UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
JORDANA SAMPAIO LEITE
ANÁLISE CINÉTICA, MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DO SÊMEN DE CURIMATÃ COMUM Prochilodus brevis (Teleostei, Characiforme) DENTRO E FORA
DA ESTAÇÃO REPRODUTIVA
FORTALEZA - CEARÁ 2015
JORDANA SAMPAIO LEITE
ANÁLISE CINÉTICA, MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DO SÊMEN DE CURIMATÃ COMUM Prochilodus brevis (Teleostei, Characiforme) DENTRO E FORA DA ESTAÇÃO
REPRODUTIVA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Carnívoros, Onívoro e Aves.
Orientadora: Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley
FORTALEZA - CEARÁ 2015
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Dedico esse trabalho
Aos meus pais, Paulo e Nádia Leite.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pelo dom da vida e por diariamente ser o meu guia me dando forças para trilhar meus caminhos, sendo o meu principal orientador.
À minha família por toda o incentivo e amor. Por terem me dado a educação e me ensinado a dar valor ao próximo, pela paciência durante as minhas ausências por motivos de experimentos e estudos. Aos meus pais Nádia Maria e Paulo Isaias por todo amor e dedicação à minha criação. Aos meus irmãos João Paulo e Fabiola pelas caronas e pela amizade. Ao meu sobrinho João Miguel pelas brincadeiras e pelo amor incondicional. Ao meu grande amor e companheiro de vida Pedro Raphael Carneiro Vasconcelos pelo incentivo diário e por me ajudar a não desanimar e a melhorar diariamente. Ao meu fiel amigo Ayron que me recebe todos os dias ao acordar e ao chegar em casa com nobre carinho e atenção.
À Família Carneiro por me aceitar como membro. Aos meus cunhados Erick e Juvenal Vasconcelos e a minha sogra Vera Silvia pela amizade e carinho, em especial a minha grande amiga e madrinha Hariádynne Carneiros Vasconcelos por todas as conversas e por me amar como uma irmã.
À Universidade Estadual do Ceará, pelo suporte desde a graduação e por todo o mestrado. Nessa instituição que tanto amo, tive o prazer de vivenciar momentos de enriquecimento científico, ao lado de grandes mestres.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -CAPES, por ter concedido a bolsa de mestrado.
À Financiadora de Estudos e Projetos – FINEP, pelo apoio financeiro fornecido ao LBRP, sendo assim possível a realização de todo o experimento.
À Profa. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley, pela orientação desde a graduação, por ter me apoiado nas minhas decisões e sempre ter tido uma relação materna e cordial.
Aos professores: Dra. Ana Cláudia Nascimento Campos, Dra. Mônica Aline Parente Melo-Maciel, Dra. Caroline Vieira Feitosa por terem aceito prontamente participar e contribuir com seus conhecimentos na correção e defesa dessa dissertação.
Ao Dr. Francisco José Lopes Cajado por ter aceitado ser suplente e por todo o conhecimento compartilhado.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - PPGCV por todo apoio, incentivo, experiências e conhecimentos fornecido durante o mestrado.
Aos funcionários, em especial a Adriana Albuquerque e ao seu César, pelas conversas e pela amizade.
Ao Prof. Dr. Claudio Cabral Campello, pela realização e explicação estatística da parte experimental.
Aos Integrantes do Laboratório de Reprodução Animal – UFC pelo auxílio durante as análises, em especial a Mestre Karoliny Farias.
Aos meus amigos de pós-graduação do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP): Júlia Trugílio, Larissa Teixeira, Priscila Almeida, Francisco Renan Aragão, João Paulo Silva Pinheiro, Vanessa Alves e Renata Vieira pela amizade e por terem me ajudado durante todo o experimento. Em especial a Mayara Setúbal Oliveira pela amizade e por ter me auxiliado nas correções escritas, a Liliane Veras, Fátima de Cássia e a Mônica Aline pelos conselhos, pela orientação e por terem se tornado as minhas mentoras científicas.
Aos ex e atuais ICs do LBRP, Thais Maia, Yasmim Maia, Maria Eduarda Magalhães, Renata Vieira, Karen Emanuelly, Filipe Oliveira, Cibele Castro, Jéssica Castelo Branco, Thaís Nery e Vanessa Sayonara, pelo companheirismo e por terem tornado os trabalhos menos laboriosos. Em especial, aos “meus filhos científicos” Eric Silva e Edna Raquel por serem tão prestativo e por terem me ajudado com as análises.
Aos colegas da turma de mestrado, pela amizade e pela troca de experiências e conhecimentos.
Aos membros e funcionários do Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB), pelo companheirismo e apoio, em especial, a Dona Maria Iraci Clemente, pelo carinho fornecido durante todos esses anos e a amiga Henna Roberta pela troca de experiência, pela convivência e amizade.
Aos meus amigos de infância e vida que sempre me demonstraram o valor de uma amizade verdadeira: Isabelle Diocleciano, Denes Raphael, Wendell Saraiva e Victor Acácio.
RESUMO
O curimatã comum caracteriza-se como um peixe reofílico, pois necessita realizar a migração para a reprodução em direção a cabeceira do rio durante a estação chuvosa. As modificações ambientais geradas pelas chuvas promovem a maturação gonadal e consequente desova, tendo essa espécie uma sazonalidade reprodutiva. Dessa forma, esse estudo teve como objetivo comparar as características físico-químicas, a cinética, a morfologia e a bioquímica do sêmen de Prochilodus brevis induzidos hormonalmente à reprodução em cativeiro, na estação reprodutiva e não reprodutiva. Para isso, foram realizadas quatro coletas ao longo do período de um ano. Durante as coletas, os reprodutores foram induzidos hormonalmente à espermiação. Os animais foram sedados, submetido à leitura do chip, medidos e pesados. O volume do ejaculado, foi aferido por meio de seringas graduadas e a leitura do pH do sêmen foi realizada com o auxílio de fitas de pH. A concentração espermática foi realizada em câmara de Neubauer. Para a análise da cinética foi utilizado o sistema de análise seminal auxiliada por computador (CASA). Foram confeccionados esfregaços corados para observar a presença e tipos de morfoanomalias espermáticas. O sêmen de cada animal foi centrifugado, para a análise do plasma seminal. Nessas análises foram avaliadas as concentrações de proteínas totais, glicose, frutose, triglicerídeo, cálcio e cloreto, através de kits bioquímicos. Os dados de pH do sêmen de P. brevis, sugerem condição alcalina do sêmen dentro do esperado para peixes de água doce (8,23 a 8,65). Não houve diferença entre a estação reprodutiva e não reprodutiva para o volume seminal e para a concentração espermática. Em relação a análise bioquímica, a concentração de proteínas totais (1,51 ± 0,06 g dL-1), glicose (79,44 ± 1,88 mg dL-1) e triglicerídeos (61,59 ± 8,10 mg dL-1) no plasma seminal, apresentaram uma maior concentração na estação não reprodutiva. Já os íons cálcio, apresentaram-se mais concentrados na estação reprodutiva (15,98 ± 1,02 mg dL-1) enquanto os íons cloreto não apresentaram diferença entre as concentrações nos períodos analisados. Em relação as velocidades somente a VSL apresentou um valor maior na estação não reprodutiva (44,06 ± 1,33 um s-1). Na morfologia dos espermatozoides houve
diferença significativa, tendo a estação reprodutiva uma porcentagem de espermatozoides normais superior a estação não reprodutiva. Assim, podemos concluir que as características físicas, cinéticas, morfológicas e bioquímicas do sêmen de Prochilodus brevis, mantidos em cativeiro, sofrem influência da estação reprodutiva. No entanto, esses animais permanecem
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aptos à reprodução quando induzidos hormonalmente, na estação reprodutiva e na estação não reprodutiva.
