A
acidez volátil, expressa em g/L de ácido acético, pode conferir, acima de certos limites, um sabor ácido ou azedo e um aroma indesejável a vinagre, o que torna o vinho impróprio para consumo traduzindo-se em perdas económicas para o produtor. Neste contexto, a remoção de ácido acético de vinhos é uma questão importante para a in-dústria enológica.O ácido acético pode ser formado em qualquer momento da pro-dução do vinho. Com efeito, pode ser produzido antes da fermen-tação alcoólica por deterioração microbiana das uvas infectadas com Botrytis cinerea. Também é formado pelas leveduras durante a fermentação alcoólica e mais tarde, pelas bactérias do ácido lác-tico durante a fermentação maloláctica. O aumento exagerado de ácido acético pode resultar da atividade metabólica das bactérias do ácido acético [1 e 2]. Em circunstâncias peculiares pode ocorrer
produção de ácido acético mesmo após o engarrafamento do vi-nho. É o que se observa em vinhos tintos armazenados em garra-fas colocadas na posição vertical em que persista uma população de bactérias do ácido acético [3].
Têm sido propostos vários processos com o objetivo de diminuir a acidez volátil de vinhos azedos, nomeadamente (a) loteamento dos vinhos; (b) a osmose reversa (OR) e a nanofiltração [4] e (c) a
remoção biológica de ácido acético através de refermentação [5 e 6]. O primeiro processo pressupõe a estabilização microbiológica
do vinho anteriormente à sua mistura com vinhos de baixo teor de ácido acético. No entanto, o vinho resultante tem um valor comer-cial reduzido [7]. Alternativamente, o vinho azedo pode ser
vendi-do para fins de destilação para a obtenção de etanol. Esta solução está associada também a perdas económicas consideráveis. A OR
e a nanofiltração são processos alternativos de desacidificação dos vinhos azedos mas requerem equipamentos sofisticados. En-tretanto, foram desenvolvidos processos de biodesacidificação a fim de obter vinhos com um bom equilíbrio entre os teores de açúcar e de ácido, mas que se aplicam apenas à redução do teor em ácido málico [8 - 14]. Apesar de já terem sido obtidas em
labo-ratório estirpes geneticamente modificadas que diminuem subs-tancialmente o ácido acético [15], devido à polémica na Europa
sobre a sua utilização na produção de alimentos é pouco provável que, num futuro próximo, estas venham a ser utilizadas em vini-ficação [16 e 17].
Em alternativa, a redução de concentrações anormalmente eleva-das de ácido acético no vinho podem ser obtida por um processo de refermentação [5]. A remoção biológica de ácido acético por
estirpes de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae é uma prática enológica que tem vindo a ser utilizada desde o trabalho pioneiro de Peynaud em 1938 [5]. Este processo empírico de
desa-cidificação biológica consiste na refermentação associada ao con-sumo de ácido acético por leveduras e pode ser conseguido pela adição ao vinho azedo de mosto ou bagaço residual de um vinho acabado. Com o objectivo de desenvolver um processo controla-do de remoção biológica da acidez volátil de vinhos baseacontrola-do na utilização de estirpes de levedura selecionadas procedemos, num estudo anterior, à caracterização de diferentes leveduras vínicas indígenas e comerciais no que respeita à capacidade de degrada-ção de ácido acético em condições de vinificadegrada-ção [18].
Verificá-mos que algumas das estirpes de leveduras indígenas e comer-ciais analizadas eram capazes de degradar o ácido acético durante a fermentação alcoólica [18] e que a desacidificação também podia
Redução da acidez volátil de vinhos
por
células de Saccharomyces
cerevisiae imobilizadas em esferas
de alginato-quitosano
O aumento exagerado de ácido acético pode resultar da atividade metabólica das bactérias do
ácido acético. Em circunstâncias peculiares pode ocorrer produção de ácido acético mesmo
após o engarrafamento do vinho. É o que se observa em vinhos tintos armazenados em garrafas
colocadas na posição vertical em que persista uma população de bactérias do ácido acético.
TM
ser realizada diretamente no vinho, sem adição de açúcares [19].
No entanto, a eficiência de degradação do ácido acético era re-duzida em vinhos com teores de etanol superiores a 10% (v/v) e baixo pH [19].
A imobilização de células por aprisionamento em esferas tem re-cebido crescente atenção nos últimos anos e resultado num gran-de número gran-de aplicações na biotecnologia, agricultura e até na medicina. Em comparação com as suspensões de células livres, esta técnica tem a vantagem de possibilitar a utilização contínua de células e de promover a proteção das células imobilizadas em relação às substâncias inibidoras do meio de fermentação. Como exemplo, podemos referir o trabalho realizado por Ciani em 1995
[20] com células de Schizosaccharomyces pombe encapsuladas em
esferas de alginato de cálcio utilizadas para diminuir a acidez fixa de vinhos através da degradação do ácido málico.
