Modelagem matemática do crescimento de bactérias ácido lácticas em condições isotérmicas e não isotérmicas

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO TECNOLÓGICO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS. FRANCIELI DALCANTON. MODELAGEM MATEMÁTICA DO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS EM CONDIÇÕES ISOTÉRMICAS E NÃO ISOTÉRMICAS. Florianópolis, outubro de 2010.

(2) FRANCIELI DALCANTON. MODELAGEM MATEMÁTICA DO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS EM CONDIÇÕES ISOTÉRMICAS E NÃO ISOTÉRMICAS. Tese submetida ao Curso de PósGraduação em Engenharia de Alimentos como requisito para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia de Alimentos.. Orientadora: Profa Dra. Gláucia Maria Falcão de Aragão Co-orientador: Prof. Dr. João Borges Laurindo Co-orientadora: Profa Dra. Rosa María García-Gimeno. Florianópolis, outubro de 2010. ii.

(3) “Nós devemos ser a mudança que desejamos para o mundo.” Gandhi. “Transportai um punhado de terra todos os dias e fareis uma montanha.” Confúcio. iii.

(4) Dedico este trabalho à minha família.. iv.

(5) AGRADECIMENTOS À Deus, por me permitir concretizar mais um sonho e dar mais um passo em minha caminhada. À minha orientadora Gláucia, pela amizade e grande contribuição nesta etapa da minha formação. Seus ensinamentos, dedicação e presença constante foram fundamentais neste trabalho, seu exemplo de pessoa e profissional é admirado por todos seus alunos. Muito obrigada por todo apoio, confiança e por fazer parte desta etapa da minha vida! Ao meu co-orientador João, pelas fundamentais contribuições, críticas, sugestões e correções para a melhoria deste trabalho. Muito obrigada! À minha co-orientadora Rosa María, que me abriu as portas da Universidade de Córdoba e me forneceu todo apoio necessário para a realização deste trabalho. Agradeço também ao professor Gonçalo, por me receber no departamento e pelas palavras de apoio e carinho. À professora Cleonice, pela contribuição fundamental no início deste trabalho, esclarecendo dúvidas ao longo de todo o doutorado, por estar sempre disposta a me ajudar e por também fazer parte da defesa desta tese. Ao professor Bruno, por me ajudar nas primeiras modelagens há “alguns” anos, pelo apoio ao longo deste caminho, pela amizade e por participar da defesa. Aos professores Agenor, Bernadette e Petrus, por aceitarem participar da defesa desta tese, enriquecendo este trabalho. À minha mãe, Maria Gessi, pelo exemplo de vida, amor, bondade, esforço e apoio incondicional para minha formação. Obrigada por estar sempre presente ao meu lado apesar da distância, e por toda a força enquanto estive na Espanha e por sempre acreditar em mim e me apoiar em todas as decisões. Amo você! Aos meus irmãos, Sidnei e Rodrigo, as minhas cunhadas Tide e Dani, e aos meus amores-sobrinhos, Luiz Henrique, Luiza, João Luiz e Maria Júlia, por estarem sempre presentes apesar da distância, pelo apoio, por acreditarem e apoiarem meus estudos. Obrigada pelo carinho e amor! Amo vocês! Ao meu namorado Francisco, por todo carinho, companheirismo, apoio, paciência e ajuda fundamental em todos os momentos, tanto na parte escrita, quanto na força e incentivo constantes. Obrigada também pelo carinho da sua família. Amo você! Aos bolsistas Silmara, Mariana e Felipe, por terem contribuído na realização dos experimentos, pela dedicação e disponibilidade nas madrugadas e finais de semana. v.

(6) Ao Cristiano, sempre disposto a ajudar, obrigada por toda contribuição “matemática” ao longo de todo o doutorado. Ao projeto PHB, especialmente a Jaci, Jorge, Kelin, Andréa, Márcia e Murilo, por me ajudarem ao longo de todo o doutorado, além das análises, pela companhia nas tantas madrugadas. Muito obrigada a todos! Aos amigos e colegas do ENGEBIO, especialmente as “Glaucetes”, por toda ajuda, compreensão, incentivo e amizade: Déia, Manu, Gisa, Ana Paula, Letícia, Mélodi, Morgana, Beatriz, Denise, Francielo, Américo, Sabrina, Anderson e Adriana. Às minhas amigas Bianca, Franciny, Patty, Kelly, Blenda, Gabi, Marinês e Priscilla por todos os momentos compartilhados, apoio e carinho. Aos colegas e amigos do laboratório da Espanha, por compartilharem momentos de alegria, pelo apoio e ajuda: Yanet, Elena, Fernando, Antonio, Juani, Rafa, Katy, Denisse, Rosa, Loli, Patty e a todos que participaram da análise sensorial. Muito obrigada! As minhas amigas “estrangeiras” Paloma, Yanet e Patty, pela companhia, carinho e amizade fundamentais no estágio da Espanha. Agradeço também a Azahara, Diego e Mayte, pela amizade conquistada nos meses que dividimos a mesma casa. Agradeço também pelo carinho das suas famílias. À UFSC e ao programa de pós-graduação em Engenharia de Alimentos pela oportunidade do desenvolvimento desta pesquisa. À CAPES pelo apoio financeiro tanto no Brasil, quanto na Espanha, que foi fundamental para a execução deste trabalho. À Universidade de Córdoba e ao Laboratório de Bromatologia e Tecnologia de Alimentos da Espanha por terem me recebido e financiado a pesquisa. À todas as pessoas e situações que contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho, as quais, direta ou indiretamente, participaram da minha formação como profissional e ser humano, a minha eterna gratidão.. Este trabalho somente foi concretizado com a participação fundamental de cada um de vocês! Muito obrigada! Fran.. vi.

(7) SUMÁRIO LISTA DE TABELAS ................................................................................................... ix LISTA DE FIGURAS.................................................................................................... xi RESUMO.......................................................................................................................xii ABSTRACT ................................................................................................................. xiv CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO ................................................................................. 15 CAPÍTULO 2 – REVISÃO DA LITERATURA ....................................................... 19 2.1 Bactérias ácido lácticas ......................................................................................... 19 2.2 Deterioração em produtos cárneos ....................................................................... 20 2.3 Importância dos fatores extrínsecos no crescimento microbiano ......................... 22 2.3.1 Temperatura ................................................................................................... 22 2.3.2 Conservantes químicos .................................................................................. 23 2.3.3 pH .................................................................................................................. 24 2.4 Microbiologia preditiva ........................................................................................ 25 2.4.1 Modelos matemáticos .................................................................................... 26 2.5 Validação dos modelos ......................................................................................... 37 CAPÍTULO 3 – MATERIAL E MÉTODOS ............................................................. 41 3.1 Modelagem matemática do crescimento de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus viridescens e Lactobacillus sakei em diferentes temperaturas de incubação. ................................................................................................................... 41 3.1.1 Micro-organismos e meio de cultivo ............................................................. 41 3.1.2 Condições de crescimento ............................................................................. 41 3.1.3 Amostragem .................................................................................................. 42 3.1.4 Modelagem matemática das curvas de crescimento das BAL ...................... 42 3.1.5 Comparação estatística dos modelos ............................................................. 44 3.2 Modelagem matemática do crescimento de Lactobacillus plantarum sob condições não isotérmicas. ......................................................................................... 45 3.2.1 Micro-organismo e meio de cultivo............................................................... 45 3.2.2 Condições de crescimento ............................................................................. 45 3.2.3 Amostragem .................................................................................................. 46 3.2.4 Modelagem matemática sob condições de temperaturas variáveis ............... 46 3.2.5 Comparação estatística dos modelos ............................................................. 48 3.3 Modelagem dos efeitos combinados da temperatura, pH, cloreto de sódio e lactato de sódio na velocidade de crescimento de Lactobacillus plantarum. ........................ 49 3.3.1 Micro-organismo e preparo do inóculo ......................................................... 49 3.3.2 Delineamento experimental e obtenção dos dados experimentais ................ 49 3.3.3 Modelagem matemática da velocidade de crescimento de L. plantarum ...... 54 3.3.4 Validação do modelo preditivo ..................................................................... 57 3.3.5 Critérios de avaliação .................................................................................... 57 3.4 Modelagem matemática do crescimento de Lactobacillus plantarum em chopped suíno cozido embalado a vácuo e armazenado em diferentes temperaturas............... 58 3.4.1 Amostras do produto cárneo .......................................................................... 58 3.4.2 Análises microbiológicas e físico-químicas .................................................. 59 3.4.3 Análise sensorial e determinação da vida de prateleira ................................. 60 3.4.4 Modelagem matemática do crescimento de L. plantarum no produto cárneo61 3.4.5 Análises estatísticas ....................................................................................... 62 CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................... 63. vii.

