UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA
MARIANA BARALDI SILVA SILVINO
COMPARAÇÃO DO PERFIL PROTEICO DE ESPERMATOZOIDES EM DIFERENTES ESPÉCIES
FORTALEZA 2018
COMPARAÇÃO DO PERFIL PROTEICO DE ESPERMATOZOIDES EM DIFERENTES ESPÉCIES
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia, Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Doutor em Zootecnia. Área de Concentração: Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura
Co-orientador: Dr. Fábio Roger Vasconcelos
FORTALEZA 2018
COMPARAÇÃO DO PERFIL PROTEICO DE ESPERMATOZOIDES EM DIFERENTES ESPÉCIES
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia, Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Doutor em Zootecnia. Área de Concentração: Reprodução Animal.
Aprovada em ____/_____/____
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________ Dr. Fábio Roger Vasconcelos (Co-orientador)
Instituto Federal do Ceará (IFCE)
_______________________________________________________ Prof. Dr. Maurício Fraga Van Tilburg
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
________________________________________________________ Prof. Dr. Airton Alencar de Araujo
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
________________________________________________________ Prof. Dr. Vicente José de Figueiredo Freitas
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
________________________________________________________ Prof. Dra. Carla Renata Figueiredo Gadelha
A minha família gostaria de dedicar esta conquista.
A Deus e meus anjinhos protetores (que devem ser muitos) que fizeram com que eu enfrentasse cada obstáculo e me deram toda a proteção necessária para chegar até aqui, me cercaram de pessoas incríveis: familiares e amigos que fazem tudo valer a pena. Sinto-me imensamente abençoada e sou grata pela vida que tenho.
A Universidade Federal do Ceará (UFC), ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, em especial a Francisca Beserra.
A toda minha família principalmente aos meus filhos Caio e Luca que me dão forças diariamente para estar sempre em busca de superação, me dão alegria suficiente para adoçar meus dias e fazem de mim a pessoa mais feliz do mundo. São a razão da minha vida! Agradeço também a meu esposo e grande companheiro por estar sempre ao meu lado cuidando de mim e de nossos maiores tesouros. Sou imensamente grata a minha mãe, pelo apoio e também por cuidar e amar minhas crias.
Agradeço ao Dr. Fábio Rogers pela coorientação e toda a ajuda prestada durante a realização do experimento e da tese.
Aos membros da banca Prof. Maurício Van Tilburg, Prof Carla Renata, Prof Airton Alencar e Prof Vicente José de Figueiredo por todas as contribuições.
Sou grata também pelo auxílio de Aderson Viana que me socorreu em momentos de desespero e tirou minhas dúvidas mais cruéis. Muito grata a você, amigo.
Agradeço a minha grande amiga Kamila Sousa por todo o auxílio dado em meu experimento e na construção desta tese, você me emprestou seus braços, seu cérebro e seus ouvidos (risos), se mostrou mais que uma companheira de curso, uma grande amiga. Eu não teria conseguido sem você!
Não posso deixar de agradecer por ter conhecido tantas pessoas especiais que aos poucos passaram a fazer parte da minha vida, dentre elas Bruna Félix que me ajudou em tantos momentos e passou a ser uma grande confidente. Você é uma pessoa muito especial e não se livrará de mim assim tão fácil.
A minha querida amiga Diana Elizabette por ser minha conselheira e amiga de longos áudios, está sempre na torcida por mim e pela minha família. Amiga para toda a vida.
A minha amiga Rosinha, que me acompanhou neste processo todo, sofreu e vibrou junto comigo. Não tenho palavras para agradecer sua presença em minha vida!
A todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desta difícil tarefa. Conseguimos!
―Tome partido. Neutralidade ajuda o opressor, nunca a vitima. Silêncio encoraja o torturador, nunca o torturado.‖
Proteínas presentes no plasma seminal de animais domésticos apresentam diversas funções na fisiologia espermática, atuando em processos de capacitação, reação acrossômica, interação entre gametas e proteção ao espermatozoide. Desse modo, o presente estudo caracterizou proteínas presentes em células espermáticas de ovinos, caprinos, equinos, suínos e cães. Por meio de espectrometria de massas, foram identificadas um total de 128 proteínas no espermatozoide das espécies utilizadas. Seis proteínas estavam presentes em quatro das cinco espécies estudadas, sendo elas a angiotensin-converting enzyme, ATP-synthase subunit α, hexoquinase 1, malate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase e succinyl-CoA. Foi feita ontologia gênica, interação interproteica e filogenia dessas seis proteínas. Foi possível identificar 10 proteínas comuns às espécies ruminantes. Esse estudo foi o primeiro a caracterizar as proteínas presentes em de espermatozoides totais de cão, além de comparar o perfil proteico das cinco espécies. Apesar da alta similaridade entre algumas espécies, o espermatozoide apresenta diferenças proteicas na sua composição, o que poderia explicar as diferentes variações no processo de fertilização.
Proteins present in seminal plasma of domestic animals present several functions in sperm physiology, acting in capacitation processes, acrosome reaction, interaction between gametes and sperm protection. Thus, the present study characterized proteins present in sperm cells from sheep, goats, horses, pigs and dogs. By means of mass spectrometry, a total of 128 proteins were identified in the enriched fraction of spermatozoa of the species used. From this total, identified proteins were found in all species, however six proteins were present in four of the five species studied: angiotensin-converting enzyme, ATP synthase subunit, hexokinase 1, malate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, succinyl- CoA and a total of 14 proteins were identified in at least 3 species. This study was the first to characterize the proteins present in the enriched fraction of spermatozoon of dogs, in addition to comparing five species. Despite the high similarity between some species, the spermatozoid presents protein differences in its composition, which could explain the different variations in the fertilization process.
Figura 1 - Gel de poliacrilamida de espermatozoides totais de carneiro (Ovis aries). SDS-PAGE de 12,5% corado com coomassie R-250. As amostras O1–O5
correspondem a diferentes machos. B1 a B28 representam os cortes das bandas do gel... 25 Figura 2 - Gel de poliacrilamida de espermatozoides totais de caprinos. SDS-PAGE
de 12,5% corado com coomassie R-250. As amostras C1–C4 correspondem a diferentes machos. B1 a B27 representam os cortes das bandas do gel... 26 Figura 3 - Gel de poliacrilamida de espermatozoides totais de equinos. SDS-PAGE
de 10% corado com coomassie R-250. As amostras E1–E5 correspondem a diferentes machos. B1 a B32 representam os cortes das bandas do gel.... 27 Figura 4 - Gel de poliacrilamida de espermatozoides totais de suínos. SDS-PAGE de
10% corado com coomassie R-250. As amostras S1–S5 correspondem a diferentes machos. B1 a B21 representam os cortes das bandas do gel... 28 Figura 5 - Gel de poliacrilamida de espermatozoides totais de caninos. SDS-PAGE
de 10% corado com coomassie R-250. As amostras D1–D4 correspondem a diferentes machos. B1 a B11 representam os cortes das bandas do gel.... 29 Figura 6 - Representação esquemática do processo de análise filogenética de
proteínas comparadas em diferentes espécies produzida por algoritmo UPGMA (A: Angiotensin-converting enzyme; B: ATP synthase subunit α; C: Hexokinase 1; D: Malate dehydrogenase; E: Pyruvate dehydrogenase E1; F: Succinyl-CoA 3-ketoacid-coenzyme A transferase; figuras 6A,6B,6C,6D,GE,6F)... 33 Figura 7 - Gráficos das anotações da ontologia gênica de espermatozoides totais de
carneiros com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C)... 36 Figura 8 - Gráficos das anotações da ontologia gênica de espermatozoides totais de
bodes com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C)... 37 Figura 9 - Gráficos das anotações da ontologia gênica de espermatozoides totais de
cavalos com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C)... 38
suínos com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C)... 39 Figura 11 - Gráficos das anotações da ontologia gênica da de espermatozoides totais
de cães com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C)... 40 Figura 12 - Análise in silico das redes de interações interproteicas das proteínas: ATP
synthase subunit a (A; MT-ATP6), hexokinase 1 (B; HK1), pyruvate dehydrogenase (C; PDHA2), succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzyme A transferase (D; OXCT1). Essas 4 primeiras proteínas foram encontradas em ovinos, caprinos, equinos e caninos. A proteína angiotensin-converting enzyme (E; ACE2) identificada em ovinos, caprinos, equinos e suínos e a proteína malate dehydrogenase (F, MDH1) observada em carneiros, cavalos, suínos e cães. Linha de cores diferentes representa os tipos de evidências para a associação. (-) Co-expressão; (-) experimentos; (-) textmining; (-) co-ocorrência; (-) banco de dados e (-) homologia... 41
Tabela 1 - Proteínas de espermatozoides totais identificados por espectrometria de massas em pelo menos três espécies diferentes... 31 Tabela 2 - Comparação da sequência proteínas de espermatozoides totais identificados
por espectrometria de massas em pelo menos três espécies diferentes tendo carneiro como referência... 32 Tabela 3 - Matriz de distâncias das proteínas de espermatozoides totais em diferentes
espécies utilizando algoritmo UPGMA (figuras A, B, C, D, E e F)... 34 Tabela 4 - Comparação dos perfis proteicos de espermatozoides totais entre as espécies.
