NANOESTRUTURAS DE α- LACTOALBUMINA PARA O
ENCAPSULAMENTO DE QUERCETINA COM FUTURAS
APLICAÇÕES EM ALIMENTOS
A. M.F. Gomes
1, L. G. Fonseca
1, R. L. Carvalho
1, J. S. R. Coimbra
2, A. B. Mageste
3, J. A. Q.
Lafetá Júnior
2, I. J. B. Santos
11- Departamento de Química, Biotecnologia e Engenharia de Bioprocessos (DQBIO) – Universidade Federal de São João Del-Rei (UFSJ), Campus Alto Paraopeba – CEP: 36420-000 – Ouro Branco – MG – Brasil, Telefone: +55 (31) 3749-7300 – e-mail: (igorboggione@ufsj.edu.br)
2- Departamento de Tecnologia em Alimentos - Universidade Federal de Viçosa (UFV) - CEP: 36570-000 – Viçosa – MG – Brasil.
3 - Departamento de Química - Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), – CEP: 35400-000 - Ouro Preto – MG – Brasil.
RESUMO – A nanotecnologia potencializa o uso de proteínas na indústria de alimentos por proporcionar novos produtos com propriedades diferenciadas. Assim, o presente trabalho tem como principal objetivo obter e caracterizar nanoestruturas de α-lactoalbumina, avaliar suas propriedades técnico-funcionais e encapsular a quercetina. A nanoestrutura obtida em 10 mM de NaCl foi caracterizada pelo espalhamento dinâmico de luz e apresentou o tamanho de 216,53 nm. A estabilidade da espuma e da emulsão da nanoestrutura foram maiores do que a proteína nativa. E a nanoestrutura obteve uma eficiência de encapsulação de quercetina maior que 80 %. Dessa forma, os resultados confirmam o potencial de aplicação das nanoestruturas de α-la na indústria de alimentos. ABSTRACT – Nanotechnology enhances the use of proteins in the food industry by providing new products with different properties. Thus, this study aims to obtain and characterize nanostructures of α-lactalbumin, assess their technico-functional properties and encapsulate quercetin. Nanostructure obtained at 10 mM NaCl was characterized by dynamic light scattering and had the size of 216.53 nm. Stability of foam and emulsion of the nanostructure was greater than the native protein. Nanostructure obtained an encapsulation efficiency of quercetin greater than 80%. Thus, the results confirm the potential of application of this nanoestructures in the food industry.
PALAVRAS-CHAVE: nanotecnologia; molécula bioativa; soro do leite. KEYWORDS: nanotechnology; bioactive molecule; whey protein.
1. INTRODUÇÃO
O estado de Minas Gerais abriga 30 % dos laticínios do território brasileiro e como um dos principais produtos desse setor está a produção de queijo. Para cada l kg de queijo gera-se, aproximadamente, 11 litros de soro do leite, sendo 85 %, aproximadamente, destinada ao descarte no meio ambiente. Esta ação quando ocorre sem tratamento específico acarreta grave problema de poluição ambiental (Pedersen et al., 2003; Rojas et al., 2004). Portanto, o aproveitamento do soro do leite, além da importância ambiental, apresenta também uma importância industrial pelas suas propriedades nutricionais e funcionais ocasionadas pelas proteínas.
As proteínas representam 0,9% em média da composição do soro do leite, destacando-se a α-lactoalbumina (α-la) com 13% da composição dessas proteínas (Antunes, 2003; Ben-Hassan e Ghaly, 1994). Esta proteína é apropriada para a preparação de diversos alimentos por apresentar na sua estrutura muitos aminoácidos essenciais e ser estratégica para a obtenção de nanoestruturas que proporcionam novas propriedades ao sistema alimentício e a possibilidade de encapsulamento de compostos bioativos (Livney, 2010). A nanoestrutura desta proteína é classificada como segura pelo GRAS (Generally Recognized as Safe) (Abd El-Salam e El-Shibiny, 2012; Benshitrit, 2012).
O interesse em encapsulamento de moléculas bioativas em nanoestruturas de proteínas para a indústria de alimentos está relacionado com a capacidade de agregar os valores nutricionais e farmacológicos destas moléculas, definindo-se, então, os nutracêuticos (Moraes e Colla, 2006). Um dos nutracêuticos importantes é a quercetina pelas suas atividades biológicas, tais como antioxidante, antialérgica, anti-inflamatória, antiplaquetária, antimicrobiana, antineurodegenerativa, antitumoral e antiviral (Harwood et al., 2007; Bischoff, 2008). Todavia, a quercetina é pouco biodisponível devido a sua baixa solubilidade, instabilidade e baixa absorção gastrointestinal (Chitkara, 2012).