ABSTRACT
The common curimatã is characterized as a rheophilic fish, as it needs to migrate for reprodution toward the headwaters of the river during the rainy season. The environmental changes generated by the rains promote maturation and subsequent spawning, thus this species has reproductive seasonality. This study aimed to compare physico-chemicals characteristics, kinetics, morphology and biochemical composition of Prochilodus brevis sêmen, hormonally induced to captive breeding, between reproductive and non-reproductive season. For this, four samples were conducted over a period of one year. During the samples, breeders were induced hormonally to spermiation. The animals were sedated, identified, measured and weighted. The ejaculate volume was measured using graduated syringes and the pH analysis was performed using pH strips. The sperm concentration was performed in a Neubauer chamber. For kinetic the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) was used. Stained smears were prepared to observe the presence and types of sperm morphological abnormalities. Semen from each fish was centrifuged for the analyses of the seminal plasma. In these analyzes were performed concentrations of total protein, glucose, fructose, triglyceride, calcium and chloride by biochemical kits. The pH data of Prochilodus brevis semen suggest an alkaline condition of semen, as expected for freshwater fish (8.23 to 8.65). There was no difference between breeding and non-breeding season for semen volume and sperm concentration, whereas in relation to plasma volume were differences between the periods analyzed. There was a statistical difference in the seminal plasma biochemistry parameters. The concentration of total protein (1.51 ± 0.06 dL g-1), glucose (79.44 ± 1.88 mg dL-1) and triglycerides (61.59 ± 8.10 mg dL-1) in seminal plasma were higher in the non-breeding season. On the other hand, the calcium ions, were more concentrated in the breeding season (15.98 ± 1.02 mg dL-1) and the chloride ions concentration showed no difference between the analyzed periods. The sperm morphology showed significant difference, with the breeding season presenting a higher percentage of normal sperm than non-breeding season. Thus, we can conclude that the physical, kinetic, morphological and biochemical features of Prochilodus brevis semen, kept in captivity, are influenced by reproductive season.
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Peso, comprimento total padrão e características físicas do sêmen in natura de curimatã comum (n=13), média ± erro padrão das médias... ... 42 Tabela 2 - Bioquímica do plasma seminal de curimatã comum (n=13), média ± erro padrão das médias. ... 42 Tabela 3 - Cinética e morfologia do sêmen in natura de curimatã comum (n=13), média ± erro padrão das médias...42
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA – Análise de Variâncias
CASA – Computer Assisted Sperm Analyses (Análise Seminal Assitida por Computador) CEUA – Comitê de Ética para o Uso de Animais
CPAq – Centro de Pesquisas em Aquicultura
DNOCS – Departamento Nacional de Obras contra as Secas EHC – Extrato Hipofisário de Carpa
FSH – Hormônio Folículo Estimulante
FUNCEME – Fundação Cearense de Metereologia e Recursos Hídricos GLM – General Linear Model
GnRH- Hormônio Liberador de Gonadotrofinas GtH- Hormônio gonadotrófico
LBRP – Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes LIN – Linearidade
LH – Hormônio Luteinizante (Luteinizing Hormone) µL - Microlitro
NIB- Núcleo Integrado de Biotecnologia pH – Potencial Hidrogeniônico
SAS - Statistical Analysis System SCA – Sperm Class Analyser SNK – Student Newman Keus
UECE – Universidade Estadual do Ceará UFC – Universidade Federal do Ceará VAP – Velocidade média do percurso VCL – Velocidade Curvilinear
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 16
2.1. TAXONOMIA (FISHBASE, 2013) ... 16
2.2. CURIMATÃ COMUM E SUAS CARACTERÍSTICAS REPRODUTIVAS ... 16
2.3. SAZONALIDADE REPRODUTIVA ... 17 2.4. CARACTERIZAÇÃO SEMINAL ... 19 2.4.1. Volume ... 19 2.4.2. pH ... 20 2.4.3. Concentração ... 20 2.4.4. Morfologia espermática ... 21 2.4.5. Cinética espermática ... 21
2.5. BIOQUÍMICA DO PLASMA SEMINAL DE PEIXES ... 22
3 JUSTIFICATIVA ... 25 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA ... 26 5 OBJETIVOS ... 27 5.1 OBJETIVO GERAL ... 27 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... ...27 6 CAPÍTULO 1 ... 28 7 CONCLUSÕES...43 8 PERPESCTIVAS ... 44 REFERÊNCIAS ... 45
1 INTRODUÇÃO
Prochilodus brevis (STEINDACHNER, 1875) ou curimatã comum, é uma espécie de peixe originária das bacias hidrográficas nordestinas, principalmente as cearenses, e também se encontra disseminada em parte do Sudeste do Brasil (DOURADO, 1981). Esta espécie mostra-se promissora para a piscicultura pela sua precocidade, prolificidade, regime alimentar e principalmente por causa da sua grande aceitação no mercado pelos habitantes da região Nordeste (FONTENELE, 1982; ARAÚJO; GURGEL, 2002). Outro aspecto relevante é a importância social, pois seu consumo está mais ligado à subsistência, muito embora, em algumas regiões tenha forte apelo econômico.
O curimatã comum caracteriza-se como um peixe reofílico, pois necessita realizar a migração para a cabeceira do rio durante a estação chuvosa. As modificações ambientais geradas pelas chuvas promovem a maturação gonadal e consequente desova, tendo essa espécie uma sazonalidade reprodutiva (FONTENELE, 1982). Entretanto, em ambiente natural, sua reprodução vem sofrendo ameaças devido à construção de reservatórios e a captura pela pesca, principalmente durante a estação reprodutiva, quando as fêmeas e os machos estão maduros sexualmente (NASCIMENTO et al., 2012). Além disso, as mudanças climáticas globais têm modificado o regime de chuvas das regiões semiáridas, alterando o processo reprodutivo e colocando em risco a sobrevivência das espécies de peixes, o que poderá afetar o funcionamento dos ecossistemas no futuro (GURGEL et al., 2012).
Para o melhor entendimento da influência de alterações ambientais sobre os aspectos reprodutivos dessa espécie, faz-se necessário a realização de estudos contemplando a biologia reprodutiva de P. brevis. Dentre esses aspectos, pode-se destacar a importância da análise da qualidade seminal. O plasma seminal desempenha um papel fisiológico na maturação espermática, tendo uma composição bioquímica que apoia e protege a viabilidade, motilidade e capacidade de fertilização dos espermatozoides, criando um ambiente ideal para o armazenamento (CIERESZKO, 2008). A composição do plasma seminal tem influência sobre a qualidade do sêmen e um importante papel no metabolismo, na sobrevivência e na motilidade espermática (BOZKURT et al., 2011; BILLARD et al., 1995), estando sujeito a alterações através de variações sazonais (ARAMLI et al., 2013). Podendo variar entre as espécies pois possui características especificas, sendo necessário a avaliação da composição em cada espécie a ser trabalhada (MUNKITTRICK; MOCCIA, 1987; LAHNSTEINER; PATZNER, 1998).
O plasma seminal é constituído por componentes inorgânicos (por exemplo, Ca2+, Mg2+) estando esses íons envolvidos na inibição ou na ativação da motilidade espermática, enquanto os componentes orgânicos estão relacionados ao metabolismo energético (triglicerídeos, glicerol, ácidos graxos, glicose) (RURANGWA et al., 2004).
Outros aspectos importantes para a análise da qualidade espermática são as variações de volume, pH, concentração e motilidade espermática, sendo parâmetros amplamente utilizados em trabalhos de análise seminal (LOPES et al., 2014; MELO-MACIEL et al., 2015). Aspectos seminais de análise morfológica, cinética e bioquímica têm sido divulgados para algumas espécies de peixes, no entanto, quando se faz referência a efeitos da sazonalidade nas espécies reofílicas de águas tropicais sobre a qualidade espermática os dados são bastante escassos (ANDRADE-TALMELLI et al., 2001; CRUZ-CASALLAS et al., 2005; SHIMODA, 2004).
Logo, se faz necessário a descrição dos parâmetros seminais de Prochilodus brevis a fim de garantir conhecimento básico que poderá ser aplicado na melhoria de protocolos reprodutivos, no desenvolvimento de tecnologias que permitam a conservação e manutenção de material genético para o estabelecimento da produção na aquicultura, bem como, avaliar as variações dos parâmetros de qualidade seminal em relação ao período reprodutivo e não reprodutivo.