(8) 4.1 Modelagem matemática do crescimento de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus viridescens e Lactobacillus sakei em diferentes temperaturas de incubação. ................................................................................................................... 64 4.1.1 Artigo 1: Modeling of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus viridescens and Lactobacillus sakei growth at different temperatures ...................................... 66 4.1.2 Informações complementares ........................................................................ 83 4.1.3 Nomenclatura................................................................................................. 91 4.2 Modelagem matemática do crescimento de Lactobacillus plantarum sob condições não isotérmicas. ......................................................................................... 92 4.2.1 Artigo 2: Mathematical modeling of Lactobacillus plantarum growth under variable temperature conditions.............................................................................. 92 4.2.2 Informações complementares ...................................................................... 109 4.2.3 Nomenclatura............................................................................................... 112 4.3 Modelagem dos efeitos combinados da temperatura, pH, cloreto de sódio e lactato de sódio na velocidade de crescimento de Lactobacillus plantarum. ...................... 113 4.3.1 Artigo 3: Modeling the combined effects of temperature, pH, sodium chloride and sodium lactate concentrations on Lactobacillus plantarum growth rate ....... 113 4.3.2 Informações complementares ...................................................................... 134 4.3.3 Nomenclatura............................................................................................... 137 4.4 Modelagem matemática do crescimento de Lactobacillus plantarum em chopped suíno cozido embalado a vácuo e armazenado em diferentes temperaturas............. 138 4.4.1 Artigo 4: Growth modeling of Lactobacillus plantarum in vacuum-packaged cooked chopped pork at different temperatures ................................................... 138 4.4.2 Informações complementares ...................................................................... 155 4.4.3 Nomenclatura............................................................................................... 159 4.5 Avaliação da capacidade preditiva dos modelos secundários. ........................... 160 CAPÍTULO 5 - CONCLUSÕES ............................................................................... 167 CAPÍTULO 6 - SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS......................... 169 CAPÍTULO 7- REFERÊNCIAS ............................................................................... 170 ANEXOS ..................................................................................................................... 187 Anexo I ......................................................................................................................... 188 Anexo II ........................................................................................................................ 190. viii.

(9) LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 3 - MATERIAIS E MÉTODOS Tabela 3.1. Modelos primários usados para ajustar os dados de crescimento das BAL. 43 Tabela 3.2. Modelos secundários usados para descrever a influência da temperatura nos parâmetros de crescimento das BAL. ............................................................................. 44 Tabela 3.3. Índices estatísticos para comparação dos modelos. ..................................... 45 Tabela 3.4. Valores utilizados no Delineamento Composto Central Rotacional para a elaboração do modelo preditivo de crescimento de L. plantarum. ................................. 50 Tabela 3.5. Ensaios experimentais extras realizados para a validação do modelo preditivo. ......................................................................................................................... 51 CAPÍTULO 4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO Artigo 1 Table 1. Primary growth models used to fit the growth of LAB. ................................... 69 Table 2. Secondary models used to describe the influence of temperature on the growth parameters of LAB. ........................................................................................................ 70 Table 3. Statistical indices for comparison of the models. ............................................. 71 Table 4. Range of statistical indices values for Gompertz, Logistic, modified Logistic, and Baranyi-Roberts models, obtained by fitting the growth curves of L. plantarum at six temperatures. ............................................................................................................. 72 Table 5. Range of statistical indices values for Gompertz, Logistic, modified Logistic, and Baranyi-Roberts models, obtained by fitting the growth curves of L. viridescens at six temperatures. ............................................................................................................. 73 Table 6. Range of statistical indices values for Gompertz, Logistic, modified Logistic, and Baranyi-Roberts models, obtained by fitting the growth curves of L. sakei at six temperatures.................................................................................................................... 74 Table 7. Secondary models for L. plantarum, L. viridescens and L. sakei growth parameters. ...................................................................................................................... 79 Informações Complementares Tabela 4.1. Coeficientes de correlação (R2) obtidos pelos ajustes dos modelos secundários que descrevem a influência da temperatura nos parâmetros de crescimento λ (h), µ (h-1) e A de L. plantarum, L. viridescens e L.sakei. .......................................... 83 Tabela 4.2. Valores dos índices estatísticos para os modelos da raiz quadrada e potência, ajustados aos valores de µ (h-1) de L. plantarum, L. viridescens e L. sakei em função da temperatura. .................................................................................................................... 84 Tabela 4.3: Valores dos parâmetros de crescimento observados (Obs) e preditos (Pred) pelos modelos secundários de L. plantarum, L. viridescens e L. sakei e os valores dos índices estatísticos (bias e exatidão) calculados para estes modelos. ............................. 86 Artigo 2 Table 1. The mean values and standard deviation for growth parameters of Lactobacillus plantarum at different temperatures. ....................................................... 99 Table 2. Statistical indices L. plantarum at different temperatures profiles................. 105. ix.

(10) Informações Complementares Tabela 4.4. Valores dos parâmetros e índices (Equação 5) definidos para os diferentes perfis de temperatura 4-12°C, 5-15°C e 20-30°C......................................................... 111 Artigo 3 Table 1. Kinetic parameters (λ and µ) of experiments from previous data of Lactobacillus plantarum and calculated K. .................................................................. 121 Table 2. Observed (Obs) and predicted growth rate (µ, h-1) by response surface model (RSM) of L. plantarum for the central composite rotatable design. ............................ 122 Table 3. Regression coefficient results from the results of the central composite rotatable design. ............................................................................................................ 123 Table 4: Analysis of variance (ANOVA) of the predictive model obtained for growth rate according to the CCRD. ........................................................................................ 123 Table 5. Observed (Obs) and predicted growth rate (µ) by response surface model (RSM) of L. plantarum for mathematical validation.................................................... 128 Artigo 4 Table 1. Lactobacillus plantarum growth parameters and statistical indices obtained by fitting the Gompertz model to the growth curves determined at different temperatures for vacuum-packaged cooked chopped pork. ............................................................... 145 Table 2. Sensorial attributes mean for vacuum-packaged cooked chopped pork at different storage temperatures (4, 10 and 16°C). ......................................................... 149. x.