A obtenção de nanotubos a partir da proteína α-la e a utilização dessas nanoestruturas no encapsulamento da quercetina são relevantes atualmente, uma vez que de acordo com as pesquisas realizadas não foi possível encontrar estudos sobre essa aplicação. A busca por mais conhecimentos para o desenvolvimento de novos produtos no mercado atual é consequência da alta demanda de alimentos nutracêuticos pelas pessoas que planejam uma vida mais saudável. Desta maneira, este trabalho propõe obter e caracterizar nanoestruturas de α-la, avaliar suas propriedades técnico-funcionais e encapsular a quercetina.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material
A α-lactoalbumina (α-la, contendo 90% de α-la) foi gentilmente cedida pela Davisco. A quercetina (grau HPLC, contendo 95% de quercetina) foi adquirida da Aldrich-Sigma (USA). O NaCl e o Docecilsulfato de sódio 90% (SDS) foram adquiridos da Êxodo Científico e da CRQ, respectivamente. Nos experimentos foram empregados água destilada e reagentes químicos de graus analíticos.
2.2. Métodos
Obtenção de nanoestruturas de α-la: soluções de proteína a 2 mg.mL-1 em água destilada, em
pH 2 (HCl) e em 10 mM de NaCl foram mantidas a 45 ºC sob agitação por duas horas em uma estufa incubadora (Nova Técnica, Brasil). A dispersão de nanoestrutura foi armazenada em um freezer para posteriores análises.
Caracterização das nanoestruturas: o DLS (NanoZetaSizer, Malvern, Japão) foi utilizado para a determinação do tamanho e do índice de polidispersão (PdI). As medidas foram realizadas utilizando um detector de fotodiodo de avalanche (Brookhaven BI-APD, USA) e um correlacionador (Turbocorr, Brookhaven, USA). A fonte de luz (CVI Melles Griot, USA) foi um laser HeNe de 35 mW de potência e λ=632,8 nm, linearmente polarizada. Para controle de intensidade foi empregado um sistema de polarizadores cruzados.
Propriedades técnico-funcionais
a) Estabilidade da espuma (FS): as dispersões de nanoestrutura foram homogeneizadas a 14000 rpm no Ultra Turrax (Biovera, Brasil) por um minuto e seu volume medido a cada 5 min por 120 min. A estabilidade da espuma (FS) e o aumento do volume (VI) foram obtidos pelas Equações 1 e 2.
Onde é o volume total, é o volume da espuma e é o volume da espuma no instante t e no tempo zero, respectivamente.
b) Índice da atividade emulsificante (IAE): utilizou-se o método proposto por Pearce e Kinsella (1978) com adaptações, na qual uma emulsão foi preparada adicionando às dispersões de nanoestrutura óleo de girassol na proporção de 3 para 1 e homogeneizando a 14000 rpm no Ultra Turrax (Biovera, Brasil) por um min. Após este tempo, alíquotas desta emulsão foram diluídas em SDS 0,1 % (m/v) em diferentes tempos (0, 5, 15 e 30 min.). Então, a absorção da emulsão diluída foi medida a 500 nm no espectrofotômetro UV-Vis (Shimadzu, Japão). O índice de atividade emulsificante (IAE) e a estabilidade da emulsão (ESI) foram obtidos pelas Equações 3 e 4.
(3) e (4)
Onde é a absorbância da emulsão diluída no t=0, é o fator de diluição, c a concentração inicial de proteína (mg.mL-1) e é a fração de óleo para formar a emulsão (0,25).
Encapsulamento de quercetina: Diferentes alíquotas de solução de quercetina a 1 mg.mL-1
foram adicionadas nas dispersões de nanoestrutura de a-lactoalbumina, agitadas por 5 min e centrifugadas por 30 min em 13500 rpm (Eppendorf, Alemanha). Após esse processo, as amostras foram diluídas e analisadas em espectrofotômetro UV/VIS (Shimadzu, Japão) em 500 nm e o pellet foi seco em estufa a 50°C. A eficiência de encapsulamento (EE) e a capacidade de ligação (LC) foram obtidos pelas Equações 5 e 6.
(5) e (6)
Onde o LC (%) corresponde à capacidade de ligação, Wtotal é o total de quercetina adicionadana nanoestrutura, Wlivre é o total de quercetina livre encontrado no sobrenadante e Wnp é o valor da
quercetina ligada na nanoestrutura.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 1 mostra os tamanhos e os índices de polidispersividade (PdI) das estruturas de proteínas obtidas.
Tabela 1 – Tamanho e índice de polidispersividade das estruturas proteicas via DLS. Solução de α-la Índice de polidispersividade
(PdI)
Tamanho (nm)
NaCl (10 mM) 1 ± 0 216,53 ± 16,07
HCl (pH 2) 0,52 ± 0,22 3,99 ± 0,22
Água destilada 0,73 ± 0,05 551,95 ± 63,85
O pH e a natureza iônica influenciam na formação de nanoestruturas de α-la, uma vez que na presença de 10 mM de NaCl obteve-se nanoestrutura pelo tamanho ter sido menor que 300 nm (Arroyo-Maya et al., 2012). Já na presença de HCl, a estrutura obtida foi de 3,99 nm sugerindo a
obtenção de um dímero de proteína (Ipsen et at., 2000). A autoassociação desta proteína ocorre via desnaturação da mesma e posterior interação intermolecular, sendo esta controlada pela presença iônica que influenciará nas distribuições das cargas elétricas na molécula. Assim, o HCl e o aquecimento desnaturou a proteína que para se estabilizar precisou associar-se em dímero, sendo este estabilizado pelo contríon cloro, uma vez que o pH é menor do que o ponto isoelétrico da a-lactalbumina, tornando-a positiva (Pelegrine e Gasparetto, 2003). De forma similar, o NaCl e o aquecimento também proporcionou a desnaturação e uma maior autoassociação do que o HCl, sugerindo, então, uma atuação dos íons sódio e cloreto na obtenção das nanoestruturas. Já o mesmo não ocorreu com a água, uma vez que o pH estava próximo do ponto isoelétrico (5,1) (Morr e Ha, 1993) e isto fez com que a proteína desnaturada pelo aquecimento se associasse por interações hidrofóbicas na ausência de cargas que repelissem um agregado do outro e interrompe-se o crescimento da estrutura.