Cada valor é o número de proteínas compartilhadas entre duas espécies (coluna × linha) e a porcentagem do perfil proteico da espécie na coluna comum com a espécie na linha é indicada entre parênteses... 35
µg Micrograma µl Microlitro g Grama kDa KiloDalton M Molar mA Miliamperagem
mAu Miliunidade de absorbância mBar Milibar
mL Mililitro mm Milimetro mM Milimolar OPN Osteopontina
PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida pH Potencial hidrogeniônico
pI Ponto Isoelétrico
% Percentagem ºC Celsius
V Volts
1 INTRODUÇÃO...
2 REVISÃO DE LITERATURA...
3 MATERIAL E MÉTODOS...
3.1 Procedimentos gerais... 3.2 Coleta de sêmen, processamento e extração de proteínas dos espermatozoides. 3.3 Extração e quantificação de proteínas... 3.5 Identificação das proteínas... 3.6 Ontologia gênica, interação e filogenia... 4 RESULTADOS...
5 DISCUSSÃO...
6 CONCLUSÃO... REFERÊNCIAS...
ANEXO A - PROTEÍNAS EXPRESSAS NOS ESPERMATOZOIDES DE CAPRINOS, CANINOS, OVINOS, EQUINOS E SUÍNOS. AS PROTEÍNAS FORAM SEPARADAS POR ELETROFORESE UNIDIMENSIONAL (SDS-PAGE) E IDENTIFICADAS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS (ESI-Q-TOF)... ANEXO B - DECLARAÇÃO DE CORREÇÃO DE INGLÊS...
15 17 21 21 21 22 23 24 25 42 50 51 64 108
1 INTRODUÇÃO
O sêmen é constituído por espermatozoides e plasma seminal, sendo este o seu principal constituinte. Os espermatozoides são células produzidas por ciclos sucessivos denominados espermatogênese, sendo constituído por três regiões: cabeça, cauda e peça intermediária (Blom, 1950). Ressalta-se que é na cabeça do espermatozoide que se encontra o núcleo haploide responsável por carrear a cromatina altamente condensada no qual está contido o DNA (Amman; Grahan, 1993).
As proteínas estão presentes em grande concentração no plasma seminal, influenciando o metabolismo espermático e atuando em diversos estágios da fertilização (Pilch; Mann, 2006). A função dos espermatozoides sofre significativas alterações pós-traducionais de proteínas celulares logo após a espermatogênese (Moura et al., 2011). Nesse sentido, técnicas de análise proteômica de espécies domésticas e selvagens tem permitido mapear o plasma seminal de diversas espécies domésticas, no intuito de identificar biomarcadores que estejam associados à fertilidade e ao congelamento de sêmen (Roncoletta et al., 1999; Cardozo et al., 2006), além de fornecer informações sobre mecanismos determinantes para a capacidade fecundante da célula (Moura et al., 2011). Dessa forma, a proteômica possibilita obter dados como a identificação de proteínas, função, níveis de expressão, interações proteicas, mecanismos regulatórios, dentre outras atividades exercidas por essas biomoléculas (Blackstock; Weir, 1999). Embora o mecanismo de atuação de algumas proteínas presentes na célula espermática não seja totalmente elucidado, defeitos a nível molecular podem interferir na fertilidade animal (Byrne et al., 2012). Estudos demonstram que os espermatozoides contribuem não somente com o DNA paterno, mas também com moléculas de mRNA responsáveis por atuar na fertilização (Bukowska et al., 2013).
Durante o trânsito epididimário e maturação, os espermatozoides passam por uma série de modificações, incluindo a motilidade, remodelamento da membrana, além de mudanças no pH. Dessa forma, as proteínas presentes no plasma estão envolvidas em diversas atividades, uma vez que no momento da ejaculação se ligam a membrana do espermatozoide e influenciam toda a cascata fisiológica da célula (Thimon et al., 2005; Manjunath; Thérien, 2002). Dentre as atividades atribuídas às proteínas associadas à fertilidade, estão a manutenção e sobrevivência desses espermatozoides no trato reprodutivo da fêmea, capacitação e ligação da zona pelúcida ao oócito (Manjunath; Therién, 2002; Druart et al., 2013). Além disso, enzimas antioxidantes presentes no plasma protegem os espermatozoides
no trato reprodutivo da fêmea contra o ataque de neutrófilos e agregação leucocitária (Gilbert; Fales, 1996). Essas enzimas previnem a peroxidação lipídica da membrana espermática pelas espécies reativas ao oxigênio (ROS), e com isso a fragmentação do DNA (Lewis, 1997).
A extração de proteínas do espermatozoide envolve primeiramente a quebra ou lise celular, no qual processos químicos ou físicos são utilizados com o objetivo de maximizar a liberação das proteínas de interesse e evitar degradação térmica e proteólises (Galdos-Riveros, 2009). De modo a recuperar grande parte das proteínas presentes na célula, o resultado desse procedimento depende de variáveis como tampões, detergentes, inibidores e procedimentos mecânicos (Beyhan, 1999). Dessa forma, técninas em proteômica permitem o reconhecimento de proteínas associadas ao espermatozoide para melhor entendimento dos mecanismos de fertilização, e assim torna-se mais fácil identificar propriedades ligadas às proteínas envolvidas no mecanismo de regulação das células no trato reprodutivo feminino após a ejaculação (Strezezk et al., 2005).
Além disso, estudos ligados a sistemática filogenética permitem o estudo de caracteres de interesse derivados de um estado ancestral. Logo, supõe-se que um determinado caráter poderá ser alterado na sua descendência, levando a apresentar alterações que possivelmente serão manifestadas nas próximas gerações. Portanto, um caráter desejável se manifesta em um ancestral exclusivo e em todos os seus descendentes, no entanto com modificações ao longo da evolução da espécie (Lopes; Ho, 2015). Em virtude dessas descobertas, esse trabalho objetivou caracterizar e comparar os perfis proteicos de espermatozoides de mamíferos comercialmente relevantes.
2 REVISÃO DE LITERATURA
Nas últimas décadas diversos estudos têm sido realizados com o objetivo de relacionar a qualidade do sêmen e a fertilidade. Dessa forma, a relação entre morfologia e motilidade desses espermatozoides e números de fertilização in vitro tem sido avaliados como indicadores da capacidade fertilizante dos espermatozoides (Linford et al., 1976; Saacke et al., 1994) e essas características tem sido mais empregadas e estudadas para avaliar o potencial reprodutivo do macho (Correa et al., 1997). Levando em consideração a alta herdabilidade de características morfológicas, é importante um completo desenvolvimento testicular para obtenção de indicadores biológicos que indiquem habilidade fecundante do gameta masculino, e dessa forma selecionar animais de alta fertilidade (Barbosa et al., 1998).
