BIBLIOGRAFIA BIBLIOGRAFIA. Objetivos Gerais. FFI0772 Enzimas: Funções, Nomenclatura e Propriedades Fundamentos da Cinética Enzimática

(1)

FFI0772

ADRIANO D ANDRICOPULO

ADRIANO D. ANDRICOPULO

RAFAEL V. C. GUIDO

Objetivos Gerais

¾ Enzimas: Funções, Nomenclatura e Propriedades

¾ Fundamentos da Cinética Enzimática

¾ Cinética Enzimática: Michaelis-Menten

¾ Ensaios Cinéticos: Padronização e Validação

¾ Parâmetros Cinéticos: v

o

, K

M

, V

max

, k

cat

, k

cat

/K

M

¾ Análise Gráfica: Lineweaver-Burk e Regresão Não-Linear

¾ Inibição Enzimática

¾ Tipos e Mecanismos de Inibição

¾ Determinação de IC

50

e K

i

¾ Exemplos de Inibidores Enzimáticos

BIBLIOGRAFIA

¾ Material didático das aulas

¾ Bibliografia: livros de cinética enzimática, bioquímica,

química orgânica e química medicinal

BIBLIOGRAFIA

¾ WILLIAMS, D.A., LEMKE, T.L. Foye's Priniples of Medicinal Chemistry, 5a edição,

BIBLIOGRAFIA

S, , , oye s p es o ed c a C e st y, 5a ed ção, Philadelphia, EUA: Lippincott Williams & Wilkins, 2002.

¾ PATRICK, G.L. An Introduction to Medicinal Chemistry, 2a edição, Nova Iorque, EUA: Oxford, 2001.

í ã

¾ BARREIRO, E.J., FRAGA, C.A.M. Química Medicinal. As Bases Moleculares da Ação dos Fármacos, Porto Alegre: Artmed, 2001.

¾ SOLOMONS, G., FRYHLE, C.B. Organic Chemistry, 7a edição, Nova Iorque, EUA: John Wiley & Sons 2000

John Wiley & Sons, 2000.

¾ ALLINGER, N.L., CAVA, M.P., JONGH, D.C., C.R. JOHNSON, C.R., LEBEL, N.A., STEVENS, C.L. Química Orgânica, 2a edição, Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1978. ¾ SILVERMAN, R.B. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, San Diego, S , e O ga c C e st y o ug es g a d ug ct o , Sa ego,

EUA: Academic Press, 1992.

¾ LEHNINGER, A.L., Bioquímica, 2.ed., São Paulo, Editora Edgard Blücher, 1976. ¾ STRYER, L., Bioquímica, 3ªed., Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 1992. ¾ JENCKS, W. Catalysis in Chemistry and Enzymology –– Dover Pub.1987.

¾ FERSHT, Enzyme Structure and Mechanism. San Francisco, W. H. Freeman and Company, 1977.

(2)

ENZIMAS

ENZIMAS E INIBIDORES ENZIMÁTICOS

Por Quê?

1

1 ENZIMAS COMO

ENZIMAS COMO

ALVOS BIOLÓGICOS

“Druggable Genome” “Genoma com Potencial de Fármaco”

ALVOS MOLECULARES

(3)

Í

ENTIDADES QUÍMICAS

Sildenafil

O QUE HÁ EM COMUM ENTRE

SÃO INIBIDORES ENZIMÁTICOS

 o fármaco mais vendido  o fármaco mais consumido  o fármaco mais “popular”

2

 o fármaco mais popular

da indústria farmacêutica em todos os tempos?

O M i V

did

O Mais Vendido

(4)

Ato

astatina

Atorvastatina

O M i C

id

O Mais Consumido

Ácido Acetilsalicílico

Seletividade

(5)

ESTRUTURAS

COX-1 e COX-2

Valina (Cox-2) Isoleucina (Cox-1)

O M i P

l

O Mais Popular

Sildenafila

Sild

fil

Sildenafila

(6)

ESPAÇO QUÍMICO BIOLÓGICO

ESPAÇO QUÍMICO-BIOLÓGICO

ENZIMAS

E

nzimas são consideradas por muitos laboratórios

E

nzimas são consideradas por muitos laboratórios farmacêuticos os alvos moleculares mais atrativos para intervenção de doenças humanas através de moléculas pequenas

pequenas

Isso se deve ao seu papel catalítico essencial em muitos fi i ló i f di d d processos fisiológicos que afetam diretamente estados de desordens, disfunções ou doenças

ENZIMAS

O

s fatores determinantes para a catálise enzimática se aplicam apropriadamente na inibição através de moléculas pequenas (candidatas a novos fármacos)

O estudo da inibição enzimática passa essencialmente pelo entendimento de parâmetros cinéticos da enzima-alvo entendimento de parâmetros cinéticos da enzima-alvo

