UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
JOSÉ MAURÍCIO MACIEL CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO SÊMEN OVINO DILUÍDO E CONGELADO
EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ
(ACP-102c) OU TRIS
FORTALEZA-CE 2008
JOSÉ MAURÍCIO MACIEL CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO SÊMEN OVINO DILUÍDO E CONGELADO
EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ
(ACP-102c) OU TRIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. José Ferreira Nunes
FORTALEZA-CE
2008
JOSÉ MAURÍCIO MACIEL CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO SÊMEN OVINO DILUÍDO E CONGELADO
EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ
(ACP-102c) OU TRIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em: 15/12/2008
Banca Examinadora
_______________________________________________ Prof. Dr. José Ferreira Nunes (Presidente da Banca)
Orientador - Universidade Estadual do Ceará
_______________________________________________ Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
Co-orientadora - Universidade Estadual do Ceará
_______________________________________________ Profª. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito-Vanderley
Examinadora - Universidade Estadual do Ceará
_______________________________________________ Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Moura
Para minha mãe, que em todos os momentos me transmitiu carinho,
força e tranqüilidade.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Dr. José Ferreira Nunes, por sua orientação e dedicação por todos estes anos, desde meu início na área da Medicina Veterinária.
À Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro, minha co-orientadora, que também vem me acompanhando desde minha entrada no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino. Exemplo de força e determinação, que muito tem ajudado a manter este laboratório e a fazê-lo crescer.
À Dra. Carminda Sandra Brito Salmito-Vanderley, pelas sugestões dadas ainda no início deste trabalho, que muito contribuiu para alcançar e ampliar os objetivos propostos.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), pelo concedimento de minha bolsa de pós-graduação.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), com quem tenho convivido desde a graduação.
À Fazenda Líbanus, em particular ao gerente Robson Lima, por terem concedido os animais do experimento. Certamente, esta parceria será duradoura.
Aos estudantes de iniciação científica: Oscar Oliveira Brasil, Divens Firmino Reis de Souza, Edgar Tavares de Assis Neto, Mateus Nunes Diógenes e João Batista e Silva Júnior pela ajuda durante a realização da parte prática do trabalho. Mais que ajudar, eles foram co-realizadores do experimento, pois, sem a participação destes, os momentos de descontração e de apoio, este trabalho teria sido muito mais difícil de ser realizado.
Aos médicos veterinários e mestres Rodrigo Vasconcelos de Oliveira e Erika da Silva Bezerra de Menezes, pelo companherismo, apoio, opiniões e aprendizagem.
À toda minha família, em particular minha afilhada Christiane de Sousa Barbosa e “minhas mães” Avelina dos Santos Maciel e Maria das Graças de Sousa, pelo apoio, carinho e atenção dados durante todos estes anos.
RESUMO
A inseminação artificial com uso do sêmen criopreservado é uma ferramenta valiosa em programas de melhoramento genético e conservação de raças ovinas. No intuito de facilitar a disponibilidade de diluidores seminais e reduzir seus custos, foi desenvolvido o diluidor de origem vegetal à base de água de coco em pó (ACP-102), que tem apresentado resultados satisfatórios na conservação do sêmen ovino resfriado. Há, no entanto, carência de estudos do uso deste diluidor na criopreservação do sêmen ovino. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência do sêmen ovino criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS sobre a motilidade espermática e na morfometria da cabeça de espermatozóides em sistema de análise de sêmen auxiliada por computador (CASA). Foram realizadas 12 coletas de sêmen de quatro ovinos da raça Santa Inês. As amostras de sêmen de cada ejaculado foram divididas em duas alíquotas e diluídas em ACP-102c e TRIS e criopreservadas. O sêmen foi avaliado logo após descongelamento (T0), após uma hora (T1) e duas horas (T2) de incubação, para percentual de espermatozóides morfologicamente normais e de células vivas (pela técnica de coloração com eosina-nigrosina), avaliação da integridade acrossomal e de viabilidade celular (com uso da técnica de coloração tripla) e análise de motilidade em sistema CASA. Foram ainda realizados esfregaços tanto para o sêmen fresco como congelado em ACP-102c e TRIS, corados com Rosa Bengala e submetidos à análise morfométrica no módulo de morfometria do sistema CASA. Foram avaliados 150 espermatozóides corretamente digitalizados por lâmina para os parâmetros comprimento, largura, área e perímetro da cabeça. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre o sêmen criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS nos parâmetros adotados em cada técnica de coloração. Foram observadas diferenças estatísticas logo após descongelamento entre os diluidores ACP-102c e TRIS para motilidade total, motilidade progressiva e amplitude lateral da cabeça, com valores superiores encontrados no diluidor TRIS, mas ambos diluidores foram equivalentes quanto aos parâmetros qualitativos (retilinearidade e linearidade) e quantitativos (velocidade curvilinear e velocidade média do percurso), bem como freqüência de batimento cruzado do flagelo. Após duas horas de incubação, ambos diluidores diferiram significativamente para os parâmetros de motilidade avaliados, exceto para o parâmetro linearidade O diluidor ACP-102c apresentou maior variabilidade individual entre reprodutores. Os parâmetros morfométricos para o sêmen fresco foram significantemente superiores aos do sêmen criopreservado, não sendo detectadas diferenças estatísticas para espermatozóides criopreservados em ACP-102c ou TRIS. Os parâmetros morfométricos, entretanto, sofreram variações individuais entre os animais estudados. A semelhança dos resultados morfométricos de espermatozóides diluídos em ACP-102c e TRIS é indicativo de que ambos possuem similar capacidade de preservação estrutural da cabeça de espermatozóides ovinos submetidos à criopreservação. Recomenda-se a pesquisa de novos protocolos de criopreservação que otimizem os resultados obtidos na criopreservação de sêmen ovino com o uso do ACP-102c, da interação entre constituintes do plasma seminal e de membrana dos espermatozóides com componentes do diluidor e a avaliação do sêmen ovino criopreservado em ACP-102c em programas de inseminação artificial.
ABSTRACT
The cryopreservated semen at artificial insemination programs is a value tool for genetic and ovine breed conservation programs. To facilitate the disponibility of seminal extenders and reduce the costs, it was developed a vegetal extender based on powder coconut water (PCW-102), that shown satisfactory results in chilled ram semen. However, there is a lack of studies using this extender in ram semen cryopreservation. The aim of this study were to evaluate the efficiency of ram semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS on sperm motility and sperm head morphometry using computer assited semen analysis (CASA). Twelve semen collections were taken from four Santa Ines rams. Semen samples of each ejaculate was divided into two aliquots and extended on PCW-102c and TRIS and cryopreserved. The semen was evaluated at the moment of thawing (T0), after one hour (T1) and two hours (T2) of incubation, for percentage of spermatozoa morphologically normal and alive cells (by eosin-nigrosin dyeing technique), evaluation of acrosomal integrity and cellular viability (by triple stain technique) and motility evaluation at CASA system. Fresh and frozen-thawed semen were smeared and stained in Bengal Rose dye and analyzed using the morphometric module of CASA system. At least 150 properly digitized sperm head per slide were analyzed for length, width, area and perimeter. It weren’t observed statistical differences between semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS extenders for the parameters adopted in each stain technique. There are significant differences at the moment of thawing between PCW-102c and TRIS extenders for total motility, progressive motility and head lateral amplitude, with superior values for TRIS extender, but both extenders was equivalent for qualitative (straightness and linearity) and quantitative parameters (curvilinear velocity and average velocity), and frequency of track crossing. After two hours of incubation, both extenders were significantly different for motility parameters evaluated, except for linearity. The PCW-102c extender shows more individual variability between rams. The morphometric parameters for fresh semen were statistically superior to those of frozen-thawed semen, not being observed statistical differences for spermatozoa cryopreserved on PCW-102c or TRIS. The morphometric parameters, however, suffered individual variations between the animals studied. The similarity of morphometric resulties of spermatozoa extended on PCW-102c and TRIS indicate that both have similar capacity of preserve the head structure of ram spermatozoa cryopreservated. It was recommended the research of new cryopreservation protocols that optimize the results obtained on the ram semen cryopreservation with the use of PCW-102c, the interaction of seminal constituents and spermatozoa membrane with the extenders components and the evaluation of ram semen cryopreserved on PCW-102c at artificial insemination programs.