Os espermatozoides são células bastante especializadas que apresentam como características morfológicas e estruturais adaptadas para a transmissão do genoma masculino, sendo produzidas por meio de um processo contínuo conhecido como espermatogênese (Russel et al., 1990; Eddy, 2006). Dessa forma, centros de comercialização de sêmen utilizam a morfologia espermática como meio de controle de qualidade para verificar qual melhor destino para determinado ejaculado (Arruda et al., 2015). Além disso, os espermatozoides são células haploides, alongadas, sendo divididas em cabeça e cauda, unidas pela região do colo (Flesch; Gadella, 2000). A cabeça do espermatozoide caracteriza-se por um núcleo haploide e presença do acrossoma, no qual este núcleo possui cromatina bastante condensada e o DNA apresenta-se enovelado sob a forma de nucleoproteínas (Knobil, 1988; Soldi; Bonaldi, 2013). No que diz respeito ao acrossoma, esta é uma organela proveniente do Complexo de Golgi e altamente rica em enzimas hidrolíticas e proteases, e dentre essas enzimas presentes podemos citar a hialuronidase e acrosina (Knobil, 1988). A cauda está associada ao processo locomotivo desses espermatozoides no trato reprodutivo da fêmea, e é dividida em três regiões distintas: peça intermediária, principal e terminal (Eddy et al., 2003). Ressalta-se que para que os espermatozoides sejam considerados viáveis ou fertéis, é necessário que o DNA se apresente intacto durante o transporte, e seja capaz de sustentar o desenvolvimento dos embriões (Holt, 2009).
O processo de formação das células espermáticas ou espermatogênese, é constituída por uma série de divisões celulares sucessivas que transformam a célula germinativa diploide na célula espermática haploide (Kudryavtsev et al., 2003). A duração desse processo é variável entre as espécies e em bovinos apresenta duração média de 60 dias. A espermatogêne é divida
em três fases: espermatocitogênse, meiose e espermiogênse (Russel et al., 1990). A espermatocitogênese corresponde ao processo de divisão mitótica das células, levando a produção de espermatócitos primários e células tronco germinativas. A meiose corresponde a duplicação dos cromossomos, responsável pela recombinação do material genético. A espermiogênese, por sua vez, corresponde as alterações morfológicas sofridas pelas espermátides, que se diferenciam em espermatozoides (Johnson et al., 2000; Leite, 2008). Estudos apontam que aproximadamente 25% das células germinativas passam por algum tipo de degeneração durante o processo de espermatogênese (Greep, 1976). Uma vez maduros, os espermatozoides são transportados e armazenados na cauda do epidídimo, o qual confere ambiente propício para sua sobrevivência. Em bovinos, o trânsito das células espermáticas pelo epidídimo demora em média sete dias (Garner; Hafez, 2004). Dessa forma, touros são considerados sexualmente maduros quando atingem todas as suas potencialidades espermáticas, de maneira que possibilitem a capacidade fecundante do gameta masculino (Schmidt – Hebbel, 2000).
A membrana espermática desempenha papel importante tanto para a manutenção da sobrevivência desse espermatozoide no trato feminino quanto o potencial fecundante dessas células. É composta por uma bicamada lipídica, as quais estão associadas a proteínas, glicoproteínas, colesterol e glicolipídios (Gwathmey et al., 2006). O modelo da membrana espermática é estruturalmente semelhante ao da membrana biológica, uma vez que essa também possui modelo mosaico-fluido, formado por bicamadas lipídicas e contínuas de fosfolipídios (Parks et al., 1987). Os lipídios possuem a capacidade de se mover nas laterais da membrana durante os processos de capacitação espermática, evento este regulado pela relação colesterol: fosfolipídio (Amann; Graham, 1993). Complementarmente, essa relação colesterol: fosfolipídio também possui a capacidade de modular a estabilidade da membrana à algumas mudanças de temperatura. Dessa forma, animais com alta relação apresentam menor fluidez da membrana e maior resistência à temperatura (Amann; Pickett, 1987; Tannert et al., 2007). Além disso, a membrana é responsável pela interação das células com o microambiente, sendo esta interação mediada por proteínas, peptídeos, lipídios e carboidratos (Lenzi et al., 1996).
O processo de fertilização requer do espermatozoide metabolismo suficiente para produção de energia, motilidade progressiva, integridade do DNA, integridade acrossoma, estabilização das estruturas de membrana e a presença de proteínas associadas a membrana
espermática que atuem na sobrevivência da célula no ambiente do trato genital feminino (Amman; Picket, 1987; Amman; Graham, 2011).
Variações no comprimento da peça intermediária apresentam variações entre diferentes espécies de mamíferos, entre indivíduos da mesma espécie e até mesmo diferenças entre raças, sendo essas modificações devido ao genótipo, atribuídos ao conteúdo mitocondrial (Wooley, 1971). Touros apresentam espermatozoides com cabeça arredondada e achatada, sendo a maior parte constituída pelo núcleo. Além disso, estudos indicam que as dimensões para cabeça e espermatozoide propriamente dito são de 0,29 µm de altura, 28,4 µm de perímetro e 46,9 µm2 de área de superfície (Carvalho, 2013).
Em ovinos foram descobertas duas proteínas conhecidas como RSVPs (Ram Seminal Vesicle Proteins) de 14 e 20 kDa que estão relacionadas a processos de proteção espermática, restauração da integridade da mebrana plasmática e capacitação dos espermatozoides (Barrios et al., 2000). O efeito protetor pode ser associado à ação decapacitante das mesmas, uma vez que promovem estabilização da membrana espermática (Barrios et al., 2005).
Cães apresentam menor produção espermática diária e menor número de espermatozoides por ejaculado, quando comparado as demais espécies domésticas (Threfall, 2003). Um grupo de proteínas ligadoras à heparina foram identificados no plasma seminal de cães, atuando no processo de reação acrossômica (Souza et al., 2006). Além das proteínas ligadoras de heparina, são encontradas também no plasma as proteínas ligadoras de zinco, que atuam na interação entre gametas durante o processo de fertilização (Mogielnicka-Brzozowska et al., 2012). Ressalta-se que o Zinco é tido como um cofator para diversas metalloenzimas envolvidas na síntese de proteínas e transcrição do DNA (Hadwan et al., 2013). Outra proteína bastante presente no plasma seminal de cães é a lactoferrina, que tem demonstrado correlação positiva com a concentração espermática, apresentando peso molecular de aproximadamente 72,5 kDa (Kikuchi et al., 2003). Além disso, a caracterização de proteínas no plasma seminal canino tem auxiliado a descobrir biomarcadores para um diagnóstico precoce de patologias reprodutivas na espécie (Mussel et al., 2010).
O suíno apresenta o maior volume de ejaculado dentre as espécies domésticas, atingindo um volume de até 500 mL por ejaculado. No entanto esse volume pode ser afetado pelo estado nutricional, idade do animal, raça e intervalo entre coletas (Cavalcanti, 1998). A célula espermática dos suínos também apresenta peculiaridades quando comparadas a outras espécies, uma vez que a mesma apresenta maior sensibilidade à baixas temperaturas devido a
sua membrana exibir um menor teor de colesterol e fosfolipídios saturados (Watson, 2000). Uma proteína utilizada como biomarcador para choque térmico no plasma de suínos é a HSP90AA1, pois quanto menor a expressão da mesma, maior a sensibilidade das células ao estresse térmico (Casas et al., 2010). Além disso, estudos realizados por Vilagran et al. (2013) identificaram duas proteínas expressas em maior intensidade no sêmen suíno que também possuem atuação no efeito contra o estresse térmico podendo atuar como biomarcadores de congelabilidade para o sêmen suíno, sendo elas a Acrosina e a Triose fostato isomerase.
Equinos apresentam os menores índices de fertilidade quando comparados a outras espécies de produção (Voss, 1993). Dessa forma, estudos tem associado os índices de fertilidade com a qualidade seminal de garanhões (Haag, 1959), logo as características seminais são determinantes na eficiência reprodutiva desses animais (Voss et al., 1981; Amann, 1989). As proteínas seminais equinas pertencem em sua maioria a três grupos: as proteínas secretórias ricas em cisteínas, proteínas transportadoras de fibronectina tipo II e espermadesinas (Kareskoski; Katila, 2008).
