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Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae): estudo fitoquímico, toxicidade e avaliação do potencial antiinflamatório e antimicrobiano

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Academic year: 2021

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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

RENATO DANTAS DE MEDEIROS

Commiphora leptophloeos (MART.) J.B. GILLETT (BURSERACEAE): ESTUDO

FITOQUÍMICO, TOXICIDADE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTIMICROBIANO

NATAL/RN 2019

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Commiphora leptophloeos (MART.) J.B. GILLETT (BURSERACEAE): ESTUDO

FITOQUÍMICO, TOXICIDADE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTIMICROBIANO

Dissertação de Mestrado apresentada à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner.

NATAL/RN 2019

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Medeiros, Renato Dantas de.

Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae): estudo fitoquímico, toxicidade e avaliação do potencial antiinflamatório e antimicrobiano / Renato Dantas de Medeiros. -2019.

123f.: il.

Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)

-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2019.

Orientadora: Silvana Maria Zucolotto Langassner.

1. Burseraceae - Dissertação. 2. Inflamação - Dissertação. 3. Infecção - Dissertação. 4. Flavonoides - Dissertação. 5.

Procianidinas - Dissertação. I. Langassner, Silvana Maria Zucolotto. II. Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 582.746.36

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De um modo especial e sentido quero agradecer à Profa. Silvana Maria Zucolotto Langassner, que durante a realização deste trabalho tem sido simplesmente incansável, demonstrando sempre disponibilidade para me auxiliar e orientar. Não deixando em esquecimento, uma infindável gratidão por toda amizade, confiança, atenção, compreensão e incentivo. Obrigado pela oportunidade e por me aceitar como orientando por mais 4 anos do doutorado.

Ao Prof. Raphäel Grougnet, por todo o ensinamento e receptividade dada durante o estágio de mestrado na Université Paris Descartes.

A doutoranda Júlia Morais, por todo ensinamento, amizade e confiança. Também, agradeço de coração pela disponibilidade de me ajudar durante todo esse trabalho e principalmente durante o estágio na Université Paris Descartes.

Ao Prof. Matheus Fernandes Pedrosa, pela colaboração que foi fundamental para a realização da avaliação da atividade anti-inflamátoria in vivo.

As doutorandas Allanny Furtado e Manoela Torres, pela ajuda incansável na realização dos experimentos de atividade anti-inflamatória in vivo e durante a escrita do artigo.

À Profa. Gerlane Coelho Bernardo Guerra e ao doutorando Anderson Wilbur pela colaboração e auxílio durante os experimentos ex vivo da atividade anti-inflamatória e de estresse oxidativo

Ao Prof. Wagner Vilegas e a sua doutoranda Ana Zanatta, pelo auxílio durante as análises por espectrometria de massas e de validação.

Ao Prof. Guilherme Chaves e a doutoranda Luanda Souza, pela colaboração nos experimentos da atividade antifúngica.

À Dra. Marylin Lecsö-Borne e ao doutorando Sergio Aguierre, pela realização dos experimentos da atividade antibacteriana.

Ao Prof. Euzébio Guimarães e a mestranda Estela Mariana, pela realização do estudo in sílico.

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Ao prof. Leandro de Santis Ferreira, pela participação na minha banca de qualificação e por todas as conseiderações e correções deste trabalho.

Aos meus colegas de mestrado, Estela Mariana, Luana Carvalho, Paulo Henrique e Valéria Costa que durante a realização deste trabalho sempre me ouviram, me auxiliaram nas disciplinas e me cederam à mão amiga nos dias mais difíceis. A vocês o meu muito obrigado.

Aos meus colegas do laboratório, Barbara Cabral, Emerson Siqueira, Fernanda Santos, Letícia Gondim, Raquel Barbosa e Larissa Marina pela recepção, atenção, carinho e apoio. Na partida levarei saudades, deixando aqui o meu agradecimento a todos pela ajuda e amizade.

À Pro-Reitoria de Pós-Graduação da UFRN, pelos auxílios financeiros concedidos para a realização dos estágios na Université Paris Descartes e na UNESP.

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A espécie Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae) é uma planta nativa do Brasil, pertence ao bioma caatinga e é conhecida popularmente como “imburana-de-espinho” ou “imburana-de-cambão”. Os estudos etnofarmacológicos citam o uso da espécie no tratamento de inflamações e infecções. Dentro deste contexto, o presente estudo objetivou avaliar a toxicidade, a atividade anti-inflamatória e antimicrobiana em ensaios não clínicos in vitro e in vivo dos extratos das folhas e das cascas do caule e isolar, identificar e quantificar os marcadores químicos. No estudo fitoquímico, o extrato hidroetanólico foi preparado por maceração e as frações foram obtidas por particição líquido-líquido (fração diclorometano, acetato de etila-AcOEt e n-butanol-BuOH). O isolamento, a elucidação estrutural e a caracterização das substâncias nos extratos foram realizadas por CPC, CL-EM, FIA-ESI-IT-MS/MS e RMN de 1H e a quantificação dos marcadores nos extratos por CLAE-DAD-ELSD. A toxicidade dos extratos foi avaliada in vitro pelo ensaio de MTT e citometria de fluxo e in vivo pelo teste de toxicidade aguda, via oral. A atividade anti-inflamatória in vitro foi avaliada pelo ensaio de óxido nítrico induzido por LPS e in vivo nos modelos de edema de pata induzido por carragenina e de bolsa de ar induzida por zimosam. A atividade antimicrobiana foi avaliada pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e triagem virtual dos compostos isolados foi realizada por estudos in sílico. Do extrato das folhas, foram isolados 2 flavonoides por CPC e caracterizadas 16 substâncias por espectrometria de massas como ácidos fenólicos, flavonoides glicosilados derivados de quercetina, luteolina, apigenina e taninos condensados derivados de catequina. Do extrato das cascas do caule foram isolados 2 taninos por CPC e caracterizadas 8 substâncias como ácidos fenólicos e procianidinas. O extrato das folhas a 200 µg/mL e o extrato das cascas do caule nas concentrações de 1, 10, 100 e 200 µg/mL demonstraram efeito anti-inflamatório in vitro no ensaio de óxido nítrico induzido por LPS. No modelo de edema de pata induzido por carragenina, o extrato das folhas e das cascas do caule nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg, via oral, reduziu significativamente (p<0,001) o edema seguido da redução da mieloperoxidase (MPO) e no modelo de bolsa de ar induzido por zimosam, nas mesmas doses testadas, reduziram significativamente (p<0,001) a migração celular, a concentração de proteínas totais, a mieloperoxidase (MPO), os níveis de malondialdeído (MDA) e da citocina pró-inflamatória TNF-α e aumentou a produção da citocina anti-inflamatória IL-10. Na avaliação da atividade antimicrobiana, o extrato das cascas do caule e as frações AcOET e BuOH demostraram efeito fungistático e bactericida. O estudo in sílico indicou possíveis ligantes da procianidina dimérica do tipo B e isovitexina relacionados à atividade anti-inflamatória e antimicrobiana. Os resultados obtidos são inéditos para a espécie, justificam seu uso na medicina popular e revelam que os extratos das folhas e das cascas do caule da espécie apresentam um potencial terapêutico para o desenvolvimento de fitoterápicos com propriedades anti-inflamatórias e antimicrobianas.

