos anos como método base para extração de diferentes analitos, tendo alto poder de concentração. Esse método se baseia na transferência do analito da amostra aquosa com um solvente imiscível em água. A LLE tem como desvantagens o uso de grandes volumes de amostra e de solventes orgânicos tóxicos e, por conseguinte, a geração de grandes quantidades de resíduos, o que torna o método dispendioso e demorado. Outro método de extração com grande utilização é a de extração em fase sólida (cuja sigla em inglês é SPE), que embora utilize menos solvente do que LLE, requer uma etapa de concentração do extrato até se obter pequenos volumes (HUANG et al., 2004; REZAEE et al., 2010).

Desde a década de 90 houve grandes avanços na adaptação dos métodos de preparação de amostras, a fim de se desenvolver métodos para se economizar tempo, trabalho e materiais, onde a miniaturização tem sido um fator fundamental para o alcance destes objetivos. A microextração líquido-líquido dispersiva (cuja sigla em inglês é DLLME) é dentre as várias técnicas de miniaturização a que possui o maior número de aplicações. O conceito fundamental desta técnica é a mistura de uma fase aquosa (5 a 10 mL) que contém os analitos, com alguns microlitros do solvente de extração (apolar, imiscível com água e tipicamente mais denso que a água) e um pequeno volume (0,25 mL a 1 mL) do solvente dispersor miscível com água (ALVES, 2010).

Apesar dos inúmeros benefícios da DLLME, trabalhos recentes têm relatado um dos problemas com o método: a necessidade da utilização de um

solvente dispersor, o qual geralmente diminui o coeficiente de partição dos analitos no solvente extrator (REGUEIRO et al., 2008; SALEH et al., 2009).

Para contornar tal problema, vários trabalhos baseados na microextração assistida por ultrassom têm sido propostos. A radiação ultrassônica contribui para a formação de pequenas gotículas dos solventes utilizados, acelera a transferência de massa entre duas fases imiscíveis, reduz o tempo de equilíbrio, aumentando então a extração dos analitos de interesse (CASTRO, 2007).

Este procedimento difere da DLLME convencional no que diz respeito a utilização de solvente dispersor, pois a energia ultrassônica é aplicada como um meio de dispersar o solvente de extração, ou seja, o solvente dispersor pode ser omitido. Durante o processo de sonicação, o solvente extrator está em maior contato com a amostra, em decorrência das formações de pequenas gotículas do solvente acarretada por esse processo. Dentre os principais métodos que utilizam ultrassom pode-se citar a microextração líquido-líquido dispersiva assistida por ultrassom (cuja sigla em inglês é UA-DLLME), a microextração líquido-líquido dispersiva com líquido iônico assistida por ultrassom (cuja sigla em inglês é UA-IL-DLLME), microextração com emulsificação reforçada com surfactante assistida por ultrassom (cuja sigla em inglês é UASEME) e a microextração com emulsificação assistida por ultrassom (cuja sigla em inglês é USAEME), representados na Figura 2 (ANDRUCH et al., 2013).

Em UA-DLLME, a sonicação não dispensa a utilização de solvente dispersor, sendo necessário então dois tipos de solventes para este procedimento. No trabalho de Yan e colaboradores (2010) foram utilizados 15 µL de clorobenzeno como solvente extrator e 0,3 mL acetona como solvente dispersor e 2 minutos de sonicação a 40 kHz para a extração de pesticidas piretroides de esgoto doméstico (YAN et al., 2010)

Figura 2 -Representação esquemática das técnicas de microextração

líquido-líquido dispersiva. (adaptado ANDRUCH et al., 2013). SE: solvente extrator; SD: solvente dispersor, S: surfactante, LI: líquido iônico.

Já na UA-IL-DLLME utiliza-se um tipo de líquido iônico como extrator e dispersão com ultrassom. Zhou e colaboradores (2009) utilizaram 60 µL do líquido iônico [C6Min][PF6] com 7% de acetonitrila e 5 minutos de sonicação, para extrair aminas aromáticas de água.

Na UASEME, o processo de emulsificação é gerado pela radiação ultrassônica e adição de surfactantes, moléculas que possuem uma parte hidrofílica e uma parte hidrofóbica. Tal procedimento foi desenvolvido por Wu e colaboradores para determinar organofosforados em água, onde foi utilizado 150 µL de C6H5Cl, como solvente extrator, 100 µL de 1,0 x 10 -2 mol L -1 Triton X-100, como emulsificante e 3 minutos de banho ultrassônico (WU, C. L. et al., 2010).