Partindo desse pressuposto, com o auxílio de técnicas proteômicas é possível obter informações sobre a fisiologia reprodutiva básica desses animais, e com isso estabelecer estratégias para identificar marcadores moleculares de fertilidade. Dessa forma, a obtenção de marcadores que auxiliem na escolha de reprodutores de alta fertilidade, tem sido objeto de diversas pesquisas nas últimas décadas (Killian et al., 1993; Miller, 2002; Moura et al., 2005). A identificação de proteínas presentes no plasma por meio de eletroforese vem sendo utilizada desde 1950, e seus primeiros resultados em géis já demonstravam o plasma como uma mistura complexa de proteínas (Larson et al., 1954; Bennet et al., 1965; Larson; Salisbury, 1954). Duas principais técnicas vêm sendo utilizadas pela análise proteômica para caracterização de proteínas de maneira qualitativa e quantitativa, sendo elas a eletroforese bidimensional e a espectrometria de massas. A eletroforese em gel de poliacrilamida é uma técnica utilizada para analisar proteínas de maneira qualitativa, no qual a mesma é baseada na separação dos compostos de acordo com sua carga e seu volume molecular (Moraes et al., 2013). Estudos realizados por Druart et al. (2013) utilizando eletroforese unidimensional para estabelecer um comparativo entre o plasma seminal de diferentes espécies, resultando em uma maior concentração de proteínas abaixo de 25 kDa em todas as espécies estudadas.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Procedimentos gerais
Os animais utilizados no estudo foram criados de acordo com o International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals. As análises foram realizadas na Universidade Federal do Ceará (UFC), no Departamento de Zootecnia, Laboratório de Fisiologia Animal. A coleta de sêmen das cinco espécies foi realizada no ambiente onde os animais estavam instalados. Foram utilizados cinco carneiros e quatro bodes (todos adultos com idade média de 2 anos), cedidos pelo Setor de Caprino e Ovinocultura da UFC; amostras de 5 varrões (idade ~ 2,5 anos) foram cedidos pelo laboratório de tecnologia do seêmen suíno da Universidade Estadual do Ceará (UECE). Amostras de garanhões (idade ~ 3 anos) foram cedidos pelo Haras Fazenda Chicote, e amostras de 5 cães (idade ~ 3 anos) foram cedidas pela Polícia Militar do Ceará. Em todas as espécies as amostras foram coletadas e imediatamente enviadas para o laboratório para a realização dos procedimentos experimentais a seguir. Os espermatozoides de cada espécies foram obtidos com auxílio de extração utilizando métodos químicos e mecânicos. Foram realizados SDS-PAGE das frações obtidas e as proteínas identificadas por meio de espectrometria de massas. Para o estudo de funções e componentes celulares as proteínas foram analisadas por meio do programa STRAP (Boston, MA) e os termos da ontologia gênica para os processos biológicos, componentes celulares e funções moleculares foram obtidas da base de dados do UniProtK. Foi utilizado o software MEGA X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) para construção das árvores filogenéticas e matriz de distância utilizando algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean).
3.2 Coleta de sêmen, processamento e extração de proteínas dos espermatozoides
Amostras de sêmen de bodes e carneiros foram coletadas por meio de eletroejaculação (Torjet-65; Neovet, Minas Gerais, Brasil), enquanto que as amostras dos garanhões foram coletadas com a utilização de vagina artificial. O sêmen dos varrões e cães foi coletado por meio de excitação mecânica, sendo utilizada apenas a segunda fração do sêmen de cães. As amostras de sêmen foram imediatamente transferidas para tubos contendo inibidor de protease Protease Inhibitor Cocktails (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) em uma proporção de
1:1000 e, em seguida, foram centrifugadas (700 x g, 15 minutos, 4 °C). Em seguida, o pellet foi submetido a 3 lavagens com tampão PBS pH 7,4 (phosphate buffered saline) por meio de centrifugação (800 x g, 15 minutos, 4 °C) para a retirada do plasma seminal residual. Após lavagem, os pellets (células) foram armazenados a –20°C até posterior utilização.
3.3 Extração e quantificação das proteínas
A extração dos espermatozoides foi realizada seguindo metodologia descrita por van Tilburg et al. (2013) com modificações. Logo após as 3 lavagens com PBS, o pellet foi ressuspendido em solução de PBS até o volume final de 1,5 ml, acrescido de inibidor de protease (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) na proporção 1:1000, e em seguida os espermatozoides foram mecanicamente lisados (20 ciclos no homogeneizador para cada amostra). A seguir foi acrescido 150 µl de Triton X-100, homogeneizado e incubado por 120 minutos a 4ºC, sob leve agitação. Na sequência as amostras foram sonicadas por 30 minutos em água gelada e posteriormente centrifugadas (5000 x g por 60 minutos a 4ºC). As frações de proteínas de membranas foram transferidas para um novo microtubo e precipitadas em nove volumes de acetona e mantidas durante 120 minutos a -20ºC. Uma nova centrifugação foi realizada (5000 x g, 60 min., 4ºC) e o pellet proteico foi mantido a 4ºC, overnight, para secagem total. As amostras foram então ressuspendidas em 100 µl de tampão de amostra (7 M uréia, 2 M tiouréia, 2% CHAPS, 1% DTT) e armazenadas a -20ºC até posterior quantificação, através do método de Bradford (Bradford, 1976).
3.4 Eletroforese unidimensional
As proteínas dos espermatozoides foram separadas por SDS-PAGE, adaptado de van Tilburg et al. (2013). Amostras dos espermatozoides contendo 30 μg de proteína foram ressuspendidas em 200 µl tampão de amostra (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% (v/v) glicerol, 0,2 M de DTT, 0,02% de azul de bromofenol), aquecidas em água por 90 segundos, e aplicadas nos poços do gel de empilhamento a 4% de poliacrilamida, sobre gel de resolução de poliacrilamida a 12,5%. Para a corrida eletroforética foi utilizado o sistema SE 600 Ruby™ (GE Life Sciences,USA) sobre correntes de 25 mA/gel, 500V, 90W. Em seguida, os géis foram corados por solução azul brilhante de Coomassie (CBB-R250) durante 12 horas, seguindo-se de descoloração com solução de lavagem contendo metanol (40%) e ácido
acético (7%) (RODRIGUES et al., 2013). Após descoloração, o gel foi digitalizado a 300 dpi (Scanner Imagem, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) e analisados utilizando software Quantity One®, v.4.6.3 (Bio-Rad, Rockville, MD, EUA).
3.5 Identificação das proteínas
As bandas proteicas separadas por eletroforese foram recortadas do gel e submetidas a digestão com tripsina, de acordo com o descrito por Fernandes et al. (2018). Em seguida os peptídeos trípticos foram separados em coluna C18 BEH300 (100 μm × 100 mm) usando o sistema nanoAcquity™ (Waters Corp., USA) e eluídos a 600 μL/min com gradiente de acetonitrila (5–85%) contendo 0,1% de ácido fórmico. O sistema de cromatografia líquida foi conectado a uma fonte de ionização de massa nanospray (SYNAPT HDMS system, Waters Corp., USA). O espectrômetro de massa foi operado em modo positivo usando capilar a 90°C e voltagem de 3,5 kV. O instrumento foi calibrado utilizando fragmentos de [Glu1]-fibrinopeptídeo B duplamente protonado (m/z 785,84), e o Lock-mass usado durante aquisição foi o íon intacto. O procedimento de LC-MS/MS foi realizado de acordo com o método de aquisição dependente de dados (DDA), selecionando MS/MS de íons precursores de dupla ou tripla carga. Os íons foram fragmentados por dissociação de colisão induzida usando argônio como gás de colisão e energia de colisão em rampa que variava de acordo com o estado de carga do íon precursor selecionado. A aquisição de dados foi feita em um intervalo m/z de 300 - 1200 para os dados de pesquisa do MS e um intervalo m/z de 50 – 2500 para MS/MS. Os dados foram coletados com o Software MassLynx 4.1 e processados usando o Protein Lynx Global Server 2.4 (Global Server), sendo convertidos para arquivos de lista de picos (.pkl) e
enviados para o servidor MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido, v.2.6) para fazer buscas no banco de dados NCBIprot e SwissProt.
3.6 Ontologia gênica, interação e filogenia
As informações obtidas pelo MASCOT foram analisadas usando o software de busca de anotações de proteínas (STRAP v. 1.5.0.0). Os termos da ontologia gênica para os processos biológicos, componentes celulares e funções moleculares foram obtidos da base de dados do UniProtKB (Bhatia et al., 2009; Fernandes et al., 2018). Já as interações entre proteínas foram analisadas por meio da base de dados STRING v.10.5 (http://stringdb.org). As análises filogenéticas e evolutivas moleculares foram conduzidas usando MEGA versão X (Kumar et al., 2018) utilizando a matriz de distância com algoritmo UPGMA.