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The specie Commiphora leptophloeos (Burseraceae) is a native plant from Brazil, belongs to caatinga biome and is known popularly as espinho” and “imburana-de-cambão”. The ethnopharmacology studies mention the use of this specie in the treatment of inflammations and infections. In this context, the present study aimed to evaluate the toxicity, anti-inflammatory and antimicrobial activity in non-clinical in vitro and in vivo assays of leaf and stem bark extracts, and to isolate, identify and quantify chemical markers. In the phytochemical study, the hydroethanolic extract was prepared by maceration and the fractionation was performaded by liquid-liquid partition (dichloromethane, ethyl acetate-AcOEt and n-buthanol-BuOH fractions). Isolation, structural elucidation and characterization of the extracts were performed by CPC, LC-MS, FIA-ESI-IT-MS/MS and 1H NMR and quantification of the content of markers in the extracts was made by DAD and HPLC-ELSD. The toxicity of both extracts was evaluated by MTT and flow cytometry assays and in

vivo by the acute toxicity test. The in vitro anti-inflammatory activity was evaluated using

LPS-induced nitric oxide assay and in viv by carrageenan-induced paw edema and oral zymosan induced air pocket models. The antimicrobial activity was measured by the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and virtual screening of the isolated compounds was performed by in silico studies. From leaves extract, 2 flavonoids were isolated by CPC and 16 compounds were characterized by Mass spectrometry such as phenolic acids, glycosylated flavonoids derivatives of quercetin, luteolin and apigenin, and condensed tannins derivatives of catechin. From the stem bark extract, 2 tannins were isolated by CPC and 8 compounds were characterized as phenolic acids and procyanidins. The leaves extract at 200 µg/mL and stem bark extract at concentrations of 1, 10, 100 and 200 µg/mL demonstrated in vitro anti-inflammatory effect in the LPS-induced nitric oxide assay. In the carrageenan-induced paw edema of model, the extracts of leaves and stem bark at the doses of 100, 200 and 400 mg/kg, by oral route, significantly reduced the edema followed by reduction of myeloperoxidase (MPO) and in the zymosan-induced model of pouch-air, at doses tested, significantly reducing (p < 0.001), cell migration, total protein concentration, myeloperoxidase (MPO), and malondialdehyde (MDA) and the proinflammatory cytokine TNF-α and increased the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10. In the evaluation of the antimicrobial activity, the extracts of the barks and the AcOET and BuOH fractions at concentrations of 20 to 100 μg/mL demonstrated a fungistatic and bactericidal effect. The in silico study indicated possible ligands of type B dimeric procyanidin and isovitexin related to anti-inflammatory and antimicrobial activity. The results obtained are unprecedent for the specie, justify its use in folk medicine and reveals that extracts of leaves and stem bark have a therapeutic potential for the development of herbal products with anti-inflammatory and antimicrobial properties.

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Figura 1 – Commiphora leptophloeos. ... 21 Figura 2 – Perfil fitoquímico por CCD dos extratos hidroetanólico (EH) e aquosos das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos... 47 Figura 3 – Cromatograma do EH das folhas de C. leptophloeos por CLAE-DAD. ... 49 Figura 4 – Espectros de UV do EH das folhas de C. leptophloeos. ... 49 Figura 5 – Cromatograma do EH das cascas do caule de C. leptophloeos por CLAE-DAD. .. 50 Figura 6 – Espectro de UV do EH das cascas do caule de C. leptophloeos. ... 50 Figura 7 – Espectro de massas de primeira-ordem, em full-scan, no modo negativo, do EH das folhas de C. leptophloeos. ... 51 Figura 8 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 191, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 52 Figura 9 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 191, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 53 Figura 10 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 447, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 54 Figura 11 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 483, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 55 Figura 12 – Íons de produtos formados pelas eliminações na EHxose ligada as posições 6-C ou 8-C da aglicona. ... 56 Figura 13 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 431, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 56 Figura 14 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 551, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 57 Figura 15 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 615, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 58 Figura 16 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 623, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 59 Figura 17 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 639, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 60 Figura 18 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 289, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 60

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Figura 20 – Proposta de fragmentação para a procianidina dimérica do tipo B. ... 62 Figura 21 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 865, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 63 Figura 22 Espectro de massas do íon precursor de m/z 1153, em modo negativo com energia de colisão 30 eV. ... 64 Figura 23 – Espectro de massas de primeira-ordem, em full-scan, no modo negativo, do EH das cascas do caule de C. leptophloeos. ... 65 Figura 24 – Espectro de massas de primeira-ordem, em full-scan, no modo negativo, da fração BuOH das cascas do caule de C. leptophloeos. ... 66 Figura 25 – Cromatograma do EH das folhas de C. leptophloeos por LC-MS/MS. ... 67 Figura 26 – Cromatograma do EH das cascas do caule de C. leptophloeos por LC-MS/MS. . 68 Figura 27 – Esquema representativo do fracionamento e isolamento guiado pelo efeito

antimicrobiano do EH das cascas do caule. ... 71 Figura 28 – Espectro de RMN de 1H de quercitrina (MeOD, 400 MHz). ... 73 Figura 29 – Espectro de RMN de 1H de isovitexina (MeOD, 400 MHz)... 74 Figura 30 – Cromatograma por CLAE-DAD do EH das folhas e padrão isovitexina de C. leptophloeos. UV= 340 nm. ... 78 Figura 31 – Curva analítica da linearidade para isovitexina ... 79 Figura 32 – Cromatograma por CLAE-ELSD do EH das folhas e do padrão procianidina dimérica do tipo B de C. leptophloeos. ... 82 Figura 33 – Curva analítica da linearidade para procianidina dimérica do tipo B. ... 83 Figura 34 – Potencial inibitório de óxido nítrico (NO) estimulado por LPS dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos... 85 Figura 35 – Avaliação dos EH das folhas Cl(L) e das cascas do caule Cl(B) de C. leptophloeos

no modelo edema de pata induzida por carragenina... 86 Figura 36 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na atividade da MPO no modelo edema de pata induzido por carragenina. ... 88 Figura 37 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na migração leucocitária a partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam. ... 89 Figura 38 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos nos níveis de proteínas a partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam. ... 90

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Figura 40 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na atividade da MPO dos exsudatos da bolsa de ar. ... 92 Figura 41 – Ensaio de MTT realizado com macrófagos (RAW264.7). ... 106

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Quadro 1 – Estudos etnobotânicos de Commiphora leptophloeos...24 Quadro 2 – Composição química de Commiphora leptophloeos...26 Quadro 3 – Atividades farmacológicas de Commiphora leptophloeos...28

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Tabela 1 – Triagem fitoquímica qualitativa por reações químicas para detecção de metabólitos secundários presentes nos extratos das folhas e das cascas de C. leptophloeos. ... 47 Tabela 2 – Substâncias identificadas no EH das folhas de C. leptophloeos por LC-MS/MS. . 67 Tabela 3 – Substâncias identificadas no extrato das cascas do caule de C. leptophloeos por LC-MS/MS. ... 68 Tabela 4 – Substâncias identificadas no EH das folhas de C. leptophloeos por LC-MS/MS e FIA-ESI-IT-MS/MS. ... 69 Tabela 5 – Substâncias identificadas no EH das cascas do caule de C. leptophloeos por LC-MS/MS e FIA-ESI-IT-LC-MS/MS. ... 69 Tabela 6 – Sistemas de solventes de duas fases por CPC para o EH das folhas. ... 70 Tabela 7 – Sistemas de solventes de duas fases por CPC para o EH das folhas. ... 71 Tabela 8 – Índices de similaridade espectral entre os espectros de UV de isovitexina e dos picos 7 e 8 do EH das folhas obtidos por HPLC-DAD ... 79 Tabela 9 – Parâmetros de validação do método analítico para isovitexina. ... 79 Tabela 10 – Concentração das substâncias presentes no EH das folhas de C. leptophloeos.... 80 Tabela 11 – Precisão do método analítico. ... 80 Tabela 12 – Parâmetros de validação do método da procianidina dimérica do tipo B... 83 Tabela 13 – Concentração de procianidina dimérica do tipo B no EH das cascas do caule de C. leptophloeos. ... Erro! Indicador não definido. Tabela 14 – Concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos e frações das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos. ... 96 Tabela 15 – Concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos, frações e isolado de C. leptophloeos frente a cepas clínicas e de referência de fungos. ... 102 Tabela 16 – Principais resultados da Triagem virtual baseada em ligante para procianidina dimérica do tipo B. ... 104 Tabela 17 – Principais resultados da Triagem virtual baseada em ligante isovitexina. ... 105 Tabela 18 – Fases do ciclo celular em macrófagos (RAW 264.7) tratados com EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos. ... 107 Tabela 19 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos no peso

corporal e peso corporal relativo em camundongos tratados por via oral. ... 109 Tabela 20 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos nos parâmetros bioquímicos em camundongos tratados por via oral. ... 109

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AcOET Acetato de Etila ANOVA Análise de Variância