ENZIMAS

P

rojetos de descoberta de fármacos, comumente, se

beneficiam da avaliação in vitro de moléculas contra enzimas-alvo

Parâmetros como afinidade, potência e seletividade podem ser quantificados a partir de ensaiosin vitro

(7)

ENZIMAS

A

i â i d i bi ló i d l d lid d é

A

importância de ensaios biológicos de elevada qualidade é evidente neste processo

Fase farmacodinâmica X fase farmacocinética X Atividade Biológica X Efeito Terapêutico

ENZIMAS

T

ransformações metabólicas de xenobióticos, incluindo a maioria dos fármacos, são catalisadas por enzimas

Interações com enzimas metabólicas da família do citocromo Interações com enzimas metabólicas da família do citocromo P450 (CYP) – otimização de propriedades farmacocinéticas essenciais

ENZIMAS

D t f é i t t i d t h Desta forma, é importante que o pesquisador tenha um conhecimento sólido da atividade enzimática e das maneiras apropriadas de avaliar as interações entre enzimas e inibidores

ENZIMAS

(8)

CATÁLISE ENZIMÁTICA

Reações Catalíticas

Esquema de reação química catalisada por uma enzima

CATÁLISE ENZIMÁTICA

Reações Catalíticas

As enzimas não alteram a energia livre de Gibbs ('G) das reações e exercem seu poder catalítico através da diminuição da energia de ativação dos sistemas ('G‡)

CATÁLISE ENZIMÁTICA

Proximidade e Orientação

ENZIMA

¾ As moléculas devem se aproximar, estar na orientação correta, e alcançar o patamar mínimo de energia para iniciar a reação

¾ As enzimas catalisam reações, eliminando o caráter randômico das reações

(9)

CATÁLISE ENZIMÁTICA

Proximidade e Orientação

ENZIMA PRODUTO ENZIMA ENZIMA ENZIMA

PROXIMIDADE: as enzimas se ligam aos substratos de forma que seus grupos reativos se aproximam para que a reações catalíticas possam ocorrer Este reativos se aproximam para que a reações catalíticas possam ocorrer. Este processo elimina a natureza randômica das colisões em soluções livres ORIENTAÇÃO: mesmo que a colisão de duas moléculas ocorra de forma ORIENTAÇÃO: mesmo que a colisão de duas moléculas ocorra de forma

randômica, seus grupos reativos podem não estar necessariamente na orientação correta que permita a reação ocorrer

ENZIMAS

Atividade Catalítica

COFATORES

ENZIMAS

Atividade Catalítica

A atividade catalítica depende muitas vezes da presença de

moléculas pequenas denominadas cofatores

Apoenzima + cofator = holoenzima

Sem Cofator ou Ligante Moléculas Orgânicas Coenzimas Grupos Prostéticos Prostéticos

CINÉTICA

Controle da velocidade de reações

A cinética enzimática estuda a velocidade de reações catalisadas por A cinética enzimática estuda a velocidade de reações catalisadas por enzimas

As reações enzimáticas diferem das outras reações químicas em vários aspectos

(10)

CINÉTICA

Controle da velocidade de reações

(i) As velocidades de reação são mais elevadas: uma reação catalisada por um enzima pode ser 106_{a 10}17_{vezes mais rápida que uma reação não catalisada, e}

á d d d á d ã l d

várias ordens de grandeza mais rápida que uma reação catalisada por um catalisador inorgânico.

(ii) Condições de reação mais suaves: as reações catalisadas por enzimas ocorrem em condições relativamente suaves – temperaturas baixas, pressão atmosférica, e pH próximos da neutralidade

e pH próximos da neutralidade.

(iii) Elevada especificidade: as enzimas têm alta especificidade nas reações (iii) Elevada especificidade: as enzimas têm alta especificidade nas reações

catalisadas.

CATÁLISE ENZIMÁTICA

Reações Catalíticas

Muitas reações nos sistemas biológicos não ocorreriam em proporções mensuráveis naç g p p ç ausência de enzimas. As enzimas aceleram as reações por fatores na ordem dos milhões

CINÉTICA

Controle da velocidade de reações

Catálise Química

Exemplo: hidrogenação com catalisador de carvão-paládio

CH3 H3C + H2 CH3 CH3 H3C H3C Pd/C CH3 H3C 2 H H

CINÉTICA

Controle da velocidade de reações

Ação do catalisador de paládio sobre carvão Ação do catalisador de paládio sobre carvão

H H H H _H _H CH3 H3C CH3 H3C H H H H _H _H

Superfície de paládio Superfície de paládio Superfície de paládio

CH3 H3C CH3 CH3 H3C H3C H H CH3 H3C _H _H Superfície de paládio Superfície de paládio