LISTA DE QUADROS
Pág. Quadro 1. Principais parâmetros cinéticos de espermatozóides obtidos através do
LISTA DE FIGURAS
Pág. Figura 1. Diferentes categorias de espermatozóides ovinos corados pela técnica de
coloração tripla (adaptada de Talbot e Chacon, 1991)... 21 Figura 2. Velocidade curvilinear (VCL), velocidade média da trajetória (VAP) e
velocidade linear (VSL) obtidas em sistema CASA... 24
Capítulo 1
Figura 1. Desenho experimental para coleta, criopreservação e avaliação do sêmen criopreservado de ovinos nos diluidores ACP-102c e TRIS... 40 Figura 2. Parâmetros de motilidade de sêmen ovino criopreservado em ACP-102c e
TRIS avaliados pelo software SCA em diferentes tempos de incubação... 45
Capítulo 2
Figura 1. Dispersão dos parâmetros morfométricos comprimento e largura de espermatozóides ovinos no sêmen fresco, criopreservados em ACP-102c e TRIS... 75
LISTA DE TABELAS
Pág.
Capítulo 1
Tabela 1. Média ± erro padrão dos percentuais dos parâmetros avaliados de viabilidade espermática pelas técnicas de coloração com eosina-nigrosina (EV) e coloração tripla (VA, VR, MA e MR) em sêmen fresco e criopreservado em TRIS e ACP-102c...
43 Tabela 2. Média ± erro padrão dos parâmetros de motilidade do sêmen ovino fresco e
criopreservado em TRIS e ACP-102c, avaliados pelo software SCA...
44 Tabela 3. Média ± erro padrão dos parâmetros de percentual de espermatozóides
móveis totais (MOV) e de progressivos (PROG) para sêmen ovino fresco e criopreservado nos diluidores TRIS e ACP-102c, segundo os reprodutores utilizados...
46
Capítulo 2
Tabela I. Média ± erro padrão (coeficiente de variação) dos parâmetros morfométricos da cabeça de espermatozóides ovinos avaliados segundo tratamento (sêmen fresco, sêmen criopreservado em ACP-102c e sêmen criopreservado em TRIS)...
74 Tabela II. Média ± erro padrão dos parâmetros morfométricos da cabeça de
espermatozóides ovinos avaliados segundo tratamento (sêmen fresco, sêmen criopreservado em ACP-102c e sêmen criopreservado em TRIS) para cada animal...
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP® água de coco em pó
ACP- 102 meio diluente para sêmen ovino à base de água de coco em pó
ACP- 102c meio para criopreservação de sêmen ovino à base de água de coco em pó ALH amplitude do deslocamento lateral da cabeça
BCF freqüência de batimento cruzado
CASA análise de sêmen auxiliada por computador CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal
EV porcentagem de espermatozóides vivos avaliados pelo método de eosina-nigrosina
IAA ácido 3-indol-acético LIN linearidade
MA percentual de espermatozóides mortos com acrossoma pela técnica de coloração tripla
MOV porcentagem de motilidade total através análise de sêmen auxiliada por computador
MR percentual de espermatozóides mortos sem acrossoma pela técnica de coloração tripla
PROG porcentagem de motilidade progressiva através análise de sêmen auxiliada por computador
SCA® Sperm Class Analyser STR retilinearidade
T0 momento de avaliação do sêmen logo após descongelamento
T1 momento de avaliação do sêmen após uma hora de incubação a 37oC T2 momento de avaliação do sêmen após uma hora de incubação a 37oC
VA percentual de espermatozóides vivos com acrossoma pela técnica de coloração tripla
VAP velocidade média da trajetória VCL velocidade curvilinear
VR percentual de espermatozóides vivos sem acrossoma pela técnica de coloração tripla
SUMÁRIO
Pág.
1. INTRODUÇÃO... 13
2. REVISÃO DE LITERATURA... 14
2.1. Preservação do sêmen de ovinos... 14
2.1.1. Diluição seminal... 14
2.1.2. Congelamento seminal... 14
2.1.3. Qualidade seminal e fertilidade após a descongelação... 17
2.1.4. Avaliação do sêmen ovino... 18
2.1.5 Técnicas básicas... 19
2.1.6. Análise do sêmen auxiliada por computador... 22
2.2. Diluentes à base de água de coco... 26
3. JUSTIFICATIVA... 29
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA... 30
5. OBJETIVOS... 31
Capítulo 1. Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS... 32
Capítulo 2. Efeitos da criopreservação sobre a morfometria da cabeça de espermatozóides de ovinos diluídos em meio à base da água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS... 58
8. CONCLUSÕES... 76
9. PERSPECTIVAS... 77
1. INTRODUÇÃO
A grande capacidade dos ovinos em adaptar-se aos modernos sistemas de exploração, uma maior produção de carne por hectare/ano, além da facilidade de manejo, fazem com que a ovinocultura possibilite uma maior produtividade em relação às criações tradicionais como a bovinocultura, tornando a criação de ovinos ideal para pequenos produtores e da agricultura familiar, perfil fundiário predominante no Nordeste (IBGE, 2007).
Os índices reprodutivos influenciam o nível produtivo de um rebanho. A inseminação artificial permite o incremento na eficiência reprodutiva e aumento da produtividade de um rebanho através da utilização de reprodutores selecionados. O uso do sêmen diluído e criopreservado se destaca entre as técnicas aplicadas por conservar a capacidade fecundante do sêmen por longos períodos de armazenamento, contribuindo significativamente em programas de melhoramento genético
Devido aos resultados obtidos com os primeiros estudos da água de coco in natura na conservação de células espermáticas realizados por Nunes (1998), objetivou-se a elaboração de um meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP®), caracterizado pela padronização e estabilização da água de coco in natura através de um processo de desidratação e subseqüente formulação de meios de conservação específicos para espermatozóides. Entretanto, até o momento atual, existe necessidade no estabelecimento de protocolos adequados de criopreservação do sêmen ovino que utilizem como diluidor a água de coco em pó. Este estudo poderá permitir a disponibilidade da água de coco em centros de pesquisa que ‘não disponham da matéria-prima (coco), e que visem sua utilização em programas de criopreservação de espermatozóides.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Preservação do sêmen de ovinos
2.1.1. Diluição seminal
Os diluentes permitem o aumento do volume total do ejaculado, facilitando sua divisão em doses inseminantes e proporcionando um meio favorável para a sobrevivência dos espermatozóides in vitro (Derivaux, 1980). Sua composição difere segundo a espécie animal da procedência do sêmen e da tecnologia seminal empregada (Hopkins e Evans, 1991).
Hafez e Hafez (2004) sugerem que um diluente deve proporcionar nutrientes como fontes de energia; proteger os espermatozóides do efeito maléfico do frio; proporcionar um meio tampão; manter a pressão osmótica adequada; inibir o crescimento bacteriano; aumentar o volume do ejaculado e proteger as células espermáticas durante congelamento. A dose inseminante ótima para sêmen de ovinos por inseminação cervical é de 400 milhões espermatozóides, em um volume de 0,25 a 0.50 mL (Evans e Maxwell, 1990).
Alguns diluentes mantêm a viabilidade do sêmen à temperatura ambiente, enquanto que outros são apropriados no resfriamento entre 4 e 5°C para ajudar a controlar o crescimento bacteriano e reduzir a taxa metabólica das células espermáticas (Hopkins e Evans, 1991).