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ASD Ágar Sabourand Dextrose

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adenosina Trifosfato

BSA Albumina Bovina

BuOH n-butanol

C-18 Fase Reversa Octadecilsilano

C3H6O Acetona

Car Carragenina

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CHCl3 Clorofórmio

CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao Detector de Arranjo de Diodos

CLAE-ELSD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao Detector Evaporativo de Espalhamento de Luz

CL-EM Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada ao Espectrômetro de Massas

CONCEA Conselho Nacional de Experimentação Animal

COX-1 Ciclo-oxigenase 1

COX-2 Ciclo-oxigenase 2

d Dubleto

dd Duplo dubleto

Dex Dexametasona

DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco's EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

DMSO Dimetilsulfóxido

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA Ensaio de Imunoabsorção Enzimática

FDA Food Drug Administration

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Fr.Aq Fração aquosa Fr.BuOH Fração butanólica Fr.EtOAc Fração acetato de etila

H2O Água

EH Extrato Hidroetanólico

ICH Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos para o Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano

IL-1 β Interleucina-1β IL-2 Interleucina-2 IL-6 Interleucina-6 IL-8 Interleucina-8 IL -10 Interleucina-10 LPS Lipopolissacarídeos m Multipleto m/z Relação Massa/Carga MDA Malonaldeído MeOH Metanol MHC Caldo Mueller-Hinton MMP-2 Metaloproteinase-2 MMP-9 Metaloproteinase-9 MPO Mieloperoxidase MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NF-kB Fator Nuclear Kappa B

Nk Células Natural Killer

OECD Guideline For Testing of Chemicals

OMS Organização Mundial de Saúde

PBS tampão fosfato-salino

PGE-2 Prostaglandina 2

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

s Singleto

Sal Solução salina

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UFC Unidades Formadoras de Colônia UFPE Universidade Federal do Pernambuco

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

UNESP Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"

UV Ultravioleta

v.o. Via oral

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1 INTRODUÇÃO ... 17

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 19

2.1 PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS E INFECCIOSAS ... 19

2.2 Commiphora leptophloeos (MART.) J.B. GILLETT (BURSERACEAE) ... 21

2.2.1 Dados botânicos ... 21

2.3 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO ... 22

2.3.1 Estudos etnobotânicos de Commiphora leptophloeos ... 22

2.3.2 Constituintes químicos de Commiphora leptophloeos ... 24

2.3.3 Atividades farmacológicas de Commiphora leptophloeos ... 26

3 OBJETIVOS ... 29

3.1 OBJETIVO GERAL ... 29

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 29

4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 30

4.1 MATERIAL VEGETAL ... 30

4.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO CAULE DE C. leptophloeos ... 30

4.3 ANÁLISES FITOQUÍMICA QUALITATIVA DOS EH DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO CAULE DE C. leptophloeos ... 31

4.3.1. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ... 31

4.3.2 Análise para a detecção de compostos fenólicos ... 31

4.3.3 Análise para a detecção de taninos ... 31

4.3.4 Análise para a detecção de flavonoides ... 32

4.3.5 Análise para a detecção de saponinas ... 32

4.3.6 Análise para a detecção de alcaloides ... 32

4.4 PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DO EXTRATO DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO CAULE DE C. leptophloeos ... 33

4.5 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO ... 33

4.5.1 Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC) ... 33

4.6 IDENTIFICAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS iSOLADAS ... 34

(18)

4.7 validação do método por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e ao detector evaporativo de espalhamento de luz

(CLAE-ELSD) ... 36

4.7.1 Condições cromatográficas ... Erro! Indicador não definido. 4.8.1 Animais de experimentação ... 37

4.8.2 Modelo de edema de pata induzido por carragenina ... 37

4.8.3 Modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ... 38

4.9 ANÁLISE BIOQUÍMICA DA INFLAMAÇÃO E ESTRESSE OXIDATIVO ... 39

4.9.1 Ensaio da enzima mieloperoxidase (MPO) a partir dos modelos de edema de pata induzido por carragenina e bolsa de ar induzido por zimosam ... 39

4.9.2 Ensaio de malondialdeído (MDA) dos exsudatos da bolsa de ar ... 40

4.9.3 Determinação de proteínas totais dos exsudatos da bolsa de ar ... 40

4.9.4 Quantificação das citocinas TNF-α e IL-10 dos exsudatos da bolsa de ar ... 40

4.9.5 Ensaio de migração leucocitária total e diferencial dos exsudatos da bolsa de ar .. 41

4.9.6 Ensaio de inibição de óxido nítrico (NO) in vitro ... 41

4.10 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE in vitro E in vivo ... 41

4.10.1 Ensaio de MTT ... 41

4.10.2 Ciclo celular ... 42

4.11 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ... 43

4.11.1 Avaliação da atividade antibacteriana ... 43

4.11.2 Avaliação da atividade antifúngica ... 43

4.12 ESTUDO in silico ... 44

4.12.1 Triagem virtual invertida baseada em ligante ... 44

4.12.1.1 Procianidina dímero do tipo B ... 44

4.12.1.2 Isovitexina ... 44

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 46

5.1 ESTUDO FITOQUÍMICO ... 46 5.1.1 Análise fitoquímica dos extratos das folhas e das cascas do caule C. leptophloeos 46

(19)

5.4 isolamento e elucidação estrutural dos compostos dos EH das folhas e das cascas do

caule de C. leptophloeos ... 70

5.4.3 Identificação e elucidação estrutural dos compostos isolados ... 72

5.4.1 Desenvolvimento do método analítico por CLAE-DAD para análise do EH das folhas de C. leptophloeos ... 77

5.4.2 Análise da seletividade do método e quantificação de isovitexina e das substâncias majoritárias do EH das folhas de C. leptophloeos ... 78

5.15.5 Análise da seletividade do método e quantificação da substância majoritária no EH das folhas de C. leptophloeos ... 82

5.5.1. Inibição da produção de Óxido Nítrico (NO) ... 84

5.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA in vivo... 85

5.6.1. Edema de pata induzida por carragenina ... 85

5.3.2 Bolsa de ar induzido por zimosam ... 88

5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA in vitro ... 94

5.3.1. Avaliação da atividade antibacteriana dos extratos EH das folhas e das cascas do caule, das frações butanólicas e compostos isolados de C. leptophloeos ... 94

5.3.1. Avaliação da atividade antifúngica dos EH das folhas e das cascas do caule e das frações butanólicas e composto isolado de C. leptophloeos ... 100

5.4 ESTUDO in silico ... 103

5.4.1 Triagem virtual baseada em ligante para o composto isolado procianidina dimérica do tipo B ... 103

5.4.2 Triagem virtual baseada em ligante para o isolado isovitexina ... 105

5.4 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE in vitro E in vivo ... 106

5.4.1 Ensaio de MTT em macrófagos (RAW 264.7) ... 106

5.4.2 Avaliação da Toxicidade Aguda ... 108

6 CONCLUSÕES ... 110

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 112 APÊNCIDE A – MANUSCRITO DA PUBLICAÇÃO ... Erro! Indicador não definido. ANEXO A ... Erro! Indicador não definido.

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1 INTRODUÇÃO

A medicina popular no Brasil é derivada de uma mistura de culturas indígenas brasileiras, europeias e africanas e é caracterizada pelo conhecimento tradicional relacionado ao uso popular de plantas medicinais que surgem como alternativa a terapias associadas ao tratamento de doenças, através da percepção do seu poder curativo. No entanto, muitas espécies são usadas de forma equivocada, sem respaldo científico quanto à eficácia e segurança, o que demonstra que em um país como o Brasil, com enorme biodiversidade e uma riqueza de conhecimentos tracionais, existe uma lacuna entre a oferta de plantas e as poucas pesquisas (CARTAXO, 2010; GIRALDI; HANAZAKI, 2010).