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1. TAXONOMIA (FISHBASE, 2013) Reino: Animalia Filo: Chordata Classe: Actinopterygii Ordem: Characiforme Família: Prochilodontidae Gênero: Prochilodus
Espécie: Prochilodus brevis (= Prochilodus cearensis)
Figura 1- Macho de curimatã comum (Prochilodus brevis). Fonte: LBRP.
2.2. CURIMATÃ COMUM E SUAS CARACTERÍSTICAS REPRODUTIVAS
O gênero Prochilodus possui hábito alimentar detritívoro, ingerindo matéria orgânica e microrganismos associados à lama do fundo de lagos e margens de rios (DOURADO, 1981). Essa característica é fundamental para o ecossistema fluvial, uma vez que os detritos são a principal via de energia e fluxo de matéria na maioria dos ecossistemas, dá suporte aos níveis tróficos superiores e é uma importante fonte de ciclagem de nutrientes inorgânicos e absorção, tornando esse grupo de animais importante para o funcionamento do ecossistema (MOORE et al., 2004).
Prochilodus brevis (Figura 1), conhecido popularmente como curimatã comum, é uma espécie originária das bacias hidrográficas nordestinas, principalmente as cearenses, e encontra-se disseminada por todo o Nordeste e parte do Sudeste (DOURADO, 1981). Esta espécie possui potencial para a piscicultura pois apresenta precocidade, prolificidade e uma grande aceitação no mercado pelos habitantes da região Nordeste do Brasil (FONTENELE, 1982; ARAÚJO; GURGEL, 2002).
Os animais adultos dessa espécie apresentam um comprimento médio de 23 a 30 centímetros e seu peso pode variar entre 215 a 513 gramas (NASCIMENTO et al., 2012). As fêmeas são ligeiramente maiores que os machos, principalmente durante o período reprodutivo, porém essa característica não pode ser considerada um dimorfismo sexual (NASCIMENTO et al., 2012; GURGEL et al., 2012).
A espécie P. brevis possui uma periodicidade reprodutiva sazonal que ocorre durante os meses de dezembro a maio, período das chuvas na região Nordeste, e é correlacionado com as mudanças das variáveis físicas e químicas do meio (NASCIMENTO et al., 2012). O gênero Prochilodus é bastante utilizado na reprodução em cativeiro oferecendo grandes vantagens à piscicultura, devido à rusticidade e à elevada taxa de crescimento (MURGAS et al., 2007). Quando bem alimentados, apresentam a vantagem de responder sem dificuldades à indução hormonal (NAVARRO et al., 2007). Na natureza, esse grupo possui hábitos reprodutivos do tipo reofílicos, ou seja, somente liberam seus gametas mediante sinais indutores; caso contrário, a desova não ocorre, mesmo que as gônadas já se encontrem desenvolvidas (LOPES; SOUZA; ROCHA, 2006). Desta forma, a reprodução destas espécies em ambientes confinados somente é possível através de duas maneiras: simulação das condições naturais, como o aumento da temperatura e elevação do nível da água, ou via indução hormonal (VINATEA, 2004).
2.3. SAZONALIDADE REPRODUTIVA
A maior parte dos peixes teleósteos apresenta sazonalidade reprodutiva, enquanto algumas poucas espécies se reproduzem continuamente (ENRIGHT, 2007). Dentre as espécies que apresentam sazonalidade, há grande variação em relação ao momento do ano em que a fertilização ocorre. Os peixes de água de regiões frias apresentam desova na primavera e início
do verão, enquanto outros, como é o caso da maioria dos salmonídeos, o fazem no outono (BILLARD; COSSON, 1992). O momento da desova é programado de modo que os nascimentos coincidam com momentos de disponibilidade alimentar (ENRIGHT, 2007).
A capacidade de reprodução dos peixes com sazonalidade reprodutiva, é dependente de estímulos ambientais, pois esses animais não apresentam capacidade de desovar em ambientes lênticos, devido à reduzida profundidade e a impossibilidade de realizar migração, para desencadear reprodução (MYLONAS; FOSTIER; ZANUY, 2010). Os estímulos ambientais como luminosidade, índices pluviométricos e temperatura (SOLIS-MURGAS et al., 2011), determinados pelos ritmos circadianos, convergem para a região pré-ótica do hipotálamo, responsável pela liberação do GnRH e da dopamina. A hipófise produz duas gonadotrofinas- GtH (GtH-I e GtH-II) que agem diretamente nas gônadas. Pelo significativo grau de homologia em relação aos hormônios de mamíferos como o hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH), o GtH-I é hoje claramente identificado como o FSH dos peixes e o GtH-II como LH (ENRIGHT, 2007).
Em peixes migradores de “piracema” é a partir dos estímulos ambientais, que estes indivíduos iniciam o processo de desenvolvimento e maturação gonadal. Porém, quando em cativeiro, os estímulos ambientais não estão presentes e a mimetização do ambiente, capaz de reproduzir os estímulos naturais para reprodutores, ainda é falha, sendo necessária a utilização de técnicas de indução do processo reprodutivo através da aplicação de hormônios (SOLIS-MURGAS et al., 2011).
Como uma forma de transpor esses entraves, a indução hormonal em cativeiro, é a técnica mais utilizada atualmente. Na maioria dos laboratórios de reprodução de espécies migradoras, utiliza-se como protocolo padrão a aplicação do extrato hipofisário de carpa (EHC). O EHC atua diretamente nas gônadas por meio das gonadotrofinas, induzindo a maturação final de ovócitos e a liberação dos espermatozoides, sem qualquer influência na produção inicial desses gametas (ORFÃO et al., 2008). Nos machos, o EHC aumenta o plasma seminal mediante a hidratação testicular, facilitando a extrusão dos espermatozoides. Em geral, são administradas doses que variam de 2 a 3 mg kg-1aplicada em dose única (ZANIBONI FILHO; WEINGARTNER, 2007).
2.4. CARACTERIZAÇÃO SEMINAL
A caracterização seminal é muito variável entre as espécies de peixes e a sua avaliação é de grande importância para o estabelecimento da fertilização artificial (SOLIS-MURGAS et al., 2011). Para a descrição de um perfil espermático, são analisadas as características físicas do sêmen (volume, pH e concentração), química, cinéticas e as características morfológicas dos espermatozoides (ROUTRAY et al., 2007). É necessário o conhecimento desses valores para que se possa avaliar a qualidade do sêmen coletado dentro e fora da estação reprodutiva e, com isso, otimizar sua utilização no processo de fertilização artificial (VIVEIROS, 2005).
A análise seminal de parâmetros como volume, motilidade, concentração espermática e bioquímica é de grande relevância para a avaliação da capacidade de produção de sêmen da espécie ou individual (MARIA et al., 2010). Porém, menos de 1% de todas as espécies brasileiras de peixe possuem alguma descrição sobre sua biologia espermática (VIVEIROS; GODINHO, 2009).
2.4.1. Volume
O volume seminal é um fator importante no processo reprodutivo e que tanto em espécies migratórias na época de reprodução, quanto em animais induzidos com hormônio, é bastante variável uma vez que pode ser influenciado pela estação do ano, clima, período de repouso sexual e método de coleta (MURGAS, 2011; VIVEIROS; GODINHO, 2009).
Em estudos realizados com P. brevis podemos evidenciar uma grande variação em relação ao volume seminal com valores de 1,31 mL (LOPES et al., 2014) e 0,15 mL (SILVA et al., 2014), sendo utilizado o mesmo método de indução hormonal em ambos os trabalhos.
Segundo Murgas (2011), a análise descritiva do volume torna-se importante, pois esta característica está diretamente ligada à quantidade de células fecundantes que o sêmen possui estando diretamente relacionada a produção espermática do animal.
2.4.2. pH
O pH extracelular é um fator que afeta os parâmetros de motilidade, e seus valores ótimos são necessários para a caracterização seminal. Um estudo realizado por Tabares; Tarazona; Oliveira. (2005), relata que o sêmen de peixes de água doce possui uma condição alcalina. A motilidade flagelar depende do pH intracelular que pode variar numa faixa de 6,5 – 8,5, acima ou abaixo desses valores, há redução significativa da motilidade (TABARES; TARAZONA; OLIVEIRA, 2005).
