RESEARCH ARTICLE Pub. 1134
ISSN 1679-9216
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Received: 15 March 2012 Accepted: 27 February 2012 Published: 15 June 2013 1Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS, Brazil. 2Laboratório de Embriologia e Diferenciação Celular, Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA-UFRGS), Porto Alegre, RS. 3Graduação, Ciências Biológicas - UFRGS. 4Unidade de Experimentação Animal (UEA), Serviço de Pesquisa Experimental, HCPA-UFRGS. 5Departamento de Medicina Animal, Faculdade de Veterinária (FaVet), UFRGS. 6Departamento de Patologia Clínica Veterinária, FaVet-UFRGS. CORRESPONDENCE: E.O. Cirne-Lima [[email protected] - FAX: +55 (51) 3308-7305]. Faculdade de Veterinária -UFRGS. CEP 91540-000 Porto Alegre, RS, Brazil.
Comparação entre três protocolos de obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP)
utilizando o coelho como modelo experimental
Comparison of Three Protocols to Obtain Platelet Rich Plasma (PRP) with Rabbits as Experimental Model Tuane Nerissa Alves Garcez1,2, Ana Helena da Rosa Paz2, Alessandra Bileski Magrisso2, Helena Flores Mello2,3, Fabiany da Costa Gonçalves2, Fabíola Schons Meyer4, Emerson Antonio Contesini5 & Elizabeth Obino Cirne-Lima2,6
ABSTRACT
Background: Platelet rich plasma (PRP) is a blood-derived source of growth factors and several cytokines, which are essential for tissue regeneration and important for wound healing due to their angiogenic, mitogenic, and chemotactic activities. To date no protocol has been established for PRP production. Standardization of this technique should consider fundamental factors such as experimental model used, blood collection method, anticoagulant choice, rotation and amount of centrifugations, elapsed time between sample activation and its clinical use in order to ensure quality and biological effects of the product. This study aimed to compare three protocols for PRP achievement in order to evaluate platelet en-richment ability and method reproducibility for further use in clinical investigations regarding PRP therapeutic properties. Materials, Methods & Results: New Zealand higid rabbit’s whole blood was collected in tubes containing sodium citrate. Samples were obtained through exsanguination, via abdominal aortic puncture, and separated in four aliquots designed for PRP processing and basal platelet count. The count was conducted at the time blood was collected and after every concentration protocol. Methods were tested in triplicates, and three different individuals repeated each technique for three times, reaching 27 repetitions. Selected methodologies consisted in two centrifugations protocols: protocol A used 250 g for 10 min for the fi rst separation, and another 10 min at 2000 g during the second centrifugation; protocol B proposed that fi rst centrifugation would last 20 min at 160 g, and the second would last 15 min at 400 g, and protocol C consisted of 10 min at 400 g for the fi rst separation, and 10 min at 800 g during second separation. Protocols were performed at the same time in three similar centrifuges, in order to standardize the variables (operator, time, environment, equipments), and also to diminish biases. Comparison objects in this study include: ability of raising platelet concentration, time required for preparing the fi nal product, reproduction handiness, and need for equipment for proper hemoconcentrated production. Achieved platelet count in each protocol and basal value were analyzed following randomized complete. Kurskal-Wallis test was used for independent samples comparison, considering a 5% signifi cance level. For each tested sample, elapsed time for product preparation was evaluated. Subjective analyzes comprehended execution easiness and the need for special material, and were evaluated through questionnaire after each protocol. Protocol A showed a 25-fold increase in platelet count, whereas protocols B and C had 13 and 7-fold, respectively. Results indicate all protocols were effi cient in concentrat-ing the samples at least 3 times more than basal count. Elapsed time for product preparation in each protocol was 35, 52, and 41 min for A, B, and C methods, respectively. Subjective analyzes considered protocols A and C as low complexity, and protocol B was defi ned as medium complexity in regards to execution. With reference to material accessibility for protocols, all were considered of easy reproducibility.
Discussion: Besides analyzing experimental model and most proper way to access blood collection, this study was limited to verify in a quantitative manner the platelet concentration in specifi c protocols, without evaluating their biological effects. Therefore, in regards to proposed objectives - relation between platelet concentration increase, spent time, and easiness of protocol - we conclude that protocol A, formulated by Nagae et al. (2007), was the method that most fi tted the work needs, and greatly suited the challenges posed.