Mais recentemente, também tem sido destacada a eficácia da microextração líquido-líquido com dispersão assistida por agitação em vortex e ultrassom (USVADLLME - ultrasound vortex assisted dispersive liquid–liquid microextraction) na determinação de diversos analitos. Russo e colaboradores utilizaram USVADLLME e quantificação em GC-IT-MS para a determinação de éster ftalatos em refrigerantes e bebidas alcoólicas, obtendo limites de detecção que variaram entre 0,03 a 0,10 pgL-1_{. Cinelli e colaboradores utilizaram USVADLLME} e quantificação em GC-IT-MS para a determinação de éster ftalatos em vinho obtendo limites de detecção maiores que 0,022 µgL-1_.

Os resultados obtidos nos trabalhos relatados sugerem que a USVADLLME pode ser eficiente na extração de pesticidas em matriz aquosa utilizando a técnica de CG/EM. Por ser uma técnica relativamente nova, sua aplicação na determinação de pesticidas em amostras ambientais ainda requer investigações.

3.6 - Validação de métodos

A eficiência de uma técnica analítica está diretamente ligada com a qualidade das medidas instrumentais, avaliada numa etapa conhecida como validação (RIBEIRO, 2008). Validar, em análise química, é “estar voltado para a confiabilidade analítica do laboratório e do método escolhido ou desenvolvido para se obter o resultado”. A validação não é uma etapa à parte do desenvolvimento do método, se trata de um processo contínuo de modo a garantir a confiabilidade do resultado final (LEITE, 2008).

No Brasil, os dois órgãos que regulamentam a validação dos métodos analíticos são a Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA e o Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (Instituto Nacional De Metrologia). Estes órgãos disponibilizam documentos que contém os critérios para validação de métodos analíticos. No caso da ANVISA tem-se a Resolução no ₈₉₉ de 29/05/2003, enquanto o INMETRO disponibiliza o documento DOQ-CGGRE-008 de fevereiro de 2010.

A validação de um método requer a avaliação dos seus parâmetros analíticos, dentre os quais, seletividade, linearidade e faixa de aplicação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Entretanto, a depender do tipo de ensaio, não se faz necessária a avaliação de todos estes parâmetros (INMETRO, 2010)

Estes termos são conhecidos como parâmetros de desempenho analítico ou figuras analíticas de mérito.

3.6.1 - Seletividade

O primeiro passo na validação de um método instrumental de separação consiste em verificar sua seletividade. De uma forma geral, podemos conceituar a seletividade como a medida da indiferença do método à presença, na amostra, de espécies que poderiam interferir na determinação do analito (LEITE, 2008).

Uma das maneiras de avaliar a seletividade consiste em confrontar a resposta da matriz isenta do analito com a da matriz fortificada com padrão do analito. Nesse caso, nenhum interferente deve eluir no tempo de retenção do analito. Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a precisão e a exatidão estarão seriamente comprometidas (LANÇAS, 2004.).

3.6.2 - Lineariedade

A linearidade corresponde à capacidade do método de fornecer resultados proporcionais à concentração do analito, dentro de um determinado intervalo (TAVERINIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).

Faz-se necessário então, que se verifique até que ponto a faixa de concentração do analito coincide com a faixa dinâmica linear do equipamento e assegurar que nenhum outro fenômeno tenha impacto significante na resposta instrumental (INMETRO, 2010)

Um coeficiente de correlação linear elevado (> 0,99) é frequentemente recomendado como evidência da linearidade. Entretanto, não é recomendado o uso deste coeficiente como teste para definir a linearidade, sendo o exame visual usualmente suficiente para este fim ou ainda a aplicação do teste de resíduos (AOAC, 2002).

3.6.3 - Precisão

O parâmetro que avalia a proximidade entre várias medidas efetuadas na mesma amostra é a precisão do processo analítico. Precisão é a medida do grau de concordância entre os resultados de cada teste quando aplicado repetidamente a várias amostragens de uma mesma amostra. É comumente expressa das seguintes formas: repetitividade e precisão intermediária. Estas são usualmente expressas pelo desvio padrão (s) e coeficiente de variação percentual (BRITO, 2003; ZANELLA, 2003; VALENTINI; MATIOLI, 2007).