Estudos comprovam que o pH do plasma seminal de peixes de água doce (salmonídeos) abaixo de 7 pode inviabilizar a motilidade dos espermatozoides ainda nos ductos espermáticos (COSSON et al., 2000; DARSZO et al., 1999). Dessa forma, o conhecimento desses parâmetros é de extrema importância, pois influencia diretamente a motilidade espermática (ALAVI; COSSON, 2006).
2.4.3. Concentração
A concentração ou densidade espermática expressa à quantidade de espermatozoides por mL de sêmen. Valores de concentração podem variar de acordo com peso e idade do peixe, época do ano, frequência de coleta e volume do ejaculado (SILVA et al., 2009). Além disso, o número de espermatozoide por mililitro é altamente variável entre as espécies brasileiras (MURGAS et al., 2011). Sanches et al. (2009) verificaram para o Salminus brasiliensis uma concentração de espermatozoides de 77,52 e 7,58 × 109 espermatozoides.mL -1 enquanto Streit Junior et al. (2004) observaram a concentração de espermatozoides de 14 × 109 espermatozoides.mL-1 para o Prochilodus lineatus.
A produção espermática de peixes é muito alta, devido ao grande número de divisões espermatogoniais (BILLARD, 1995). Em algumas espécies o macho produz 100 bilhões de espermatozoides/ano/kg do peso corporal ou mais de 1 × 109 espermatozoides/g de testículo/dia, o que é 10 vezes maior do que a produção relatada para mamíferos (BILLARD; COSSON, 1992). Em estudos realizados com P. brevis a concentração variou entre 22,26 × 109 espermatozoides.mL-1 (LOPES et al., 2014), 1,5 × 107 espermatozoides.mL-1 (SILVA et al., 2014) e 27,89 × 109 espermatozoides.mL-1 (NUNES, 2015).
2.4.4. Morfologia espermática
A morfologia das células espermáticas é uma análise relevante na avaliação da qualidade do sêmen, sendo o aumento das patologias espermáticas um fator que pode provoca a diminuição na capacidade de fertilização (LAHNSTEINER; PATZNER, 1998). Patologias como flagelo dobrado, cabeça isolada, gotas citoplasmáticas proximal e distal são geradas durante a espermatogênese sendo conhecidas como patologias primárias ou maiores. Por outro lado, patologias como flagelo quebrado, enrolado, degenerado, macrocefalia e microcefalia são, geralmente, associadas à coleta e manipulação do sêmen sendo classificadas como patologias secundárias ou menores (HERMAN; MITCHELL; DOAK, 1994).
A avaliação morfológica dos espermatozoides de peixes pode auxiliar na caracterização de amostras seminais, fazendo inferência sobre seu potencial fertilizante ou de amostras congeladas de sêmen e explicando insucessos de reprodutores tidos como aptos após análises convencionais de motilidade espermática (MILIORINI, 2006).
Segundo Streit Jr et al. (2009), as patologias ocorrem naturalmente podendo ser encontradas no sêmen in natura. Em estudo realizado por Miliorini et al. (2011) com sêmen in natura de curimba (Prochilodus lineatus) pode-se encontrar uma porcentagem de 0,7% de patologias como cabeça curta, cauda quebrada e cauda fortemente enrolada, sendo que as anormalidades espermáticas de cauda curta e cauda fortemente enrolada, são as que mais afetam a motilidade e a taxa de fertilização (CHENOWETH, 2005; MILIORINI et al., 2011)
O padrão normal de morfoanomalias dos espermatozoides é preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal para mamíferos, bovinos, equinos, ovinos e suínos, no entanto, em peixes, as referências ainda não foram estabelecidas (MILIORINI, 2006).
2.4.5. Cinética espermática
O sêmen de peixes teleósteos possui uma característica de ser imóvel no ejaculado, adquirindo motilidade somente quando entra em contato com a água, permanecendo móveis
por um curto período de tempo, sendo inferior a um minuto (MELO; GODINHO, 2006). Segundo Viveiros; Godinho (2000), a motilidade espermática é um dos principais requisitos a serem considerados na análise da qualidade do sêmen de peixes, e é influenciada por inúmeros fatores como temperatura, estado nutricional, condições de análise, manejo e estresse dos doadores.
Apesar dos métodos subjetivos serem utilizados rotineiramente para a análise qualitativa e quantitativa do sêmen, os métodos objetivos de avaliação da motilidade e cinética espermática têm sido considerados mais relevantes na pesquisa em reprodução (OLIVEIRA et al., 2007). Um dos métodos utilizados em análises objetivas da motilidade é o Computer Assisted Sperm Analysis (CASA), um sistema automático (hardware e software Sperm Class Analyser - SCA) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, gerando informações precisas e significativas do movimento individual de cada célula e de subpopulações de células espermáticas (AMANN; KATZ, 2004).
Com o auxílio do programa é possível avaliar a porcentagem de espermatozoides móveis (ou taxa de motilidade), além da porcentagem de espermatozoides com velocidade rápida, média ou lenta; assim como analisar as propriedades de trajetória e velocidade dos espermatozoides, sendo algumas delas: Velocidade curvilínea (VCL- μm/s), velocidade linear progressiva (VSL- μm/s), velocidade média da trajetória (VAP- μm/s), retilinearidade (STR - %) e linearidade (LIN - %).
2.5. BIOQUÍMICA DO PLASMA SEMINAL DE PEIXES
O sêmen é constituído por plasma seminal e espermatozoides. O plasma seminal tem composição única, formado por substâncias de apoio à viabilidade das células espermáticas e algumas substâncias que auxiliam o sistema reprodutor e os espermatozoides (CIERESZKO, 2008). Compreender os efeitos da composição do plasma seminal e a concentração de espermatozoides é útil para a formulação de soluções artificiais do plasma seminal, substâncias ativadoras ou imobilizadoras, bem como para determinar a composição de sêmen ideal para a fertilização (HATEF et al., 2007).
Estudos sobre peixes teleósteos revelam que os testículos, ducto testicular principal e ductos espermáticos estão envolvidos na produção do plasma seminal que é um produto
sintetizado nos ductos espermáticos e testículos, na maioria dos peixes teleósteos (LAHNSTEINER et al., 1993) tendo esse constituinte do sêmen a função de prover um ótimo ambiente para o armazenamento dos espermatozoides dentro e fora dos testículos.
A composição do plasma seminal tem uma influência na qualidade biológica do sêmen, sendo um importante constituinte, tendo uma função vital no metabolismo, na sobrevivência e na motilidade dos espermatozoides (BOZKURT et al., 2011). Alterações na composição do plasma seminal poderão impedir a proteção e conduzir a uma redução da qualidade espermática (CIEREZKO, 2008).
Existe uma grande variação da composição bioquímica do plasma seminal, entre as espécies e entre indivíduos da mesma espécie, relacionando-se a diferentes concentrações de proteínas, enzimas, lipídios, açúcares e ácidos (PIIRONEN; HYVÄRINEN, 1983). O plasma seminal de peixes é caracterizado por possuir uma baixa concentração de proteínas, componentes minerais (Na+, K+, Ca+ e Mg++) e substâncias orgânicas (triglicerídeos, glicose, frutose) (RURANGWA et al., 2004).
A maioria dos íons no plasma seminal de peixe estão envolvidos na regulação da motilidade espermática, pois realizam um efeito sobre a osmolaridade para a composição iônica intra ou extracelular (LINHART; SLECHTA; SLAVIK, 1991; BILLARD; COSSON, 1992; ALAVI; COSSON, 2006). A maioria dos estudos sobre bioquímica do plasma seminal de peixes observa que os íons sódio (Na+), potássio (K+), cloretos (Cl-) e cálcio (Ca2+) contribuem na composição iônica intracelular causando um efeito osmótico (LINHART; SLECHTA; SLAVIK, 1991; BILLARD; COSSON 1992; ALAVI; COSSON, 2006; BOZKURT et.al., 2011).