Nos últimos anos, a pesquisa etnobotânica cresceu de forma significativa e vem despertando cada vez mais o interesse de pesquisadores em estudos com Produtos Naturais de origem vegetal, que possam ser utilizados tanto como farmacógenos no tratamento e cura de patologias, como também, na descoberta de novas substâncias bioativas (OTIMENYIN, 2018). Nesse sentindo, o bioma caatinga se destaca devido à rica diversidade da sua flora que ainda é pouco explorada quanto aos seus potenciais farmacológicos e como fonte de matéria prima, permitindo assim, estudos que interliguem áreas multidisciplinares, como por exemplo, farmacologia, fitoquímica e a biotecnologia, que juntas podem ser uma excelente ferramenta para auxiliar na descoberta de novos fitoterápicos (MACIEL et al., 2002).

O desenvolvimento de novos fitoterápicos constitui uma importante fonte de inovação em saúde com a inclusão de novas alternativas terapêuticas. A RDC Nº 26, de maio de 2014 define fitoterápicos como medicamentos obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais cuja segurança e eficácia sejam baseadas em evidências clínicas e que sejam caracterizados pela constância de sua qualidade. Com o propósito da inserção da fitoterapia no Sistema Único de Saúde (SUS), o Ministério da Saúde vem desenvolvendo ações para implementar novas políticas públicas voltadas à introdução do uso de plantas medicinais e da fitoterapia no SUS e que ocorra o desenvolvimento do setor, em toda a cadeia produtiva (BRASIL, 2006).

A padronização de extratos vegetais é uma etapa primordial no desenvolvimento de novos fitoterápicos e deve ser realizado com base no teor de uma substância marcadora presente no extrato, indicando que se a mesma estiver presente em quantidade apropriada também os demais componentes estarão igualmente representados (BRASIL, 2017; DAVID; NASCIMENTO; DAVID, 2004). Nesse contexto, torna-se imprescindível a determinação das substâncias marcadoras nos extratos da espécie. A RDC Nº 26/2014 define marcador como composto ou classe de compostos químicos presentes na matéria-prima vegetal tendo

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preferencialmente correlação com o efeito terapêutico. Logo, se faz necessário o isolamento e a identificação dos constituintes ativos e o desenvolvimento de métodos analíticos que garantam a segurança, qualidade e consequentemente a eficácia, colaborando assim com o controle de qualidade da matéria-prima vegetal e da produção de fitoterápico (s) (BRASIL, 2014).

A espécie Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae) é nativa do Brasil, pertence ao bioma caatinga, é da família Burseraceae e do gênero Commiphora. A família Burseraceae é encontrada principalmente na região Norte, Nordeste e Centro-Oeste do Brasil e é formada por aproximadamente 600 espécies distribuídas entre 20 gêneros, de porte arbóreo, raramente arbustos, que possuem óleos essenciais aromáticos e resina na casca. As folhas são alternas, em espiral ou dística, compostas, pinadas, ternadas ou unifolioladas. É uma família de distribuição pantropical, mas apresenta a maior riqueza de espécies na América do Sul (DALY, 1987; WATSON; DALLWITZ, 1991). O gênero Commiphora possui 208 espécies, distribuída por toda América do Sul, embora a maior parte das espécies seja encontrada no Nordeste do Brasil (CARVALHO, 2009).

A espécie Commiphora leptophloeos é conhecida popularmente como “imburana-de-espinho” ou “imburana de cambão” e as folhas, flores, frutos e o látex são utilizados no tratamento de problemas renais, gripe, tosse, bronquite, disfonia, inflamações em geral, odontalgia, cólica, diarreia, antiemético e como tônico (ALBUQUERQUE et al., 2007), enquanto que as cascas do caule são utilizadas no tratamento de gripe, tosse, bronquite, doenças urinárias e hepáticas, gastrite, úlceras vaginais, cicatrização de feridas, infecções e inflamações em geral (AGRA et al., 2007a; CARVALHO, 2009).

Embora seja uma espécie amplamente utilizada na medicina popular, não há evidência científica para apoiar o uso tradicional dessa espécie em relação a doenças inflamatórias e infecciosas e a pesquisa nestas áreas é de grande importância, uma vez que aumentaria as opções terapêuticas, fortalecendo a cadeia de produção de um possível fitoterápico que possa ser desenvolvido com essa espécie.

Diante da relevância etnofarmacológica e da escassez de pesquisas com essa espécie e considerando a importância das plantas medicinais como fonte para descoberta de novos medicamentos, neste trabalho foi realizado o estudo fitoquímico com objetivo de isolar e caracterizar os marcadores químicos, bem como avaliar a toxicidade e as atividades antimicrobiana e anti-inflamatória in vitro e in vivo dos extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule de Commiphora leptophloeos.

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2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS E INFECCIOSAS

Desde as primeiras civilizações, baseado no conhecimento empírico acumulado pelos povos primitivos e indígenas, as plantas medicinais, certamente por possuírem uma matriz complexa de moléculas biotivas, tem sido usadas para combater múltiplas doenças graves, incluindo infecções microbianas e inflamações crônicas como a diabetes, obesidade, osteoporose, artrite reumatoide, distúrbios do sistema nervoso central, doenças intestinais e o câncer (JAN et al, 2017; KUNNUMAKKARA et al., 2018).

As infecções microbianas são caracterizadas pela presença de células vivas estranhas (micro-organismos) nos órgãos ou partes do corpo. Dependendo dos órgãos, se a invasão desses micro-organismos não for controlada, resultará na morte da célula hospedeira (humana) e na perda de função do órgão envolvido. Como resposta a presença desses micro-organismos, os tecidos recrutam macrófagos com o objetivo de combatê-los. No processo de recrutamento ocorre a liberação de mediadores inflamatórios. Sendo assim, a inflamação pode ser considerada como um processo primário no qual o sistema imunológico reage contra um agente infeccioso (OTIMENYIN, 2018; SENGUPTA; GAURAV; TIWARI, 2018).

A ocorrência de múltiplos micro-organismos resistentes tem aumentado a taxa de morbidade e mortalidade, consequentemente, elevando os custos de tratamentos. Considerando também que os medicamentos sintéticos antimicrobianos apresentam uma série de efeitos adversos e que muitas vezes os efeitos colaterais podem sobrepor os efeitos terapêuticos, a busca por substâncias bioativas capazes de combater o agente agressor e consequentemente interferir no processo inflamatório tem sido de grande importância na pesquisa científica, incentivando cada vez mais pesquisadores na busca por novos fármacos efetivos com o mínimo de efeitos colaterais (CAMPANIÇO; MOREIRA; LOPES, 2018; VIEIRA, 2015).

Nesse contexto, as plantas medicinais se destacam por ser uma fonte de substâncias bioativas com efeito antimicrobiano e/ou anti-inflamatório, atuando principalmente na eliminação do agente infeccioso e/ou na inibição dos mediadores inflamatórios e apresentarem menores efeitos adversos e menor custo quando comparadas com os medicamentos sintéticos (SENGUPTA; GAURAV; TIWARI, 2018).

As plantas medicinais com efeitos antimicrobiano e/ou anti-inflamatório são frequentemente usadas na medicina tradicional de forma equivocada. A redução da inflamação em muitos casos não está associada à cura total da doença. Por exemplo, se a

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causa da inflamação for uma infecção microbiana, será necessário uso de antimicrobianos associados a anti-inflamatórios. Na medicina tradicional, é comum os pacientes terem a sensação de cura devido à redução do processo inflamatório e por isso um diagnóstico prévio é de grande importância. A incapacidade de algumas plantas de não terem um efeito anti-inflamatório associado a um efeito antimicrobiano gera riscos para os pacientes, uma vez que as infecções podem progredir tornando-se crônica e com manifestações sistêmicas, isto é, comprometendo vários órgãos e levando o paciente em alguns casos até a morte (OTIMENYIN, 2018).

Diante disso, o objeto de estudo deste trabalho é a espécie Commiphora leptophloeos, cujas folhas e as cascas do caule são amplamente utilizadas na medicina popular no tratamento de problemas inflamatórios e infecciosos. No entanto, não há evidência científica que forneçam embasamento científico ao uso tradicional dessa espécie em relação a doenças inflamatórias e infecciosas (ALBUQUERQUE et al., 2007; MACEDO et al., 2018). Como base nessas informações, surgiram as hipóteses deste trabalho: a ação da planta pode ser por mecanismos anti-inflamatórios e/ou antimicrobianos, ou, é possível que a espécie tenha um efeito anti-inflamatório e não tenha efeito antimicrobiano, diminuindo assim a inflamação, mas não sendo capaz de combater o agente agressor, no caso de uma infecção. Portanto, estudos farmacológicos que comprovem a eficácia pré-clínica e que compare as partes da planta utilizadas na medicina tradicional são de grande relevância clínica.