(11) LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 2 - REVISÃO DA LITERATURA Figura 2.1. Curva típica de crescimento microbiano em função do tempo.. .................. 27 Figura 2.2. Representação gráfica do modelo linear de três fases. ................................. 31 CAPÍTULO 3 - MATERIAL E MÉTODOS Figura 3.1. Exemplo de placa do Bioscreen C usada na realização dos experimentos, onde os poços são preenchidos com diferentes meios MRS. ......................................... 53 Figura 3.2: Bioscreen C utilizado neste trabalho ............................................................ 53 Figura 3.3. Chopped em latas fornecido pela indústria e o produto fatiado. .................. 59 CAPÍTULO 4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 4.1: Valores dos parâmetros de crescimento calculados a partir dos dados de absorbância a diferentes níveis de inóculo (Log UFC/mL) de L. plantarum em MRS a 30°C.. .............................................................................................................................. 65 Artigo 1 Figure 1. Example of L. plantarum growth curves in MRS broth at different temperatures.................................................................................................................... 75 Figure 2. Example of L. viridescens growth curves in MRS broth at different temperatures.................................................................................................................... 76 Figure 3. Example of L. sakei growth curves in MRS broth at different temperatures .. 76 Figure 4. Temperature effect on the LAB growth parameters. ...................................... 78 Informações Complementares Figura 4.2. Relação entre os parâmetros de crescimento observados vs preditos pelos modelos secundários obtidos para L. plantarum.. .......................................................... 87 Figura 4.3. Relação entre os parâmetros de crescimento observados vs preditos pelos modelos secundários obtidos para L. viridescens.. ......................................................... 88 Figura 4.4. Relação entre os parâmetros de crescimento observados vs preditos pelos modelos secundários obtidos para L. sakei ..................................................................... 89 Figura 4.5. Exemplo das análises de pH de L. plantarum nas diferentes temperaturas ao longo do tempo. .............................................................................................................. 90 Figura 4.6: Acompanhamento da curva de crescimento (■) e do pH (□) no cultivo de L. plantarum a 30°C. .......................................................................................................... 90 Artigo 2 Figure 1. Example of L. plantarum isothermal growth curves in MRS broth at different temperatures.................................................................................................................... 98 Figure 2. Temperature effect on the Lactobacillus plantarum growth parameters ...... 100 Figure 3. Growth curves of L. plantarum under non-isothermal conditions ................ 103 Figure 4. Growth curves of Lactobacillus plantarum under non-isothermal conditions. Top: the experimental and predicted growth curves .................................................... 104 Informações Complementares Figura 4.7. Curvas de crescimento de Lactobacillus plantarum sob condições isotérmicas e não isotérmicas.. ..................................................................................... 110 xi.

(12) Figura 4.8. Exemplo do acompanhamento do pH durante o cultivo de L. plantarum sob condições não isotérmicas.. .......................................................................................... 111 Artigo 3 Figure 1. Response surfaces and contour curves for the growth rate (µ, h-1) of L. plantarum ..................................................................................................................... 125 Informações Complementares Figura 4.9. Curvas de crescimento de Lactobacillus plantarum .................................. 135 Figure 4.10. Relação entre a concentração celular (Log N (UFC/mL)) e os dados de absorbância (Log10 abs) de Lactobacillus plantarum a 30°C. ...................................... 135 Figura 4.11. Representação gráfica da velocidade de crescimento (h-1) observada e predita pelo modelo da superfície de resposta, nas condições do delineamento experimental (a) e nas condições da validação matemática (b).................................... 136 Artigo 4 Figure 1. Lactobacillus plantarum growth curves fitted by Gompertz model in slices of vacuum-packaged cooked chopped pork at different storage temperatures. ................ 144 Figure 2. Behavior of pH values during the growth of L. plantarum (CFU/g) in slices of vacuum-packaged cooked chopped pork at different storage temperatures. ................ 147 Figure 3. Linear regression of the sensorial global quality (Q) over time (days), at storage temperatures of 4°C (a), 10°C (b) and 16°C (c). ............................................. 150 Informações Complementares Figura 4.12. Efeito da temperatura nos parâmetros de crescimento de Lactobacillus plantarum em chopped ................................................................................................. 156 Figura 4.13: Exemplo dos dados de crescimento de BAL ( ● ) e contagem total (-∆-) em chopped, armazenado em condições de aerobiose (coluna 1) e a vácuo (coluna 2), nas temperaturas de 4°C (a), 10°C (b) e 16°C (c). ....................................................... 157 Figura 4.14. Valores de pH para as amostras de chopped embalado em aerobiose (a) e a vácuo (b) nas temperaturas de 4°C (□), 10°C (∆) e 16°C (○) ...................................... 157 Figura 4.15. Predição da curva de crescimento de Lactobacillus plantarum inoculado em chopped sob condições não isotérmicas. ................................................................ 158 Avaliação da capacidade preditiva dos modelos secundários. Figura 4.16. Comparação entre os modelos preditos para a fase lag (λ) de L. plantarum, L. viridescens e L. sakei em meio MRS e a fase lag de BAL em diferentes produtos cárneos .......................................................................................................................... 161 Figura 4.17. Comparação entre os modelos preditos para a velocidade de crescimento (µ) de L. plantarum, L. viridescens e L. sakei cultivadas em meio MRS, e L. plantarum cultivada em meio MRS modificado ............................................................................ 163 Figura 4.18. Comparação dos modelos preditos para o aumento logarítmico da população (A) de L. plantarum, L. viridescens e L. sakei cultivadas em meio MRS e o aumento logarítmico da população observado em diferentes produtos cárneos .......... 163 Figura 4.19 Comparação das curvas de crescimento construídas a partir do modelo de Gompertz modificado utilizando-se os parâmetros de crescimento obtidos para L. plantarum, L. viridescens, L. sakei e dados da literatura.............................................. 165. xii.

(13) RESUMO As bactérias ácido lácticas (BAL) são um dos principais grupos de micro-organismos responsáveis pela deterioração de produtos cárneos embalados a vácuo e em atmosfera modificada, armazenados sob temperatura de refrigeração. A microbiologia preditiva é considerada uma importante ferramenta para quantificar e predizer o comportamento microbiano sob influência de diferentes fatores ambientais, como por exemplo, a temperatura. Assim sendo, o objetivo geral deste trabalho foi modelar o crescimento de BAL em condições isotérmicas e não isotérmicas de cultivo. Primeiramente foram ajustados quatro modelos primários às curvas de crescimento de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus viridescens e Lactobacillus sakei em meio de cultivo MRS sob seis diferentes temperaturas isotérmicas (entre 4°C e 30°C), sendo que o modelo primário que apresentou melhor ajuste aos dados experimentais foi o modelo de Gompertz. Foram avaliados também cinco modelos secundários, sendo que a influência da temperatura foi melhor descrita pela equação da potência para a fase lag (λ), o modelo da raiz quadrada para a velocidade de crescimento (µ) e a equação do tipo Arrhenius para o aumento logarítmico da população (A). Com base nos modelos selecionados, foi estabelecido um modelo de crescimento não isotérmico, baseado na metodologia proposta por Corradini e Peleg. O modelo proposto foi validado com dados experimentais de L. plantarum em meio MRS sob três diferentes perfis de temperatura. A partir de um delineamento composto central rotacional, um modelo de superfície de resposta foi estabelecido para predizer a velocidade de crescimento de L. plantarum em meio MRS, sob diferentes temperaturas (4°C a 16°C), pH (5,5 a 7,5), NaCl (0 a 6%) e Na-lactato (0 a 4%). Todos os fatores estudados foram estatisticamente significativos (p < 0,10) no intervalo de confiança estudado e usados para a construção do modelo, sendo que o fator que apresentou a maior significância foi a temperatura, seguido pelo NaCl, Na-lactato e pH. Este modelo de superfície de resposta foi validado matematicamente com condições adicionais realizadas dentro do domínio do delineamento experimental. O crescimento de L. plantarum também foi analisado quando esta bactéria foi inoculada em um produto cárneo, chopped suíno cozido, embalado a vácuo e armazenado sob diferentes temperaturas isotérmicas (4°C, 10°C e 16°C). O modelo primário de Gompertz ajustou-se bem às curvas de crescimento e os modelos secundários foram os mesmos selecionados no caso do crescimento da bactéria em meio MRS. Não foram observadas mudanças sensoriais no produto quando L. plantarum atingiu a população máxima (107 UFC/mL). Os modelos preditivos estabelecidos neste estudo podem ser úteis para predizer, dentro dos limites estabelecidos para cada modelo, o comportamento de bactérias ácido lácticas em produtos cárneos. Palavras-chave: bactérias ácido lácticas, microbiologia preditiva, temperatura, modelo de crescimento não isotérmico.. xiii.