Keywords: regenerative therapy, hemoconcentrado, growing factors, platelets, rabbits.
INTRODUÇÃO
O plasma rico em plaquetas derivado de san-gue autólogo é defi nido como um volume de plasma com uma concentração plaquetária acima dos níveis fi siológicos [9,14]. É uma fonte autógena e de baixo custo de fatores de crescimento (FC) [1,12]. FC são moléculas bioativas fundamentais no reparo e regene-ração de diversos tecidos [7,8,22], capazes de estimular a mitogênese, angiogênese, quimiotaxia, proliferação e diferenciação celular [21,22]. Entre os fatores liberados pelas plaquetas destacam-se: Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF), Fator de Crescimento Transformador Beta (TGF- β), Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e Fator de Crescimento Epitelial (EGF) [14,22].
A literatura pertinente demonstra uma relação linear entre o número de plaquetas e a produção de FCs [5,14,17]. Anitua e colaboradores [2] postularam que concentrações superiores a 300.000 plaquetas/µL já podem ser consideradas PRP, passíveis de alcançar efeito terapêutico.
Este trabalho objetivou a análise comparativa entre três protocolos de obtenção do PRP com o in-tuito de averiguar qual o mais indicado em relação ao enriquecimento plaquetário e reprodutibilidade, para posterior utilização em investigações clínicas contro-ladas sobre a sua atividade terapêutica.
MATERIAIS E MÉTODOS
Obtenção do sangue
Utilizou-se aproximadamente 450 mL de san-gue obtido de seis coelhos Nova Zelândia (Oryctolagus
cuniculus), fêmeas, adultas, entre quatro e cinco meses
de idade e pesando aproximadamente três quilogramas de massa corpórea.
Para realização do procedimento de coleta do maior volume de sangue possível, adotou-se o método de exanguinação por punção da artéria aorta abdo-minal, com os animais sob anestesia geral inalatória com isofl uorano e suporte analgésico pela associação de cloridrato de meperidina (3mg.kg-1) e cloridrato
de cetamina (15mg.kg-1). Com o animal posicionado
em decúbito dorsal, após os cuidados de antissepsia rotineiros, acessou-se a artéria aorta abdominal através
de sódio. O óbito do animal foi ocasionado pelo pro-cedimento de exsanguinação sob anestesia geral. Do conteúdo sanguíneo total (sangue e anticoagulante) medindo aproximadamente 90 mL/animal e transferido para tubos Falcon® de 15 mL, foi separada uma amostra
(50 µL), para contagem plaquetária e demais valores celulares sanguíneos.
O volume sanguíneo restante foi dividido em três alíquotas iguais e encaminhado para o Laboratório de Embriologia e Diferenciação Celular no Centro de Pesquisa Experimental (CPE) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)-UFRGS, para ser submetido ao processo de obtenção do PRP, de acordo com três diferentes protocolos: Nagae et al. [18], Messora et al. [16] e Vendramin et al. [24]. Ressalta-se que as meto-dologias foram escolhidas em virtude de sua citação em periódicos, sendo ainda, factíveis de reprodução com a estrutura disponível em grande parte dos laboratórios de pesquisa. O organograma apresentado na Figura 2 demonstra a sequência de procedimentos realizados após a coleta sanguínea de cada animal.
Preparo do PRP
Os protocolos foram testados em modelo de tri-plicata, com três pesquisadores repetindo cada uma das técnicas por três vezes, em um total de 27 repetições. As metodologias foram realizadas ao mesmo tempo em três centrífugas semelhantes1. Estes cuidados foram
adotados a fi m de padronizar as variáveis (operador, tempo, ambiente, equipamentos) e diminuir os vieses da pesquisa. Os objetos de comparação deste estudo foram: a capacidade de incremento (concentração pla-quetária), tempo necessário para o preparo, praticidade de reprodução e a necessidade de equipamentos para a produção do hemoconcentrado.
Para a análise dos resultados designou-se que o protocolo A, referiu-se à metodologia proposta por Nagae et al. [18]; o protocolo B, ao proposto por Messora et al. [16] e protocolo C, ao estabelecido por Vendramin et al. [24]. Todas as metodologias propostas consistiam em protocolos de dupla centrifugação.