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2.2 Commiphora leptophloeos (MART.) J.B. GILLETT (BURSERACEAE) 2.2.1 Dados botânicos

A espécie Commiphora leptophloeos, nativa do Brasil, pertencente ao bioma caatinga, é conhecida popularmente como “imburana-de-espinho” ou “imburana de cambão”. Seu nome popular é derivado das palavras em tupi y-mb-ú (árvore de água) e ra-na (falso), que significa “falso imbu” (CARVALHO, 2009).

A espécie pertence ao grupo Angiospermae, classe Eurosídeas II, ordem Sapindales, família Burseraceae e gênero Commiphora. Possui como sinonímias Bursera martiana Engl., Bursera orinocensis Engl. e Bursera leptophloeos Mart.. Tem ocorrência principalmente na região Nordeste do Brasil (Rio Grande do Norte, Paraíba, Ceará, Pernambuco, Bahia, Alagoas, Sergipe e Maranhão) como também em alguns outros estados como Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e na Bolívia. C. leptophloeos é uma árvore espinhosa de grande porte, podendo atingir até 12 metros de altura na idade adulta. Possui o tronco tortuoso com espinhos agudos e fortes, suas cascas são moderadamente espessas, amareladas quando jovens e vermelhas quando adultas. As folhas são alternas, de coloração verde clara-rosadas quando bem jovens, compostas, imparipinadas, com três a nove folíolos ovais, medindo de 1,5 cm a 3,5 cm de comprimento. As flores são pequenas, de coloração verde clara, medindo de 3 mm a 4 mm de comprimento. O fruto é um drupóide do tipo filotrimídio, de cor verde, medindo cerca de 1,5 cm de diâmetro e a semente é rígida, rugosa, de cor escura e com diâmetro maior que 1 cm (CARVALHO, 2009).

Figura 1 – Commiphora leptophloeos.

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2.3 ESTUDOS ETNOFARMACOLÓGICOS, FARMACOLÓGICOS E QUÍMICOS

Os estudos etnofarmacológicos destacam a relevância da espécie Commiphora leptophloeos na medicina tradicional e chama atenção para a realização de estudos químicos e farmacológicos que possam justificar o seu uso, uma vez que os estudos descritos na literatura são escassos (AGRA et al., 2007a; ALBUQUERQUE et al., 2007; MACEDO et al, 2018). Dessa forma, foi realizado um levantamento bibliográfico acerca dos estudos etnofarmacológicos, químicos e farmacológicos da espécie.

2.3.1 Estudos etnofarmacológicos de Commiphora leptophloeos

Na medicina popular as partes da planta mais utilizadas são as cascas do caule e as folhas. Entretanto, também é descrito o uso das raízes, flores, frutos, sementes e do látex. As formas de preparo variam entre a maceração, decocção, infusão e xaropes e a forma de administração é por via oral e/ou tópica (AGRA et al., 2007a; AGRA et al., 2007b; ALBUQUERQUE et al., 2007; CARTAXO et al., 2010; MACEDO et al, 2018). As cascas do caule, folhas e frutos são usadas para o tratamento de tosse, bronquite, inflamação, infecção, cicatrização, edemas, mordida de cobra, lesões em diabéticos, sinusite, dor de barriga, ferida, rins, rouquidão, gastrite, úlcera, dor de dente, asma, coriza, dor de garganta, dor generalizada e como tônico (AGRA et al., 2007a; AGRA et al., 2007b; ALBUQUERQUE et al., 2007; CARTAXO et al., 2010; RIBEIRO et al, 2017; MACEDO et al, 2018). As flores e o látex são usados para o tratamento de problemas renais, gripe, tosse, bronquite, disfonia, inflamações em geral, odontalgia, cólica, diarreia e como antiemético e tônico (ALBUQUERQUE et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2007) e as sementes para tratar a insônia (RODRIGUES et al, 2008). O Quadro 1 resume o uso popular dessa espécie.

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Quadro 1 – Estudos etnobotânicos de Commiphora leptophloeos. Parte da

planta

Uso popular Preparação e via de

administração

Referências

Cascas do caule

Utilizado no tratamento de gripe, tosse, bronquite, tratamento de doenças urinárias e hepáticas. Além disso, uso externo contra úlceras vaginais

Decocção de um punhado em um 1 L de água e feito com açúcar como xarope. Beber uma colher de 5 a 6 vezes por dia

Agra et al., 2007a.

Cascas do caule

Tratamento de gripe, tosse e bronquite

Decocção de um punhado em um 1 L de água e feito com açúcar como xarope. Beber uma colher de 5 a 6 vezes por dia

Agra et al., 2007b.

Folha, flor, fruto, látex e cascas

Problemas renais, gripe, tosse, bronquite, disfonia, inflamações em geral, odontalgia, cólica, diarréia, antiemético, tônico e cura

ND

Albuquerque et al., 2007.

Cascas Tratamento de ferimentos Maceração. Banho Roque et al, 2010.

Sementes Tratamento de insônia Decocção e ingerir Rodrigues et al, 2008. Casca do

caule

Doenças do estômago, enjôo e tosse, como tônico e cicatrizante no tratamento de feridas, gastrite e úlcera. Também é indicado contra tosses, bronquites e inflamações do trato urinário

Infusão, decocção, xarope e garrafada

Carvalho, 2009.

Casca do caule

Tratamento de influenza, dor de estômago e cura

Decocção e maceração (Beba ou lave o local afetado)

Cartaxo et al., 2010.

ND

Tratamento de inflamação de

garganta, dente e útero ND

Ferreira-Júnior; Ládio;

Albuquerque, 2011.

Folhas Tratamento de tosse Infusão Ribeiro et al,

2017. Casca do caule, casca interna do caule, folha e fruto

Tratamento de tosse, bronquite, inflamação, infecção, cicatrização, edemas, mordida de cobra, lesões em diabéticos, sinusite, dor de barriga, ferida, rins, rouquidão, gastrite, úlcera, dor de dente, asma, coriza, dor de garganta, dor generalizada e tônico

Xarope, decocção,

maceração, infusão e banho Macedo et al, 2018.

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2.3.2 Constituintes químicos de Commiphora leptophloeos

Os estudos acerca dos constituintes químicos da espécie ainda são escassos na literatura e a maior parte deles estão relacionados com a triagem fitoquímica qualitativa e são limitados apenas para as cascas do caule e das folhas. Para as cascas, a partir de uma triagem fitoquímica foi detectada a presença de compostos fenólicos, taninos, antocianina, flavonoides, saponinas, alcaloides e albuminas (ARAÚJO et al., 2008; CLEMENTINO et al., 2016; LIMA et al, 2017; VIEIRA et al., 2015). Também, a partir de uma análise por MALDI-TOF-MS/MS do extrato aquoso das cascas do caule foram identificados taninos condensados formado principalmente por séries poliméricas de prorobinetinidina do tipo B e profisetinidina do tipo A (TRENTIN et al., 2013). Posteriormente, um único estudo de isolamento foi encontrado, no qual foi isolado uma hinoquinina a partir do extrato clorofórmico das cascas do caule e foi identificados por CLAE-DAD a presença de ácido gálico, ácido clorogênico e ácido protocatequico (PEREIRA et al., 2017).

Para as folhas, foi realizado um doseamento de flavonoides e taninos totais do extrato aquoso. Também, a partir do óleo essencial foi identificado por CG-MS a presença de terpenos caracterizados como α-phellandrene, (E)-caryophyllene, β-phellandrene, α-himulene e germacrene-D (LIMA et al, 2017; SILVA et al., 2015). Vale salientar que nenhum estudo de isolamento e caracterização das folhas para a espécie é descrito na literatura. O Quadro 2 resume os constituintes químicos relatado para espécie.