(14) ABSTRACT Lactic acid bacteria (LAB) are the main microorganism group responsible for the spoilage of modified atmosphere or vacuum-packaged meat products, stored under refrigeration. The predictive microbiology is an important tool to quantify and predict microbial behavior under the influence of different environmental factors, such as temperature. Then, the overall aim of this study was to model the LAB growth in isothermal and non-isothermal conditions. Firstly, four primary models were fitted to the growth curves of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus viridescens and Lactobacillus sakei in MRS broth under six different isothermal temperatures (4°C to 30°C), being the Gompertz model the primary model that showed the best fit to the experimental data. Five secondary models were also evaluated, and the influence of temperature on the lag phase duration (λ) was better described by the power equation, the square root for the maximum specific growth rate (µ), and the Arrhenius-type equation for the microbial population increase (A). Based on selected models, the nonisothermal growth model was established, based on the methodology proposed by Corradini and Peleg. The model proposed was validated with experimental growth curves of L. plantarum in MRS obtained under three periodic temperature profiles. From a central composite rotatable design, the response surface model was established to predict L. plantarum growth rate in MRS broth, under different temperatures (4°C to 16°C), pH (5.5 to 7.5), NaCl (0 to 6%) and Na-lactate (0 to 4%). All the factors were statistically significant (p < 0.10) and used to build the model, where the temperature was the most decisive factor, followed by the concentrations of NaCl and Na-lactate and by the pH. This model was mathematically validated with additional conditions within model range. L. plantarum growth was also analyzed when this bacteria was inoculated in a meat product, cooked chopped pork, vacuum packaged and stored under different isothermal temperatures (4°C, 10°C and 16°C). The Gompertz model showed a good fit to growth curves and the secondary models were the same ones selected in the case of growth in MRS broth. There were no sensory changes in the product when L. plantarum reached the maximum population. The predictive models established in this study can be useful for predicting, within the limits set for each model, the behavior of lactic acid bacteria in meat products. Keywords: lactic acid bacteria, predictive microbiology, temperature, non-isothermal growth model.. xiv.

(15) CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO A deterioração dos alimentos devido à ação de micro-organismos é um problema de grande importância econômica e social, que afeta tanto as indústrias de alimentos como os consumidores (ZURERA-COSANO et al., 2006). O comportamento dos micro-organismos nos alimentos é determinado pelas propriedades destes alimentos, bem como pelas condições de armazenamento (NAKASHIMA et al., 2000). Em especial, no caso das carnes e dos produtos cárneos, devido à sua alta atividade de água (aw), presença de nutrientes e condições favoráveis de pH, estes produtos são especialmente susceptíveis à deterioração microbiana. As bactérias ácido lácticas (BAL) foram identificadas como a principal população deteriorante de produtos cárneos embalados a vácuo e em atmosfera modificada, além de outros produtos cárneos processados armazenados sob temperatura de refrigeração (BORCH et al., 1996; HUGAS, 1998; NYCHAS et al., 2008). A deterioração causada por estas bactérias é primordialmente devido à produção de metabólitos que causam mudanças indesejáveis na aparência, textura e flavor do alimento, produzindo odores e sabores desagradáveis, além de formar limo na superfície dos produtos (SAMELIS et al., 2000; CAYRÉ et al., 2003). Dentre os principais fatores responsáveis pelas reações de deterioração nos alimentos, especialmente na deterioração microbiana, a temperatura é o que apresenta maior destaque, uma vez que os parâmetros cinéticos de crescimento são altamente dependentes deste fator (GIANNUZZI et al., 1998; LABADIE, 1999). Portanto, é essencial o controle da temperatura ao longo de toda cadeia de frio, caso contrário pode ocorrer o desenvolvimento microbiano rápido, diminuindo a vida de prateleira do produto e podendo colocar em risco a saúde do consumidor (MASSAGUER, 2005). Neste sentido, diversos estudos têm sido realizados para avaliar a importância da temperatura no armazenamento de produtos cárneos, focando no efeito dos abusos de temperatura, bem como nas variações da mesma durante o armazenamento, interferindo diretamente na qualidade e na segurança destes produtos (KOUTSOUMANIS et al., 2005; McMEEKIN et al., 2006; PELEG, 2006). Além do controle da temperatura, muitas estratégias são utilizadas nas indústrias de alimentos para aumentar a vida de prateleira dos produtos, como o uso de agentes 15.

(16) químicos. Dentre estes compostos, o cloreto de sódio (NaCl) é o mais importante a ser adicionado aos alimentos, pois exerce um efeito bacteriostático, além de realçar o sabor dos mesmos (NEUMEYER et al., 1997). Outros sais, como o lactato de sódio (Nalactato), têm sido usados para controlar o crescimento microbiano, aumentando assim a vida de prateleira de produtos cárneos (DEVLIEGHERE et al., 2000). Este sal também melhora os atributos sensoriais, além de minimizar a oxidação lipídica (MANCINI et al., 2010; ZHOU et al., 2010). Deste modo, torna-se importante o estudo das interações entre os diferentes fatores ambientais que afetam a capacidade de sobrevivência e de multiplicação dos micro-organismos. O contínuo progresso da ciência e da tecnologia na preservação dos alimentos envolve o desenvolvimento de novas ferramentas na microbiologia de alimentos. Neste contexto, a necessidade de garantir a segurança microbiológica e a qualidade dos alimentos tem estimulado a aplicação das ferramentas da microbiologia preditiva (NAKASHIMA et al., 2000). No campo da pesquisa, que basicamente se concentra no desenvolvimento de modelos matemáticos para descrever o crescimento de microorganismos patogênicos e deteriorantes em alimentos, tem havido um crescente interesse na aplicação desta ferramenta (ANTWI et al., 2008). Os modelos matemáticos preditivos têm sido usados para quantificar e predizer o comportamento microbiano sob diferentes condições ambientais (fatores intrínsecos e extrínsecos), tais como a temperatura, pH, aw, condições de embalagem, entre outros (ZWIETERING et al., 1990; BRUL et al., 2008). Dentre estes, os modelos primários descrevem o comportamento dos micro-organismos com o tempo e os modelos secundários demonstram como os parâmetros obtidos nos modelos primários se comportam com a variação de um ou mais fatores ambientais. Muitos modelos matemáticos são baseados em condições ambientais constantes para determinar os valores dos parâmetros cinéticos de crescimento. No entanto, condições tais como temperatura, pH ou composição da atmosfera gasosa nem sempre se mantêm constantes durante o armazenamento de alimentos refrigerados. Devido a isto, nos últimos anos, a modelagem matemática está orientada para obtenção de modelos dinâmicos, ou seja, modelos que permitam predizer a segurança ou vida útil dos alimentos sob condições que variam com o tempo, principalmente condições não isotérmicas (CORRADINI et al., 2006; SMITH-SIMPSON et al., 2007; VELOGUTI et al., 2010).. 16.