A repetitividade representa a concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo método, efetuadas nas mesmas condições, ou seja, mesmo analista, instrumento, local e número de repetições, no menor intervalo de tempo possível. A precisão intermédia é definida com base na avaliação da precisão numa dada amostra ou em amostras idênticas, utilizando o mesmo procedimento experimental, no mesmo laboratório, mas definindo previamente quais as condições que se variaram (período de tempo, operador ou equipamento). Este tipo de precisão

é utilizada para assegurar que há resultados concordantes para amostras idênticas analisadas em períodos de tempo distintos por outros operadores e/ou equipamentos (TAVERINIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).

3.6.4 – Reprodutilidade

Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): trata da concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica. Embora a reprodutibilidade não seja um componente de validação de método executado por um único laboratório, é considerada importante quando um laboratório busca a verificação do desempenho dos seus métodos em relação aos dados de validação obtidos por meio de comparação interlaboratorial (INMETRO, 2010).

3.6.5 - Exatidão (Recuperação)

A exatidão é um parâmetro analítico que representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro (RIBANI, 2004; RIBEIRO, 2008).

A exatidão pode ser avaliada através de ensaios de recuperação analítica, permitindo comparar valores esperados com valores observados pelo próprio método. No entanto, este parâmetro também pode ser avaliado a partir de ensaios interlaboratoriais ou através de comparação de resultados com os materiais de referência certificados (MRC) (LANÇAS, 2004.; VALENTINI; MATIOLI, 2007).

3.6.6 - Limite de detecção e quantificação

A sensibilidade de um método é definida pelos limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ). O LD é a menor concentração da espécie de interesse que pode ser detectada pela técnica instrumental, enquanto o LQ é a mais baixa concentração que pode ser quantificada dentro dos limites de precisão e exatidão

do método durante as operações de rotina do laboratório, em condições usuais (RIBEIRO et al., 2008). Existem diferentes formas de determinar estes limites, sendo que para a validação de um método analítico é normalmente suficiente fornecer uma indicação do nível em que a detecção do analito pode ser distinguida do sinal do branco/ruído (BRITO et al., 2003; RIBANI, 2004; INMETRO, 2010).

Este método pode ser aplicado em procedimentos analíticos que apresentam ruído da linha de base e é estimado a partir da comparação do sinal analítico obtido para uma amostra contendo baixas concentrações da espécie de interesse com o sinal de uma

amostra do branco. Em geral, considera-se aceitável uma relação sinal-ruído de 3:1 para LD e 10:1 para LQ (ANVISA, 2003).

4 - PARTE EXPERIMENTAL

Todas as vidrarias foram previamente enxaguadas com água de torneira e pequenas porções de acetona. Em seguida, foram mantidas submersas por doze horas em solução aquosa a 2% (v/v) de Extran Alcalino. Após esse período, foram enxaguadas, sucessivamente, com água de torneira, água deionizada e deixadas por duas horas em banho ultrassônico. Após esse processo, foram novamente enxaguadas com água deionizada e pequenas porções de acetona para a retirada de possíveis resíduos ainda remanescentes. Por fim, foram secas em estufa com circulação de ar a 150º C por duas horas, com exceção das vidrarias volumétricas e materiais de polipropileno, cuja secagem se deu à temperatura ambiente (27 ± 3° C).

4.2 - Solventes, padrões e reagentes

Os padrões de atrazina (ATZ), ametrina (AME), prometrina (PRO), terbutilazina (TER), metribuzina (MET), flutriafol (FLU) e hexazinona (HEX) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, todos com pureza superior a 98,5%.

No preparo das soluções padrão estoque foram utilizados acetona e tolueno Tedia grau pesticida. Como solução extratora foram utilizados tolueno Tedia, hexano Vetec, ciclohexano Synth, todos grau pesticida. Na limpeza de vidraria foram utilizados acetona PA Cromoline, com pureza superior a 99% e detergente Extran Alcalino MA-01 Merck.

Cloreto de sódio Quemis com pureza superior a 99% foi utilizado no ajuste da força iônica das amostras. Fenantreno deuterado (D10) Sigma-Aldrich com pureza superior a 98% foi utilizado como padrão interno.

4.3 - Preparo das soluções padrão

A partir dos padrões primários foram preparadas soluções estoque em acetona a 100 μg mL-1 _{de cada analito. Estas soluções, foram utilizadas no preparo} das soluções intermediárias mistas a 1,00 e 10,0 µg mL-1 _{dos analitos também em} acetona. Também foram preparadas soluções mistas em tolueno com concentrações no intervalo de 0,05 a 5,0 μg mL-1 _{para a avaliação dos parâmetros instrumentais.} Para a construção das curvas analíticas, pelo método da superposição de matriz, foram preparadas soluções padrão aquosas, a partir das soluções intermediárias em acetona, nos seguintes intervalos de trabalho: 1,00 a 25,0 µg L-1 _{para ATZ e TER;} 5,00 a 75,0 µg L-1 _{para AME e PRO; 15,0 a 150,0 µg L}-1 _{para MET, FLU e HEX.} Como padrão interno, foi utilizada uma solução 1,00 µg mL-1 _{de fenantreno-D}

10 em tolueno. Estes intervalos de trabalho foram selecionados com base no Limite de detecção instrumental (LDI) para cada analito.

