TÍTULO: ANÁLISE DA POPULAÇÃO NEURONAL DA COLUNA DORSOLATERAL DA SUBSTÂNCIA CINZENTA PERIAQUEDUTAL
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): CAROLINA RIBEIRO PIRES AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): SANDRA REGINA MOTA ORTIZ ORIENTADOR(ES):
RESUMO DO PROJETO
Trabalhos mostram um importante papel do hipotálamo na expressão de comportamentos de defesa e que estimulações elétricas ou químicas da zona medial do hipotálamo também podem provocar respostas somatomotoras e autonômicas semelhantes àquelas que ocorrem quando o animal é exposto a predadores. Adicionalmente, a substância cinzenta periaquedutal (PAG) é um sítio neural fundamental para organizar as repostas de defesa frente ao predador e sua porção dorsolateral (PAGdl) apresenta o maior grau de mobilização durante o a exposição direta, bem como os menores limiares para provocar respostas integradas de defesa. Dados do nosso laboratório indicam que os principais alvos de projeção deste sítio são para a coluna ventrolateral da PAG (PAGvl), uma região crítica para a expressão de respostas de medo condicionado, incluindo o congelamento motor (freezing), e para o núcleo hipotalâmico anterior (AHN), que está envolvido na integração de informações do sistema septo-hipocampal veiculadas pela parte rostral do núcleo septal lateral. Uma vez elucidada a importância da ligação entre a PAGdl e a PAGvl e o AHN, para a expressão das respostas de freezing e de avaliação de risco, é de interesse determinar se a população neuronal da PAGdl que aferenta a PAGvl é a mesma população que aferenta o AHN, ou se são populações distintas. Assim, podemos inferir que possivelmente existe populações distintas que podem modular a expressão freezing, através das projeções da PAGdl para PAGvl e a expressão da avaliação de risco, através das projeções da PAGdl para o AHN
INTRODUÇÃO
Historicamente, os trabalhos de Bard (1928) e Hess e Brugger (1943) estabeleceram o importante papel do hipotálamo na expressão de comportamentos de defesa. Estes autores também mostraram que estes sistemas são organizados de forma hierárquica, de tal maneira que respostas às estimulações amigdalianas ou hipotalâmicas são abolidas com lesões da PAG, enquanto que as respostas comportamentais às estimulações desta última
estrutura, não são comprometidas por lesões na amígdala ou hipotálamo (Fernandez de Molina e Hunsperger, 1962).
Trabalhos posteriores mostraram que estimulações elétrica ou química da zona medial do hipotálamo também podem provocar respostas somatomotoras e autonômicas semelhantes àquelas que ocorrem quando o animal é exposto a predadores (Azevedo et al., 1980; Brutus et al. 1985; Fuchs et al., 1985; Schmitt et al., 1985; Yardley et al., 1986; Lammers et al., 1988; Silveira e Graeff, 1992).
Como originariamente descrito por Hunsperger (1956), a PAG é um sítio fundamental para organizar as repostas de defesa durante o confronto com o predador e sua porção dorsolateral apresenta o maior grau de mobilização durante o a exposição direta ao predador (Canteras e Goto, 1999; Comoli et al., 2003), bem como os menores limiares para provocar respostas integradas de defesa (Bittencourt et al., 2004). Contudo, os dados acerca das projeções desta região particular da PAG ainda são bastante fragmentários (ver Cameron et al., 1992a e b).
Dados do nosso laboratório indicam que os principais alvos de projeção deste sítio da PAG são para a PAGvl e para o AHN, estruturas de particular interesse para o entendimento do envolvimento da PAG na expressão das respostas do freezing e na formação da resposta contextual de defesa associada a um predador, respectivamente.
A PAGvl é um sítio neural crítico para a expressão de respostas de medo condicionado, incluindo o freezing, uma vez que lesões deste setor reduzem as respostas de freezing a um estímulo neutro, associado a um estímulo doloroso (Vianna et al., 2001).
O AHN está envolvido na integração de informações do sistema septo-hipocampal veiculadas pela parte rostral do núcleo septal lateral (Risold e Swanson, 1997). A parte rostral do septo lateral recebe projeções da porção intermediária do campo CA1 e subículum, estando em posição de veicular informação relativas à análise contextual do ambiente ao circuito hipotalâmico de defesa (Risold e Swanson, 1997). Além disso, o AHN aferenta densamente o núcleo reuniens e a parte ventral do núcleo anteromedial do tálamo, que
representam por sua vez, uma das maiores fontes de projeção talâmica para a formação hipocampal e setores da área retrosplenial (Risold et al, 1994; Vertes et al., 1995). Segundo Carvalho-Netto, 2009, o núcleo reuniens e a parte ventral do núcleo anteromedial do tálamo, através da modulação de setores da área retroesplenial, estão criticamente envolvidos no processamento mnemônico associado a um estímulo incondicionado, no caso, o predador.