A atuação das proteínas do plasma seminal está relacionada à proteção dos espermatozoides durante a maturação no sistema reprodutivo (PING LI; HULAK; LINHART, 2009). Estudos realizados por Lahnsteiner et al. (2004) afirmam que as proteínas do plasma seminal desempenham um papel chave no prolongamento da viabilidade espermática, em peixes teleósteos, podendo ser encontradas em maior concentração em períodos de estocagem. Em relação aos carboidratos, não se sabe ao certo a importância da glicose no plasma seminal de peixe (ARAMLI; KALBASSI; NAZARI, 2013). Alguns estudos têm mostrado que a presença desse carboidrato tem sido relacionada com a alta demanda de energia dos testículos durante a espermatogênese ou para a síntese de lipídeos de espermatozoides (SOENGAS et al.,
1993). Outra importância dos carboidratos está relacionada a proteção da membrana do espermatozoide tendo uma função de crioprotetor externo (MAISSE, 1996).
Em relação a classe de lipídeos, como por exemplo, os triglicerídeos têm a função de fontes de energia para os espermatozoides durante o período de armazenamento (LAHNSTEINER et al., 1993), prevalente fora da estação reprodutiva. Além disso, a redução da concentração dos triglicerídeos dentro da estação é necessária, uma vez que altas concentrações, podem ter efeitos deletérios ao processo de espermatogênese (BEER-LJUBIC, 2009) que ocorre em grande quantidade dentro da estação reprodutiva. No entanto, geralmente os lipídeos e o colesterol têm papel protetor contra mudanças ambientais que ocorrem quando o sêmen é liberado no meio (BOZKURT et al., 2008). Além disso, de acordo com Piironen (1994), os lipídeos presentes no plasma seminal estão associados ao metabolismo espermático. Lahnsteiner et al. (2009), mostraram que os ácidos graxos são compostos importantes para prolongar a viabilidade de espermatozoides, durante o armazenamento de curto prazo, à medida que afeta positivamente a motilidade dos espermatozoides e a fertilidade.
Apesar do pouco conhecimento sobre a função das substâncias no plasma seminal, alguns estudos, como os realizados em truta arco-íris (MUNKITTRICK; MOCCIA, 1987; LAHNSTEINER; PATZNER, 1998) relatam que o plasma seminal possui características espécie especificas, sendo necessário a avaliação da composição em cada espécie a ser trabalhada.
3 JUSTIFICATIVA
O curimatã comum (P. brevis) sofre ameaças, em épocas reprodutivas, pela pesca predatória, principalmente das fêmeas em virtude do interesse em suas ovas, e pela construção de barragens nos rios, que impedem a migração desses animais para a reprodução em ambiente natural.
Apesar do grande interesse econômico e ecológico dessa espécie, ainda existem poucos estudos contemplando aspectos de sua biologia reprodutiva, principalmente abordando a caracterização seminal.
Segundo Borges et al. (2005), o controle e a produção bem-sucedida, em aquicultura industrial, requerem conhecimentos básicos da física e dos índices bioquímicos do sêmen para determinar a viabilidade reprodutiva de peixes e estabelecer melhores protocolos de reprodução em cativeiro.
Compreender os efeitos da composição do plasma seminal, e da concentração de espermatozoides é útil para a formulação de soluções artificiais do plasma seminal, substâncias ativadoras ou imobilizadoras, bem como para determinar a composição ideal do sêmen para a fertilização (HATEF et al., 2007). Estudos relatam a importância da análise da composição bioquímica e da motilidade, pois são importantes para avaliar a qualidade espermática em peixes (BILLARD et al., 1995; LAHNSTEINER; PATZNER, 1998).
Mylonas et al. (2004) relatam que é de extrema importância que seja observado à existência de mudanças sazonais relacionadas a qualidade dos espermatozoides para cada nova espécie selecionada para a aquicultura. Dessa forma, esse trabalho justifica-se pela necessidade da descrição dos parâmetros seminais dessa espécie como informações necessárias para o conhecimento básico que poderá ser aplicado na melhoria de protocolos reprodutivos, no desenvolvimento de tecnologias que permitam a conservação e manutenção de material genético para o estabelecimento da produção de P. brevis em aquicultura. Outra relevância é a necessidade de um trabalho que analise à qualidade espermática com a composição bioquímica do plasma seminal na época reprodutiva e não reprodutiva dessa espécie.
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
Existem variações entre os parâmetros cinéticos, morfológicos e bioquímicos do sêmen fresco de P. brevis entre os períodos reprodutivo e não reprodutivo.
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Determinar as características cinéticas, morfológicas e bioquímicas do sêmen de Prochilodus brevis em cativeiro, dentro e fora da estação reprodutiva, para fornecer conhecimentos básicos para a melhoria de protocolos reprodutivos.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a motilidade total, as velocidades e a morfologia de cauda e de cabeça do sêmen fresco dentro e fora da estação reprodutiva;
Determinar a concentração de proteínas totais, cloreto, triglicerídeo, cálcio, glicose e frutose no plasma seminal de P. brevis dentro e fora da estação reprodutiva;
6 CAPÍTULO 1
Variação sazonal da qualidade seminal de Prochilodus brevis (Teleostei, Characiforme) no Nordeste do Brasil
Seasonal variation in semen quality of Prochilodus brevis (Teleostei, Characiformes) in Northeastern Brazil
Variação sazonal da qualidade seminal de Prochilodus brevis (Teleostei, Characiforme) no Nordeste do Brasil
[Seasonal variation in semen quality of Prochilodus brevis (Teleostei, Characiformes) in Northeastern Brazil]
J.S. Leite1,4; M.S. Oliveira1; L.T Nunes1; P.S Almeida-Monteiro1; A.C.N, Campos2; C.C Campello1; C.S.B. Salmito-Vanderley1,3
1Faculdade Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, 2Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza,
Ceará, Brasil. 3Centro de Ciências da Saúde, Universidade Estadual do Ceará, Ceará, Brasil. 4Correspondência: Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. Telefone: 3101
9851. Fax: 3101 9840. E-mail: jordanasleite@gmail.com.
RESUMO
O curimatã comum caracteriza-se como um peixe reofílico, pois necessita realizar a migração para a reprodução até a cabeceira do rio durante a estação chuvosa. As modificações ambientais geradas pelas chuvas promovem a maturação gonadal e consequente desova, tendo essa espécie uma sazonalidade reprodutiva. Apesar da evidência da sazonalidade reprodutiva dessa espécie na natureza, em cativeiro, técnicas de indução hormonal permitem a coleta de sêmen em diferentes períodos do ano. Dessa forma, esse estudo teve como objetivo comparar as características físico-químicas, a cinética, a morfologia e a bioquímica do sêmen de Prochilodus brevis induzidos hormonalmente à reprodução em cativeiro, na estação reprodutiva e não reprodutiva. Para isso, foram realizadas quatro coletas ao longo do período de um ano. Durante as coletas, os reprodutores foram induzidos hormonalmente à espermiação. Os animais foram sedados, submetido à leitura do chip, medidos e pesados. O volume do ejaculado, foi aferido por meio de seringas graduadas e a leitura do pH do sêmen foi realizada com o auxílio de fitas de pH. A concentração espermática foi mensurada em câmara de Neubauer. Para a análise da cinética foi utilizado o sistema de análise seminal auxiliada por computador (CASA). Foram confeccionados esfregaços corados para observar a presença e tipos de morfoanomalias espermáticas. O sêmen de cada animal foi centrifugado para a análise do plasma seminal. Nessas análises foram avaliadas as concentrações de proteínas totais, glicose, frutose, triglicerídeo, cálcio e cloreto, através de kits bioquímicos. Os dados de pH do sêmen de P. brevis, sugerem condição alcalina do sêmen dentro do esperado para peixes de água doce (8,23 a 8,65). Não houve diferença entre a estação reprodutiva e não reprodutiva para o volume seminal e a concentração espermática, entretanto, foram verificadas diferenças entre as concentrações bioquímicas nos períodos analisados. A concentração de proteínas (1,51 ± 0,06 g dL-1), glicose (79,44
± 1,88 mg dL-1) e triglicerídeos (61,59 ± 8,10 mg dL-1) no plasma seminal apresentaram uma maior
concentração na estação não reprodutiva. No entanto, em relação aos íons cálcio, estes apresentaram-se mais concentrados na estação reprodutiva (15,98 ± 1,02 mg dL-1) e os íons cloreto não apresentaram
diferença entre as concentrações nos períodos analisados. Sobre a morfologia dos espermatozoides houve diferença significativa, tendo a estação reprodutiva uma porcentagem de espermatozoides normais superior a estação não reprodutiva. Assim, podemos concluir que as características físicas, cinéticas, morfológicas e bioquímicas do sêmen de Prochilodus brevis, mantidos em cativeiro, sofrem influência da estação reprodutiva.