As proteínas do soro do leite são reconhecidas pelas suas propriedades técnico-funcionais, portanto avaliou-se essas propriedades de espuma e emulsão das nanoestruturas obtidas, de tal forma a comparar com a proteína nativa. A Tabela 2 mostra os resultados das propriedades de espuma.
Tabela 2 – Resultados do teste de espuma.
Proteína Pura Nanoestrutura (α-la + NaCl)
VI 42,43 20,45
FS30 0,00 75,00
FS60 0,00 50,00
FS120 0,00 12,50
A proteína nativa obteve maior incremento de volume do que a nanoestrutura, já que retém um maior volume de espuma formada, porém não apresenta estabilidade ao longo dos 120 min conforme a nanoestrutura. De uma forma geral, pode-se concluir que a nanoestrutura de α-la proporciona maior estabilidade da espuma do que a proteína no seu estado nativo. Um dos fatores que podem influenciar a estabilização da espuma está relacionado com concentração de proteínas no meio, o pH e a força iônica. Para Pelegrine e Gasparetto (2003) quanto mais próximo for o pH da solução ou dispersão proteica do seu ponto isoelétrico, maior será as interações proteína-proteína, diminuindo a sua solubilidade e contribuindo desta maneira para a formação de uma interface que estabiliza as bolhas de ar. Dessa forma, a autoassociação da proteína no tamanho nanométrico acarretou maior estabilidade da espuma por possuir maior iteração proteína-proteína do que a proteína nativa.
A Tabela 3 mostra as propriedades de emulsão da nanoestrutura obtida. Tabela 3 – Resultados do teste de emulsão por absorbância.
Amostra IEA ESI 5 ESI 15 ESI 60
Α-la em NaCl 2,98 12,14 65,47 96,9
Rodiles-López et al. (2008) estudaram as propriedades emulsificantes da α-la e obtiveram para esta proteína nativa sob tratamento de 40 ºC uma estabilidade de 11,7 por 5 min e 106 de IEA. Dessa forma, verifica-se que a nanoestrutura, da mesma forma que o resultado da espuma, apresenta um IEA menor que a proteína nativa, mas uma estabilidade maior ao longo do tempo.
A nanoestrutura apresentando melhores propriedades técnico-funcionais e tendo o potencial de encapsular moléculas bioativas, possibilitou, então, a avaliação da eficiência de encapsulação e capacidade de ligação entre essas nanoestruturas e a quercetina (Tabela 4).
Tabela 4 – Resultados obtidos da eficiência do encapsulamento da quercetina na nanoestrutura formada pela proteína α-la e da capacidade de ligação.
[Q] na dispersão de NPs em (µg.mL-1) Eficiência de encapsulamento (%) Capacidade de ligação (%) 25 33,25 ± 8,61 6,30 ± 0,08 50 73,09 ± 2,55 10,65 ± 0,02 100 83,34 ± 0,70 35,80 ± 0,01 150 80,70 ± 2,39 26,86 ± 0,01 300 8,24 ± 4,30 23,76 ± 1,23
A solução de quercetina a 100 µg.mL-1 em dispersão com nanoproteínas apresentou melhor
eficiência e capacidade de ligação comparada às outras concentrações. Monteiro et al (2014) avaliou a encapsulação de quercetina em nanoestruturas de lisozima associada a α-la. Eles obtiveram 50 % de eficiência de encapsulação, enquanto que a nanoestrutura de α-la com cloreto de sódio conseguiu encapsular 83,34 %, mostrando-se, então, mais eficiente para este tipo de molécula bioativa.
4. CONCLUSÕES
A nanoestrutura de α-la formada na presença de NaCl auxilia na estabilização de espumas e emulsão quando comparada à proteína nativa. Além disso, essa nanoestrutura mostrou-se eficiente na encapsulação da quercetina, apresentando mais de 80 % de eficiência. Os resultados encontrados são úteis para possíveis aplicações na indústria de alimentos, uma vez que moléculas bioativas encapsuladas agregam valor nutricional e funcional ao produto por proporcionar uma liberação controlada do bioativo, além da possibilidade de serem empregados como emulsificantes alternativos em processos alimentícios.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico (CNPq), à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo suporte financeiro e ao Laboratório de Embalagens do DTA-UFV pelas análises DLS.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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