4 RESULTADOS
Comparação do SDS-PAGE de espermatozoides das diferentes espécies
O perfil proteico representativo das proteínas de espermatozoides totais das espécies ovino, caprino, suíno, equino e canino estão representados nas figuras 1 a 5. No gel de células espermáticas de ovinos (FIGURA 1) foi observado uma média de 26 bandas por animal com pesos moleculares teóricos (retirados do UniProt) variando entre 4,8 kDa a 274,4 kDa.
Figura 1 - Gel de poliacrilamida de espermatozoides totais de carneiro (Ovis aries). SDS-PAGE de 12,5% corado com coomassie R-250. As amostras O1–O5 correspondem a diferentes machos. B1 a B28 representam os cortes das bandas do gel.
Fonte: A autora.
Para o gel de espermatozoides totais de caprinos (FIGURA 2) foi observado uma média de 23 bandas por animal cujos pesos moleculares teóricos variaram entre 6,8 kDa e 115,8 kDa.
Figura 2 – Gel de poliacrilamida de espermatozoides totais de caprinos. SDS-PAGE de 12,5% corado com coomassie R-250. As amostras C1–C4 correspondem a diferentes machos. B1 a B27 representam os cortes das bandas do gel.
Fonte: A autora.
No gel de células espermáticas totais de equinos (FIGURA 3) observou-se uma média de 31 bandas por animal cuja variação foi de 11 kDa a 287 kDa.
Figura 3 – Gel de poliacrilamida de proteínas de espermatozoides totais de equinos. SDS-PAGE de 12,5% corado com coomassie R-250. As amostras E1–E5 correspondem a diferentes machos. B1 a B32 representam os cortes das bandas do gel.
Fonte: A autora.
Já no gel de espermatozoides totais de suínos (FIGURA 4) foram encontradas uma média de 32 bandas por animal com pesos moleculares teóricos variando entre 11,7 kDa e 572 kDa.
Figura 4 – Gel de poliacrilamida de proteínas de espermatozoides totais de suínos. SDS-PAGE de 10% corado com coomassie R-250. As amostras S1– S5 correspondem a diferentes machos. B1 a B21 representam os cortes das bandas do gel.
Fonte: A autora.
No gel de células espermáticas totais cães (FIGURA 5) foram observadas, em média a quantidade de 27 bandas por animal que apresentaram pesos moleculares teóricos entre 1,5 kDa e 188,4 kDa.
Figura 5 – Gel de poliacrilamida de proteínas de espermatozoides totais de caninos. SDS-PAGE de 10% corado com coomassie R-250. As amostras D1–D4 correspondem a diferentes machos. B1 a B11 representam os cortes das bandas do gel.
Fonte: A autora.
A análise SDS-PAGE das proteínas de espermatozoides totais de ovinos mostrou bandas mais intensas (bandas 24 a 28; FIGURA 1) com baixos pesos moleculares teóricos oscilando entre 13 e 22 kDa. Deste modo foram encontradas proteínas como spermadhesin Z13-like (13,3 kDa), histone H2B subacrosomal variant (14,2), sperm acrosome membrane-associated protein 3 (18 kDa) e phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (22,2 kDa). O gel de caprino apresentou bandas mais intensas em pesos moleculares mais baixos (banda 26; FIGURA 2) com peso molecular teórico médio ente 13 e 15 kDa onde foram identificadas proteínas como spermadhesin-1 (15 kDa) e spermadhesin Z13 (13,3 kDa).
Analisando o gel de proteínas de células espermáticas totais de equino foi possível observar a maior intensidade em bandas de baixo peso molecular, correspondendo as bandas 24 a 32 (FIGURA 3) cujos pesos moleculares teóricos variam entre 11 e 26 kDa. Nas bandas mais intensas estão presentes algumas proteínas como: sperm-associated acrosin inhibitor (11,1 kDa), seminal plasma protein HSP-1-like (16,7 kDa), proteasome subunit beta type-6 (25,5 kDa) e izumo sperm-egg fusion protein 1 (26,5 kDa).
O gel de proteínas de espermatozoides totais de suíno mostrou-se mais bem marcado nas bandas de baixo peso molecular teórico com variação que em vai de 11 a 16 kDa aproximadamente (FIGURA 4). Referente as bandas de menor peso molecular podemos encontrar carbohydrate-binding protein AQN-1 (11,8 kDa), major seminal plasma glycoprotein PSP-I (14,5 kDa), seminal plasma sperm motility inhibitor (15,1 kDa) e lysozyme C-2 (16,4 kDa).
As bandas apresentadas no gel de proteínas contidas nas células espermáticas totais de cão estavam com proteínas de peso molecular teórico intermediário mais bem marcadas nas bandas cuja variação ficou entre 24 e 50 kDa. Para os cães foram identificadas algumas proteínas como ropporin-1A (23,8 kDa) e tubulin alpha-1B chain (50,1 kDa) (FIGURA 5).
Identificação de proteínas
A análise por espectrometria de massa identificou um total de 374 proteínas, sendo estas 128 proteínas únicas entre as espécies estudadas, sendo que nenhuma delas foi comum a todas as espécies avaliadas neste estudo. Por espécie, foi possível identificar o número de 63 proteínas em espermatozoide totais de carneiros, 72 em espermatozoides totais de bodes, 53 em espermatozoides totais de garanhões, 24 em espermatozoides totais de varrões e 28 em espermatozoides totais de cães. Foram encontradas 29, 42, 31, 15 e 11 proteínas únicas de células espermáticas totais de ovinos, caprinos, equinos, suínos e cães respectivamente. Um grupo com 14 proteínas foram compartilhadas em pelo menos 3 espécies (TABELA 1). A lista completa de proteínas, dados espectrométricos, seus respectivos peptídeos e as espécies em que foram identificadas estão descritas no anexo 1.
Tabela 1 - Proteínas de espermatozoides totais identificados por espectrometria de massas em pelo menos três espécies diferentes.
Nome da proteína Nome
Genético Ovino Caprino Equino Suíno Canino
Angiotensin-converting enzyme ACE x x x x
ATP synthase subunit
α MT-ATP6 x x x x Hexokinase 1 HK1 x x x x Malate dehydrogenase MDH1 x x x x Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit β, mitochondrial PDHA2 x x x x succinyl-CoA 3-ketoacid coenzyme A transferase 1, mitochondrial OXCT1 x x x x Citrate synthase CS x x x
Cytochrome c oxidase COX x x x
Glutathione
S-transferase GSTM3 x x x
Lactoferrin LTF x x x
L-amino-acid oxidase IL4I1 x x x
Ras-related protein Rab-2A RAB2A x x x Sorbitol dehydrogenase SORD x x x Sperm acrosome membrane-associated protein 1 SPACA1 x x x
Fonte: elaborada pela autora.
Na tabela 2 algumas proteínas identificadas em espermatozoides totais de ovino apresentaram sequência bastante semelhantes à de outras espécies como a ATP synthase subunit α que mostrou semelhança de 90,27; 86,28 e 85,84% com sequências de proteínas de de espermatozoides totais de caprino, equino e canino respectivamente. Malate dehydrogenase mostrou 92,90; 92,05 e 91,19% com sequências de proteínas de de espermatozoides totais de suíno, equino e canino respectivamente. A cytochrome c oxidase também mostrou grande semelhança: 99,61 e 97,67% para sequências de proteínas de espermatozoides totais de caprino e equino. Já a hexokinase 1 mostrou poucas sequências de proteínas semelhantes entre espermatozoides totais de equino (7,76%) e cão (7,04%; TABELA 2).
Tabela 2 - Comparação da sequência proteínas de espermatozoides totais identificados por espectrometria de massas em pelo menos três espécies diferentes tendo carneiro como referência.
Fonte: elaborada pela autora. Análise filogenética de proteínas
Foram feitas análises filogenéticas utilizando MEGA versão X (Kumar et al., 2018) de seis proteínas identificadas em quatro espécies neste estudo (FIGURAS 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F) e distâncias dessas proteínas utilizando algoritmo UPGMA.