Uma técnica comum para o aprisionamento de microrganismos em esferas de 0,3-3,0 mm de diâmetro é a gelificação ionotrópica de macromoléculas com catiões multivalentes. A matriz porosa é sintetizada in situ em torno das células. A imobilização pode ser conseguida por mistura de uma suspensão de microrganis-mos com um polímero aniónico, seguida de ligação cruzada com catiões multivalentes para formar uma estrutura que retém os mi-crorganismos. A imobilização das células em Ca-alginato (algina-to de cálcio) é um dos mé(algina-todos mais simples, bara(algina-to e frequente para o aprisionamento de diferentes tipos de células, incluindo as microbianas [21]. O problema mais comum que pode ocorrer
durante a fermentação alcoólica utilizando células de levedura imobilizadas em esferas de alginato de cálcio é a libertação de células do interior da esfera para o meio de fermentação, devi-do à desestabilização devi-do gel. A ruptura das esferas pode ocorrer
Figura 1 – Imagens de microscopia eletrónica de varrimento (MEV) de esferas e células de uma levedura comercial de S. cere-visiae, imobilizadas em camada dupla (CD) de alginato-quitosano:
A) Esfera de camada dupla com alginato a 2% (p/v) e quitosano 1,5% (p/v), antes do processo de desacidificação (140X); B) Esfera de camada dupla com alginato a 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v), antes do processo de desacidificação (1000X); C) Esfera de camada dupla com alginato 2% (p/v) e 1,0% de quitosano (p/v), antes do processo de desacidificação (5000X); D) Distribuição das leveduras no interior de uma esfera de camada dupla de alginato de 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v) depois
de 168 h de desacidificação a pH 3,12 (10000x);
E) Camada externa (quitosano a 1,0%, p/v) de uma esfera após 168 h de desacidificação, a pH 3,12 (5000X); F) Camada externa (quitosano a 1,0%, p/v) de uma esfera após 168 h de desacidificação, a pH 3,50 (4000X).
A
D E F
B C
TM
devido ao crescimento celular, à formação e acumulação de CO2
[22], à presença de agentes quelantes (lactato, citrato ou fosfato)
e à presença de iões não gelificantes, nomeadamente Mg2+, Na+
ou K+, que substituem os iões de cálcio no gel de alginato [23]. O
quitosano é um polímero natural com numerosas aplicações e tem a propriedade de forma um gel por gelificação ionotrópica como o alginato. Não é tóxico, é biocompatível, biodegradável, e possui propriedades antimicrobianas [24]. Esferas de camada dupla de
alginato-quitosano têm sido utilizadas para a imobilização de cé-lulas de levedura em fermentações alcoólicas [25]. A presença de
uma camada de quitosano, exterior à camada de alginato, melhora a estabilidade química e mecânica das esferas durante a fermenta-ção e impede a libertafermenta-ção de células para o meio [26].
Neste contexto resolvemos explorar a imobilização em esferas
de alginato-quitosano de células da estirpe comercial de
Saccha-romyces cerevisiae que se revelou, nos ensaios anteriormente
re-feridos [18-19], entre as mais eficientes para a redução de ácido
acético de vinhos azedos. Com o objetivo de uma melhor compre-ensão do potencial das células imobilizadas para a desacidifica-ção de vinhos, à escala industrial, avaliamos o efeito de diferentes parâmetros relevantes no processo de imobilização de células, tais como a concentração celular, o pH inicial, o número de ca-madas e a composição da matriz de imobilização na eficiência do processo de desacidificação .
No presente estudo, utilizamos um vinho branco, com 12,5% (v/v) de etanol, 1,12 g/L de açúcar residual e uma acidez volátil de 1,1 g/L em ácido acético. Testamos dois valores de pH inicial, pH 3,50 (vinho A) ou 3,12 (vinho B) e duas concentrações celulares
Tabela 2 – Parâmetros enológicos dos vinhos após desacidificação por células de uma levedura comercial de S.