(17) Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi modelar o crescimento de bactérias ácido lácticas em condições isotérmicas e não isotérmicas de cultivo, trabalhando em um sistema in vitro e aplicando ao produto. Para atingir este objetivo geral, foram estabelecidos os seguintes objetivos específicos: • Obter os parâmetros de crescimento (duração da fase lag (λ), velocidade específica máxima de crescimento (µ) e aumento logarítmico da população (A)) de L. plantarum, L. viridescens e L. sakei em meio de cultivo MRS sob diferentes condições isotérmicas de incubação, pelo ajuste e comparação de diferentes modelos primários aos dados experimentais; • Escolher o melhor modelo secundário para descrever a influência da temperatura sobre os parâmetros de crescimento obtidos pelo ajuste do modelo primário selecionado; • Estabelecer de um modelo preditivo do crescimento de L. plantarum em condições não isotérmicas, a partir do modelo primário e dos modelos secundários obtidos em condições isotérmicas; • Validar o modelo não isotérmico proposto com a realização de cultivos de L. plantarum em meio MRS sob condições de temperatura variáveis; • Estabelecer e validar um modelo para descrever os efeitos combinados de diferentes temperaturas, pH, NaCl e Na-lactato sobre a velocidade de crescimento de L. plantarum em meio MRS, através de um delineamento composto central rotacional; • Avaliar e modelar o crescimento de L. plantarum inoculado em fatias de chopped suíno cozido embaladas a vácuo sob diferentes temperaturas de armazenamento; • Avaliar a relação entre o crescimento de L. plantarum e a qualidade sensorial do produto cárneo analisado. • Comparar a capacidade preditiva dos modelos obtidos em meio de cultura para descrever o crescimento de BAL em diferentes produtos cárneos.. Para tanto, este trabalho está estruturado em capítulos, onde a introdução é apresentada neste capítulo 1, e no capítulo 2 a revisão da literatura, abordando os assuntos referentes ao tema proposto neste trabalho. No capítulo 3, estão descritos os materiais e métodos utilizados no desenvolvimento do trabalho, sendo que os itens 3.1 e 17.

(18) 3.2 foram desenvolvidos no Laboratório de Engenharia Bioquímica da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), e os itens 3.3 e 3.4 foram desenvolvidos no Laboratório de Bromatologia e Tecnologia de Alimentos da Universidade de Córdoba (UCO), Espanha, sob orientação da Profa Rosa María García-Gimeno. Os resultados e as discussões estão apresentados no capítulo 4, sendo que este capítulo está apresentado sob a forma de artigos. No capítulo 5 estão as conclusões, no capítulo 6 as sugestões para trabalhos futuros e no capítulo 7 as referências da literatura.. 18.

(19) CAPÍTULO 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Bactérias ácido lácticas As bactérias ácido lácticas (BAL) compreendem um grupo amplo de microorganismos, mas que apresentam características morfológicas, metabólicas e fisiológicas comuns. São bactérias Gram positivas, geralmente imóveis, apresentam-se sob a forma de cocos ou bacilos não esporulados, que obtêm sua energia pela fermentação de carboidratos produzindo ácido lático, podendo ser homo ou heterofermentativas. As homofermentativas produzem ácido lático como produto principal da fermentação da glicose e as heterofermentativas produzem menos ácido lático, além de produzirem etanol e, em alguns casos, ácido acético e dióxido de carbono (CO2) (MASSAGUER, 2005; FRANCO e LANDGRAF, 1996). As BAL se subdividem em quatro gêneros: Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc e Lactobacillus. As BAL têm sua importância na preservação dos alimentos, interferindo na multiplicação de bactérias deteriorantes e patogênicas por meio de mecanismos como: competição por oxigênio, produção de substâncias antagônicas, especialmente bacteriocinas, entre outros (AMMOR et al., 2006). Entretanto, o crescimento incontrolável de algumas espécies de BAL pode causar deterioração em carnes e produtos cárneos. As BAL foram identificadas como a maior população deteriorante de produtos embalados a vácuo e em atmosfera modificada, além de outros produtos cárneos processados armazenados sob temperatura de refrigeração. A deterioração causada por estas bactérias é primordialmente devido à produção de metabólitos que causam mudanças indesejáveis na aparência, textura e flavor do alimento, produzindo odores e sabores desagradáveis, além de formar limo na superfície dos produtos (BORCH et al., 1996; SAMELIS et al., 2000; CAYRÉ et al., 2003; NYCHAS et al., 2008). Linhagens de BAL geralmente consideradas como naturais em carnes e produtos cárneos são: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus curvatus e Leuconostoc mesenteroides (HUGAS, 1998). Entre estas, L. plantarum, L. sakei e L. viridescens são as estudadas neste trabalho.. 19.

(20) Farag e Korashy (2006), após isolarem as principais bactérias presentes em amostras de carne e de alguns produtos cárneos (carne picada, hambúrguer, salsicha, entre outros), chegaram à conclusão que as bactérias predominantes em todas as amostras examinadas eram: Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum e Leuconostoc mesenteriodes. Zwietering et al. (1991) modelaram curvas de crescimento de L. plantarum em meio MRS a diferentes temperaturas de incubação, e Van Impe et al. (1995) utilizaram os dados deste micro-organismo deteriorante para estabelecer o modelo dinâmico de crescimento e inativação. García-Gimeno et al. (2002) estudaram a aplicação dos modelos baseados em redes neurais, para a verificação dos efeitos da concentração de NaCl, pH e temperatura de armazenamento, nos parâmetros de crescimento de L. plantarum, por considerar que este micro-organismo era um importante deteriorante de produtos cárneos. Devlieghere et al. (1998) isolaram L. sakei de presunto cozido e consideraram esta bactéria como representativa na deterioração de produtos cárneos cozidos e embalados em atmosfera modificada, avaliando o efeito de diferentes concentrações de CO2 e temperatura no crescimento deste micro-organismo. Por sua vez, Vaikousi et al. (2009) avaliaram a aplicabilidade de um indicador microbiano de tempo e temperatura para monitorar a deterioração de carne picada embalada em atmosfera modificada, sendo que o micro-organismo indicador utilizado foi L. sakei. Em outro estudo, Nicolai et al. (1993) observaram que, em carnes embaladas a vácuo, a deterioração a temperaturas abaixo de 20°C foi dominada pelo crescimento de BAL. Algumas espécies heterofermentativas como os L. viridescens podem produzir peróxidos que reagem com os pigmentos da carne, causando o esverdeamento da mesma. Park et al. (2001) descrevem L. viridescens como um dos principais microorganismos deteriorantes de carnes processadas e investigaram o efeito do tratamento de alta pressão hidrostática sobre este micro-organismo. 2.2 Deterioração em produtos cárneos Entre os vários parâmetros que podem determinar a qualidade de um alimento, os mais importantes são aqueles que definem as suas características microbiológicas. (FRANCO e LANDGRAF, 1996). A carne e os produtos cárneos, devido à sua alta atividade de água (aw), pH e presença de nutrientes, são sensíveis à deterioração 20.