Nome da proteína Nome Genético Caprino Equino Suíno Canino
Angiotensin-converting
enzyme ACE 21,67% 76,16% 75,87%
ATP synthase subunit α MT-ATP6 90,27% 86,28% 85,84%
Hexokinase 1 HK1 7,76% 7,04% Malate dehydrogenase MDH1 92,05% 92,90% 91,19% Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit β, mitochondrial PDHA2 78,26% 80,56% succinyl-CoA 3-ketoacid coenzyme A transferase 1, mitochondrial OXCT1 92,50% 91,73%
Cytochrome c oxidase COX 99,61% 97,67%
Glutathione S-transferase GSTM3 86,96% 89,57%
Lactotransferrin LTF 73,73% 70,34%
L-amino-acid oxidase IL4I1 61,57% 38,64%
Figura 6 - Representação esquemática do processo de análise filogenética de proteínas comparadas em diferentes espécies produzida por algoritmo UPGMA (A: Angiotensin-converting enzyme; B: ATP synthase subunit α; C: Hexokinase 1; D: Malate dehydrogenase; E: Pyruvate dehydrogenase E1; F: Succinyl-CoA 3-ketoacid-coenzyme A transferase; figuras 6A, 6B, 6C, 6D, GE, 6F).
Fonte: A autora.
Foram calculadas as distâncias resultantes da comparação das sequências das seis proteínas identificadas neste estudo em pelo menos quatro espécies utilizando algoritmo UPGMA do software MEGA versão X (Kumar et al., 2018; TABELAS 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F).
C D
E F
Tabela 3 - Matriz de distâncias das proteínas de espermatozoides totais em diferentes espécies utilizando algoritmo UPGMA (figuras A, B, C, D, E e F).
Fonte: elaborada pela autora.
O perfil proteico de espermatozoides totais de ovinos mostrou maior similaridade com perfil de caprinos com 33% de semelhança, seguido de 22, 19 e 9% para equinos, cães e suínos respectivamente. Perfil proteico de spermatozoide totais de caprinos mostrou 21, 16, 7
Angiotensin converting enzyme Ovis aries
Angiotensin converting enzyme Capra hircus 0,8928 Angiotensin converting enzyme Equus caballus 0,1750 0,8512 Angiotensin converting enzyme Sus scrofa 0,1780 0,8483 0,1297 Angiotensin converting enzyme Canis lupus 0,2159 0,8394 0,1087 0,1598
Angiotensin converting enzyme Bos taurus 0,8971 0,0252 0,8547 0,8483 0,8360
Angiotensin converting enzyme Mus musculus 0,2421 0,8493 0,1819 0,1892 0,1895 0,8527 Angiotensin converting enzyme Drosophila melanogaster 0,7694 0,9368 0,7596 0,7492 0,7793 0,9321 0,7669 Angiotensin converting enzyme Homo sapiens 0,2045 0,8277 0,1368 0,1645 0,1593 0,8244 0,1811 0,7740 ATP Syntase Ovis aries
ATP Syntase Capra hircus 0,1024
ATP Syntase Equus caballus 0,1475 0,1630 ATP Syntase Sus scrofa 1,3683 1,4816 1,3683 ATP Syntase Canis lupus 0,1527 0,1841 0,1272 1,3332
ATP Syntase Bos taurus 0,0687 0,0975 0,1630 1,4046 0,1735
ATP Syntase Mus musculus 1,3683 1,4816 1,3683 0,0201 1,3332 1,4046 ATP Syntase Drosophila melanogaster 0,8395 0,9305 0,8615 1,4559 0,8615 0,8615 1,4559 ATP Syntase Homo sapiens 1,3506 1,4618 1,3683 0,0219 1,3332 1,3863 0,0256 1,4559 Hexokinase 1 Ovis aries
Hexokinase 1 Capra hircus 0,3532 Hexokinase 1 Equus caballus 0,0821 0,3363 Hexokinase 1 Sus scrofa 0,0656 0,3271 0,0470 Hexokinase 1 Canis lupus 0,0737 0,3384 0,0458 0,0493
Hexokinase 1 Bos taurus 0,1219 0,3898 0,1023 0,1035 0,1057
Hexokinase 1 Mus musculus 0,1077 0,3659 0,0951 0,1096 0,1347 0,1166 Hexokinase 1 Drosophila melanogaster 1,1075 1,0514 1,0898 1,1097 1,1008 1,1505 1,1299 Hexokinase 1 Homo sapiens 0,0713 0,3354 0,0458 0,0562 0,0446 0,0913 0,0961 1,0877 Malate dehydrogenase Ovis aries
Malate dehydrogenase Capra hircus 1,16490 Malate dehydrogenase Equus caballus 0,03040 1,13943
Malate dehydrogenase Sus scrofa 0,02118 1,16870 0,02732 Malate dehydrogenase Canis lupus 0,07765 1,13465 0,03349 0,03659
Malate dehydrogenase Bos taurus 0,00601 1,13943 0,02424 0,01508 0,03970
Malate dehydrogenase Mus musculus 0,05857 1,13943 0,05224 0,05224 0,06494 0,05224 Malate dehydrogenase Drosophila melanogaster 0,43750 1,34171 0,43286 0,43286 0,42365 0,43286 0,42365 Malate dehydrogenase Homo sapiens 0,05224 1,13943 0,03970 0,04595 0,05224 0,04595 0,03659 0,40998 Pyruvate dehydrogenase E1 Ovis aries
Pyruvate dehydrogenase E1 Capra hircus 1,4071 Pyruvate dehydrogenase E1 Equus caballus 0,0181 1,4177 Pyruvate dehydrogenase E1 Sus scrofa 0,0129 1,3941 0,0234 Pyruvate dehydrogenase E1 Canis lupus 0,0000 1,2040 0,0000 0,0000
Pyruvate dehydrogenase E1 Bos taurus 1,5686 1,9204 1,5841 1,5533 2,3026
Pyruvate dehydrogenase E1 Mus musculus 0,0207 1,3967 0,0260 0,0313 0,0000 1,5841 Pyruvate dehydrogenase E1 Drosophila melanogaster 0,5997 1,3688 0,6044 0,6113 1,2040 1,7047 0,6044 Pyruvate dehydrogenase E1 Homo sapiens 0,0207 1,4071 0,0207 0,0260 0,0000 1,5999 0,0181 0,5997 Succinyl-CoA Ovis aries
Succinyl-CoA Capra hircus 0,6891 Succinyl-CoA Equus caballus 0,3112 0,5967 Succinyl-CoA Sus scrofa 0,3112 0,5749 0,0780 Succinyl-CoA Canis lupus 0,3086 0,6115 0,0842 0,0842
Succinyl-CoA Bos taurus 0,3007 0,6115 0,0656 0,0738 0,0842
Succinyl-CoA Mus musculus 0,3007 0,5821 0,0842 0,0947 0,1075 0,0821 Succinyl-CoA Drosophila melanogaster 0,5909 0,7219 0,5050 0,5082 0,5115 0,5018 0,5082 Succinyl-CoA Homo sapiens 0,3086 0,5967 0,0884 0,1075 0,1118 0,0968 0,0821 0,5082
A B C D E F
e 3% de semelhança com espermatozoides totais de ovinos, equinos, caninos e suínos respectivamente. Já o perfil proteico de células espermáticas totais de cavalos apresentou 14, 16, 12 e 2% de semelhança com células espermáticas totais de carneiros, bodes, cães e suínos. Células espermáticas totais de cães mostraram maior semelhança em seus perfis de proteínas de espermatozoides totais de ovinos e equinos (43%), seguido de caprinos (25%) e suínos (11%). Suínos tiverem seus perfis proteicos de espermatozoides totais mais semelhantes a espermatozoides totais de ovinos (25%), em seguida de caprinos e cães (12%), por último os equinos (8%; TABELA 4), esta espécie foi a que apresentou menor semelhança com as demais.
Tabela 4 - Comparação dos perfis proteicos de espermatozoides totais entre as espécies. Cada valor é o número de proteínas compartilhadas entre duas espécies (coluna × linha) e a porcentagem do perfil proteico da espécie na coluna comum com a espécie na linha é indicada entre parênteses.
Ovino Caprino Equino Canino Suíno
Ovino x 21 (33%) 14 (22%) 12 (19%) 6 (9%)
Caprino 21 (29%) x 16 (22%) 7 (10%) 3 (4%)
Equino 14 (26%) 16 (30%) x 12 (23%) 2 (4%)
Canino 12 (43%) 7 (25%) 12 (43%) x 3 (11%)
Suíno 6 (25%) 3 (12%) 2 (8%) 3 (12%) x Fonte: elaborada pela autora.