2.1.2. Congelamento seminal
Atualmente, existem dois métodos que permitem a manutenção de níveis aceitáveis de fertilidade obtidos por inseminação artificial (IA) em ovinos: o resfriamento, realizado a 15oC ou 4oC, e o congelamento, principalmente pelo uso da laparoscopia (Anel et al., 2006). Entretanto, a fertilidade da IA ovina depende da interação entre a preservação do sêmen e a técnica de aplicação seminal (vaginal, cervical ou deposição intrauterina) (Anel et al., 2006). Um problema metodológico é derivado desta interação, o que proporcionou um largo leque de técnicas baseadas no sêmen ovino congelado (Anel et al., 2006).
A composição do diluente é um dos fatores que afeta a proporção de espermatozóides vivos após a descongelação (Watson, 1995), sendo seu incremento um dos desafios da biotecnologia da reprodução de ovinos.
Os diluentes para congelamento devem possuir uma substância orgânica que atue como crioprotetor externo e que proteja as células contra o choque térmico que se produz ao resfriar o sêmen desde os 20°C aos 5°C, tal como a gema de ovo ou leite desnatado; uma fonte de energia, como a glicose ou frutose; um componente tampão, como citrato de sódio ou tris-(hidroximetil) aminometano (TRIS); um crioprotetor interno que proteja aos espermatozóides durante congelamento, a exemplo do glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol; e antibióticos para prevenir o crescimento bacteriano, como a penicilina, estreptomicina ou gentamicina.
O congelamento de sêmen na espécie ovina encontra-se atualmente estagnado devido à escassa difusão deste processo aplicada ao campo (Anel et al., 2006). Vários métodos de uso comercial vêm sendo desenvolvidos com resultados aceitáveis (Maxwell et al., 1995), mas seu uso geral tem sido restrito a deposição do sêmen intra-uterino por laparoscopia, devido à baixa taxa de fertilidade observada no sêmen descongelado por inseminação vaginal/cervical, especialmente no estro induzido (Curry, 2000). Entretanto, os métodos de congelamento podem ser melhorados, visando contornar problemas relacionados à manipulação do sêmen, congelabilidade das células espermáticas e aumento da população de espermatozóides recuperados após a criopreservação (Anel et al., 2006).
Segundo Hopkins e Evans (1991), a sensibilidade dos espermatozóides às mudanças de temperaturas se deve a ação protetora do plasma seminal e à integridade da membrana espermática. Esta última relaciona-se tanto com sua composição lípido-protéica como de colesterol e fosfolipídios (Darin-Bennett e White, 1977).
Pérez-Pé et al. (2001) verificaram que proteínas do plasma seminal conferem proteção aos espermatozóides ovinos contra o choque térmico. Estas proteínas, identificadas como RSVP14 e RSVP20 (Barrios et al. 2005; Fernández-Juan et al., 2006), secretadas na vesícula seminal (Fernández-Juan et al., 2006), tem seu papel na estabilização da membrana espermática, evitando a capacitação (Barrios et al. 2005).
A baixa taxa de fertilidade de espermatozóides ovinos criopreservados pode ser devido às alterações ultra-estruturais, bioquímicas e funcionais ocorridas numa boa parte da população de espermatozóides, que resulta em insuficiente motilidade e perda de viabilidade dos mesmos no trato reprodutivo da fêmea (Salamon e Maxwell, 2000). Mudanças ultra-estruturais afetam principalmente a membrana plasmática, pois durante o processo de
congelamento-descongelamento, existe uma redistribuição de lipídios que altera as interações lipídio-lipídio e lipídio-proteína da membrana espermática (Park e Graham, 1992).
A maioria dos diluentes apresenta a gema de ovo como componente básico, já que a fosfatidilcolina (lecitina) e lipoproteínas da gema, bem como a caseína nos diluentes à base de leite, protegem os espermatozóides contra o choque térmico (Mies Filho et al., 1982; Das, 1995).
A fração ativa da gema de ovo é uma lipoproteína de baixa densidade (LDL) (Waltson e Martin, 1975). Tem sido sugerido que a LDL pode-se agregar à membrana plasmática durante o processo de congelamento, evitando a perda de fosfolipídios da membrana e aumentando a tolerância ao processo de criopreservação (Graham e Foote, 1987). Entretanto o papel dos componentes lipídicos e protéicos da LDL ainda não foi elucidado. Alguns autores obtiveram bons resultados no uso da LDL em sêmen bovino (Moussa et al., 2002, Amirat et
al., 2004). Outras substâncias como fosfocaseinato ou lactoglobulina (Batellier et al., 1997)
têm sido testadas em sêmen resfriado, mas sua aplicação em sêmen ovino criopreservado ainda não foi verificada (Anel et al., 2006). Em bovinos, Manjunath et al. (2002) e Bergeron
et al. (2007) propuseram que tanto a LDL da gema de ovo como a caseína do leite ligam-se às
proteínas do plasma seminal bovino (BSP), evitando a ligação das mesmas ao espermatozóide. As proteínas BSP ligam-se à membrana dos espermatozóides (Manjunath et
al., 1994), induzindo o efluxo de colesterol e fosfolipídeos (Thérien et al., 1998, 1999),
resultando na desestabilização da membrana. A LDL e a caseína do leite presente nos diluidores seminais seqüestram a maioria das BSP, resultando em mínima modificação da membrana plasmática, permitindo melhor conservação do sêmen (Manjunath et al., 2002). Proteínas semelhantes à BSP têm sido encontradas em outras espécies, inclusive em ovinos (Jobim et al., 2005) e os mecanismos de proteção podem ser similares aos observados em bovinos (Manjunath et al., 2002; Bergeron et al., 2007).
Na espécie ovina, o glicerol é o principal crioprotetor utilizado. A sobrevivência espermática, entretanto, é altamente afetada pelo glicerol durante a criopreservação (Anel et
al., 2003). Deste modo, a adição de glicerol em etapas parece representar o melhor balanço
entre a citotoxicidade e crioproteção. Entretanto, a variabilidade de resultados leva a concluir que mais estudos se fazem necessários sobre a adição de glicerol e sua relação com diluentes e curvas de congelamento requeridas para se obter ótimos resultados na IA (Salamon e Maxwell, 1995). Outras substâncias (DMSO, etilenoglicol, açúcares, polímeros, proteínas anti-congelantes), têm sido testadas, mas apresentam resultados inferiores em comparação aos obtidos com o glicerol (Salamon e Maxwell, 2000).
Segundo Maxwell e Evans (1990), o sêmen ovino pode ser congelado em palhetas ou em peletes. No acondicionamento em palhetas, o sêmen pode ser diluído em uma ou duas etapas. No método de duas etapas, o sêmen é diluído a 30ºC com diluentes sem glicerol. É então resfriado até 4ºC em 1,5-2,0 horas, sendo então adicionado à porção do diluente com glicerol. No método de uma etapa, o sêmen a 30ºC é diluído com diluente com glicerol, resfriado até 4ºC em 1,5-2,0 horas e então envasado em palhetas de 0,25 mL. O congelamento é realizado inicialmente em vapores de nitrogênio líquido, colocando as palhetas resfriadas horizontalmente em gradil a 4ºC a 3-4 cm acima do nível do nitrogênio líquido, referentes a temperaturas de -80 a -100ºC, onde permanecem por 7 a 8 minutos, quando então são imersas e armazenadas em nitrogênio líquido.
O objetivo principal do processo de criopreservação é a manutenção de ótimas taxas de congelamento. Byrne et al. (2000), observou melhores resultados de fertilidade, tanto in
vitro como in vivo, com rápidas taxas de congelamento (-5ºC/min). O mesmo foi constatado por Kumar et al. (2003), que obteve taxas de congelamento ótimas entre -20 e -30ºC/min. Em geral, o dano na membrana espermática ovina durante o congelamento ocorre entre 10 e -20ºC/min (Salamon e Maxwell, 1995). Uma significativa melhoria poderia ser mantida com o uso de gradientes multi-térmicos (Arav et al., 2002). Isto permite um ajuste progressivo e contínuo de congelamento e formação de cristais de gelo, reduzindo a crioinjúria.