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Quadro 2 – Composição química de Commiphora leptophloeos.

Legenda: ND: Não descrito. Fonte: Autoria própria.

Parte da Planta

Classificação Composto Análise e tipo de extrato Referências Cascas Flavonoides e taninos ND Doseamento de flavonoides e taninos totais Araújo et al., 2008. Cascas Polifenóis, cumarinas, esteroides e terpenos ND Análise por CLAE-DAD do extrato aquoso Trentin et al., 2011.

Cascas Taninos proantocianidinas

Análise por MALDI-TOF-MS/MS do extrato aquoso Trentin et al., 2013. Cascas Compostos fenólicos, taninos, antocianinas, flavonoides, saponinas, alcaloides e albuminas ND Triagem fitoquímica qualitativa do extrato etanólico Vieira et al., 2015. Folhas

Terpenos α-phellandrene, (E)-caryophyllene, β-phellandrene, α-himulene e germacrene-D Análise por CG/MS da extração do óleo por hidrodestilação Silva et al., 2015. Cascas Compostos fenólicos, taninos, antocianina, flavonoides, saponinas, alcaloides e albuminas ND Triagem fitoquímica qualitativa Clementino et al., 2016.

Cascas Ácidos orgânicos e lignana

Ácido gálico, ácido clorogênico, ácido protocatequico e hinoquinina Análise por HPLC-DAD e RMN do Extrato clorofórmico Pereira et al., 2017. Folhas Flavonoides e taninos ND Doseamento de flavonoides e taninos totais Lima et al, 2017.

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2.3.3 Atividades farmacológicas de Commiphora leptophloeos

Os trabalhos que avaliaram as atividades farmacológicas da espécie ainda são escassos na literatura, e na sua maior parte, estão relacionados à atividade antimicrobiana. Todos os estudos são ensaios não clínicos in vitro. Vale destacar que não há trabalhos na literatura que avaliaram as atividades farmacológicas in vivo ou em ensaios clínicos com a espécie. Quanto aos estudos encontrados, foi avaliada a atividade antimicrobiana do extrato aquoso das cascas do caule contra S. epidermidis e P. aeruginosa que mostraram atividade bactericida (4,0 mg/mL) e bacteriostática (1,0 mg/mL) e redução de 15,3% e 32,7% na formação de biofilme, respectivamente (TRENTIN et al., 2011; TRENTIN et al., 2013). O extrato etanólico das cascas do caule também apresentou atividade bactericida contra S. aureus na concentração de 125 μg/mL. Posteriormente, avaliaram os extratos metanólico, clorofórmico, ciclohexanico e acetato de etila das cascas do caule que mostrou efeito bacteriostático contra S. aureus, S. faecalis, B. subtilis, E. faecalis, M. luteus P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae, M. smegmatis e M. tuberculosi e fungistático contra Aspergillus sp. e C. albicans nas concentrações variando de 0,098 a 50 mg/mL. Ainda foi avaliado um composto isolado, uma hinoquinina, obtido do extrato clorofórmico das cascas do caule, que apresentou efeito bactericida e bacteriostático contra cepas clínicas de S. aureus nas concentrações variando de 0,0485 a 3,125 mg/mL (PEREIRA et al., 2017). Vale salientar, que não há estudos na literatura que avaliaram a atividade antimicrobiana dos extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule, bem como suas frações e compostos isolados contra cepas clínicas de uma variedade considerável de diferentes espécies de fungos e bactérias.

A citotoxicidade dos extratos aquoso, metanólico, clorofórmico, hexanico e acetato de etila das cascas do caule foi avaliada pela atividade hemolítica e os resultados mostraram que os extratos não causaram hemólise (PEREIRA et al., 2017). Também, outro estudo avaliou a toxicidade aguda sobre náuplios de Artemia salina do extrato etanólico das cascas do caule que se mostrou moderadamente tóxico (CLEMENTINO et al., 2016).

Para as folhas, apenas um trabalho foi encontrado na literatura em que avaliou o efeito de dissuasão para oviposição contra Aedes aegypti do óleo essencial e os resultados mostraram uma boa atividade larvicida (LC50 = 99,4 ppm) (SILVA et al., 2015). O quadro 3

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Quadro 3 – Atividades farmacológicas de Commiphora leptophloeos. Parte da

planta Extrato Modelo Resultados Referências

Atividade antimicrobiana

Cascas do

caule Aquoso

Concentração Inibitória Mínima (CIM) e formação

de biofilme

O extrato aquoso inibiu 100% o crescimento de S. epidermidis e uma menor taxa de formação de biofilme (15,3%) concentração 4,0 mg/mL, Na dose 0,4 mg / mL, houve uma redução na

formação de biofilme (32,7%) e não houve morte bacteriana. Tretin et al., 2011. Cascas do caule Aquoso Concentração Inibitória Mínima (CIM) e formação

de biofilme

O extrato aquoso apresentou uma atividade bacteriostático para Pseudomonas aeruginosa

na concentração de 1,0 mg/mL e uma menor taxa de formação de biofilme.

Tretin et al., 2013.

Cascas do caule

Etanólico Concentração Inibitória Mínima (CIM)

O extrato etanólico da casca apresentou atividade bactericida contra Staphylococcus

aureus na concentração de 125 μg/mL. Clementino et al., 2016. Cascas do caule Clorofórmico Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Microbicida Mínima (CMM)

Os resultados mostraram que C. leptophloeos apresenta potencial propriedade inibitória contra

espécies de resistência a múltiplos fármacos de S. aureus, bem como vários Gram-positivos, Gram-negativos e fungos (Aspergillus sp. e C.

albicans.

(31)

(Continuação)

Atividade Larvicida

Folhas Hidrodestilação Utilização da larva do mosquito Aedes aegypti

Os bioensaios mostraram que o óleo essencial exibiu fortes efeitos de dissuasão de oviposição contra A. aegypti em concentrações entre 25 e 100 ppm e possuía boa atividade larvicida (LC50 = 99,4 ppm).

Silva et al., 2015.

Citotoxicidade e toxicidade Cascas Extrato

etanólico

Toxicidade aguda sobre náuplios de Artemia salina

O extrato testado se mostrou moderadamente

tóxico. Clementino et al., 2016.

Folhas hexânico e metanólico

Linhagem de células tumorais Hep-2 e NCI-H292

Os EH e Met frente a linhagem Hep-2 na concentração de 50 µg inibiram 11,53% e 46,45% e na mesma concentração para a linhagem NCI-H292 inibiram 26,1% e 13,23%, respectivamente.

Melo et al., 2017.

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3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Isolar e caracterizar os compostos do extrato hidroetanólico das folhas e do extrato hidroetanólico das cascas do caule de Commiphora leptophloeos e avaliar a toxicidade, a atividade anti-inflamatória e antimicrobiana.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Isolar e elucidar a estrutura dos compostos majoritários dos extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos;

 Desenvolver e validar metodologia para quantificar os marcadores dos extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos por CLAE;

 Caracterizar o perfil fitoquímico dos extratos hidroeatanólicos das folhas e do caule por espectrometria de massas;

 Avaliar a atividade antimicrobianados extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos in vitro frente a cepas clínicas e de referência de fungos e bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;

 Avaliar o efeito anti-inflamatóriodos extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos in vitro pelo ensaio de óxido nítrico induzido por LPS e in vivo nos modelos de edema de pata induzido por carragenina e de bolsa de ar induzida por zimosam;

Avaliar a segurança dos extratos hidroetanólico das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos por ensaios não clínicos in vitro e in vivo;

Realizar uma triagem virtual in sílico dos compostos marjoritários dos extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos.

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4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 MATERIAL VEGETAL

O material vegetal é constituído das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos. O material vegetal foi coletado em abril de 2016 na comunidade do Carão, Município de Altinho, no Pernambuco, Brasil, as seguintes coordenadas geográficas latitude: 8º 29’ 32” S e longitude: 36º 03’ 03” W. A autorização da coleta foi obtida pelo Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO), sob o número de processo 35017 e a Autorização de acesso ao Patrimônio Genético foi obtida pelo Conselho de Gestão do Patrimônio Genético do Ministério do Meio Ambiente (CGEN/MMA), sob o número de cadastro no SISGEN A618873. Uma exsicata incluindo folhas e cascas do caule de C. leptophloeos foi depositada no Herbário Geraldo Mariz (UFP) da Universidade Federal do Pernambuco (UFPE), com o número de registro UFP: 46.191.