O protocolo A preconizou a primeira centri-fugação a 250 g durante 10 min. Ao seu fi nal, o tubo apresentava três camadas distintas formadas pelas hemácias: - inferior (zona de névoa) composta pelos leucócitos e plaquetas maiores; - intermediária; e
supe-coletada foi novamente centrifugada à 1000 g durante 10 min. Ao fi nal da segunda centrifugação obteve-se a formação de um precipitado (pellet) sedimentado ao fundo do tubo e uma porção de plasma. Coletou-se o pellet e uma fração de 150 µL do plasma, que após homogeneização, formaram o PRP.
A metodologia proposta no protocolo B con-sistiu em uma primeira centrifugação a 160 g durante 20 min. Ao fi nal desta etapa obtiveram-se três frações: células vermelhas do sangue (fundo do tubo), PRP (meio do tubo) e plasma pobre em plaquetas (PPP) (parte superior do tubo). Para a segunda centrifugação, um ponto de seis milímetros foi marcado além da linha divisória existente entre o componente superior e inferior do tubo. Toda a região acima da marcação foi transferida para outros tubos vazios, para nova centrifugação a 400
g por 15 min. Em seguida, separou-se todo o PPP, e a
substância remanescente correspondeu ao PRP.
No protocolo C, a primeira centrifugação foi realizada a 400 g durante 10 min para a obtenção de uma amostra da qual, retirou-se toda a porção plas-mática e a zona de névoa com as quais realizou-se a segunda centrifugação a 800 g por 10 min. Ao fi nal destes procedimentos coletou-se o pellet e dois terços do volume de plasma para homogeinização.
A plaquetometria foi realizada, no momento da coleta do sangue e após cada protocolo de concen-tração, em todas as amostras pelo método automático. Variáveis analisadas
A quantidade de plaquetas alcançadas em cada protocolo e o valor basal (de referência) foram anali-sados segundo delineamento aleatório, com três trata-mentos e nove repetições. Para comparação, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis para amostras independentes e nível de signifi cância de 5%.
Para cada amostra testada as variáveis hora inicial e hora fi nal do procedimento (das quais obteve--se a média em minutos do tempo de preparo) foram anotadas em uma fi cha de avaliação entregue a cada pesquisador.
As análises subjetivas (praticidade de exe-cução e necessidade de materiais especiais) foram respondidas através de questionário objetivo aplicado ao fi nal dos testes. As avaliações foram estabelecidas de acordo com a qualifi cação em três níveis (a saber: difi culdade/complexidade de execução do protocolo graduada em: 1-baixa, 2-média e 3-alta) e quanto à acessibilidade aos materiais necessários à execução da metodologia (graduada em: 1-acessível e 2-de difícil acesso).
Figura 1. A. Demonstração de localização da artéria aorta abdominal
através do acesso pela linha média em porção retro-umbilical de coelho. B. Exposição da artéria aorta abdominal para posterior canulação (a seta preta sinaliza a aorta abdominal e a seta azul a veia cava caudal).
Figura 2. Representação esquemática dos procedimentos realizados após
RESULTADOS Obtenção do sangue
A escolha do coelho como modelo para o estu-do de obtenção e comparação de três diferentes proto-colos de PRP mostrou-se efetiva quanto à possibilidade de coleta de grande volume sanguíneo e facilidade de manuseio. O acesso pela artéria aórta abdominal para a exanguinação resultou em aproximadamente 90 mL de sangue coletado de cada animal. Além de ser um procedimento rápido e acessível, foi capaz de produzir menor perda das amostras por formação de agregados plaquetários e fi brina.
Análise dos protocolos
Os valores relacionados ao potencial de con-centração plaquetária estão mostrados nas Figuras 3, onde é possível constatar que o protocolo A alcançou taxas de incremento em média 26 vezes superiores aos níveis basais, enquanto os protocolos B e C atingiram incremento de 13 e sete vezes, respectivamente. Não houve significância estatística entre as diferenças obtidas pela análise dos protocolos pelo modelo de Kruskal-Wallis para amostras independentes e nível de signifi cância de 5%.
Na avaliação do tempo transcorrido para a produção do material obtivemos uma variação de 35, 52 e 41 min, para o protocolo A, B e C, respectivamen-te. As análises subjetivas (praticidade de execução e necessidade de materiais especiais) consideraram os protocolos A e C de baixa complexidade e o pro-tocolo B foi referido como de média complexidade de execução. Quanto à acessibilidade aos materiais necessários à execução das metodologias, todos os Figura 3. Representação gráfi ca da análise dos protocolos pelo modelo de
Kruskal-Wallis para amostras independentes e nível de signifi cância de 5%. Variáveis indicadas: incremento obtido e protocolo analisado.