Uma vez elucidada a importância da ligação entre a PAGdr e a PAGvl e o AHN, para a expressão das respostas de freezing e de avaliação de risco, seria de particular relevância determinar se a população neuronal da PAGdr que aferenta a PAGdr é a mesma população que aferenta o AHN, ou se são populações distintas.
PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS
Em todos os estudos foram utilizados ratos albinos (Rattus norvegicus, linhagem Wistar), machos, adultos, com aproximadamente 90 dias de idade (350g). Os animais foram obtidos de cruzamentos sucessivos no biotério do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo.
Os animais foram divididos em dois grupos experimentais:
# Grupo Injeção de fluorogold no núcleo hipotalâmico anterior (AHN; n=6) # Grupo Injeção de fluorogold na coluna ventrolateral da substância cinzenta periaquedutal (PAGvl; n=6)
Os animais foram anestesiados por via intraperitoneal com uma solução de Equitesin (0,3ml/100g) e em seguida posicionados em aparelho estereotáxico, onde receberam um depósito iontoforético unilateral de Fluorogold (Fluorochrome, Inc.) a 2,0%, no AHN ou na PAGvl
Sete dias após a injeção iontoforética de fluorogold, os animais foram por perfundidos por via trans-aórtica inicialmente com 150 ml de uma solução salina 0,9% seguida de 900 ml de uma solução fixadora de paraformaldeído a 4% diluído em tampão fosfato de sódio 0,1M (pH 7,4). Os encéfalos permaneceram na caixa craniana por 3 horas antes de serem removidos e transferidos para uma solução contendo sacarose 20% em tampão fosfato de potássio 0,02M, onde permaneceram por aproximadamente 12 horas para crioproteção. Posteriormente
o encéfalo foi processado por um micrótomo de congelação e os cortes foram obtidos com 40m de espessura e colhidos sequencialmente em 5 compartimentos que foram utilizados para coloração pelo método de Nissl e para reação de imuno-histoquímica para detecção de neurônios retrogradamentes marcados por fluorogold. Posteriormente realizamos desenhos esquemáticos com auxilio de uma câmera lúcida de toda extensão rostrocaudal da PAG.
RESULTADOS
Analisamos as populações neurais da PAGdr, através de injeções iontoforéticas de fluorogold no AHN (Grupo AHN) e na PAGvl (Grupo PAGvl).
Através de desenhos esquemáticos feitos com auxilio da câmera lúcida, podemos notar que as injeções iontoforéticas de fluorogold foram restritas ao AHN (Figura 1) e a PAGvl (Figura 2). Adicionalmente, analisamos os neurônios retrogradamente marcados de toda extensão rostrocaudal PAG e observamos duas populações neuronais distintas. Quando a injeção iontoforética de fluorogold é restrita ao AHN (Grupo AHN), notamos nitidamente que as aferências são descendentes para a PAG, para as camadas internas e externas desta estrutura (Figura 1).
Figura 1: Desenho esquemático feito com auxilio da câmera lúcida, ilustrando as aferências do AHN para as camadas internas e externas da PAG nos cinco níveis (Grupo AHN).
Quando a injeção iontoforética de fluorogold é restrita a PAGvl (Grupo PAGvl), notamos nitidamente que as aferências para a PAG são ascendentes para a camada justaquedutal (Figura 2).
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Figura 2: Desenho esquemático feito com auxilio da câmera lúcida, ilustrando as aferências da PAGvl para a camada justaquedutal dos cinco níveis da PAG (Grupo PAGvl).
Com os resultados obtidos, podemos inferir que essas populações distintas podem modular a expressãodo freezing, através das projeções da PAG para PAGvl e a expressão da avaliação de risco, através das projeções da PAGdr para o AHN
DISCUSSÃO
O comportamento de defesa consiste em um conjunto de respostas comportamentais altamente conservadas por todos os animais ao longo da evolução, podendo ocorrer em resposta ao ataque de um predador ou um coespecífico ou também, em resposta a um perigo eminente do próprio ambiente, além de serem rapidamente condicionadas ao estímulo ameaçador ou a situações associadas a ele.