(21) microbiana (PEXARA et al., 2002). A quantidade e os tipos de micro-organismos que irão se desenvolver nos produtos cárneos, dependem desde a qualidade das matérias primas, passando pelo processamento, distribuição, armazenamento, até o momento do consumo (VELD, 1996; TERRA, 2000). As alterações indesejáveis nos alimentos levam a grandes perdas econômicas para as indústrias, tornando fundamental a aplicação de tecnologias para conseguir produtos com maior qualidade. A temperatura e a atmosfera que envolve os produtos alimentícios durante o armazenamento, são parâmetros sobre os quais a maioria das indústrias intervêm para garantir a qualidade do alimento e, desta maneira, estender sua vida de prateleira (PEXARA et al., 2002). As embalagens a vácuo ou com atmosfera modificada são técnicas de proteção amplamente aplicadas na indústria de carnes, retardando o desenvolvimento microbiano e os processos oxidativos nos produtos (GRAY et al., 1996; KOUTSOUMANIS et al., 2008). Segundo a ANVISA (2001), entende-se por produto alterado ou deteriorado aquele que apresenta alterações e ou deteriorações físicas, químicas e ou organolépticas, em decorrência da ação de micro-organismos e ou por reações químicas e ou físicas. As alterações nos produtos cárneos podem ser evidentes em alguns casos (danos físicos, crescimento visível de fungos, mudanças na cor ou odores estranhos), no entanto, são mais difíceis de detectar a simples vista, quando as alterações são devido à reações físico-químicas e ou microbiológicas, que desencadeiam mudanças na textura, perda de sabor, formação de metabólicos, entre outros (VELD, 1996; RODRÍGUEZ-PÉREZ, 2004). Entre as reações físico-químicas se destacam as mudanças na cor e a formação de odores e sabores estranhos, como por exemplo, a rancificação, devido aos processos de oxidação, calor, entre outros. Assim, o estudo das interações físico-químicas e microbiológicas torna-se de grande importância para se ter um melhor e mais completo conhecimento nos mecanismos de alteração dos alimentos (VELD, 1996). Entretanto, a determinação na qualidade de um alimento também deve ser analisada do ponto de vista sensorial, de forma conjunta com as análises microbiológicas e físico-químicas. Por isto as indústrias de produtos cárneos utilizam a análise sensorial como uma importante, e cada vez mais crescente, ferramenta no desenvolvimento, otimização, controle de qualidade e avaliação de mercado de um determinado produto (STONE e SIDEL, 2004; SLONGO, 2008).. 21.

(22) Desta maneira, é importante avaliar a qualidade dos produtos cárneos realizando tanto análises microbiológicas e/ou físico-químicas, além da determinação da qualidade do ponto de vista sensorial. 2.3 Importância dos fatores extrínsecos no crescimento microbiano A capacidade de sobrevivência ou multiplicação dos micro-organismos que estão presentes em um alimento depende das próprias características do alimento, ou seja, fatores intrínsecos, bem como os relacionados com o ambiente em que o alimento se encontra, os fatores extrínsecos. Dentre os fatores intrínsecos, encontram-se a atividade de água, a acidez (pH), o potencial de oxi-redução, a composição química, a presença de fatores antimicrobianos naturais e as interações entre os micro-organismos presentes nos alimentos. Entre os extrínsecos pode-se destacar a temperatura e umidade relativa ambientais, como também a composição da atmosfera que envolve o alimento (FRANCO e LANDGRAF, 1996). Neste trabalho, será dado ênfase à temperatura e à presença de fatores antimicrobianos como os conservantes químicos (cloreto de sódio e lactato de sódio), e pH. 2.3.1 Temperatura A temperatura é o principal fator responsável pelas reações de deterioração dos alimentos, especialmente a deterioração microbiana, onde os parâmetros cinéticos de crescimento são altamente dependentes da temperatura (GIANNUZZI et al., 1998; LABADIE, 1999). Alimentos refrigerados são normalmente armazenados entre 0 e 10°C. Apesar dos micro-organismos psicrófilos e psicrotróficos serem capazes de se multiplicar a temperaturas de refrigeração, as velocidades de multiplicação diminuem consideravelmente nesta faixa de temperatura. A refrigeração também reduz as alterações químicas, físicas e bioquímicas dos alimentos e aumenta assim a vida de prateleira dos mesmos. No entanto, a refrigeração só torna esses processos mais lentos, não os elimina. Portanto, é essencial que a cadeia de frio seja controlada, caso contrário pode ocorrer o desenvolvimento microbiano rápido, diminuição da vida de prateleira do produto e ocorrência de risco à saúde do consumidor (MASSAGUER, 2005). A logística de transporte adotada e a armazenagem fria, passando pela venda no comércio e então a geladeira do consumidor, são pontos críticos para a qualidade e 22.

(23) segurança global dos produtos cárneos (KOUTSOUMANIS et al., 2005). Segundo Nychas et al. (2008), as condições de temperatura nos refrigeradores de mercados desempenham um papel significativo na qualidade final do alimento e alguns estudos mostram uma grande variação na temperatura dos produtos. Sabe-se que muitos pontos de vendas não praticam um armazenamento seguro dos produtos refrigerados e/ou congelados, com a variação da temperatura no período do dia e da noite, afetando significativamente a qualidade e a segurança dos alimentos O controle da temperatura é dificultado entre o momento da venda, o armazenamento doméstico e o tempo de preparo e de consumo. Algumas evidências de variações de temperatura são descritas em pesquisas que abordaram a distribuição de alimentos refrigerados. Em países no sul da Europa, 30% dos alimentos refrigerados foram mantidos acima de 10°C em mercados e refrigeradores domésticos, enquanto que, no norte europeu, 5% estavam acima de 13°C no varejo e 21% acima de 10°C em armazenamento doméstico (KENNEDY et al., 2005 citado por NYCHAS et al., 2008). Um estudo avaliando o controle da temperatura em equipamentos que armazenam alimentos congelados e mantidos sob refrigeração, foi realizada no sul do Brasil por Murmann et al. (2004). Foram investigados 163 equipamentos (50 congeladores, 51 refrigeradores, 14 câmaras frias, 38 balcões de refrigeração e 10 balcões de congelamento) em 45 estabelecimentos. Do total de equipamentos, 57% estava com a temperatura acima da permitida. Em relação à refrigeração, 34% dos equipamentos estava com temperatura inadequada, chegando a encontrar um refrigerador com a temperatura de 22°C. Estes autores citam ainda que, em pesquisa realizada por Chesca et al. (2001), na cidade de Uberaba em Minas Gerais, foi constatado que 70% dos estabelecimentos que comercializavam alimentos trabalhavam com temperaturas inadequadas de armazenamento. Com os relatos apresentados, fica evidente o abuso de temperatura que os alimentos sofrem, demonstrando a importância de estudos que levem em consideração as flutuações de temperatura em armazenamento refrigerado. 2.3.2 Conservantes químicos Enquanto a temperatura é o fator mais importante nas condições de armazenamento, influenciando diretamente o crescimento dos micro-organismos em alimentos, o cloreto de sódio (NaCl) é o mais importante produto adicionado em muitos 23.