DISCUSSÃO
A escolha do modelo para o experimento foi uma das primeiras preocupações dos pesquisadores. Segundo Messora et al. [17], a utilização de modelos experimentais inapropriados fazem com que as análises sobre os efeitos biológicos deste produto sejam difíceis de padronizar.
A maioria dos artigos relacionados a este tema concentra-se em ensaios clínicos utilizando amostras de pacientes humanos e pesquisas expe-rimentais em três espécies animais: coelho, rato e camundongo. Geralmente, ratos e camundongos são os mais utilizados devido à praticidade de obtenção, alojamento, por serem animais resistentes e de baixo custo [6]. No entanto, a decisão pelo uso do coelho foi feita devido ao seu tamanho em relação aos de-mais, visto que possibilita, assim, a coleta de maior volume sanguíneo. Ainda, previsão de possibilidade de obtenção de um PRP autógeno, mantendo o animal com todos os sinais vitais preservados e sem nenhum tipo de comprometimento sistêmico após a coleta. A característica autógena do PRP é importante devido ao risco de rejeição e também à impossibilidade de secreção dos fatores de crescimento derivados dos grânulos plaquetários, em estudos sobre sua efi cácia. Por estes motivos observamos que, tal como outros estudos [4, 14], este parece ser o modelo animal ide-al para a investigação dos protocolos de obtenção e atividade do PRP.
Apesar de alguns autores questionarem a va-lidade da comparação direta do valor proposto para obter um PRP “terapêutico” em humanos e a simples adoção desse valor para outra espécie animal, sobre-tudo pelas diferenças na morfologia dos elementos fi gurados do sangue entre coelhos e humanos, sendo a principal delas o tamanho das plaquetas (5,17 ± 0,46 µm3 para humanos e 4,78 ± 0,26 µm3 para
coe-lhos), neste estudo, partimos de uma etapa inicial que comparou o volume plaquetário médio de coelhos e humanos e a análise destes pelo método automático e por contagem direta. Observamos correlação positiva entre os valores para as duas espécies, bem como também uma equivalência entre os dois métodos analíticos (dados não apresentados). A correlação entre o aumento porcentual médio de plaquetas no
Em relação ao procedimento de coleta, cons-tatamos a partir de ensaios prévios a difi culdade de se obter grandes volumes sanguíneos pela punção cardí-aca após eutanásia. Além do pequeno volume obtido, notamos que muitas destas amostras apresentavam alto índice de agregados plaquetários e formação de fi brina, o que as tornavam inadequadas ao preparo do hemo-concentrado, em desacordo com os resultados obtidos em experimentos de O‘Neill et al. [20]. Dessa forma, optamos por realizar a coleta de um dos grandes vasos, no caso, a aorta abdominal, com o animal sob anestesia geral. Por este acesso foi possível obter maior volume coletado em relação ao obtido por punção cardíaca (aproximadamente 90 mL e 40 mL, respectivamente) e maior qualidade da amostra. Quanto aos fatores re-ferentes ao procedimento cirúrgico, verifi camos que o tempo médio de cirurgia variou entre 10 e 15 min. e o acesso possibilitou facilidade de observação, exposição e canulação da artéria abdominal. Não foram encon-trados trabalhos semelhantes na literatura pertinente a fi m de comparação dos dados sobre a adequação do local e forma de coleta de sangue para preparo do PRP.
Existe ampla variedade de protocolos pro-postos para a produção de pequenas quantidades de PRP com o uso de centrífugas de bancada [1,15]. A escolha por uma determinada metodologia deve ser feita com cautela e muitos detalhes precisam ser leva-dos em consideração. Apesar das discrepâncias entre os protocolos, parece haver um consenso no que se refere à utilização de duas centrifugações. Pesquisas recentes tem demonstrado que estas obtêm maiores concentrações plaquetárias do que àquelas com uma única centrifugação [3,19]. Desta forma, todas as metodologias propostas consistiam em protocolos de dupla centrifugação.