O resfriamento deve ser suficientemente lento para minimizar a formação de cristais de gelo intracelular e o suficientemente rápido para tornar mínimo o dano do "efeito solução" (Watson, 1995).
2.1.3. Qualidade seminal e fertilidade após a descongelação
As injúrias causadas pela criopreservação são prejudiciais ao transporte e sobrevivência dos espermatozóides no trato reprodutivo feminino (Salamon e Maxwell, 1995). Segundo Bailey et al. (2000), a capacitação espermática induzida pela congelação poderia produzir uma população de espermatozóides após a descongelação com viabilidade curta e ineficiente.
Após o processo de preservação, as células espermáticas devem apresentar boa motilidade a fim de alcançar o local da fecundação e manter a integridade das membranas espermáticas para levar a cabo a penetração do ovócito (Royere, 1996), já que qualquer falha
inerente à fisiologia espermática poderia prejudicar sua capacidade de fertilização do oócito como também de suportar o desenvolvimento embrionário (Holt e Look, 2004).
Durante a conge1ação-descongelação, os espermatozóides são submetidos a condições desfavoráveis como desidratação, mudanças da fase de transição dos fosfolipídios da membrana, efeito solução e a formação de gelo intracelular (Parks e Graham, 1992).
A conseqüência imediata destes processos é a ruptura da membrana plasmática (Watson, 1995) devido aos estresses térmico, mecânico, químico e osmótico exercidos sobre a célula durante congelamento (Parks e Graham, 1992). O acrossoma também pode sofrer mudanças estruturais e degenerativas, como ruptura da membrana acrossomal (Hafez, 1995).
2.1.4. Avaliação do sêmen ovino
A avaliação da qualidade seminal é complementar ao exame clínico para estimar o potencial de um macho como reprodutor e normalmente julga o volume, aspecto, concentração, motilidade e morfologia espermática (Rodriguez-Martinez, 2005).
No caso de ovinos, devido a problemas específicos na IA, o desenvolvimento de técnicas de avaliação do sêmen que predigam a fertilidade a campo, constitui um importante objetivo no progresso da reprodução assistida. Tem sido demonstrado que técnicas convencionais não são aptas para estimar acurada e repetidamente a fertilidade de uma amostra de sêmen (Correa et al., 1997). Técnicas que avaliam o status funcional de organelas espermáticas (acrossomos, mitocôndrias), ou a integridade de componentes celulares (membranas, cromatina), têm ganhado importância durante as últimas décadas (Martinez-Pastor et al., 2004). Além disso, o desenvolvimento destas técnicas poderia possibilitar uma avaliação acurada diariamente do sêmen, podendo ser usado para avaliar e melhorar os protocolos de preservação. O uso de técnicas de alto valor preditivo para fertilidade poderia resultar em incremento na IA, oferecendo a possibilidade da deposição intravaginal do sêmen congelado.
2.1.5 Técnicas básicas
Atualmente, a avaliação do sêmen em centrais de IA é baseada em técnicas convencionais como aspecto externo (volume e coloração), motilidade subjetiva (motilidade massal e motilidade individual) e concentração espermática, principalmente usando o espectrofotômetro (Anel et al., 2006). São ensaios rápidos e práticos, requerendo equipamentos simples que efetivamente detecta amostras de sêmen de baixa qualidade (Anel
et al., 2006).
Tradicionalmente, a morfologia espermática pode ser avaliada através de preparação úmida e esfregaços corados (Bearden e Fuquay, 1992). As anormalidades espermáticas podem afetar, isolada ou simultaneamente, as diferentes regiões da cabeça, peça intermediária e peça principal (Derivaux, 1980). As anormalidades espermáticas foram primeiro classificadas em primárias, ocorridas durante a espermatogênese, e secundárias, resultado de condições não fisiológicas que afetam os espermatozóides após a espermatogênese. Posteriormente os espermatozóides passaram a ser classificados como defeitos maiores ou menores, caracterizados pela gravidade dos seus efeitos deletérios à fertilidade (Nöthling e Irons, 2008). Em ovinos, o percentual de espermatozóides morfologicamente normais possui correlação com a fertilidade, podendo esta correlação ser superior a 0,5 (Colas, 1981).
A integridade da membrana espermática é um atributo essencial para a fertilidade do espermatozóide e, por isso, a análise deste parâmetro é fundamental para a predição da fertilidade (Luz et al., 2000). O uso de corantes vitais, como a eosina-nigrosina, é eficiente na determinação de espermatozóides com danos na membrana, uma vez que estes corantes não podem passar pela membrana de uma célula viva, mas penetra em células mortas, corando-as (Bearden e Fuquay, 1992).
De modo semelhante, a integridade do acrossoma é pré-requisito básico para garantir um bom potencial de fertilidade dos espermatozóides, uma vez que o percentual de espermatozóides que apresentaram reação acrossomal possui correlação negativa com a fertilidade (Gil et al., 2000). Entretanto, a integridade acrossomal não reflete necessariamente a integridade de membrana, sendo importante o uso de testes que combinem ambas avaliações (Holt, 2000). É possível a ocorrência de lesões do acrossoma durante congelação e descongelação, sem que isto interfira na motilidade espermática (Tasseron et al., 1977).
Torna-se interessante o uso de técnicas que aliem a vitalidade espermática com a integridade acrossomal. Talbot e Chacon (1991) desenvolveram uma técnica de coloração tripla que faz uso de três corantes: Azul de Tripan (coloração vital), Marrom de Bismark e
Rosa Bengala (coloração do acrossoma). Baseado no tipo de padrão de coloração apresentado pelo espermatozóide, eles podem ser classificados em quatro categorias (Figura 1):
a) espermatozóides mortos, com acrossoma intacto: acrossoma corado de rosa e região pós-acrossomal de marrom escuro;
b) espermatozóide morto, sem acrossoma: região acrossomal e pós-acrossomal marrom escuro;
c) espermatozóide vivo com acrossoma: acrossoma com coloração rosa e região pós-acrossomal marrom claro;
d) espermatozóide vivo, sem acrossoma: região acrossomal e pós-acrossomal em marrom claro.
Sendo uma técnica relativamente rápida e de fácil execução, apresenta ainda como vantagens o fato dos esfregaços submetidos a esta coloração poderem ser guardados por longos períodos, baixo custo e permitir avaliar também a morfologia espermática (Risopatrón
et al., 2001). Sua eficácia foi comparada à técnica fluorescência usando a aglutinina da Pisum sativum (FITC-PSA) em sêmen humano, resultando em semelhantes percentuais de
espermatozóides viáveis e com acrossoma íntegro (Köhn et al., 1997, Risopatrón et al., 2001). Os ensaios tradicionais de avaliação seminal podem ser suficientes quando é aplicada IA cervical com sêmen resfriado, pois há um elevado número de espermatozóides por dose (Anel et al., 2006). Entretanto, melhor estimação da qualidade espermática é requerida quando sêmen criopreservado é utilizado (Anel et al., 2006). Além disso, em situações específicas (problemas de sub-fertilidade, avaliação acurada de machos, etc.), estas técnicas são insuficientes devido a sua alta subjetividade, baixa sensibilidade e pobre correlação com fertilidade a campo (Anel et al., 2006). Desta forma, novas técnicas de análise e avaliação do sêmen são necessárias, como a análise seminal auxiliada por computador.
Figura 1. Diferentes categorias de espermatozóides ovinos corados pela técnica de coloração tripla (adaptada de Talbot e Chacon, 1991).