4.4 - Instrumentação

Todas as pesagens foram feitas em balança analítica Bel Mark modelo 210, com precisão de ± 0,0001g. As medidas de volumes foram feitas em balões volumétricos Pyrex e micropipetas Pipetman com volumes ajustáveis no intervalo de 100-1000 µL e de 20-200 µL e precisão de ±0,60 µL e ±0,20 µL, respectivamente. Nos ensaios com USVADLLME foi utilizado um agitador tipo vortex Labnet International, uma centrífuga Heittech Zentrifugan modelo Universal 320 R, banho ultrassônico Thorton Inpec Eletrônica, com frequência de 25 KHz e 240W de potência, tubos de ensaio de vidro Pyrex (15x100 mm) com tampa de polipropileno, microseringa Hamilton de 25 µL, vials de 1500 µL e inserts de 100 µL Agilent.

Água ultrapurificada (< 2 µScm-1_{) foi obtida por um sistema Millipore} Simplicity 185. As amostras de água coletadas em campo foram filtradas em membrana 0,45 µm Millipore.

A quantificação dos analito foi feita num sistema cromatográfico Agilent modelo 6890 acoplado a um espectrômetro de massas modelo 5973. As

separações foram feitas em coluna capilar HP-5MS de 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro e 0,25 µm de espessura de fase, com hélio (99,9999%) como gás de arraste. Aquisição e processamento dos dados foram feitas com software ChemStation®.

As determinações de pH e condutividade elétrica das amostras de água foram feitas com uma sonda HQ 4d Multi Hack. A determinação de carbono orgânico total foi feita em um analisador de carbono Analytical Aurora modelo 1030 equipado com um amostrador automático da A.I. Analytical modelo 1088.

4.5 - Condições cromatográficas e avaliação dos parâmetros instrumentais

As condições cromatográficas empregadas foram determinadas com o objetivo de se ter o menor tempo total de corrida, sem que houvesse comprometimento da resolução dos picos dos analitos. Sendo assim, as amostras foram injetadas no modo splitless, com injetor operando a 280º C e a linha de transferência do cromatógrafo para o espectrômetro de massas a 250º _{C. A} temperatura do forno foi inicialmente mantida a 100ºC por 2 min e depois elevada a 175º C a uma taxa de 25º C min-1_{; onde permaneceu por 14 minutos, sendo} novamente elevada até 240° C a uma taxa de 25º C min-1_{, na qual foi mantida por} 6 minutos. O delay do solvente foi de 10 min. No espectrômetro de massas a fonte de íons por impacto de elétrons operou a 70 eV e temperatura de 250° C, a temperatura do quadrupolo foi ajustada a 150° C. O método da padronização interna foi utilizado para a quantificação em modo SIM (monitoramento de íon selecionado), sendo o íon principal utilizado para a quantificação e os íons secundários para a identificação (Tabela 5).

A linearidade instrumental foi avaliada por meio do exame visual das curvas analíticas e do coeficiente de correlação linear (r2_{) entre a resposta} instrumental e a concentração dos analitos (AOAC, 2002). Os limites de detecção (LDI) e quantificação instrumentais (LQI) foram determinados a partir do método da relação sinal/ruído (S/N) (RIBANI, 2004).

Tabela 5 - Tempos de retenção e íons monitorados por CG-EM. Pesticida Tempo de retenção (min) Íons de quantificação m/z Íons de identificação m/z Fenantreno-D10 11,59 188 160, 80 Atrazina 10,78 200 173, 215 Terbutilazina 11,47 214 229, 216 Metribuzina 14,58 200 198, 182 Ametrina 15,86 227 212, 185 Prometrina 16,22 241 226, 199 Flutriafol 21,98 164 219, 123 Hexazinona 25,02 171 128, 126

A precisão instrumental foi determinada por meio de nove injeções sucessivas de padrões mistos dos pesticidas em três diferentes níveis de concentração, sendo os resultados expressos em termos de coeficiente de variação (TAVERINIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).