Sobre a capacidade de concentração de cada protocolo testado, foi possível verifi car que o protocolo A apesar de não diferir estatisticamente dos valores obtidos pela reprodução dos demais protocolos - B e C, alcançou taxas de incremento média 26 vezes superiores aos níveis basais, enquanto o segundo atin-giu um aumento de 13 vezes e o terceiro, representando a metodologia com o menor poder de concentração, sete vezes o nível basal. Apesar de o protocolo C ter atingido o menor incremento entre os testados pelos autores, esta concentração é maior que a observada em outros protocolos como o de Anitua [1] e o de Landesberg et al. [11], que não conseguiram chegar a
um aumento de duas vezes a concentração plaquetária no sangue do paciente. Além disso, foi semelhante às concentrações obtidas pelos métodos automatizados, que alcançam níveis um a quatro vezes superiores aos níveis fi siológicos segundo os relatos de Kevy & Jaco-bson [10], estando, ainda, muito próximo ao intervalo terapêutico proposto por Marx [14] que preconiza concentrações entre três e cinco vezes à encontrada no sangue sem nenhuma preparação (um milhão de plaquetas.µl-1 de sangue).
Sobre os aspectos referentes ao tempo ne-cessário ao preparo, calculado pela média entre as amostras de cada protocolo testado, obtida pelas variáveis hora de início do procedimento e hora do fi nal do procedimento, foi observada uma variação de 35, 52 e 41 min, para o primeiro, segundo e terceiro protocolos, respectivamente. Esta característica é importante se levarmos em consideração que para a utilização de um preparado autólogo, em pesquisas que avaliem a capacidade terapêutica do PRP, é fac-tível que os animais objetos do estudo mantenham-se sob anestesia durante o período necessário ao seu preparo. Assim sendo, considerou-se que o menor tempo despendido na confecção seja também um fator a ser analisado. As análises subjetivas - praticidade de execução e necessidade de materiais especiais- ava-liadas por cada pesquisador através de questionário objetivo respondido ao fi nal dos testes, consideraram os protocolos A e C como de baixa complexidade de execução, sendo que o protocolo B foi referido como de média complexidade. A razão desta classifi cação deu-se, segundo os operadores, pela difi culdade em padronizar o volume de plasma recolhido entre a pri-meira e segunda centrifugação, uma vez que o autor preconiza a marcação de um ponto de seis milímetros além da linha divisória existente entre o componente superior e o componente inferior do tubo e a trans-ferência de toda a região acima da marcação para outros tubos para posterior centrifugação. Quanto à acessibilidade aos materiais necessários à execução das metodologias, todos os protocolos testados apre-sentaram materiais de fácil obtenção, ou presentes em qualquer laboratório de pequeno ou médio porte (a saber: capela de fl uxo laminar, centrífuga, tubos de coleta preparados com anticoagulante, seringas,
falcons, ponteiras e pipetas graduadas). Não foram
encontrados dados relevantes para comparação na literatura consultada.
Além da análise do modelo experimental e do acesso mais apropriado à coleta da amostra sanguínea, este trabalho se limitou à verifi cação quantitativa da concentração de plaquetas de um protocolo específi co, sem a avaliação de seus efeitos biológicos, assim, para os objetivos propostos, o protocolo A, preconizado por Nagae et al. [18], mostrou-se o mais adequado, visto que combinou uma alta capacidade de incremento plaquetário à praticidade de execução, enquanto, o segundo protocolo testado apesar de ter proporcionado boa taxa de incremento, não foi considerado como o mais prático de ser reproduzido além de ter necessitado de maior tempo para o seu preparo. A metodologia C, proposta por Vendramin et al. [24], apesar de satisfazer as variáveis subjetivas (facilidade e tempo de execução) apresentou o menor poder de concentração plaquetária.
CONCLUSÃO
O protocolo A, preconizado por Nagae et al. [18] apresentou a metodologia que melhor se adequou aos desafi os propostos neste estudo comparativo.
SOURCE AND MANUFACTURER
1Modelo Centrifuge 5804R, Eppendorf® do Brasil Ltda., São Paulo, Brazil.
Acknowledgements. This work was supported by Fundo de
Incentivo à Pesquisa (FIPE), Hospital de Clínicas de Porto Alegre and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científi co e Tecnológico (CNPq).
Ethical approval. All of the experiments were performed
ac-cording to the Experimental Animal Management Law and Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) and certifi ed by the local Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), Hospital de Clínicas de Porto Alegre, protocol num-ber 11-0359.
Declaration of interest. The authors report no confl icts of
interest. The autors alone are responsible for content and writ-ing of the paper.
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