Espermatozóide morto com acrossoma
Espermatozóide vivo com acrossoma
Espermatozóide vivo com acrossoma
Espermatozóide morto sem acrossoma
2.1.6. Análise do sêmen auxiliada por computador
A motilidade é comumente tida como uma das mais importantes características associadas com a habilidade de fertilização do sêmen. Ela é a expressão da viabilidade e integridade estrutural dos espermatozóides. Classicamente, o julgamento da qualidade seminal tem sido baseado em uma avaliação subjetiva de parâmetros como motilidade massal e individual (Verstengen et al., 2002). A avaliação subjetiva tem reduzido a predição da fertilidade devido à alta variabilidade observada entre avaliadores. Assim, variação de 30-60% tem sido registrada na estimação da motilidade no mesmo ejaculado. Desta forma, a ênfase é dada para o desenvolvimento de métodos de avaliação objetivas (Anel et al., 2006).
Mack et al. (1988) ressaltaram que a necessidade de uma metodologia objetiva motivou a elaboração e desenvolvimento de instrumentos automatizados capazes de analisar as trajetórias dos espermatozóides.
A Análise de Sêmen Assistida por Computador (CASA) é definida como um sistema automatizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas dos espermatozóides, fornecendo informação acurada, precisa e significativa do movimento individual de cada espermatozóide e também resumos estatísticos da população espermática (Amann e Katz, 2004). A automatização desta análise permite maior objetividade e rapidez, uma vez que esta é realizada numa fração do tempo requerido pela avaliação subjetiva (Motimer, 1997).
Os sistemas CASA têm permitido a detecção de súbitas mudanças no movimento espermático, além de melhorar a discriminação a nível laboratorial de estudos com novos diluentes (Amann e Katz, 2004).
Os parâmetros comumente obtidos através de analisadores de sêmen computadorizados são: velocidade do percurso curvilinear (VCL), velocidade do percurso médio (VAP), velocidade em linha reta (VSL), retilinearidade (STR), linearidade (LIN), oscilação (WOB), freqüência de batimento cruzado (BCF), e deslocamento lateral da cabeça (ALH) (Motimer, 1997; Verstegen et al., 2002) (Quadro 1; Figura 2).
Os três parâmetros de velocidade (VCL, VAP, VSL), são comumente utilizados para descrição gral do movimento do espermatozóide, entretanto, para uma avaliação adicional, foram estabelecidos os parâmetros STR, LIN e WOB, que tratam das relações entre estas velocidades (Motimer, 1997). A retilinearidade fornece uma indicação da relação entre o percurso líquido percorrido e a trajetória média do espermatozóide, de modo que em situações em que o percurso médio se aproxima da trajetória em linha reta apresente elevado STR, com baixa ALH. Ao contrário, percursos circulares possuem baixos STR, pois o percurso médio
apresenta valores superiores que o retilíneo. A linearidade expressa a relação entre o percurso líquido percorrido pelo espermatozóide e sua trajetória real, de modo que uma trajetória circular pode apresentar baixa linearidade uma vez que o percurso real do espermatozóide é maior que seu deslocamento efetivo. A oscilação (WOB) apresenta-se baixa em percursos em que o espermatozóide percorre vasta área em seu deslocamento (elevado ALH), mas alto em trajetórias circulares ou retilíneas uma vez que a VAP e a VCL se assemelham (Motimer, 1997).
Algumas centrais de inseminação têm adotado o CASA em sua rotina de avaliação de sêmen, mas, geralmente, apenas como métodos padronizados de cálculo da motilidade progressiva e total. Parâmetros de motilidade que são os mais correlacionados com a fertilidade não são comumente usados e a avaliação de sub-população de espermatozóides não tem sida aplicada (Anel et al., 2006).
Deve-se ressaltar a possibilidade de potenciais erros nas mensurações realizadas pelo sistema CASA. Uma destas é a dificuldade na distinção entre espermatozóides e debris ou células não-espermáticas, levado a uma superestimação da concentração espermática e subestimação na proporção de espermatozóides móveis. A presença de espermatozóides aglutinados também afeta a correta avaliação da concentração espermática e de percentual de espermatozóides móveis. Concentração elevada de espermatozóides na amostra analisada interfere na reconstrução da trajetória dos espermatozóides analisados, podendo haver sobreposição de trajetórias distintas de modo que sejam interpretados como uma só. (Motimer, 1997).
Outra análise possibilitada pelo CASA é a da morfologia e morfometria dos espermatozóides. A morfologia normal dos espermatozóides pode ser um indicador do potencial de fertilização do mesmo, porém a avaliação subjetiva tem mostrado considerável variação entre avaliadores. O desenvolvimento da análise morfométrica do sêmen assistida por computador (CASMA), tem permitido reduzir esta variação e revelar sutis diferenças entre indivíduos que não podem ser detectados usando métodos subjetivos (Anel et al., 2006).
Quadro 1. Principais parâmetros cinéticos de espermatozóides obtidos através do sistema CASA.
Parâmetro Unidade Descrição
Velocidade do percurso curvilinear (VCL) µm/s Velocidade da trajetória real percorrida pelo espermatozóide Velocidade do percurso médio (VAP) µm/s Velocidade da média da trajetória
real percorrida pelo espermatozóide Velocidade em linha reta (VSL) µm/s Velocidade em linha reta do ponto inicial ao final do trajeto analisado
Retilinearidade (STR) % Relação percentual entre VSL e
VAP
Linearidade (LIN) % Relação percentual entre VSL e
VCL
Oscilação (WOB) % Relação percentual entre VAP e
VCL
Freqüência de batimento cruzado (BCF) Hz Freqüência com que o percurso real do espermatozóide cruza o percurso médio
Deslocamento lateral da cabeça (ALH) µm Distância do espermatozóide em seu trajeto real da trajetória média
Fonte: Motimer (1997).
Figura 2. Velocidade curvilinear (VCL), velocidade média da trajetória (VAP) e velocidade linear (VSL) obtidas em sistema CASA.
VSL VAP
Devido à precisão do CASMA, morfometria da cabeça do espermatozóide pode ser um indicador de alterações reprodutivas e de animais sub-férteis, uma vez que as dimensões dos espermatozóides de animais férteis são homogêneas. As diferenças nas dimensões em animais sub-férteis têm sido verificadas em eqüinos (Casey et al., 1997). Entretanto, mais que a média do tamanho da cabeça dos espermatozóides, é o grau de variação nas dimensões dos espermatozóides é o melhor preditor da fertilidade em humanos e bovino (Katz et al., 1986; Sailer et al., 1996).
Estudos utilizando CASMA têm demonstrado que a criopreservação reduz as dimensões dos espermatozóides nas mais diversas espécies com caprinos (Hidalgo et al., 2006; Marco-Jiménez et al., 2006), bovinos (Rubio-Guillén et al., 2007; Gravance et al., 1998), eqüinos (Arruda et al., 2002) e suínos (García-Herreros et al., 2007). Este efeito tem sido explicado por alguns mecanismos como mudanças osmóticas durante a criopreservação, danos acrossomais e alterações na condensação da cromatina (Gravance et al., 1998, Hidalgo
et al., 2006, Garcia-Herreros et al., 2007).
As dimensões morfométricas apresentam ligações com o protocolo de congelamento. A área, bem como o formato do espermatozóide, tem importantes implicações na criopreservação do sêmen, por influir nas trocas térmicas e no fluxo de água e íons durante congelamento e são os principais determinantes na taxa ótima de congelamento (Curry et al., 1996). Esteso et al. (2006) afirmam que cervídeos caracterizados como congeláveis ou
não-congeláveis apresentaram diferenças morfométricas no sêmen fresco, mas não em outros
parâmetros de qualidade seminal como percentual de espermatozóides móveis, integridade de membrana e acrossoma, sendo razoável supor que as variações na morfologia espermática podem influenciar as características biofísicas dos espermatozóides que são essenciais para o sucesso da criopreservação.