(24) alimentos. Este sal atua sobre os micro-organismos inibindo ou retardando seu crescimento, reduz a atividade de água, além de atuar no desenvolvimento de propriedades sensoriais dos alimentos (DAVEY e DAUGHTRY, 1995; NEUMEYER et al., 1997). O lactato de sódio, devido à sua atividade antimicrobiana, tem sido sugerido como uma possível alternativa na substituição de nitritos/nitratos em alimentos (SHELEF, 1994; KITAKAWA, 2002). O lactato de sódio foi regulamentado como regulador de acidez pela portaria SVS/MS no 1004/98 (BRASIL, 1999), para produtos cárneos frescais embutidos ou não; produtos secos, curados e/ou maturados embutidos ou não; produtos cozidos embutidos ou não; produtos salgados crus ou cozidos e conservas e semiconservas de origem animal, sem limite máximo de aplicação. Em níveis de 2 a 4% podem ser aplicados em alimentos para proporcionar propriedades emulsificantes e umectante, controlar o pH, aumentar a capacidade de retenção de água, retardar a oxidação lipídica, além de acentuar o sabor e aroma e estender a vida de prateleira de produtos cárneos (BREWER et al., 1991; KITAKAWA, 2002; SALLAM, 2007; MANCINI et al., 2010; ZHOU et al., 2010). De acordo com Wit et al. (1990), citado por Souza (2005), nos produtos cárneos embalados a vácuo e mantidos sob temperatura de refrigeração, onde predominam as BAL, o lactato exerce ação inibitória sobre estas bactérias. 2.3.3 pH Para todos os micro-organismos existem valores de pH mínimo, ótimo e máximo para sua multiplicação. Verifica-se que o pH em torno da neutralidade (6,5 – 7,5) é o mais favorável para a maioria dos micro-organismos. Alguns micro-organismos são favorecidos pelo meio ácido, como ocorre com as BAL, certamente porque há inibição da microbiota de competição. No caso de L. plantarum, o pH mínimo de crescimento é de 3,5, o pH ótimo é de 5,5-6,5 e o pH máximo é de 8 (FRANCO e LANDGRAF, 1996). As carnes, em função do seu pH, são altamente suscetíveis à multiplicação dos micro-organismos presentes. A carne bovina (moída) apresenta pH de 5,1 a 6,2, a de frango de 6,2 a 6,4, já alguns produtos cárneos cozidos como o presunto apresenta pH em torno de 6,2 e a salsicha 6,4 (DEVLIEGHERE et al., 2000; FRANCO e LANDGRAF, 1996). A deterioração dos produtos cárneos está associada a um conjunto 24.

(25) de fatores extrínsecos e intrínsecos, que determinará o tipo de micro-organismo que se desenvolverá nestes produtos, como por exemplo, o pH, a temperatura, atmosfera que envolve os produtos, entre outros fatores. 2.4 Microbiologia preditiva A microbiologia preditiva tem enfoque interdisciplinar em que se conjugam a microbiologia, a matemática, a estatística e a ciência de alimentos, com o objetivo de descrever, por meio de equações matemáticas, o comportamento dos micro-organismos frente a combinações de condições ambientais específicas (McDONALD e SUN, 1999). Há um crescente interesse no campo de pesquisa da microbiologia preditiva, principalmente relativo ao desenvolvimento de modelos matemáticos que descrevem o crescimento de micro-organismos patogênicos e deteriorantes em alimentos (ANTWI et al., 2008). De acordo com Van Impe et al. (1995), a microbiologia preditiva oferece modelos matemáticos com um desenvolvimento preciso e ao mesmo tempo com versatilidade. Segundo Shimoni e Labuza (2000), trata-se de uma área promissora que está em grande desenvolvimento na microbiologia de alimentos. Ela tem recebido significante atenção científica nos últimos anos, fornecendo base de dados e pacotes de softwares que podem ser ferramentas úteis na análise de riscos. Conforme Valík et al. (1999), a microbiologia preditiva estuda o comportamento de micro-organismos sob diferentes condições químicas, físicas e físico-químicas, tais como temperatura, atividade de água, pH ou compostos antimicrobianos. Isto pode ajudar a identificar os pontos críticos da produção e processos de distribuição, além da otimização da produção e distribuição em cadeia. A microbiologia preditiva também tem utilidade na elaboração de planos de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), identificando perigos e pontos críticos, especificando limites e ações corretivas (McMEEKIN e ROSS, 2002). O verdadeiro poder das abordagens feitas pela microbiologia preditiva é que, ao contrário do processo tradicional de armazenamento, os modelos uma vez validados, podem ser utilizados para predizer com rapidez e segurança a resposta do microorganismo sob várias condições, dentro dos limites investigados (temperatura, pH, concentração de sal, etc). Isto faz com que a microbiologia preditiva seja considerada. 25.

(26) uma ferramenta muito útil para os microbiologistas de alimentos na tomada de decisões diárias (McCLURE et al., 1994). 2.4.1 Modelos matemáticos Os modelos matemáticos tem sido analisados sob dois aspectos principais. Os modelos probabilísticos que tem por objetivo predizer a probabilidade de ocorrência de alguns eventos, em um conhecido período de tempo, e os modelos cinéticos que têm por objetivo representar o aumento ou a diminuição de uma população microbiana de interesse (ROSS e McMEEKIN, 1994; NAKASHIMA et al., 2000). Estes modelos descritos poderiam ser do tipo empírico, que descrevem um conjunto de dados através de uma relação matemática conveniente, ou do tipo determinístico, que fornecem a interpretação dos parâmetros do modelo em termos de fenômenos e processos conhecidos (McMEEKIN et al., 1993). Whiting e Buchanan (1993) classificaram os modelos matemáticos em três níveis: modelos primários, modelos secundários e modelos terciários. Os modelos primários descrevem o comportamento da população microbiana com o tempo e os modelos secundários demonstram como os parâmetros obtidos nos modelos primários se comportam com a variação de um parâmetro ambiental. Os autores descrevem os modelos terciários como softwares utilizados para resolver os modelos de nível primário e secundário. 2.4.1.1 Modelos primários de crescimento Os modelos primários descrevem as mudanças na concentração de microorganismos em função do tempo, em um ambiente específico. Utilizam-se, de maneira clássica, três parâmetros na caracterização de uma curva de crescimento microbiano: a velocidade específica máxima de crescimento (µmax), a duração da fase lag (λ) e a população máxima atingida (nmax) ou aumento logarítmico da população (nmax – n0). Estes parâmetros de crescimento podem ser observados na Figura 2.1, onde ln N = logaritmo neperiano da concentração celular.. 26.

(27) Figura 2.1. Curva típica de crescimento microbiano em função do tempo. Fonte: Swinnen et al., 2004.. Os modelos primários de crescimento mais utilizados na literatura são o modelo de Gompertz ou Gompertz modificado, modelo Logístico, modelo Logístico modificado, modelo de Baranyi e Roberts, e modelo linear de três fases, também conhecido como modelo de Buchanan. Estes modelos serão brevemente descritos a seguir. Modelo de Gompertz ou Gompertz modificado O modelo de Gompertz é uma função exponencial dupla, que descreve uma curva sigmóide assimétrica e está apresentado na Equação 1 (GIBSON et al., 1987). A base deste modelo é que, devido à limitação de espaço e/ou nutrientes, bem como a produção de metabólitos tóxicos, a velocidade de crescimento aumentaria até um máximo e depois então diminuiria. Desta maneira, a velocidade máxima de crescimento exponencial é determinada no ponto de inflexão na curva (McKELLAR e LU, 2004).. LogN = N 0 + A exp{− exp[− B (t − M )]}. (1). onde Log N é o logaritmo decimal da densidade microbiana no tempo t, N0 é o valor da assíntota inferior (equivalente ao log da densidade microbiana inicial), A é o aumento da densidade microbiana (equivalente ao log da contagem microbiana máxima durante a fase estacionária menos o log da contagem inicial), B é a velocidade de crescimento relativa no tempo M (h-1) e M é o tempo requerido para alcançar a velocidade de crescimento máxima (h). A partir destes parâmetros, a velocidade de crescimento 27.

(28) máxima (µ) (h-1) (Equação 2) e a duração da fase lag (λ) (h) (Equação 3) podem ser calculadas (e= 2,7182).. µ=. A.B e. (2). 1 B. (3). λ=M−. O modelo de Gompertz foi reparametrizado por Zwietering et al. (1991) (Equação 4), com o objetivo de obter a representação direta dos parâmetros de interesse biológicos λ e µ, resultando no modelo de Gompertz modificado. Por ser uma reparametrização, os dois modelos apresentam ajustes similares..  = A. exp − exp  µ .e (λ − t ) + 1  Log  N    A   N0    . (4). Este modelo é bastante utilizado para descrever o comportamento microbiano em diferentes meios de cultivo e alimentos (JUNEJA e MARKS, 1999; NAKASHIMA et al., 2000; CAYRÉ et al., 2003; SLONGO et al., 2009).. Modelo Logístico A diferença entre o modelo Logístico e o modelo de Gompertz é que, no primeiro, a curva logística é descrita por uma curva sigmóide simétrica (GIBSON et al., 1987). Este modelo é representado pela Equação 5.. A = Log  N   N 0  {1 + exp[− B.(t − M )]}. (5). onde os parâmetros do modelo apresentam os mesmos significados da equação 1. Sendo o parâmetro µ dado pela Equação 6 e o parâmetro λ pela Equação 7.. µ=. A.B 4. (6). 28.