Ontologia gênica de proteínas das frações enriquecidas de espermatozoides
De acordo com a ontologia gênica, as proteínas identificadas em espermatozoides totais de ovinos participam de processos celulares (31%), estão presentes na mitocôndria (12%) e citoplasma (12%; FIGURA 7) e apresentam primordialmente atividade catalítica (49%) seguidas de função de ligação (38%).
Figura 7 - Gráficos das anotações da ontologia gênica de espermatozoides totais de carneiros com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C).
Fonte: A autora.
Para as proteínas encontradas em espermatozoides totais de caprinos foi possível observar que as mesmas participam principalmente de processos celulares (44%), processos metabólicos (16%) e regulação (13%). Estão presentes na mitocôndria (25%), núcleo (12%). Assim como em ovinos, espermatozoides totais de caprinos apresentaram majoritariamente atividade catalítica (53%) seguida de função d ligação (39%) (FIGURA 8).
Figura 8 - Gráficos das anotações da ontologia gênica de espermatozoides totais de bodes com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C).
Fonte: A autora.
Para a espécie equina também predominaram proteínas participantes de processos celulares (33%) e de regulação (19%). Tais proteínas compõem principalmente a mitocôndria (17%), meio extracelular (14%), citoplasma (10%). Apresentam função molecular de ligação (45%) e atividade catalítica (39%), citoplasma (12%; FIGURA 9).
Figura 9 - Gráficos das anotações da ontologia gênica de espermatozoides totais de cavalos com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C).
Fonte: A autora.
Em suínos foram observadas majoritariamente proteínas participantes de processos celulares (21%), com interação entre células e organismos (21%) e de regulação (20%). As proteínas de espermatozoides totais de varrões foram observadas em meio extracelular (31%) além de outros componentes celulares (20%). Apresentam em sua maioria função de ligação (60%), seguida de atividade catalítica (33%; FIGURA 10).
Figura 10 - Gráficos das anotações da ontologia gênica de espermatozoides totais de suínos com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C).
Fonte: A autora.
Para os cães, as proteínas identificadas participam principalmente de processos celulares (45%), compõem a mitocôndria (21%) e citoplasma (18%). Nesta espécie foi observada abundância de proteínas com atividade catalítica (48%) e com função molecular de ligação (35%; FIGURA 11).
Figura 11 - Gráficos das anotações da ontologia gênica de espermatozoides totais de cães com base nos seus processos biológicos (A), componentes celulares (B), funções moleculares (C).
Fonte: A autora.
Análise das redes de interações das proteínas dos espermatozoides
As interações foram analisadas por meio do banco de dados STRING v.10.5 (http:// string-db.org). A análise das redes de interação foi realizada para as proteínas ATP synthase subunit α, hexokinase 1, pyruvate dehydrogenase, succinyl-CoA 3-ketoacid-coenzyme, angiotensin-converting enzyme A transferase, malate dehydrogenase encontradas em cinco espécies utilizadas (FIGURA 12).
Figura 12 - Análise in silico das redes de interações interproteicas das proteínas: ATP synthase subunit α (A; MT-ATP6), hexokinase 1 (B; HK1), pyruvate dehydrogenase (C; PDHA2), succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzyme A transferase (D; OXCT1). Essas 4 primeiras proteínas foram identificadas em espermatozoides totais de ovinos, caprinos, equinos e caninos. A proteína angiotensin-converting enzyme (E; ACE2) identificada em espermatozoides totais de ovinos, caprinos, equinos e suínos e a proteína malate dehydrogenase (F, MDH1) observada em espermatozoides totais de carneiros, cavalos, suínos e cães. Linha de cores diferentes representa os tipos de evidências para a associação. (-) Co-expressão; (-) experimentos; (-) textmining; (-) co-ocorrência; (-) banco de dados e (-) homologia.
Fonte: A autora.
5 DISCUSSÃO
O presente estudo identificou um grande número de proteínas presentes nas frações enriquecidas de células espermáticas das espécies estudadas. Esses dados aumentam as informações na literatura sobre a composição proteica de espermatozoides totais de ovinos, caprinos, equinos, suínos e cães, além de identificar similaridades e diferenças entre as espécies, segundo as proteínas identificadas neste estudo.
Interação de proteínas entre as espécies
Um grupo de 14 proteínas foram em expressas em pelo menos três espécies das cinco estudadas (TABELA 1). Dentre elas, a Angiotensin-converting enzyme (ACE), uma carboxipeptidase responsável pela remoção dos dipeptídeos do C terminal de substratos (Corvol et al., 1995). A angiotensina II por sua vez, é relatada atuando no desenvolvimento das espermátides e do espermatozoide maduro e regulação dos processos de capacitação e reação acrossômica (Gur et al., 1998). Segundo estudos realizados por Bromfield et al., (2015), identificaram que a ACE está localizada na região periacrossomal da cabeça do espermatozoide, representando uma peça fundamental nos processos de fertilização. Angiotensinogênio e ACE já foram identificados nos testículos de ratos, além de terem sido encontrados nas células do epidídimo, atuando na formação de angiotensina I (Cushman; Cheung, 1971). Estudos realizados com epidídimos de ratos identificaram altas concentrações de ACE quando comparados a outros órgãos do sistema reprodutor, e essa concentração aumenta após esses animais atingirem a puberdade, podendo estar relacionada de forma positiva com a produção de sêmen (Hohlbregger et al., 1982). Esta proteína (ACE) foi descrita na superfície da peça intermediária e da peça principal do flagelo de espermatozoides de mamíferos (Gatti et al., 1999; Métayer et al., 2002b), sendo ela altamente resistente a redução redox (Moskovitz; Johnson, 2004), resistindo assim ao estresse oxidativo. Ela ainda está relacionada a espermatogênese (Ayaz et al., 2018) e a forma testicular da angiotensina (TACE), tem sido relatada como uma proteína funcional a motilidade e capacitação espermática (Shibahara et al., 2001).
A ATP-synthase, que está presente como um grande complexo de proteínas que catalisam a síntese de ATP (Devenish et al., 2008). Inúmeras alterações intracelulares estão atreladas ao processo de capacitação e reação acrossômica, devido ao efluxo de colesterol que provoca aumentos na fluidez da membrana, fosforilação da tirosina e mudanças no padrão de
motilidade das células espermáticas (Eisenbach; Giojalas, 2006). No entanto, para que tais fenômenos aconteçam é necessário um consumo significativo de energia (Tulsiani et al., 2007), logo a ATP é fonte de energia para a motilidade espermática culminando ao processo de capacitação (Ruiz-Pesini et al., 2007). Ressalta-se que a produção de ATPs utilizada pelos espermatozoides é oriunda de duas vias, a glicólise e a respiração mitocondrial, sendo a primeira produzida na parte principal do flagelo, e a segunda na peça secundária, a qual representa a principal fonte de ATP utilizada pela célula espermática (Ramió-Lluch et al., 2014). Essa síntese ocorre através da catalise que ocorre a partir da transferência de íons H+ entre a subunidade Fo, que é uma subunidade transmembranar e que possui um poro de transferência para à matriz e retorna para a subunidade F1, que é a subunidade catalítica, responsável pela síntese de adenosina trifosfato (ATP). Todas as mudanças sofridas pelo espermatozoide requerem consumo significante de ATP (Tulsiani et al., 2007), sendo que existem duas principais vias para a produção de ATP na célula espermática: através da glicólise que ocorre ao longo de todo o comprimento da peça principal do flagelo e através da respiração mitocondrial, centrada na mitocôndria da peça intermediária. Desta forma, a presença das enzimas ATP synthase faz-se necessária para a síntese de ATP no espermatozoide. A glicólise é a principal via de ATP necessária para a atividade, capacitação e fertilização flagelar espermática (Mukai; Okuno, 2004), e as enzimas desse processo que estão localizadas na região da parte principal do flagelo. Isto coloca as enzimas glicolíticas e a produção de ATP ao longo da maior parte do comprimento do flagelo.
Atividades enzimáticas também exercem influência na espermatogênese por meio de enzimas mitocondriais como a citrate synthase (Ruiz-Pesini et al., 2000). O citrato é a enzima responsável pelo início do ciclo do ácido cítrico, por meio da síntese de citrato a partir de oxalacetato e acetil-CoA (Bonache et al., 2007). Estudos realizados por Novak et al. (2010), identificaram por meio de análise de regressão que embora não houvessem diferenças estatísticas nas taxas de concepção em geral, há confirmação da relação entre a síntese de citrate synthase e altas taxas de fertilidade em garanhões.