4.6 - Coleta e caracterização das amostras de água

Para a avaliação do efeito de matriz foram feitos ensaios de adição e recuperação em amostras de água de rio coletadas no município de Rosário Oeste-MT (14° 50′ 9″ S, 56° 25′ 40″ W1) e uma amostra de água de córrego coletada no município de Cuiabá-MT (15° 35′ 45″ S, 56° 5′ 49″ W). Estas amostras foram caracterizadas em termos de pH, condutividade elétrica (CE), concentração de carbono orgânico total (COT).

Na aplicação do método foram coletadas amostras em duplicata, na profundidade de 30 cm, em um ponto próximo à margem do rio Verde, um ponto próximo à margem rio Sucuruína, ambos localizados na cidade de Campo Novo dos Parecis-MT (13° 40′ 30″ S, 57° 53′ 31″ W), um importante polo agrícola de Mato Grosso, e em dois poços artesianos localizados na zona urbana da referida cidade.

As amostras foram coletadas em garrafas de vidro âmbar e acondicionadas a 4 °C até as análises.

4.7 - Extração e quantificação dos analitos

Nos ensaios com USVADLLME foram avaliados tipo e volume de solvente extrator (tolueno, cliclohexano e n-hexano), temperatura e tempo de sonicação e força iônica do meio. Para isso, alíquotas de 5,00 mL da amostra foram colocadas separadamente em tubos de ensaio de vidro (15x100 mm) com diferentes quantidades de NaCl (0, 10, 20, e 30% (m/v) e volumes de solvente extrator (100, 150 e 200 µL), que foram então fechados e submetidos à agitação vortex por 30 segundos. Imediatamente após a agitação, cada amostra foi levada a banho ultrassônico por diferentes intervalos de tempo (1, 2, 5, 10, 15 e 20 min.) e temperatura (30, 35, 40, 45, 50, 55 e 60° C). Após a sonicação, as amostras foram centrifugadas por 5 min a 5000 rpm. Na sequência, com auxílio de uma micropipeta, foram retirados 50 µL do sobrenadante e transferidos 25 µL do padrão interno (PI.) fenantreno-D10 para um insert de 100 µL que foi colocado em um vial de 2 mL para injeção automática do extrato no sistema cromatográfico (Figura 4). Estes experimentos foram feitos em triplicatas (n= 3) e acompanhados de um branco analítico.

Figura 3 - Representação esquemática do procedimento de extração dos analitos de amostras de água por USVADLLME.

A fim de minimizar interferências instrumentais e de matriz, a quantificação dos analitos foi feita pelo método da superposição da matriz com padronização interna (RIBANI, 2004).

4.8 - Validação do método

A validação do método foi feita em termos de seletividade, linearidade, exatidão, precisão e limites de detecção e quantificação, seguindo orientações de AOAC (2002) e TAVERINIERS; LOOSE; BOCKSTAELE (2004).

A seletividade foi avaliada por meio da comparação de cromatogramas de extratos de amostras isentas e a 20,0 μgL-1 _{dos analitos. Também foram feitas} comparações com cromatogramas de um padrão 1000 μg L-1 _{dos analitos em} tolueno.

A linearidade foi avaliada por meio do coeficiente de correlação linear (r2_{) e inspeção visual de curvas analíticas construídas em triplicatas pelo método da} superposição de matriz com cinco padrões no intervalo de 1,0 a 150,0 µg L-1_.

A exatidão foi avaliada por meio de teste de adição e recuperação, sendo expressa em porcentagens de recuperação.

A precisão foi avaliada em termos de repetibilidade e precisão intermediária, e expressa pelo CV da resposta instrumental para extratos obtidos em testes de adição e recuperação. Na avaliação da repetibilidade, o método foi aplicado a amostras de água fortificadas em três níveis de concentração para cada analito: 1,00; 10,0 e 25,0 mg L-1 _{para ATZ, TER, 5,00; 25,0; e 50,0 para AME e} PRO e 15,0 ; 50,0 e 150 mg L-1 _{para MET, FLU e HEX. Para avaliação da} repetibilidade, foram feitas extrações em nonoplicatas num único dia, com cada nível. Já a precisão intermediária foi obtida de maneira semelhante, porém com extrações em nonoplicatas em três dias consecutivos.

Os limites de detecção (LDM) e quantificação (LQM) do método foram determinados com base na relação sinal/ruído (S/N) da linha de base, onde o LDM foi calculado como aquele que apresentou S/N de 3:1 e o LQM S/N de 10:1 (RIBANI, 2004; TAVERINIERS, LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).