(11)

CINÉTICA

Controle da velocidade de reações

Produtos

Catálise Enzimática

Produtos

Sítio ativo

Ligação do substrato no sítio ativo da enzima Substrato Sítio ativo

ENZIMA

E • S

E • P

E + P

ENZIMA

E S

E P

E + P

CINÉTICA

Controle da velocidade de reações

O sítio ativo de uma enzima

Aminoácidos presentes no sítio ativo podem ter dois papéis principais:

Ligação (binding): o resíduo de aminoácido está envolvido diretamente na ligação do Ligação (binding): o resíduo de aminoácido está envolvido diretamente na ligação do substrato ao sítio ativo

Catalítico (catalytic): o aminoácido está envolvido diretamente no mecanismo de reação

Lei de Beer-Lambert:

constante absorbância (Ofixo)

=

(para um Ofixo)

A

_O

H

_O

c.l

distância percorrida_{pelo feixe luminoso}

concentração da solução p através da amostra da solução absorvente

A absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e concentração

Onde: H = absorbtividade molar ou coeficiente de extinção molar, uma constante característica para uma dada substância absorvente.

Para o NADH a 340 nm, H = 6200 L mol-1_cm-1 _{(ou M}-1_cm-1₎

c = concentração de NADH em mol/L

l = comprimento da amostra em cm (usual 1 cm para cubetas padrões)

A intensidade I do feixe diminui a

medida que passa pela amostra

Amostra em solução

Monocromador

Fonte de luz com comprimento de onda

1 cm

Detector

comprimento de onda selecionável

I

_o_o

_I

(12)

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Definições e Fundamentos

1,0 unidade de atividade enzimática (enzyme unit, U ou EU) é definida como a quantidade de enzima que causa a transformação de 1 μmol (10-6

como a quantidade de enzima que causa a transformação de 1 μmol (10-6

M) de substrato por minuto (250_{C, condições padrões de ensaio) (U = μmol}

min-1_{). A atividade se refere ao total de unidades de enzima em solução.}

A atividade específica é o número de unidades de enzima por mg total dep p g proteína. A atividade específica é uma medida da pureza da enzima, e aumenta de acordo com a evolução do processo de purificação de uma enzima e torna-se máximo e constante quando a enzima está enzima e torna se máximo e constante quando a enzima está completamente pura.

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Definições e Fundamentos

d d á d d d / l d l ã

¾ Atividade enzimática = unidades de enzima / volume de solução (e.g., units / mL)

¾ Ati id d E ífi id d d i / t t l d t í

¾ Atividade Específica = unidades de enzima / mg total de proteína

¾ A atividade específica de uma solução de enzima depende diretamente da sua pureza

sua pureza

A atividade específica aumenta durante o processo de purificação alcançando um A atividade específica aumenta durante o processo de purificação, alcançando um máximo quando a enzima estiver totalmente pura e ativa

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Atividade Enzimática versus Atividade Específica

Mesma atividade total da enzima (em vermelho)

Maior especificidade (em vermelho)

Atividade Específica = atividade enzimática / total de proteína. Ou seja, mols convertidos por unidade de tempo por massa de proteína.

A ti id d ífi t d t d ifi ã l d á i

Atividade enzimática = mols convertidos por unidade de tempo

A atividade específica aumenta durante o processo de purificação, alcançando seu máximo quando E = 100% pura e ativa

É a própria atividade catalítica da enzima, em geral expressa em unidades de velocidade, ou seja, massa transformada por unidade de tempo (μmol min-1₎

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Atividade Enzimática versus Atividade Específica

66 KDa 45 KDa 30 KDa 22 KDa Proteína Pura 13 KDa

Sucessivas etapas de purificação geralmente diminuem o total de proteína. Uma proteína pode ser considerada pura quando etapas adicionais de purificação não

p p p q p p ç

melhoram a atividade específica e quando somente uma espécie de proteína pura pode ser detectada.

(13)

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Definições

A atividade enzimática é uma função da quantidade de enzima á

(unidade prática, 1 EU = 1 μmol min-1_{) (SI, 1 katal = mol s}-1₎

Atividade Específica = atividade enzimática / massa total de enzima presente (unidade prática μmol mg-1_min-1_{ou μmol μg}-1_min-1₎

(unidade prática, μmol mg1_min1_{ou μmol μg}1_min1₎

A atividade enzimática é uma medida da eficiência, usualmente constante para um enzima pura. Se a atividade específica de uma enzima pura é conhecida, uma amostra enzima pura. Se a atividade específica de uma enzima pura é conhecida, uma amostra impura da enzima deverá apresentar atividade específica menor, permitindo o cálculo da pureza

í í

% pureza = 100% x atividade específica da amostra de enzima / atividade específica da enzima pura