Palavras-chave: bioquímica, estação reprodutiva, plasma seminal, peixe e sêmen.
ABSTRACT
The common curimatã is characterized as a rheophilic fish, as it needs to migrate for reprodution toward the headwaters of the river during the rainy season. The environmental changes generated by the rains promote maturation and subsequent spawning, thus this species has reproductive seasonality. Despite evidence of reproductive seasonality of this species in the wild, in captivity, hormonal induction techniques allow the collection of semen at different times of year. This study aimed to compare physico-chemicals characteristics, kinetics, morphology and biochemical composition of Prochilodus
brevis sêmen, hormonally induced to captive breeding, reproductive and non-reproductive season. For
this, four samples were conducted over a period of one year. During the samples, breeders were induced hormonally to spermiation. The animals were sedated, identified, measured and weighted. The ejaculate volume was measured using graduated syringes and the pH analysis was performed using pH strips. The sperm concentration was performed in a Neubauer chamber. For kinetic analysis Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) was used. Stained smears were prepared to observe the presence and types of sperm morphological abnormalities. Semen from each fish was centrifuged for the analyses of the seminal plasma. In these analyzes were performed concentrations of total protein, glucose, fructose, triglyceride, calcium and chloride by biochemical kits. The pH data of Prochilodus brevis semen suggest an alkaline condition of semen, as expected for freshwater fish (8.23 to 8.65). There was no difference between breeding and non-breeding season for semen volume and sperm concentration, whereas in relation to plasma volume were differences between the periods analyzed. There was a statistical difference in the seminal plasma biochemistry parameters. The concentration of total protein (1.51 ± 0.06 dL g-1), glucose (79.44 ± 1.88 mg dL-1) and triglycerides (61.59 ± 8.10 mg dL-1) in seminal plasma
were higher in the non-breeding season. On the other hand, the calcium ions, were more concentrated in the breeding season (15.98 ± 1.02 mg dL-1) and the chloride ions concentration showed no difference
between the analyzed periods. The sperm morphology showed significant difference, with the breeding season presenting a higher percentage of normal sperm than non-breeding season. Thus, we can conclude that the physical, kinetic, morphological and biochemical features of Prochilodus brevis semen, kept in captivity, are influenced by reproductive season.
Introdução
Prochilodus brevis (STEINDACHNER, 1875) ou curimatã comum, é uma espécie
originária das bacias hidrográficas do Nordeste do Brasil, principalmente as cearenses, e também se encontra disseminada em parte da região Sudeste (DOURADO, 1981). Esta espécie mostra-se promissora para a piscicultura por sua precocidade reprodutiva, prolificidade e principalmente por causa da sua grande aceitação no mercado pelos habitantes da região Nordeste (FONTENELE, 1982; ARAÚJO; GURGEL, 2002). Essa espécie apresenta desova anual total e seu período reprodutivo se estende de dezembro a maio, que corresponde ao período de chuvas na região Nordeste do Brasil (NASCIMENTO et al., 2012).
O curimatã comum caracteriza-se como um peixe reofílico, pois necessita realizar a migração para a reprodução em direção a cabeceira do rio durante a estação chuvosa. As modificações ambientais geradas pelas chuvas promovem a maturação gonadal e consequente desova, tendo essa espécie uma sazonalidade reprodutiva (FONTENELE, 1982). Entretanto, em ambiente natural, a reprodução do P. brevis vem sofrendo ameaças pela construção de reservatórios e pela pesca, principalmente durante a estação reprodutiva, quando as fêmeas e os machos estão maduros sexualmente (NASCIMENTO et al., 2012). Além disso, as mudanças climáticas globais têm modificado o regime de chuvas das regiões semiáridas, alterando o processo reprodutivo e colocando em risco a sobrevivência das espécies de peixes, o que poderá afetar o funcionamento dos ecossistemas no futuro (GURGEL; VERANI; CHELLA, 2012).
Para o melhor entendimento da influência de alterações ambientais sobre os aspectos reprodutivos dessa espécie, faz-se necessário a realização de estudos contemplando a biologia reprodutiva de P. brevis. Dentre esses aspectos, pode-se destacar a importância da análise da qualidade seminal, tanto das características celulares quanto das plasmáticas. O plasma seminal de peixes é constituído por componentes orgânicos e inorgânicos. A porção inorgânica (por exemplo, Ca2+, Cl-) está
envolvida na inibição e ativação da motilidade espermática, enquanto a porção orgânica está relacionada ao metabolismo energético (RURANGWA et al., 2004), sendo a glicose, a frutose e os triglicerídeos as principais fontes energéticas para os espermatozoides (BAJPAI et al., 1998). Tal composição pode sofrer influência de vários fatores, dentre eles ressalta-se as variações sazonais (ARAMLI; KALBASSI; NAZARI, 2013).
Os constituintes do plasma seminal desempenham um papel fisiológico na maturação espermática, tendo uma composição bioquímica que dá suporte e protege a viabilidade, motilidade e capacidade de fertilização dos espermatozoides, criando um ambiente ideal para o armazenamento (BILLARD et al., 1995; CIERESZKO, 2008; BOZKURT et al., 2011). Além disso, o conhecimento da
composição do plasma seminal pode ajudar na preparação de soluções artificiais adequadas para o processo de resfriamento ou criopreservação (BILLARD; COSSON, 1992).
Apesar da evidência da sazonalidade reprodutiva dessa espécie na natureza, em cativeiro, técnicas de indução hormonal permitem a coleta de sêmen em diferentes períodos do ano, inclusive fora da estação reprodutiva natural (LOPES et al., 2014). Em águas paradas, os peixes reofílicos não se reproduzem naturalmente, devido à ausência de estímulos desencadeados pela piracema. Assim, a reprodução destas espécies em ambientes confinados somente é possível de duas maneiras: simulação das condições naturais, como o aumento da temperatura e elevação do nível da água, ou via indução hormonal (VINATEA, 2004; ZANIBONI FILHO; WEINGARTNER, 2007). Porém, não existem trabalhos que verifiquem a qualidade seminal dentro e fora da estação reprodutiva para P. brevis induzido hormonalmente à reprodução.
Portanto, os conhecimentos básicos sobre índices físicos e bioquímicos podem ser utilizados como subsídios para elucidar a influência de fatores ambientais sobre a reprodução de P.
brevis, auxiliar programas de conservação e desenvolvimento da aquicultura dessa espécie, bem como
verificar a possibilidade da obtenção de sêmen de boa qualidade o ano todo em cativeiro (BORGES et al., 2005). Dessa forma, esse estudo teve como objetivo comparar as características físico-químicas, a cinética, a morfologia e a bioquímica do sêmen de P. brevis induzidos hormonalmente à reprodução em cativeiro, na estação reprodutiva e não reprodutiva.
Material e Métodos
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais- CEUA da Universidade Estadual do Ceará (4313324/2014). O experimento ocorreu entre os anos de 2014-2015, sendo realizadas duas coletas no período de estação reprodutiva (dezembro a maio) e duas na estação não reprodutiva (junho a novembro) da espécie (NASCIMENTO et al., 2012). Para o melhor entendimento das variações ambientais durante o experimento, foram coletados dados de precipitação, temperatura e radiação solar a partir de informações fornecidas pela FUNCEME (Fundação Cearense de Meteorologia e Recursos Hídricos).