(29) λ=. (M − 2 ) B. (7). A aplicação do modelo Logístico é mais limitada quando comparada com o modelo de Gompertz. Este modelo tem sido utilizado, por exemplo, no ajuste de curvas de crescimento de micro-organismos deteriorantes em peixe (DALGAARD et al., 1997; KOUTSOUMANIS e NYCHAS, 2000), além de ter sido utilizado na avaliação da significância do tamanho de inóculo na fase lag de Listeria monocytogenes (AUGUSTIN et al., 2000).. Modelo Logístico modificado Para corrigir uma falha do modelo Logístico, onde o ajuste do modelo, em muitos casos, não parte do ponto de origem, uma nova versão foi proposta por Corradini e Peleg (2005), chamada de Logístico modificado (Equação 8).. a a = Log  N −  N 0  1 + exp[k (t c − t )] 1 + exp(kt c ). (8). onde a, k e tc apresentam os mesmo significados de A, B e M apresentados na equação 1, respectivamente. O segundo termo no lado direito da equação foi introduzido para satisfazer a condição de que o início da curva de crescimento seja a partir do ponto de origem, ou seja, quando t= 0, Log (N/N0)= 0 e quando t → ∞, Log (N/N0) → constante.. Modelo de Baranyi e Roberts Baranyi e Roberts (1994) estabeleceram um modelo para fornecer uma base de dados mais mecanística ou biológica (Equação 9), incluindo uma fase de crescimento exponencial linear e uma fase lag que se calcula mediante uma função de ajuste (F(t)) (Equação 10). Um importante conceito apresentado por este modelo é que a fase lag observada é uma combinação do estado fisiológico das células e da adaptação ao novo ambiente. Se as células não estão preparadas para crescer ou a adaptação é lenta, a fase lag será estendida. Uma vez que as células tenham se adaptado ao novo ambiente, elas crescerão exponencialmente até atingir a fase estacionária, ditada por restrições do meio de crescimento (BARANYI e ROBERTS, 1994; McKELLAR e LU, 2004).. 29.

(30) LogN = LogN 0 + µ.F (t ) −. 1  e m. µ . F ( t ) − 1  ln1 + m ( Nmax − N0 )  m  e . (9). onde N é a concentração celular no tempo t, N0 é a concentração celular inicial, Nmax é a concentração celular máxima, m é o parâmetro de curvatura do modelo e F(t) é dada pela Equação 10:. F (t ) = t +. 1. µ. (. ln e (− µ .t ) + e (− h0 ) − e [(− µ .t )− h0 ]. ) (10). onde o parâmetro h0 = µ.λ, este parâmetro é considerado aproximandamente constante em situações onde as condições de pré-inoculação das células são similares. A maneira mais utilizada para ajustar o modelo de Baranyi e Roberts é utilizando o programa DMFit (macro do software Microsoft Office Excel®), desenvolvido pelos próprios autores e colaboradores. Neste programa, tem-se a opção de mudar a curvatura do modelo, através de dois parâmetros, nCurv e mCurv, que representam a curvatura no início e no final da fase linear, respectivamente. McKellar e Lu (2004) citam que o modelo de Baranyi e Roberts é muito utilizado na literatura (GARCÍA-GIMENO et al., 1998; PIN et al., 2000; VALÍK e PIECKOVA, 2001), e que a “popularidade” deste modelo tem sido facilitada pelo uso do DMFit, bem como o MicroFit, que são programas com acesso fácil pela internet.. Modelo linear de três fases ou modelo de Buchanan Buchanan et al. (1997) estabeleceram um modelo primário mais simples que os anteriormente descritos. Trata-se de um modelo linear de três fases, o qual divide a curva de crescimento microbiana em três fases: fase lag, fase de crescimento exponencial e fase estacionária. A representação gráfica do modelo pode ser observada na Figura 2.2.. 30.

(31) Figura 2.2. Representação gráfica do modelo linear de três fases.. Durante a fase lag, se assume que as células não se dividem, pois estão se adaptando ao novo meio. Por este motivo, a velocidade de crescimento é igual a zero. Durante a fase exponencial, assume-se que a velocidade de crescimento é uma constante, onde o logaritmo da concentração celular aumenta linearmente com o tempo (Equação 11). Uma vez alcançada a fase estacionária, não ocorre aumento das células e a velocidade de crescimento volta a ser zero. As três fases do modelo são descritas a seguir: Fase lag: Para t ≤ tLAG, Nt = N0 Fase exponencial de crescimento: Para tLAG ≤ t ≤ tMAX, Nt = N0 + µ (t- tLAG). (11). Fase estacionária: Para t ≥ tMAX, Nt = NMAX. onde Nt é o logaritmo da densidade celular no tempo t, N0 é a densidade celular inicial, NMAX é a densidade celular máxima, t é o tempo transcorrido, tLAG é o tempo onde a fase lag termina, tMAX é o tempo onde se atinge a população máxima, µ é a velocidade específica de crescimento. Buchanan e colaborados (1997) comparam este modelo com o modelo de Baranyi e Roberts, e Gompertz, usando dados de crescimento de E. coli. As curvas preditas pelos três modelos apresentaram bons ajustes e os parâmetros cinéticos de 31.

(32) crescimento obtidos foram similares. O modelo linear se apresentou mais robusto que os outros, especialmente quando havia poucos dados experimentais.. 2.4.1.2 Modelos secundários Os modelos secundários são equações que descrevem como variam os parâmetros de crescimento dos modelos primários com a mudança de um ou mais fatores extrínsecos e intrínsecos, como temperatura, pH, atividade de água, entre outros (WHITING, 1995). O conhecimento dos parâmetros ambientais que mais influenciam o crescimento microbiano é essencial para o desenvolvimento, bem como para o uso prático dos modelos preditivos (McKELLAR e LU, 2004). Os modelos secundários mais utilizados na literatura são o modelo da raiz quadrada, também conhecido como Bélerádek, e a equação de Arrhenius, que são os dois principais modelos secundários que têm sido propostos para descrever o efeito da temperatura no crescimento microbiano (RATKOWSKY et al., 1982; McMEEKIN e ROSS, 2002; CAYRÉ et al., 2003; MATARAGAS et al., 2006). O modelo da raiz quadrada é dado pela Equação 12 e a equação de Arrhenius pela Equação 13.. k = b(T − Tmin ). (12). onde k é o parâmetro de interesse do modelo, b representa o coeficiente de regressão, T é a temperatura (°C) e Tmin é a temperatura mínima para o crescimento ou coeficiente do modelo..  − Ea  k = A exp   RT . (13). onde k é a velocidade de crescimento, A é a constante da equação (fator préexponencial), T é a temperatura (K), Ea é a energia de ativação para o crescimento microbiano (kJ/mol) e R representa a constante universal dos gases (8,314 J/K.mol) (McDONALD e SUN, 1999).. A clássica equação de Arrhenius, em alguns casos, não descreve bem o efeito da temperatura nas velocidades de crescimento dos micro-organismos. Por este fato, vários modelos secundários são baseados na equação de Arrhenius, realizando modificações. 32.