cerevisiae imobilizadas em esferas de camada simples (CS) de alginato ou camada dupla (CD) de alginato-quito-sano. Os resultados são valores médios de experiências efetuadas em triplicado, após 168 h de desacidificação. Os resultados obtidos para as duas concentrações celulares iniciais e as duas condições de imobilização, com a mesma letra, não são significativamente diferentes (P≤0,05)
C élu la s (N .º c él u la s/ m l) E sfe ra s V in h o* Á c. a cé ti co (i n ic ia l) (g /L) V in ho pH (i n ic ia l) E ta n ol % ( v/ v) pH (f in a l) Á ci d o a cé ti co (% d e c on su m o) A ci d ez t ot a l (fin a l) (g /L) SO 2 t ot a l (fin a l) (m g /L) SO 2 l iv re (f in a l) (m g /L) L ib er ta çã o d e cé lu la s p a ra o mei o (C F U /m l) 4,0x107 CD A (1,1) 3,50 11,4±0,4 a, b 3,34±0,03 g 21,8±3,6 d 5,10±0,00 c 71,05±3,44 a 0,0±0,0 a 4,0x107 ± 6,0x105a CD B (1,1) 3,12 11,8±0,3 b 3,01±0,04 f 38,2±6,4 a, b 5,70±0,21 a 71,04±0,91 a 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b CS B (1,1) 3,12 11,3±0,3 a, b 2,74±0,32 c 35,5±6,4 a 5,89±0,05 b 75,83±0,29 b 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b 8,0x107 CD B (1,1) 3,12 11,8±0,1 b 2,95±0,05 e 61,8±0,9 e 5,80±0,13 a, b 71,05±0,01 a 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b CD C (1,3) 3,12 11,5±0,1 a, b 2,84±0,01 d 50,0±0,8 c 6,07±0,02 d 72,80±0,40 a 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b CD D (1,5) 3,12 11,3±0,1 a, b 2,63±0,01 b 50,0±4,0 c 6,32±0,03 e 75,56±1,41 b 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b CD E (1,7) 3,12 11,1±0,4 a 2,60±0,01 a 38,2±0,6 b 6,58±0,06 f 77,03±0,75 b 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b
*Características químicas do vinho inicial: Densidade (20 °C) – 0,9910; SO2 livre – 4,8 mg/L; SO2 total – 70,5 mg/L; açúcares residuais – 1,12 g/L;
acidez total – 5,55 g/L; Grau alcoólico – 12,5% (v/v) em etanol
Tabela 1 – Remoção de ácido acético (%) e número de células no meio (CFU/ml), após 48 ou 72 h de
desacidifi-cação com células de uma levedura comercial de S. cerevisiae imobilizadas em esferas de camada simples de alginato ou camada dupla de alginato-quitosano. Os ensaios, valores médios de experiências efetuadas em tri-plicado, foram realizados em vinho branco (1,12 g/L de açúcar residual; 1,1 g/L de ácido acético e 12,5% (v/v) de etanol), em condições de aerobiose limitada, a 25 °C e pH 3,50 ou 3,12. Os resultados obtidos para os vinhos com a mesma letra não são significativamente diferentes (P≤0,05)
Esferas de camada simples
Alginato, 2% (p/v) Alginato, 2% (p/v) e quitosano, 1% (w/v)Esferas de camada dupla
Celulas/ml 4,0 x 107 4,0 x 107 8,0 x 107 Vinhos 48 h 72 h 48 h 72 h 48 h 72 h Ácido acético % (CFU/ml) Vinho (A) pH 3,50 23,5 ± 5,2 a, b 28,3 ± 3,2 c 17,9 ± 1,2 d 21,6 ± 2,3 a, d 25,7 ± 1,6 a, b, c 28,1 ± 3,2 c 3,3x106b 2,0x107c 4,4x103* a 3,5x104* a 5,6x103* a 6,7x104* a Vinho (B) pH 3,12 23,1 ± 5,7 a, b 24,9 ± 5,2 a, b, c 24,8 ± 9,7 a, b, c 27,3 ± 5,1 b, c 31,1 ± 3,4 d 42,9 ± 2,4 e (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a * Floculação celular TM
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(4,0 x 107 células/ml e 8,0 x 107 células/ml). A
redução do pH conduziu a um aumento signi-ficativo no consumo de ácido acético em 6,9% e 5,7% após 48 h e 72 h, respetivamente (Ta-bela 1), quando foram utilizadas esferas com camada dupla de alginato-quitosano (2,0%, p/v e 1,0%, p/v, respetivamente) contendo 4,0 x 107 células/ml. A pH 3,50 a libertação de
cé-lulas das esferas diminuiu significativamente com a utilização de esferas de camada dupla enquanto que, a pH 3,12, não se observou li-bertação de células do interior das esferas, independentemente do número de camadas ou da concentração celular utilizada (Tabe-la 1). A análise das célu(Tabe-las imobilizadas por microscopia eletrónica de varrimento (MEV) confirmou estes resultados, sugerindo que o valor de pH é crítico para a manutenção da integridade das esferas. Com efeito, o reves-timento das esferas de alginato com quitosano (1,0%, p/v) conferiu uma maior integridade à camada externa das esferas após o processo de
desacidificação (Figura 1-E). No entanto, para o vinho a pH 3,50 (o pH desejável para vinhos brancos de mesa é de 3,0-3,3 [1]), a
camada externa de quitosano não manteve a sua integridade ao longo do processo de desacidificação, provavelmente devido ao elevado crescimento celular que ocorreu no interior das esferas (Figura 1-F). Verificámos também que a utilização de uma con-centração superior de quitosano (1,5%, p/v) não conferiu às esfe-ras uma superfície integra, mesmo antes do início do processo de desacidificação (Figura 1-A).