Manejo dos animais e coleta seminal
Foram utilizados 13 machos de curimatã comum, oriundos do Centro de Pesquisa em Aquicultura (CPAq) do Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), localizado em Pentecoste, Ceará, Brasil (3°45’00”S; 39°10’24”W); e mantidos no Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP), localizado no campus do Itaperi da Universidade Estadual do Ceará, em Fortaleza, Ceará, Brasil (3°47'36.2"S; 38°33'30.1"W).
Foram selecionados machos que apresentaram tamanho/peso semelhantes (20,60 ± 0,31 cm; 126,92 ± 5,71 g) e liberação de sêmen quando submetidos a leve pressão abdominal.
Antes da realização dos experimentos, os animais foram identificados com microchips estéreis (Veri-Tag) para o acompanhamento individual de cada reprodutor. Os animais foram mantidos em tanques de fibra de vidro de 7100 litros, com temperatura média de 27 °C e oxigênio dissolvido de ~8 mg L-1. Diariamente, receberam ração comercial contendo 32% de proteína bruta fornecida em uma
taxa de 3% do peso vivo, dividida em duas refeições diárias, conforme procedimento rotineiro de manejo.
Para induzir à espermiação, os reprodutores receberam tratamento hormonal com extrato hipofisário de carpa comum (Cyprinus carpio) (EHC) por meio de dose única de 3 mg Kg-1 de peso
animal aplicada por via intracelomática na base da nadadeira peitoral. Após 18 horas da indução hormonal, os animais foram sedados com solução à base de óleo de cravo (Eugenol; Sigma-Aldrich) na proporção de 1:10:10000 (eugenol: álcool: água), para facilitar o manejo e reduzir o estresse dos animais.
Após a sedação, os animais foram contidos em decúbito lateral sobre uma esponja e tiveram seus olhos cobertos por um pano úmido, para minimizar o estresse. Em seguida, foram submetidos à leitura do chip, medição, pesagem e coleta de sêmen, sendo devolvidos ao tanque de manuseio após a realização destes procedimentos. Durante a coleta, para que não houvesse contaminação do sêmen com água, sangue, fezes ou urina, foi realizada uma limpeza do orifício genital com papel toalha. O sêmen foi coletado por meio de uma leve pressão abdominal no sentido anteroposterior, utilizando seringas estéreis graduadas e, em seguida, transferido para tubos de polietileno estéreis. O sêmen coletado foi mantido em caixa térmica com gelo a uma temperatura de aproximadamente 4 ºC, até a análise das amostras (não ultrapassando 30 minutos).
Análise do sêmen
O volume do ejaculado (mL), foi aferido no momento da coleta, por meio de seringas graduadas. A leitura do pH do sêmen foi realizada com o auxílio de fitas de pH (MERCK-Alemanha) em escala de 0-14.
Para a concentração espermática, o sêmen de cada animal foi fixado em solução formol-citrato a 4% na proporção de 1:4000 (1 µL sêmen:4 mL fixador) conforme o método adotado por Leite et al. (2013). Desta diluição, 20 µL foram depositados em câmara de Neubauer e analisadas em microscópio ótico, em objetiva de 40x.
Para avaliar a cinética espermática, foi utilizado 1 µL de sêmen homogeneizado com 100 µL de solução ativadora (NaCl 50 mM – 100mOsm) sobre a câmara de Makler e submetido a imediata análise. As análises foram feitas utilizando o sistema de análise seminal auxiliada por computador (CASA), por
meio do software Sperm Class Analyser (SCA, Microptics, versão 5.0, Barcelona, Espanha). Os parâmetros para a análise da motilidade (%) foram ajustados para peixes de acordo com a Velocidade Curvilinear (VCL) com faixa de velocidade de 40 μm s-1 para espermatozoides rápidos, 20 μm s-1 para
espermatozoides médios, 10 μm s-1 para espermatozoides lentos e zero μm s-1 para espermatozoides
estáticos (VIEIRA, 2010). Dentre os parâmetros de velocidade foram avaliados: velocidade curvilinear (VCL – μm s-1), velocidade linear progressiva (VSL – μm s-1) e velocidade média da trajetória (VAP –
μm s-1).
A análise da morfologia ocorreu após a fixação do sêmen em solução formol-citrato a 4% na proporção de 1:100 (sêmen: fixador), após a fixação, as amostras foram coradas com Rosa Bengala na proporção de 3:20 (corante: sêmen fixado). Foram confeccionadas duas lâminas por animal e avaliados 100 espermatozoides por lâmina de acordo com a classificação proposta por Miliorini et al. (2011). As leituras foram realizadas no programa SCA, utilizando o módulo “Contador”.
Análise do plasma seminal
Para a obtenção do plasma seminal, o sêmen foi centrifugado a 2500g por 15 minutos a uma temperatura de 4 °C em centrífuga refrigerada (5430R, Eppendorf). Após a centrifugação, o plasma seminal foi transferido para tubos de polietileno estéreis, devidamente identificados, e armazenado em ultra freezer a - 80 °C até o momento das análises bioquímicas.
Para as dosagens bioquímicas do plasma seminal, as alíquotas foram descongeladas em temperatura ambiente (~25 ºC). As concentrações de proteínas totais, glicose, frutose, triglicerídeo, cálcio e cloreto, foram avaliadas em duplicata por meio de kits comerciais (LABTEST® Diagnóstica S.A). Estes kits são rotineiramente usados para diagnóstico in vitro de análises clínicas humanas, podendo também ser utilizados para dosagens bioquímicas de plasma seminal (PINHEIRO et al., 1996; WONG et al., 2001; KAYA; AKSOY; TEKELI, 2002).
As leituras das amostras foram baseadas na formação de um produto corado, cuja intensidade de cor é proporcional à concentração. Os kits são formados por três reagentes: 1- diluído em água destilada para calibração do branco no espectrofotômetro; 2- determina a coloração do padrão; 3- adicionado às amostras de plasma para a reação e modificação da cor. Para os kits de proteínas totais, glicose, frutose e triglicerídeos, foi necessária a utilização de banho-maria aquecido a 37 °C para a ocorrência da reação. As absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro (1105, Bel photonics), utilizando o comprimento de onda específico para cada substância analisada de acordo com o kit utilizado.
Análise estatística
Os dados foram incialmente submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Bartlett para confirmação da normalidade da distribuição dos resíduos e homocedasticidade, respectivamente. Verificado o atendimento desses requerimentos para realização da análise de variância (ANOVA), esta foi executada por meio do procedimento GLM do Programa SAS (2002), considerando um delineamento inteiramente casualizado, aplicando-se o teste de Student-Newman-Keuls (SNK) para comparação das médias. Nos casos em que houve heterogeneidade de variâncias entre os tratamentos, mesmo após tentativas de transformação de dados (proteínas, glicose, triglicerídeos, percentual de rápidos, médios, lentos, e outros defeitos de cabeça), foi aplicado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão das médias e foi adotado nível de significância de 5%.
Resultados e Discussão
As características ambientais do período de realização do experimento apresentaram variações bem definidas. Dentro da estação reprodutiva, observou-se precipitação de 171,88 + 115,06 mm mês-1, temperatura média máxima de 28,75 + 0,68 °C e mínima de 27,77 + 0,61 °C e radiação de
1327,42 + 110,63 KJ (m2)-1. Em relação ao período caracterizado como fora da estação reprodutiva, esse
apresentou uma precipitação mais baixa de 43,38 + 53,22 mm mês-1, temperatura média máxima de
33,38 + 14,91 °C e mínima de 27,70 + 0,72 °C e radiação de 1606,67 + 219,35 KJ (m2)-1. Dessa forma,
esses valores refletem as condições ambientais esperadas para os períodos.
Os resultados referentes ao peso e comprimento dos animais (n=13) e à caracterização do sêmen de P. brevis, estão descritos na tabela 1. A média de tamanho dos animais no presente estudo foi de 20,60 ± 0,31 cm e está de acordo com a faixa estimada para reprodutores (16 a 23 cm; ARAÚJO; GURGEL, 2002). A qualidade do sêmen das espécies aquícolas, na natureza ou em cativeiro, depende de vários fatores externos, como o regime alimentar, manejo e a época de desova dos machos (RURANGWA et al., 2004). Todos esses parâmetros foram controlados no presente estudo.