4.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO CAULE DE C. leptophloeos

As folhas foram secas em estufa de ar circulante (temperatura inferior a 45 ºC), e em seguida foram trituradas em moinho de facas. O material obtido após trituração foi submetido à produção do extrato, pelo método de maceração (48 h), utilizando como solvente etanol: água (70: 30, v/v) na proporção de 1: 10 de solvente (g/v). Na sequência, o material vegetal foi submetido a três remacerações seguidas de 48 horas, cada. Em seguida, o extrato foi filtrado através de filtro de papel obtendo-se então os extratos hidroetanólicos (EH) 70% das folhas. A fase orgânica foi evaporada sob pressão reduzida com o auxílio de um evaporador rotatório (Büchi®) com temperatura ≤40ºC e por fim liofilizado e armazenado a -20°C.

Com o intuito de reproduzir o uso popular da espécie e selecionar o melhor método de extração, também foram preparados extratos aquosos pelo método de decocção utilizando como solvente água. O processo de decocção foi realizado durante 15 minutos após início da ebulição. Em seguida, os extratos foram arrefecidos, filtrados a vácuo e liofilizados. No processo de liofilização, as amostras foram previamente congeladas em freezer a - 80 oC.

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4.3 ANÁLISE FITOQUÍMICA QUALITATIVA DOS EH DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO CAULE DE C. leptophloeos

Inicialmente, foi realizada uma investigação do perfil químico com o objetivo de detectar as principais classes de metabólitos secundários presentes nos extratos aquosos obtido por decocção e nos extratos hidroetanólicos obtido por maceração das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos.

4.3.1. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

A análise do perfil químico dos extratos foi realizada por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) utilizando como adsorvente cromatoplacas de gel de sílica 60 em alumínio F254 (Merck®) e como fase móvel a mistura de AcOET: AcOH: H2O (1,1:0,8:0,3 v/v/v) e

como reveladores, Reagente natural A 0,5% (difenilboriloxietilamina) com posterior visualização em luz ultravioleta a 254 e 365 nm e vanilina sulfúrica (vanilina 2% e ácido sulfúrico 10 % em etanol).

4.3.2 Análise para a detecção de compostos fenólicos

A análise para detectar a presença de compostos fenólicos nos extratos foi realizada através da reação com cloreto férrico. Inicialmente, adicionou-se separadamente 2 mL dos extratos em tubos de ensaios e em seguida foi adicionado 2 gotas de solução etanólica de cloreto férrico a 2,5%. Posteriormente, foi observado se houve mudança ou não de coloração para verde-escuro, violeta ou azul (SIMÕES, 2016).

4.3.3 Análise para a detecção de taninos

A análise para detectar a presença de taninos nos extratos foi realizada através da reação de precipitação em gelatina. Inicialmente, adicionou-se separadamente 2 mL dos extratos em tubos de ensaios e em seguida foi gotejada uma solução aquosa de gelatina a 2,5% até a visualização da formação de precipitado (SIMÕES, 2016).

(35)

4.3.4 Análise para a detecção de flavonoides

A análise para a detecção da presença de flavonoides foi realizada através da reação de cianidina ou shinoda. Para o ensaio, 2 mL dos extratos foram colocados separadamente em almofariz de porcelana e submetidos ao aquecimento em banhomaria a 50 °C até a evaporação completa dos solventes. Em seguida, adicionou-se 0,2 mL de clorofórmio sobre os extratos secos e posteriormente o clorofórmio retirado. Por fim, as amostras foram suspendidas com 1 mL de etanol 70% e transferidas para tubos de ensaios, onde foi adicionado vagarosamente pelas paredes dos tubos 1 mL de ácido clorídrico (HCl) 37% e 200 mg de magnésio em pó (SIMÕES, 2016).

4.3.5 Análise para a detecção de saponinas

A análise para detectar a presença de saponinas nos extratos foi realizada pelo teste de formação de espuma. Para o teste, 2 mL dos extratos foram adicionados em tubos de ensaios e suspendidos em 5 mL de água destilada. Em seguida, os tubos de ensaios foram agitados bruscamente por 1 minuto e observado se havia formação de espuma persistente (SIMÕES, 2016). Aos tubos de ensaios que foi verificado a formação de espuma, foi adicionado 5 gotas de HCl e observado se a espuma formada era persistente. A presença de espuma persistente após a adição de HCl confirmaria a presença de saponinas nos extratos.

4.3.6 Análise para a detecção de alcaloides

A análise para detectar a presença de alcaloides nos extratos foi realizada através da reação de precipitação em reagente de Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand. Inicialmente, em um béque foram adicionados 2 mL dos extratos e 20 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) 10%.

Em seguida, as amostras foram aquecidas até a ebulição por 5 minutos e posteriormente foram arrefecidas e filtradas. Em uma placa de vidro, foram adicionadas 5 gotas das amostras em contato com os reagentes Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand. A formação de um precipitado laranja, branco ou amarelo confirmaria a presença de alcaloides nos extratos (SIMÕES, 2016).

(36)

4.4 PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DO EXTRATO DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO CAULE DE C. leptophloeos

Após a redução total da fase orgânica dos extratos com o auxílio de um evaporador rotatório a temperatura não superior a 40 ºC, a fase aquosa dos extratos foi submetida a uma partição líquido-líquido em funil de separação. Foram utilizados solventes de polaridade crescente, para obtenção das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt),

n-butanol (n-BuOH) e residual aquosa. O processo foi repetido 3 vezes utilizando uma alíquota de 150 mL por vez para cada solvente. Todas as frações obtidas e a fração residual aquosa foram analisadas preliminarmente por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e também foram utilizadas para avaliação da atividade antimicrobiana in vitro.

4.5 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO

O isolamento e a elucidação estrutural foram realizados em parceria com o Laboratoire de Pharmacognosie da Université Paris Descartes em supervisão do Prof. Dr. Räphael Grougnet, durante a realização de um estágio no exterior (Stage de master 2).

O processo de fracionamento e isolamento foi realizado em uma única etapa através da Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC).

4.5.1 Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC)

O EH das folhas (10 g) e a fração BuOH (6,0 g) das cascas do caule de C. leptophloeos foram submetidos a fracionamento por CPC (Armen-Gilson® Instrument) equipado com um rotor de capacidade de 1000 mL, contendo 2016 células gêmeas e a velocidade de rotação foi ajustada para 1600 rpm. O aparelho CPC foi operado no modo descendente e as frações foram coletadas por um coletor de frações (Büchi®). Os experimentos foram realizados em temperatura ambiente. Os sistemas de solventes de duas fases foram selecionados de acordo com uma avaliação do coeficiente de partição (K), definido pela razão das concentrações dos compostos de interesse entre as duas fases não miscíveis. As misturas de solventes foram preparadas e em seguida adicionadas em tubos de ensaios. Os tubos foram agitados e mantidos em repouso até que as duas fases fossem separadas. Posteriormente, em cada tudo de ensaio foi adicionado 3 mg do EH das folhas e da fração BuOH das cascas do caule e os tubos foram agitados novamente e deixados em repouso até a separação das duas fases. Passado isso, as fases superiores foram transferidas para outros tubos de ensaios e finalmente as fases foram analisadas por CCD. Os sistemas de solventes Hex: AcOEt: MeOH: H2O (1:3:1:3, v/v/v/v) e Hex: AcOEt: MeOH: C3H6O: H2O

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(0,1:1,8:0,6:1,1:0,5, v/v/v/v) foram selecionados para o EH das folhas e fração BuOH das cascas do caule, respectivamente. A partir do EH das folhas foi possível isolar diretamente os compostos 1 e 2 e a partir do EH das cascas do caule, após o processo de fracionamento por partição líquido-líquido, foi possível isolar os compostos 3 e 4. O esquema de fracionamento e isolamento para o EH das cascas do caule é apresentado na Figura 2.