O consumo mais elevado de ácido acético (42,9%), foi observado para o vinho B (pH 3,12, 12,5% (v/v) de etanol, 1,1 g/L de áci-do acético), trataáci-do com esferas de camada dupla contenáci-do 8,0 x 107 células/ml, após 72 horas de incubação (Tabela 1). O aumento
da concentração de ácido acético (1,3; 1,5 e 1,7 g/L, vinhos C, D e E) traduziu-se numa redução do consumo de ácido nas condições descritas (Figura 2). Foi observada floculação celular a pH 3,50, quando foram utilizadas esferas de camada dupla (Tabela 1). Após 168 h de desacidificação foram avaliados vários parâme-tros enológicos para as diferentes condições testadas (Tabela 2). O prolongamento da desacidificação de 72 h (Tabela 1) para 168 h (Tabela 2) conduziu a um aumento na remoção de ácido acético de 42,9% para 61,9% (a concentração final de ácido acético, ao fim de 168 h foi de 0,42 g/L, Figura 2) para o processo mais eficiente (vinho B, esferas de dupla camada com uma concentração celular de 8,0 x 107 células/ml). A diminuição do valor de pH inicial de
3,50 para 3,12 levou a um aumento de 16,4% na remoção de ácido acético (vinhos A e B, Tabela 2). Além disso, para pH 3,12 a du-plicação da concentração celular inicial levou a uma dudu-plicação no consumo de ácido acético (de 35,5% para 61,8%, Tabela 2). No entanto, nestas estas condições, o aumento da concentração inicial de ácido acético (de 1,1 a 1,7 g/L) conduziu a uma redução no consumo do mesmo (Figura 2) e do pH final. Apesar de se observar este efeito negativo na eficiência de remoção do ácido acético foi ainda assim possível verificar uma redução da acidez volátil de um vinho azedo com 1,7 g/L de ácido acético (vinho E) para valores abaixo do limite legal (1,2 g/L). Estas alterações estiveram associadas a um aumento na acidez total e de SO2 total
(Tabela 2) tendo em conta os valores iniciais no vinho de 5,55 g/L e 70,5 mg/L, respetivamente. Após 168 h de desacidificação ve-rificámos um ligeiro decréscimo na concentração de etanol em todos os vinhos, independentemente da imobilização das células, do pH inicial, ou da concentração inicial de ácido acético. Esta di-minuição foi tanto mais acentuada quanto mais elevada a concen-tração inicial de ácido acético nos vinhos (Tabela 2 e Figura 2). Até à data existem vários exemplos de aplicação de leveduras imobilizadas na produção de vinhos e, tanto quanto é do nosso conhecimento, não têm sido reportados efeitos negativos na qua-lidade do vinho. No entanto, só a realização de ensaios à escala da adega, para avaliar o impacto da utilização de células imobiliza-das de S. cerevisiae em camada dupla de alginato-quitosano nas
Figura 2 – Concentração inicial de ácido acético (g/L) e após 48, 72 e 168 h de desacidificação de vinhos com células de uma levedura comercial de S. cere-visiae imobilizadas em esferas de camada dupla de alginato-quitosano (8,0 x
107 células/ml). Os ensaios foram realizados num vinho branco com
concentra-ções iniciais de ácido acético de 1,1; 1,3; 1,5 e 1,7 g/L (vinhos B, C, D e E, res-pectivamente), a um pH inicial de 3,12 e uma concentração inicial de etanol de 12,5% (v/v), em condições de aerobiose limitada, a 25 °C.
TM
características organolépticas do vinho desacidificado, permiti-rá validar a sua aplicação como uma alternativa eficiente para a correção da acidez volátil de vinhos e, consequentemente, para a melhoria da sua qualidade.
Alice Vilela(1), Dorit Schuller (2),
Arlete Mendes-Faia(1) e Manuela Côrte-Real(2) (1) Instituto de Biotecnologia e de Bioengenharia,
Centro de Genómica e Biotecnologia, (IBB/CGB-UTAD), Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real
(2) Centro de Biologia Molecular e Ambiental,
Departamento de Biologia, Universidade do Minho, Braga
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