Em relação ao pH, houve diferença (p<0,05) entre a estação reprodutiva (8,23 ± 0,08) e não reprodutiva (8,65 ± 0,07). Apesar da diferença encontrada o pH está dentro do esperado para peixes de água doce, que varia de 6,5 a 8,5 (TABARES; TARAZONA; OLIVEIRA, 2005), visto que, o pH alcalino do plasma seminal aumenta a porcentagem de espermatozoides móveis e sua capacidade de fertilizar ovócitos (BILLARD, 1981).
Para os parâmetros de volume do sêmen e concentração espermática, não houve diferença (p>0,05), entre a estação reprodutiva e não reprodutiva. Esses parâmetros podem ser influenciados pelo regime alimentar e indução hormonal à reprodução (SOLIS-MURGAS et al., 2011). Assim, podemos
destacar que o curimatã tem uma boa capacidade de responder fisiologicamente a indução hormonal em todas as épocas do ano, quando mantidos em regime alimentar controlado.
No plasma seminal, houve diferença (p<0,05) da concentração de proteínas totais entre as diferentes estações, que foi maior durante a estação não reprodutiva (1,51 ± 0,06 g dL-1; Tabela 2).
Lahnsteiner et al. (2004) afirmam que as proteínas do plasma seminal desempenham um papel chave no prolongamento da viabilidade espermática em peixes teleósteos, podendo ser encontrada em maior concentração em períodos não reprodutivos. Em comparação com os outros vertebrados, a quantidade de proteínas totais no plasma seminal de peixes é baixa (KROL; GLOGOWSKI; DEMSKA-ZAKES, 2006).
A quantidade de glicose no plasma seminal apresentou maior concentração na estação não reprodutiva (79,44 ± 1,88 mg dL-1) em relação a estação reprodutiva (2,42 ± 0,50 mg dL-1; p<0,05). Isso
pode estar relacionado a maior necessidade de glicose no plasma seminal em períodos de demanda de energia dos testículos para a espermatogênese ou para a síntese de lipídeos, pois os animais reofílicos armazenam nutrientes no organismo em período não reprodutivo e utilizam as reservas em períodos de migração (SOENGAS et al., 1993).Em relação à concentração de frutose, não houve diferença (p>0,05) entre os períodos analisados. Os monossacarídeos como a glicose e a frutose são parâmetros bioquímicos importantes, pois proporcionam proteção à membrana do espermatozoide ainda dentro do sistema reprodutivo (MAISSE, 1996).
A concentração de triglicerídeos no plasma seminal foi maior (p<0,05) durante a estação não reprodutiva (61,59 ± 8,10 mg dL-1), uma vez que esses lipídeos servem como fonte de energia para
os espermatozoides durante o período em que esses animais não se reproduzem (LAHNSTEINER; PATZNER; WEISMANN, 1993). Os triglicerídeos são compostos importantes para prolongar a viabilidade espermática durante o período não reprodutivo, influenciando positivamente a motilidade dos espermatozoides e a fertilidade (LAHNSTEINER et al., 2009). Além disso, a redução da concentração dos triglicerídeos no período reprodutivo (9,76 ± 0,95 mg dL-1) é necessária, uma vez que
altas concentrações podem ter efeitos deletérios ao processo de espermatogênese (BEER-LJUBIC et al., 2009).
No presente estudo, a concentração de íons cálcio foi maior na estação reprodutiva (15,98 ± 1,02 mg dL-1) em comparação à não reprodutiva (8,42 ± 0,85 mg dL-1; p<0,05). Segundo Billard et al.
(1995) os íons cálcio, externos à estrutura celular, são necessários para a iniciação da motilidade do espermatozoide. Em relação aos íons cloreto, não houve diferença (p>0,05) entre as concentrações dos períodos analisados. Porém a concentração deste íon no sêmen de P.brevis, independente da estação, tendeu a ser maior que as já descritas para outros teleósteos (ARAMLI; KALBASSI; NAZARI, 2013). A maioria dos íons no plasma seminal de peixe são envolvidos na regulação da motilidade espermática,
pois atuam sobre a osmolaridade para a composição iônica intra ou extracelular (LINHART; SLECHTA; SLAVIK, 1991; BILLARD; COSSON, 1992; ALAVI; COSSON, 2006).
Além da bioquímica do plasma seminal, foram realizadas análises objetivas da cinética e morfologia do espermatozoide de curimatã comum (Tabela 3). Em relação aos parâmetros de motilidade, pode-se destacar que não houve diferença (p>0,05) entre o período reprodutivo e não reprodutivo, com uma porcentagem de espermatozoides móveis (98,82 ± 0,45%; 98,59 ± 0,45%, respectivamente) dentro da faixa esperada para o gênero Prochilodus (89 e 99,8%; NASCIMENTO et al., 2012).
Os parâmetros de velocidade espermática foram escolhidos por serem comumente utilizados para a determinação da qualidade espermática (LOPES et al., 2014; MELO-MACIEL et al., 2015). Em relação à cinética espermática, apenas a VSL apresentou diferença (p<0,05) entre estação reprodutiva (38,22 ± 1,03 um s-1) e não reprodutiva (44,06 ± 1,33 um s-1), sendo essa velocidade maior
na estação não reprodutiva. No entanto, a VSL não é a velocidade mais relevante para a análise do sêmen de peixe de fecundação externa, como o P.brevis, pois é esperado que o espermatozoide faça uma trajetória curvilínea ao encontro da micrópila. Desse modo a VCL é a velocidade mais importante. Bons resultados referentes as velocidades são de notável importância, uma vez que existe uma correlação positiva das velocidades espermáticas com a taxa de fertilização, de acordo com os resultados encontrados para Prochilodus lineatus (VIVEIROS et al., 2010). Assim, podemos afirmar que, em relação as velocidades espermáticas, o sêmen de P.brevis tem uma boa capacidade fertilizante durante todo o ano.
Em relação a morfologia espermática, pode-se destacar que houve diferença (p<0,05) entre a porcentagem de espermatozoides normais nas estações reprodutiva e não reprodutiva (81,25 ± 1,77%; 66,73 ± 2,41%, respectivamente). Alguns estudos já realizados com a mesma espécie mostram uma porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais de 97,21 ± 1,46% e 74,18 ± 10,67% (LOPES et al., 2014; NUNES, 2015). A análise da morfologia espermática é fundamental para a determinação da qualidade espermática, pois espermatozoides com a morfologia comprometida podem inviabilizar o momento da fertilização (MILIORINI et al., 2011).
Quanto aos tipos de morfoanomalias encontradas, a porcentagem de espermatozoides com cauda dobrada foi menor (p<0,05) na estação reprodutiva (17,42 ± 1,71%) quando comparada à estação não reprodutiva (31,15 ± 2,68%). Uma alta porcentagem de cauda espermatozoides com cauda dobrada também foi encontrada no sêmen in natura de Curimba, causando problemas de movimentação dos espermatozoides e de fertilização (MILIORINI et al., 2011). Outras morfoanomalias também foram analisadas nesse estudo, dentre os defeitos de cauda encontrados (cauda quebrada, curta, fortemente enrolada e corrugada) prevaleceram cauda fortemente enrolada e corrugada. Em relação aos defeitos de
cabeça encontrados (microcefalia, macrocefalia, cabeça degenerada e cabeça solta normal) o que mais prevaleceu foi cabeça solta.
Conclusão
De acordo com as condições metodológicas empregadas, conclui-se que as características físicas, cinéticas, morfológicas e bioquímicas do sêmen de Prochilodus brevis, mantidos em cativeiro, são influenciadas pela época de coleta. No entanto, esses animais permanecem aptos à reprodução, desde que induzidos hormonalmente, na estação reprodutiva e na estação não reprodutiva.
Agradecimentos
Ao Departamento Nacional de Obras contra as Secas, a Universidade Estadual do Ceará, a Universidade Federal do Ceará e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.
Referências
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