Outra importância do CASMA é permitir distinguir diferentes sub-populações de espermatozóides numa amostra (Núñez-Martinez et al., 2007), uma vez que a susceptibilidade para a capacitação e habilidade de fertilização variam segundo estas sub-populações (Williams e Ford, 2001). Desta forma, sub-populações de espermatozóides podem ser definidas segundo a morfometria da cabeça do espermatozóide e a distribuição destas sub-populações pode estar relacionada com a fertilidade (Anel et al., 2006). De modo semelhante, Thurston et al. (2001) detectaram sub-populações morfologicamente distintas de espermatozóides suínos, cuja proporção no ejaculado correlacionou com a análise da qualidade seminal após criopreservação. A análise de sêmen deveria contemplar a presença de
sub-populações e não apenas fornecer valores médios para a população de espermatozóides como um todo (Sancho et al., 1998).
É notório que o perfil da cabeça dos espermatozóides pode ser relacionado com a organização da cromatina espermática. Além disso, potenciais problemas no DNA podem resultar em alterações no padrão da cabeça do espermatozóide, detectados pelo CASMA (Anel et al., 2006). Núñez-Martinez et al. (2007) encontraram significante correlação entre as variáveis morfométricas e a quantidade de DNA desnaturado no ejaculado canino, uma vez que a distribuição morfométrica de sub-populações foi similar àquela derivada da integridade do DNA. A variação da morfologia espermática é um indicador da estrutura anormal da cromatina e conseqüentemente, da fertilidade (Karabinus et al., 1997).
Em ovinos, alguns estudos têm sido realizados de modo a desenvolver métodos acurados no emprego do CASMA (Gravance et al., 1998a) e outros têm analisado o efeito da criopreservação na cabeça do espermatozóide devido a criopreservação (Lambrechts et al., 2000). Entretanto a possível relação entre o CASMA e a fertilidade precisa de comprovação na espécie ovina (Anel et al., 2006).
2.2. Diluentes à base de água de coco
A água de coco é uma solução ácida, natural e estéril, composta de sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras (Nunes e Combarmous, 1995), além de indutores da divisão celular e eletrólitos diversos, que conferem densidade e pH compatíveis com o plasma sangüíneo, proporcionando, os nutrientes necessários para manter a sobrevivência e viabilidade de gametas masculinos e femininos criopreservados (Blume e Marques Jr., 1994).
A água de coco tem sido utilizada em biotecnologias da reprodução animal obtendo-se bons resultados com a utilização da água de coco na preservação do sêmen de animais domésticos como caprinos (Nunes, 1988; Salles, 1989; Campos et al., 2003), ovinos (Araújo, 1990; Figueredo et al., 2001), suínos (Toniolli e Mesquita, 1990), peixes (Carvalho, et al., 2002) e cães (Montezuma Jr. et al., 1994; Cardoso et al. 2003; Cardoso et al. 2006).
Nunes (1986, 1987), avaliando o sêmen caprino após duas horas de incubação a 37°C, observou que tanto a motilidade individual progressiva (MIP) como a porcentagem de espermatozóides móveis (PEM) eram superiores quando o sêmen se diluía em uma solução baseada em água de coco, que em leite desnatado. A motilidade individual progressiva dos
espermatozóides diluídos em água de coco quando comparados aos diluídos em leite glicosado foi superior ao final de 2 horas de incubação (Nunes e Salgueiro, 1999).
Resultados similares foram obtidos ao utilizar ambos os diluentes na refrigeração de sêmen a 4°C e em seu uso para inseminação artificial em cabras nas que se haviam sincronizado o estro com tratamentos hormonais (Nunes, 1986). Com o uso da inseminação artificial com sêmen caprino diluído em água de coco e refrigerado a 4°C se obtiveram taxas de parição superiores a 60% (Nunes, 1986).
Freitas (1988) observou 55,6% de fêmeas contra 44,4% de machos nascidos de partos de cabras inseminadas com sêmen diluído em água de coco. Salles (1989) inseminou 78 cabras com sêmen resfriado a 4°C e diluído em água de coco na forma in natura, estabilizada e em gel, observando as respectivas taxas de parições: 63,15%, 87,50% e 92,59%. Com relação à proporção sexual, foram obtidos valores de 83,33%, 76,00% e 67,89% de fêmeas nascidas, segundo a forma da água de coco utilizada: in natura, estabilizada e em gel, respectivamente.
Araújo e Nunes (1991) avaliando o sêmen caprino diluído e congelado em água de coco in natura com gema de ovo (10%) e sem gema, verificando após a descongelação que a adição da gema de ovo conferiu uma maior sobrevivência espermática in vitro.
Tratando de determinar a fração da água de coco que atua sobre os espermatozóides, Nunes et al. (1994) isolaram uma molécula pertencente ao grupo das auxinas, o ácido 3- indol acético (IAA), que ativa o metabolismo dos espermatozóides. A introdução do IAA na composição dos diluentes convencionais do sêmen de diferentes espécies conferiu aos espermatozóides um aumento de motilidade, maior taxa de fertilidade, além de permitir sua conservação durante períodos mais prolongados (Nunes et al., 1994). A presença do IAA pode variar com o estágio de maturação e a espécie do fruto e influir nos resultados in vitro e
in vivo em sêmen diluído em água de coco (Nunes e Salgueiro, 1999).
Diluidores de sêmen à base de água de coco apresentam como vantagens o baixo custo, fácil preparo, além do fato do coco ser abundante no Nordeste do Brasil. Entretanto, a água de coco apresenta deficuldades quando à conservação por longos períodos após sua extração do fruto, limitações na disponibilidade do fruto em regiões onde há a carência do vegetal, além de variações na constituição bioquímica da água de coco entre diferentes frutos. Isto motivou o desenvolvimento do produto água de coco em pó (ACP), onde os constituíntes nutricionais da água de coco são obtidos em sistema de desidratação a alto vácuo. O produto ACP se caracteriza por possuir composição padronizada, obtido a partir de frutos oriundos de plantações orgânicas certificadas, além de possuir características bioquímicas similares às da
água de coco in natura. Para conservação do sêmen ovino, a formulação ACP-102 foi desenvolvida.
Pesquisas foram realizadas objetivando avaliar o diluidor ACP-102 na conservação do sêmen ovino. Braz et al. (2003) não encontraram diferenças estatísticas entre os diluidores ACP-102 e leite na conservação do sêmen ovino diluído e resfriado a 4oC ou 15oC.
Com relação à inseminação artificial em ovelhas, Salgueiro et al. (2004), obtiveram fertilidade de 66,67% e 54,54% com uso de sêmen ovino diluído em ACP-102 e resfriado a 4oC por 24h e 48h, respectivamente. Resultados semelhantes foram encontrados por Cavalcante et al. (2005), que verificaram fertilidade de 53,13% e 63,38% com uso de sêmen ovino resfriado em ACP-102 por 24h e 48h, respectivamente. Machado et al. (2006) com uso de sêmen resfriado a 4oC diluído em ACP-102, encontrou fertilidade nas ovelhas inseminadas 48% para inseminação cervical e de 70,3% para inseminação por laparoscopia. Salgueiro et
al. (2007), usando sêmen ovino resfriado a 4oC diluído em ACP-102 e TRIS por 24 horas, encontraram taxas de fertilidade de 88,5% e 82,6%, respectivamente, para ambos diluentes. Tais resultados vêm demonstrar a viabilidade técnica do uso do ACP-102 como diluente de sêmen ovino.
Objetivando uma melhor solubilização da gema de ovo adicionada ao diluidor, foi elaborado, a partir da formulação do diluidor ACP-102, o diluidor ACP-102c para uso na criopreservação do sêmen ovino.
3. JUSTIFICATIVA
Trabalhos têm demonstrado que a água de coco pode exercer uma ação benéfica sobre a conservação celular. Entretanto, ainda é grande a necessidade da realização de estudos, especialmente quanto aos protocolos de criopreservação.