Nos ensaios para avaliação de efeito de matriz, o método foi aplicado a amostras de água de rio e córrego fortificados em três níveis de concentração para cada analito: 1,00; 10,0 e 25,0 mg L-1 _{para ATZ, TER, 5,00; 25,0; e 50,0 para AME} e PRO e 15,0; 50,0 e 150 mg L-1 _{para MET, FLU e HEX, feitos em quintuplicata e} expressos em termos de porcentagem de recuperação. Foram feitos ensaios em quintuplicata, para a aplicação do método USVADLLME em águas de rio e poço.

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

As condições cromatográficas utilizadas proporcionaram valores de resolução (Rs) superiores a 1,60, exceto para o par terbutilazina/fenantreno-D10 onde Rs foi de 0,83. Apesar da baixa resolução, a quantificação da terbutilazina não foi comprometida, uma vez que a detecção foi feita por espectrometria de massas em modo de monitoramento seletivo de íons (SIM) e o fenantreno-D10 e a terbutilazina não possuem íons monitorados comuns (Figura 5).

Figura 4 – Cromatograma de um padrão misto em tolueno a 5,00 μg mL-1 _{dos analitos} e 200 μg mL-1 _{do padrão interno. Acima, à direita, descrição e identificação dos picos} e íons monitorados, com os íons principais em negrito.

A inspeção visual das curvas analíticas (Figura 6) e os valores de r2 superiores a 0,99 indicam linearidade instrumental adequada (AOAC, 2002).

Figura 5 - Curvas analíticas para a avaliação da linearidade instrumental.

Os valores de LDI e LQI para os diferentes analitos variaram de 0,50 a 61 e 1,5 a 150 µg L-1

,respectivamente (Tabela 6). O CV do sinal analítico ficou abaixo do valor máximo de 16% estabelecido pelos protocolos de validação, para todos os analitos em todos os níveis de concentração avaliados (Tabela 6), o que indica uma precisão instrumental aceitável (TAVERINIERS, LOOSE, BOCKSTAELE, 2004; BRITO, 2003).

Tabela 6 – Valores de LDI, LQI e CV da resposta instrumental para diferentes

concentrações dos analitos.

* Não avaliado Analitos Nível de concentração (µgL-1₎ LDI LQI 50 500 1000 5000 CV (µgL-1₎ ATZ 5,3 3,0 * 1,0 6,1 21 TER 7,5 4,5 * 0,8 0,50 1,5 AME 11 3,7 * 2,4 18 59 PRO 4,7 3,6 * 1,5 9,0 30 MET * 5,3 4,9 4,0 45 150 FLU * 11,8 6,1 3,1 61 104 HEX * 4,8 2,3 1,3 18 60 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 (A) S in al an al ít ic o (A n al it o /P I) ATZ, y = 0,7128x - 0,0188, r2 = 0,9996 TER, y= 0,9779x - 0,0016, r2 = 1 AME, y = 0,9091x - 0,157, r2 = 0,9974 PRO, y = 0,6791x - 0,0715, r2 = 0,9989 Concentração (ug mL-1) 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

(B)

Nos ensaios com USVADLLME, foram utilizados 5,00 mL de amostra e 100 µL de solvente extrator o que proporcionou um fator de concentração de 50 vezes. Com isso, será possível a detecção/quantificação dos analitos em água em concentrações cerca de 50 vezes menores que os valores de LDI e LQI apresentados na Tabela 6.

5.2 - Avaliação dos parâmetros de extração

5.2.1 - Solvente extrator

Dentre os principais requisitos para seleção de um solvente extrator para a DLLME destaca-se a baixa miscibilidade em água, alta capacidade em solubilizar os analitos de interesse e bom comportamento cromatográfico (SALEH et al., 2009). Com isso em vista, foram selecionados para estudo tolueno, ciclohexano e hexano, que além destas características, possuem densidade menor que a água. Dentre estes solventes, o tolueno proporcionou as maiores porcentagens de recuperação para todos os analitos avaliados (Figura 7).

ATZ TER MET AME PRO FLU HEX

0

20

40

60

80

100

120

Recu

pe

ração

%

Figura 6- Recuperação dos analitos com diferentes solventes extratores. Condições

de extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _{de cada pesticida; 100 µL de} solvente extrator; 30 seg de agitação vortex; 10 minutos de sonicação a 40º C e 240 W (n = 3).