Outra proteína identificada a nível mitocondrial nesse estudo foi a cythocrome C oxidase, responsável pela transferência de elétrons do citocromo c, atuando como um facilitador na cadeia transportadora de elétrons, uma vez que por meio dessas reações e maior espaço intramembranar livre ocorre um gradiente eletroquímico através da membrana que facilita a atividade da ATP synthase em converter moléculas de ATP que serão posteriormente
utilizadas como fonte de energia para o espermatozoide. Adicionalmente, além de atuar diretamente na produção de ATP, a cytochrome C oxidase atua como antioxidante para espécies reativas de oxigênio na mitocôndria (Iaffaldano et al., 2010).
A glutathione S-transferase participa como proteína de ligação, auxiliando na interação entre gametas. De modo que o seu mecanismo de proteção específico ainda não foi muito bem elucidado (Kumar et al., 2014). Estudos sugerem que a glutatione S-transferase atue na quebra de pontes de dissulfeto que estão em volta do núcleo do espermatozoide logo após o momento de interação espermatozoide-oócito, o que resultaria na degradação das estruturas que compõe a célula e a seguinte descondensação do núcleo do espermatozoide, contribuindo para a formação do pronúcleo paterno (Hamilton et al., 2017).
A hexokinase 1, por sua vez está presente na região da peça principal do flagelo dos espermatozoides. Sua ação está relacionada a glicólise, pois a mesma sendo a primeira enzima utilizada na via glicolítica, se tornando peça fundamental no processo (Wilson, 1995). Estudos sugerem que um aumento na síntese de hexokinases resulta em aumento da glicólise e maior produção de moléculas de ATP, tendo como produto final maior motilidade para a célula espermática (Nakamura et al., 2008), além de utilizar a energia produzida para converter glicose em glicose-6-fosfato (Punyatanasakchai et al., 2008).
Estudos referentes a lactoferrin associam essa proteína a síntese em diversos tecidos, incluindo o endométrio e o epidídimo, além de estar presente no plasma seminal de garanhões (Inagaki et al., 2002). Foi identificada como biormarcador de fertilidade em elefantes, uma vez que 85% de ejaculados de elefantes asiáticos de alta fertilidade a apresentavam em sua composição (Kiso et al., 2013). Sua expressão está associada a fluidos de variados mamíferos, incluindo o plasma seminal de homens, cães, varrões, ratos e garanhões (Thaler et al., 1990; Kikuchi et al., 2003; Pearl; Roser, 2008), sendo sintetizada no epidídimo de camundongos, varrões, garanhões e nas vesículas seminais de homens (Pearl; Roser, 2008; Yu; Chen; 1993; Wichmann et al., 1989). Algumas propriedades antibióticas e antioxidantes também vem sendo associadas à lactoferrin, devido a sua capacidade de sequestrar íons ferro e dessa forma proteger os espermatozoides contra possíveis patógenos que poderiam danificar a célula espermática (Brock, 2002; Farnaud; Evans, 2003).
A proteína L-amino-acide oxidase (LAAO), geralmente é expressa na cauda do espermatozoide de animais ruminantes. No entanto estudos realizados por Aikten et al.
(2015), identificaram sua presença na cabeça do espermatozoide de equinos, auxiliando na recuperação de motilidade espermática no processo pós-criopreservação e descongelamento.
A malate dehydrogenase está presente no citosol e associadas as vias de pentose-fosfato representam a principal fonte de NADP (Clarenburg, 1992). A enzima malate dehydrogenase dependente de NADP é ativa em ambos os tipos de espermatozoides, maduros e epididimários, sendo encontradas principalmente na peça intermediária de espermatozoides de carneiros, varrões e búfalos (Mann; Lutwak Mann, 1981; Kohsakat et al., 1992) e sua localização pode estar associada aos eventos metabólicos do qual participa, dentre eles a respiração celular (Mann; Lutwak, 1981).
A pyruvate dehydrogenase atua nos processos de capacitação e reação acrossômica por meio da regulação do pH, lactato e cálcio intracelular (Mitra; Shivaji, 2004; Mitra et al., 2005). Os componentes do complexo piruvato encontram-se na peça principal do espermatozoide, viabilizando sua conversão em acetil-CoA fora da mitocôndria (Arcelay et al., 2008; Ijiri et al., 2011). Enquanto isso a proteína RAB2 atua diretamente na espermatogênese, e logo após se enovela como um componente da camada subacrossomal da teca perinuclear auxiliando na formação e desenvolvimento do acrossoma, onde permanecem nos espermatozoides maduros (Mountjoy et al., 2008).
Estudos realizados por Rickard et al. (2015), identificaram sete proteínas associadas positivamente ao congelamento de sêmen, dentre elas o sorbitol dehydrogenase. Os tecidos presentes no trato reprodutivo masculino, com exceção dos testículos, são capazes de produzir sorbitol e frutose (Kobayashi et al., 2002), onde o sorbitol pode substituir a glicose no meio utilizado para capacitação espermática, e consegue induzir um aumento de fosforilação da tirosina semelhante ao que ocorre com a glicose, além de servir como fonte de energia para processos como glicólise e a fosforilação oxidativa (Glander; Dettmer, 1978).
A succinyl-CoA catalisa as reações do metabolismo aeróbico para conversão em moléculas de ATP e CoA (Johnson et al., 1988). Essa enzima afeta a motilidade espermática e participam mais ativamente dos processos metabólicos após o processo de capacitação (Kwon et al., 2014).
Comparação do perfil proteico e filogenia entre as espécies
As frações enriquecidas de espermatozoides de ovinos e caprinos mostraram muitas proteínas em comum entre essas espécies e a sequência de algumas dessas proteínas
mostraram-se bastante semelhantes como a ATP synthase subunit α e a cytochrome c oxidase conforme mostrado na tabela 2. Essas proteínas estão mais relacionadas nas espécies ruminantes do que com as demais espécies estudadas. A ATP synthase subunit α dos espermatozoides totais de ovino mostra sequência de proteínas muito próxima em comparação a de caprino com 0,1024 quando comparada com as demais espécies estudadas (TABELA 3B).
Na tabela 2 algumas proteínas identificadas em espermatozoides totais de ovino apresentaram sequência bastante semelhantes à de outras espécies como a ATP synthase subunit α que mostrou semelhança de 90,27; 86,28 e 85,84% com sequências de proteínas de espermatozoides totais de caprino, equino e canino respectivamente. Malate dehydrogenase mostrou 92,90; 92,05 e 91,19% com sequências de proteínas de espermatozoides totais de suíno, equino e canino respectivamente. A cytochrome c oxidase também mostrou grande semelhança: 99,61 e 97,67% para sequências de proteínas de espermatozoides totais de caprino e equino. Já a hexokinase 1 mostrou poucas sequências de proteínas semelhantes entre espermatozoides totais de equino (7,76%) e cão (7,04%; TABELA 2). O estudo das proteínas contidas nos espermatozoides totais de ovinos também mostrou sequências de proteínas em comum com outras espécies como o caso da malate dehydrogenase que mostrou mais de 90% de similaridade com espermatozoides totais de cavalo, suíno e cão, assim como a succinyl-CoA também apresentou mais de 90% de similaridade para espermatozoides totais de cavalo e cão quando comparada com as sequências de espermatozoide totais de carneiro (TABELA 2). Essas informações podem ser confirmadas observando a árvore filogenética em que essas proteínas mostram-se mais relacionadas do que quando comparada com as sequências aminoácidos da mesma proteína de espermatozoides totais de bode. Podemos inferir que em algum momento as duas sequências da proteína succinyl-CoA divergiram de sua sequência em comum (FIGURA 6F, TABELA 3F).
Neste estudo, a similaridade filogenética de sequências aminoácidos de espermatozoides totais de ovinos e caprinos foi observada para algumas proteínas. Pudemos observar aproximadamente 33% de proteínas em comum para as espécies citadas. Este fato pode ser dar a presença de um ancestral comum para estas espécies. Já o suíno apresentou menor similaridade com as demais espécies estudadas (TABELA 4). Existem poucos estudos de filogenia para caprinos o que possivelmente tenha diminuído a similaridade de sequências proteicas dessa espécie com as demais. Cães apresentaram alta similaridade com ovinos (~