O problema consiste no fato de que a água de coco é um produto oriundo de vegetações tipicamente tropicais, o que limita a sua difusão em trabalhos em regiões de clima temperado. Além de ser susceptível a contaminação após sua retirada do fruto e, por isso, de difícil conservação. Vale ressaltar a necessidade de pessoas aptas a identificar o estágio de frutificação ideal para uso como conservante celular. Neste sentido, a estabilização da água de coco na forma de pó (ACP®) facilitará a sua utilização, bem como a sua difusão para regiões que não disponham da matéria-prima (coco).
O rebanho ovino nordestino, em sua maioria, é composto por animais sem padrão racial definido e de baixa produtividade. A inseminação artificial de ovelhas com sêmen de reprodutores de raças puras otimizará o melhoramento genético, aumentando a produtividade do plantel ovino nordestino.
O interesse pelo uso da água de coco em pó como diluidor seminal vem crescendo, sendo necessário o estabelecimento de protocolos experimentais de congelação adequados ao referido meio. Além disso, há a necessidade de trabalhos que avaliem os diluentes à base de água de coco em pó para a congelação do sêmen ovino, que permitirá a criopreservação do sêmen de animais geneticamente superiores, para a constituição de bancos de germoplasma.
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
A água de coco em pó poderá se constituir em um eficiente diluidor capaz de criopreservar o sêmen ovino, tornando-se mais uma alternativa mercadológica para a área de reprodução animal, uma vez que este apresenta relação custo/benefício equiparável aos diluentes tradicionais.
5. OBJETIVOS
Geral:
Avaliar a viabilidade in vitro do sêmen de ovinos congelado nos meios diluentes à base de água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS.
Específicos:
• Avaliar o sêmen fresco e diluído de ovinos em ACP-102c e TRIS através de análise computadorizada (SCA, Microptics S.L., Espanha), quanto aos seguintes parâmetros: percentual de espermatozóides móveis (MOV), percentual de espermatozóides com movimento progressivo (PROG), velocidade curvilinear (VCL), velocidade média do percurso (VAP), linearidade (LIN), retilinearidade (STR), deslocamento lateral de cabeça (ALH) e freqüência de batimento cruzado (BCF), bem como o de integridade da membrana espermática com uso de coloração vital eosina-nigrosina e integridade de membrana plasmática e acrossomal com uso da coloração tripla;
• Avaliar o efeito da criopreservação e do tipo de diluente sobre os parâmetros morfométricos de comprimento, largura, área e perímetro da cabeça de espermatozóides frescos e criopreservados de ovinos nos meios diluentes à base de ACP-102c e TRIS.
Capítulo 1
Artigo 1:
Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS
[Cryopreservation of ram semen in extenders based on powder coconut water (PCW-102c) and TRIS]
Periódico: Small Ruminant Research (a ser submetido) ISSN: 0921-4488
Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS
Resumo
A inseminação artificial com uso do sêmen criopreservado é uma ferramenta valiosa em programas de melhoramento genético e conservação de raças ovinas. No intuito de facilitar a disponibilidade de diluidores seminais e reduzir seus custos, foi desenvolvido o diluidor de origem vegetal à base de água de coco em pó (ACP-102), que tem apresentado resultados satisfatórios na conservação do sêmen ovino resfriado. Há, no entanto, carência de estudos do uso deste diluidor na criopreservação do sêmen ovino. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência do sêmen ovino criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS. Foram realizadas 12 coletas de sêmen de quatro ovinos da raça Santa Inês. As amostras de sêmen de cada ejaculado foram divididas em duas alíquotas e diluídas em ACP-102c e TRIS e criopreservadas. O sêmen foi avaliado logo após descongelamento (T0), após uma hora (T1) e duas horas (T2) de incubação, para percentual de espermatozóides morfologicamente normais e de células vivas (pela técnica de coloração com eosina-nigrosina), avaliação da integridade acrossomal e de viabilidade celular (com uso da técnica de coloração tripla) e análise de motilidade em sistema CASA. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre o sêmen criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS nos parâmetros adotados em cada técnica de coloração. Foram observadas diferenças estatísticas logo após descongelamento entre os diluidores ACP-102c e TRIS para motilidade total, motilidade progressiva e amplitude lateral da cabeça, com valores superiores encontrados no diluidor TRIS, mas ambos diluidores foram equivalentes quanto aos parâmetros qualitativos (retilinearidade e linearidade) e quantitativos (velocidade curvilinear e velocidade média do percurso), bem como freqüência de batimento cruzado do flagelo. Após duas horas de incubação, ambos diluidores diferiram significativamente para os parâmetros de motilidade avaliados, exceto para o parâmetro linearidade. O diluidor ACP-102c apresentou maior variabilidade individual entre reprodutores. Recomenda-se a pesquisa de novos protocolos de criopreservação que otimizem os resultados obtidos na criopreservação de sêmen ovino com o uso do ACP-102c, da interação entre constituintes do plasma seminal e de membrana dos espermatozóides com componentes do diluidor e a avaliação do sêmen ovino criopreservado em ACP-102c em programas de inseminação artificial.
Cryopreservation of ram semen in extenders based on powder coconut water (PCW-102c) and TRIS
Abstract
The cryopreservated semen at artificial insemination programs is a value tool for genetic and ovine breed conservation programs. To facilitate semen the disponibility of seminal extenders and reduce the costs, it was developed a vegetal extender based on powder coconut water (PCW-102), that shown satisfactory results in chilled ram semen. However, there is a lack of studies using this extender in ram semen cryopreservation. The aim of this study was to evaluate the efficiency of ram semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS. Twelve semen collections were taken from four Santa Ines rams. Semen samples of each ejaculate was divided into two aliquots and extended on PCW-102c and TRIS and cryopreserved. The semen was evaluated at the moment of thawing (T0), after one hour (T1) and two hours (T2) of incubation, for percentage of spermatozoa morphologically normal and alive cells (by eosin-nigrosin dyeing technique), evaluation of acrosomal integrity and cellular viability (by triple stain technique) and motility evaluation at CASA system. It weren’t observed statistical differences between semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS extenders for the parameters adopted in each stain technique. There are significant differences at the moment of thawing between PCW-102c and TRIS extenders for total motility, progressive motility and head lateral amplitude, with superior values for TRIS extender, but both extenders was equivalent for qualitative (straightness and linearity) and quantitative parameters (curvilinear velocity and average velocity), and frequency of track crossing. After two hours of incubation, both extenders were significantly different for motility parameters evaluated, except for linearity. The PCW-102c extender shows more individual variability between rams. It was recommended the research of new cryopreservation protocols that optimize the results obtained on the ram semen cryopreservation with the use of PCW-102c, the interaction of seminal constituents and spermatozoa membrane with the extenders components and the evaluation of ram semen cryopreserved on PCW-102c at artificial insemination programs.
Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS
Cryopreservation of ram semen in extenders based on powder coconut water (PCW-102c) and TRIS
Cavalcante, J.M.M.1*; Nunes, J.F. 1; Salgueiro, C.C.M. 1; Salmito-Vandederley, C.S.B. 1; Brasil, O.O. 1; Souza, D.F.R. 1; Assis Neto, E.T. 1; Silva Júnior, J.B.1
1
Programa Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Faculdade de Veterinária. Núcleo Integrado de Biotecnologia. Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino. Universidade Estadual do Ceará. Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP: 60.740-000, Fortaleza, Ceará, Brasil.