Pode ser observado na Tabela 1, que os analitos apresentam estruturas assimétricas com átomos eletronegativos como O, N e Cl o que, juntamente com os valores de Kow, evidencia uma relativa polaridade dos mesmos. Dos extratores avaliados o tolueno é o mais polar (NOJAVAN et al., 2014), o que pode justificar a maior eficiência de extração com este solvente. Alguns autores também têm destacado a contribuição da estrutura aromática do tolueno na extração de analitos insaturados (CHEN et al., 2010; LI et al., 2013; TOLCHA; MERDASSA; MEGERSA., 2013). Também foi observada uma elevada correlação linear entre a recuperação dos analitos e seus respectivos valores de log Kow (Figura 8).

60

70

80

90

100

110

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

lo

g

Ko

w

Recuperação %

Figura 7 - Correlação entre a recuperação e o logKow dos analitos. Condições de

extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _{com os analitos; 100 µL de} solvente extrator; 30 seg de agitação vortex; 10 minutos de sonicação a 40º C e 240 W (n = 3).

Em geral, quanto maior a polaridade do analito, maior sua solubilidade em água e menor o valor de Kow. Como esperado, os analitos mais solúveis em água foram menos extraídos.

5.2.2 - Volume de solvente extrator

Trabalhos que utilizam a microextração associada a ultrassom para determinação de pesticidas em água têm relatado a utilização de volumes de extrator no intervalo de 14 a 225 µL (ANDRUCH et al., 2013). A utilização de volumes pequenos de extrator (<100 L) contribui para a diminuição do LDM, porém dificulta a automatização das injeções cromatográficas dos extratos. A utilização de volumes grandes do extrator (>150 L) contribui para os processos de transferência de massa do analito entre a matriz e o extrator, entretanto colabora para a diluição do extrato e consequentemente para a elevação dos valores de LDM.

No presente estudo, foi observado que o aumento do volume do extrator de 100 para 200 µL causou uma diminuição significativa (p = 0,05) na recuperação da ATZ, MET, AME e PRO (Figura 9). O aumento do volume de extrator pode afetar a eficiência de dispersão e consequentemente a transferência de massa do analito. Alguns autores também atribuem a menor recuperação aos efeitos de diluição dos extratos (OZCAN; TOR; AYDIN, 2010; FONTANA et al., 2009).

Figura 8- Recuperação dos analitos em ensaios com diferentes volumes de extrator.

Condições de extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _{com os analitos;} 30 seg de agitação vortex; 10 minutos de sonicação a 40º C e 240 W (n = 3).

ATZ TER MET AM E PRO FLU HEX

0

20

40

60

80

100

120

Re

cu

p

eraç

ão

%

O aumento do volume do extrator praticamente não teve efeito sobre a recuperação da TER e HEX e causou um pequeno aumento na recuperação do FLU.

A utilização de 100 µL de extrator proporcionou as maiores recuperações para a maioria dos analitos avaliados e permitiu a injeção automática dos extratos. Com isso em vista, optou-se pela utilização deste volume de extrator em todos os ensaios subsequentes.

5.2.3 - Avaliação da força iônica do meio

O aumento da força iônica do meio causou um aumento de 12, 17 e 86%, na recuperação da MET, FLU e HEX, respectivamente (Figura 10). A adição de NaCl pode ter diminuído a solubilidade destes analitos em água e contribuído para suas transferências para a fase orgânica (efeito salting out). Dentre os analitos avaliados, a HEX apresenta a maior solubilidade em água (Tabela 1), o que pode justificar a maior contribuição do efeito salting out para este pesticida. Fica evidenciado que sem a presença do sal, não seria possível obter recuperações satisfatórias para tal analito.

ATZ TER MET AME PRO FLU HEX

0

20

40

60

80

100

120

Re

cu

p

eraç

ão

%

Figura 9 - Recuperação dos analitos a partir de amostras com diferentes valores de

força iônica. Condições de extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _com os analitos; 100 µL de solvente extrator (tolueno); 30 seg de agitação vortex; 1 minuto de sonicação a 40 ºC e 240 W (n = 3).

Não foram observadas diferenças significativas (t 95%) entre as porcentagens de recuperação das triazinas com o aumento da força iônica do meio. Resultados semelhantes foram obtidos por Tolcha; Merdassa; Megersa (2013) que também avaliaram o efeito da força iônica na extração desta classe de pesticidas em água por DLLME.

Tendo em vista os resultados obtidos para o MET, FLU e HEX, os experimentos subsequentes foram feitos com as amostras a 30% (m/v) de NaCl.