Figura 2 – Esquema representativo do fracionamento e isolamento guiado pelo efeito antimicrobiano do EH das cascas do caule.

Fonte: Resultados Experimentais.

4.6 IDENTIFICAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS

A identificação e a elucidação das substâncias isoladas foram obtidas por análises espectroscópicas e espectrométricas.

As análises espectroscópicas e espectrométricas foram realizadas em colaboração com o Prof. Dr. Wagner Vilegas do Laboratório de Bioprospecção de Produtos Naturais (LBPN) da UNESP, com auxílio da doutoranda Ana Zanatta.

4.6.1 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Os compostos isolados foram analisados por RMN de 1H 1D e 2D em um equipamento espectrômetro Bruker® (400 MHz). As amostras soram solubilizadas em MeOD (Euriso-top®). Foram obtidos os espectros de RMN de 1H e número de scans foi variável de 8

(38)

à 32 a depender da concentração da amostra. Os espectros obtidos foram analisados e comparados com os dados da literatura.

4.6.2 Análise por Espectroscopia de Massas (EM)

Os EH das folhas e das cascas do caule e as substâncias isoladas foram analisados FIA-ESI-IT-MS/MS. Para análise, foi utilizado um Espectrômetro de massas LCQ FLEET (ESI-IT-MSn, Thermo Scientific®), equipado com um dispositivo de injeção direta da amostra via análise por injeção em fluxo contínuo (FIA). Ionização por electrospray (ESI) e analisador do tipo íon-trap (IT). Inicialmente, foi realizada uma varredura completa (full-scan) do espectro de massas para adquirir os dados dos íons na faixa m/z estabelecida. Posteriormente foram realizados experimentos de MS/MS a partir dos dados da primeira varredura para íons precursores pré-selecionados, com energia de colisão de 30 V.

Para obtenção do perfil dos extratos por LC-MS/MS foi utilizado um espectrômetro de massas LC-QTOF HR-ESI (Waters Synapt G2, Manchester, UK). Os espectros de massas foram obtidos no modo positivo e negativo, sendo o modo negativo selecionado. A faixa de trabalho dos íons variaram de m/z de 100−2000 Da. O software XcaliburTM versão 1.3 (Thermo Scientific®) foi utilizado para tratamento dos dados.

Para a preparação das amostras, os extratos foram submetidos a um pré-tratamento em extração de fase sólida por clean up em cartucho SPE C18. Para análise do EH das folhas de C. leptophloeos, 10 mg do extrato foram dissolvidos em 1,5 mL de MeOH/H2O (85:15,

v/v). O cartucho SPE C18 (Chromabond® C18 ec, 500 mg, 3 mL cartucho) foi previamente condicionado com 4,5 mL de MeOH e 4,5 mL de MeOH / água (85:15, v/v). Em seguida, 1 mL da amostra do extrato foi adicionada ao cartucho e eluída com 1,5 mL MeOH/ H2O

(85:15, v/v) seguido de MeOH para a limpeza do cartucho.

Para o EH das cascas do caule de C. leptophloeos, 10 mg do extrato foi dissolvido em MeOH/ H2O (50:50, v/v). O cartucho SPE C18 (Chromabond® C18 ec, 500 mg, 3 mL

cartucho) foi previamente condicionado com 4,5 mL de MeOH e 4,5 mL de MeOH / H2O

(20:80, v/v). Em seguida, 1 mL da amostra do extrato foi adicionada ao cartucho e eluida com 1,5 mL de MeOH/ H2O (20:80, v/v) e 1,5 mL de MeOH/ H2O (50:50, v/v) seguido de MeOH

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4.7 VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA AO DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-DAD) E AO DETECTOR EVAPORATIVO DE ESPALHAMENTO DE LUZ (CLAE-ELSD)

As análises obedeceram ao disposto nas resoluções nacionais e internacionais vigentes, abrangendo os parâmetros descritos pela RE Nº 166/2017 e o guia internacional ICH (BRASIL, 2017; ICH, 1996). Pretendeu-se avaliar os parâmetros de seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) e robustez (BRASIL, 2017).

A repetibilidade do método foi avaliada utilizando 3 concentrações do padrão isovitexina, a saber: uma concentração baixa (31,25 µg/mL), uma média (125 µg/mL) e uma alta (500 µg/mL). Cada uma das concentrações (em triplicata) foi analisada três vezes, somando no total 9 análises cromatográficas. A avaliação da precisão intermediária foi realizada no mesmo laboratório em 2 dias diferentes.

O EH das folhas foi analisado em um equipamento CLAE JASCO® constituído de bomba quaternária, detector de arranjos de diodos (DAD) e injetor automático. Foi utilizada uma coluna de fase reversa C18 modelo Thermo Scientific® (250 x 4,6 mm d.i.; 5 μm). Inicialmente, foi desenvolvido o método para o EH das folhas e a partir desse método foi realizado o teste de linearidade para o padrão isovitexina.

Foi preparada uma solução estoque do padrão isovitexina com concentração de 1 mg/mL, a partir da qual foi realizada diluição seriada para obtenção de seis soluções nas concentrações de 7,81; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250 e 500 µg/mL. O volume de injeção foi de 10 µL. Para otimização do método, o gradiente de eluição foi constituído de água (solvente A) e metanol (solvente B), ambos acidificados com 0,1% de ácido fórmico. O programa de corrida foi de 30-75% de MeOH em 50 minutos. O fluxo foi mantido constante em 1,0 mL/min e a detecção realizada a 254 e 340 nm com a aquisição de espectros UV na faixa de 190 a 450 nm. As análises foram realizadas em triplicatas.

Para a análise do EH das cascas do caule foi utilizado o mesmo equipamento de CLAE e a mesma coluna como descrito anteriormente. Para a detecção foi utilizado o detector evaporativo de espalhamento de luz (ELSD) da JASCO® modelo ELS-2040/2041.

Inicialmente, foi desenvolvido o método para o EH das cascas do caule e a partir desse método foi realizado o teste de linearidade para o padrão procianidina dimérica do tipo B.

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Foi preparada uma solução estoque do padrão procianidina dimérica do tipo B com concentração de 3 mg/mL, a partir da qual foi realizada diluição seriada para obtenção de cinco soluções nas concentrações de 250; 500; 1000; 1250 e 1500 µg/mL.

O gradiente de fase móvel utilizado foi: água acidificada em ácido fórmico 0,1% (solvente A) acetonitrila (solvente B), com 10-20%, de 0-7 min; 20%, de 7-25 min; 20-60 %,

de 25-45 min. O volume de injeção foi de 10 µL e o ELSD foi operado com temperatura do

drift tube em 40 °C e pressão do gás nebulizador de 3,5 bar. O fluxo foi mantido constante em 1,0 mL/min. As análises foram realizadas em triplicatas.

O software EZChrom Elite 3.1.7 foi utilizado para controle, coleta e processamento dos dados para todas as análises.

4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA

O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA/UFRN) pelo parecer de nº 019.026/2017 e está em conformidade com as diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

4.8.1 Animais de experimentação

Foram utilizados para o estudo camundongos albinos Swiss machos e fêmeas, com período de vida de 6 a 8 semanas, pesando em torno de 30 a 35 g, mantidos sob temperatura controlada (22 ± 2 ° C), ciclo claro/escuro de 12/12 horas e com acesso livre a água e comida. Cada grupo foi composto por cinco animais (n = 5). Os animais foram procedentes do Biotério do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFRN.

Os experimentos foram realizados em parceria com o Prof. Dr. Matheus Freitas Fernandes Pedrosa, do Departamento de Farmácia da UFRN e com o auxílio das doutorandas Manuela Torres Rêgo e Allanny Furtado.

4.8.2 Modelo de edema de pata induzido por carragenina

O efeito anti-inflamatório do pós-tratamento por via oral (v.o) dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na inflamação aguda foi avaliado conforme o procedimento descrito por Posadas e colaboradores (2004), com algumas modificações. Inicialmente, o edema de pata nos animais foi induzido através de injeção subplantar (s.pl.) de 50 µL de λ-carragenina 1% (500 µg/pata). Após 30 minutos os animais foram tratados por v.o

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