*Experimento integrante da dissertação de Mestrado do primeiro autor. E-mail: jmmcavalcante@bol.com.br
Resumo
A inseminação artificial com uso do sêmen criopreservado é uma ferramenta valiosa em programas de melhoramento genético e conservação de raças ovinas. No intuito de facilitar a disponibilidade de diluidores seminais e reduzir seus custos, foi desenvolvido o diluidor de origem vegetal à base de água de coco em pó (ACP-102), que tem apresentado resultados satisfatórios na conservação do sêmen ovino resfriado. Há, no entanto, carência de estudos do uso deste diluidor na criopreservação do sêmen ovino. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência do sêmen ovino criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS. Foram realizadas 12 coletas de sêmen de quatro ovinos da raça Santa Inês. As amostras de sêmen de cada ejaculado foram divididas em duas alíquotas e diluídas em ACP-102c e TRIS e criopreservadas. O sêmen foi avaliado logo após descongelamento (T0), após uma hora (T1) e duas horas (T2) de incubação, para percentual de espermatozóides morfologicamente normais e de células vivas (pela técnica de coloração com eosina-nigrosina), avaliação da integridade acrossomal e de viabilidade celular (com uso da técnica de coloração tripla) e análise de motilidade em sistema CASA. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre o sêmen criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS nos parâmetros adotados em cada técnica de
coloração. Foram observadas diferenças estatísticas logo após descongelamento entre os diluidores ACP-102c e TRIS para motilidade total, motilidade progressiva e amplitude lateral da cabeça, com valores superiores encontrados no diluidor TRIS, mas ambos diluidores foram equivalentes quanto aos parâmetros qualitativos (retilinearidade e linearidade) e quantitativos (velocidade curvilinear e velocidade média do percurso), bem como freqüência de batimento cruzado do flagelo. Após duas horas de incubação, ambos diluidores diferiram significativamente para os parâmetros de motilidade avaliados, exceto para o parâmetro linearidade. O diluidor ACP-102c apresentou maior variabilidade individual entre reprodutores. Recomenda-se a pesquisa de novos protocolos de criopreservação que otimizem os resultados obtidos na criopreservação de sêmen ovino com o uso do ACP-102c, da interação entre constituintes do plasma seminal e de membrana dos espermatozóides com componentes do diluidor e a avaliação do sêmen ovino criopreservado em ACP-102c em programas de inseminação artificial.
Palavras-chave: sêmen ovino, criopreservação, ACP-102c, TRIS, CASA.
Abstract
The cryopreservated semen at artificial insemination programs is a value tool for genetic and ovine breed conservation programs. To facilitate semen the disponibility of seminal extenders and reduce the costs, it was developed a vegetal extender based on powder coconut water (PCW-102), that shown satisfactory results in chilled ram semen. However, there is a lack of studies using this extender in ram semen cryopreservation. The aim of this study was to evaluate the efficiency of ram semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS. Twelve semen collections were taken from four Santa Ines rams. Semen samples of each ejaculate was divided into two aliquots and extended on PCW-102c and TRIS and cryopreserved. The semen was evaluated at the moment of thawing (T0), after one hour (T1) and two hours (T2) of incubation, for percentage of spermatozoa morphologically normal and alive cells (by eosin-nigrosin dyeing technique), evaluation of acrosomal integrity and cellular viability (by triple stain technique) and motility evaluation at CASA system. It weren’t observed statistical differences between semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS extenders for the parameters adopted in each stain technique. There are significant differences at the moment of thawing between PCW-102c and TRIS extenders for total motility, progressive motility and
head lateral amplitude, with superior values for TRIS extender, but both extenders was equivalent for qualitative (straightness and linearity) and quantitative parameters (curvilinear velocity and average velocity), and frequency of track crossing. After two hours of incubation, both extenders were significantly different for motility parameters evaluated, except for linearity. The PCW-102c extender shows more individual variability between rams. It was recommended the research of new cryopreservation protocols that optimize the results obtained on the ram semen cryopreservation with the use of PCW-102c, the interaction of seminal constituents and spermatozoa membrane with the extenders components and the evaluation of ram semen cryopreserved on PCW-102c at artificial insemination programs.
Keywords: ram semen, cryopreservation, PCW-102c, TRIS, CASA.
1. Introdução
A inseminação artificial, particularmente com uso do sêmen criopreservado, é uma ferramenta valiosa nos programas de melhoramento genético e conservação de raças ovinas (Anel et al., 2006). Diluidores utilizados para preservação seminal a baixas temperaturas contém ingredientes básicos e aditivos que possibilitam proteção dos espermatozóides contra mudanças na temperatura (Salamon & Maxwell, 1995). O diluidor deve conter substratos energéticos, tampões que mantenham pH e osmolaridade e componentes que protejam o espermatozóide contra dano criogênico, de modo a permitir a sobrevivência das células espermáticas durante a diluição, resfriamento, congelamento e descongelamento (Salamon & Maxwell, 2000).
O diluidor Tris-frutose-gema é o mais comumente utilizado na criopreservação do sêmen ovino (Salamon & Maxwell, 1995). Entretanto, no intuito de facilitar a disponibilidade dos mesmos e reduzir seus custos, novos diluidores têm sido desenvolvidos. Usualmente, os ingredientes de um diluidor variam de componentes químicos puros a produtos de origem animal ou vegetal (Gil et al., 2003). Nunes (1988) desenvolveu um diluidor de origem vegetal à base de água de coco que tem se mostrado efetivo na conservação de sêmen de caprinos (Nunes, 1988; Campos et al., 2003), ovinos (Figueredo et al., 2001), suínos (Toniolli et al, 1998), peixes (Carvalho, et al., 2002) e cães (Cardoso et al., 2003; Cardoso et al., 2006). Foi verificada que uma auxina, o ácido indol-3-acético (IAA), presente na água de coco, proporciona uma melhor motilidade in vitro aos espermatozóides caprinos e da fertilidade ao
sêmen ovino na inseminação artificial (Nunes, 1998). O diluidor à base de água de coco é de baixo custo, fácil preparo e abundante na região Nordeste do Brasil. Entretanto, o uso deste diluidor tem apresentado algumas desvantagens como a dificuldade de armazenamento da água de coco por longos períodos e a limitada disponibilidade de frutos em algumas regiões desprovidas do vegetal. Além disso, a constituição bioquímica pode variar entre frutos, afetando diretamente a habilidade do diluidor em preservar o espermatozóide. Assim, estudos foram conduzidos para o desenvolvimento do produto água de coco em pó (ACP®), obtido a partir da desidratação da água de coco a alto vácuo. Este produto caracteriza-se pelo fácil armazenamento e uso, além do pronto envio para regiões onde a água de coco não é disponível. De composição padronizada, obtido de frutos oriundos que plantações orgânicas certificadas, as características bioquímicas de interesse da ACP®, após dissolução em água destilada, são similares àquelas encontradas na água de coco, de modo que este diluidor tem sido aprovado para uso na conservação do sêmen de diferentes espécies animais como ovinos (Salgueiro et al., 2004; Machado, et al., 2006), cães (Cardoso et al., 2005; Cardoso et al., 2007), gatos (Silva et al., 2007) e peixes (Vieira et al., 2007). Apesar dos resultados promissores obtidos com o sêmen ovino resfriado, há carência de pesquisas com a criopreservação do sêmen desta espécie. Este trabalho tem como objetivo avaliar parâmetros do sêmen ovino criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS em sistema de análise de sêmen auxiliada por computador (CASA).
2. Materiais e Métodos
2.1. Animais e coleta de sêmen
O experimento foi executado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino do Núcleo Integrado de Biotecnologia da Universidade Estadual do Ceará, no município de Fortaleza (03°43’ S, 38°30’ O), Ceará, Brasil, durante os meses de maio a julho de 2008. Foram utilizados quatro ovinos da raça Santa Inês, idade média de três anos, mantidos em baias individuais, alimentados com feno de tifton (Cynodon sp.) e concentrado comercial com 18% PB, além de sal mineral e água à vontade. As coletas de sêmen foram realizadas com uso de vagina artificial duas vezes por semana, perfazendo 12 coletas por animal, totalizando 48 ejaculados. Após a coleta, cada ejaculado foi avaliado quanto ao volume (medido em tubo graduado), concentração (por espectrofotometria), motilidade