5.2.4 - Avaliação da temperatura e tempo de sonicação

A dispersão do solvente extrator, bem como o processo de transferência de massas são cruciais na USVADLLME e podem ser influenciados pelo tempo e temperatura de sonicação (WU,Q.L. et al., 2010). No entanto, estas variáveis não tiveram efeito significativo (t 95%) na recuperação dos analitos no presente trabalho (Figura 11).

Figura 10- Recuperação dos analitos a (11A) diferentes temperaturas e (11B) tempos

de sonicação. Condições da extração: 5,00 mL de água fortificada a 0,20 µg mL-1 _com os analitos; 100 µL de solvente extrator tolueno, 30 seg. de agitação em vortex e ultrassom a 240 W (n = 3).

Quando a mistura tolueno:água (1:50, v:v) é submetida à radiação no ultrassom ocorre a formação de micro gotículas de tolueno que se dispersam

30 35 40 45 50 55 60 40 60 80 100 120 140 (A) Temperatura ºC Re cupe raç ão % ATZ TER MET AME PRO FLU HEX 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 40 60 80 100 120 140 (B)

Tempo de sonicação (min) ATZ TER MET AME PRO FLU HEX

rapidamente na água. Este fenômeno pode ser percebido visualmente pela turvação da mistura formada durante os experimentos. A eficiência da USVADLLME parece estar relacionada com a eficiência desta dispersão e com o tamanho das gotículas de solvente dispersas. Quanto menor o tamanho das gotículas maior a área interfacial entre a água e o solvente extrator e maior a eficiência de extração. Há evidências experimentais de que o tempo e a potência do ultrassom possuem grande influência neste processo. Com potência da ordem de 240-300 W, a dispersão do solvente orgânico pode atingir um máximo em poucos minutos e permanecer constante a partir de então (JIA et al., 2010). Formada a emulsão solvente/água, a transferência dos analitos para a fase orgânica tende a ocorrer muito rapidamente (GUO; LEE, 2012). Burdel e colaboradores (2013) relatam a microextração de ácido pícrico, em matriz aquosa, com tolueno em apenas um minuto de ultrassom a 240W.

O efeito da temperatura parece estar mais relacionado com a transferência de massas do analito entre a fase aquosa e orgânica (GUO; LEE, 2012) e quando a eficiência de dispersão é grande seus efeitos podem ser pouco expressivos. Saleh e colaboradores (2009) avaliaram o efeito da temperatura na determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em água por USVADLLME e não observaram diferenças significativas na recuperação dos analitos em ensaios com temperatura de amostras no intervalo de 25 a 50º C.

Com base nestes resultados, experimentos subsequentes foram feitos com 1 minuto de sonicação a 240 W em temperatura na média de 45 ± 3º C, que é a temperatura de trabalho do banho de ultrassom utilizado.

5.2.5 -Validação do método proposto

A comparação entre o cromatograma do branco analítico (Figura 12 A) e do extrato de uma amostra de água ultra pura fortificada a 20 µg L-1 _{dos analitos} (Figura 12 C), evidenciam a ausência de interferentes nos tempos de retenção dos analitos avaliados. A semelhança entre o perfil cromatográfico apresentado nas Figuras 12B e 12C indica que o procedimento de extração não influencia as separações cromatográficas.

Nos ensaios de adição e recuperação, com amostras de água ultra-pura, as recuperações variaram entre 81,2 e 109%, com repetitividade entre 1,4 e 9,0% e precisão intermediária entre 2,9 a 15%. Os valores de LDM e LQM variaram de 0,10 a 2,71 µg L-1 e 0,70 a 8,22 µg L-1, para a terbutilazina e flutriafol, respectivamente (Tabela 7). Nenhum dos analitos foi detectado no branco analítico.

Segundo Taverniers e colaboradores (2004), para concentrações entre 100 a 1000 µg L-1 são aceitas recuperações no intervalo de 80 a 110%, enquanto que para concentrações inferiores a 100 µg L-1 podem ser aceitas recuperações no intervalo de 60 a 115%. Para estes intervalos são aceitos CV de até 21%.

Figura 11 – Cromatograma (A) do branco analítico contendo padrão interno a 200 μg

mL-1_{,(B) de um padrão em tolueno a 1,00 μg mL}-1 _{dos pesticidas e (C) de um extrato} de uma água ultra pura fortificada a 20,00 μg L-1 _{com os analitos.}

A exatidão e precisão dos resultados também evidenciam a eficácia da utilização do insert no frasco de amostragem para injeção automática dos extratos no