Diversos estudos descreveram em detalhes os padrões defensivos dos ratos selvagens e de laboratório em resposta ao predador natural, no caso o gato e a pista olfativa do mesmo (odor de gato), fornecendo uma análise detalhada dos comportamentos de defesa inata e das situações em que eles ocorrem (Blanchard e Blanchard, 1972; Blanchard et al., 1981; Blanchard e Blanchard, 1988; Blanchard et al., 1989; 1990; 1991). A resposta de defesa incondicionada dos roedores consiste das seguintes reações: fuga, freezing e avaliação de risco (Blanchard et al., 2001); sendo que o freezing constitui a resposta comportamental mais proeminente, frente a ameaça real do predador, enquanto as posturas de avaliação de risco inclui comportamentos de orientação e busca de informações sobre estímulos potencialmente perigosos, seguidos por aproximações da área ou do estímulo ameaçador, como o que ocorre frente ao odor do predador (Canteras et al., 2008).
Muitos são os trabalhos que demonstraram o papel clássico da substância PAG, originariamente descrito por Hunsperger (1956), como um sítio neural crítico para a expressão das respostas de defesa (Bandler e Shipley, 1994; Carrive, 1993; Fanselow, 1991).
Cezário e colaboradores (2008) inferiram que além de mediar respostas incondicionadas emitidas frente ao predador, PAGdr poderia estar relacionada com a emissão de respostas contextualmente condicionadas a ambientes hostis onde o predador não está presente. Especificamente, a diminuição da ativação da PAGdr produzida pela inativação farmacológica por muscimol do núcleo pré-mamilar dorsal, induziu a ocorrência de respostas comportamentais puramente exploratórias, em contextos onde o animal havia previamente confrontado o predador.
Em experimentos realizados em nosso laboratório, verificamos que a inativação farmacológica por muscimol da porção rostrodorsal da PAG, que inclui a PAGdr, foi capaz de inibir as respostas contextuais associadas a ambientes onde houve exposição prévia ao predador, mesmo após a expressão do comportamento de defesa, nos permitindo inferir que a PAG, em particular a PAGdr, poderia estar também envolvida nos processos de formação da resposta
contextual de defesa associada a um estímulo incondicionado, no caso, o predador.
Estes resultados sugerem que a PAGdr desempenha um papel crucial na formação da memória de medo e ampliam os dados da literatura que anteriormente apontavam, apenas, para a participação da PAGvl, influenciando a formação da memória de medo condicionada a um estímulo doloroso, através de um circuito neural envolvendo os núcleos intralaminares do tálamo e o córtex pré-frontal. (Johansen et al., 2010).
Dessa forma, é lícito pensarmos que dependendo do grau de ativação da PAGdr, a expressão comportamental pode ser uma resposta de freezing que corresponde a resposta comportamental mais proeminente, frente a ameaça real do predador, ou uma resposta de avaliação de risco que inclui comportamentos de orientação e busca de informações sobre estímulos potencialmente perigosos, seguidos por aproximações da área ou do estímulo ameaçador, como o que ocorre frente ao odor do predador ou nas respostas contextuais de defesa frente ao ambiente previamente relacionado ao predador.
Dados obtidos utilizando como traçador anterógrado a leucoaglutinina do Phaseolus vulgaris mostraram que as principais projeções eferentes da PAGdr são o AHN e para a PAGvl e o núcleo cuneiforme (Mota-Ortiz, S.R. e Canteras, N.S., observação pessoal). De particular interesse para o entendimento do envolvimento da PAG na expressão das respostas de freezing e na formação da resposta contextual de defesa associada a um predador estão a PAGvl e o AHN, respectivamente.
A PAGvl é um sítio neural crítico para a expressão de respostas de medo condicionado, incluindo o freezing (Vianna et al., 2001). A ligação entre este setor da PAG e o núcleo central da amígdala, em particular, o seu setor medial, corespondem a circuitaria chave para a expressão do freezing condicionado (Ciocchi et al., 2010), sendo altamente preservada em várias espécies, inclusive em humanos.
O AHN está envolvido na integração de informações do sistema septo-hipocampal veiculadas pela parte rostral do núcleo septal lateral (Risold e
Swanson, 1997). Além disso, o núcleo hipotalâmico aferenta densamente o núcleo reuniens e a parte ventral do núcleo anteromedial do tálamo, que representam por sua vez, uma das maiores fontes de projeção talâmica para a formação hipocampal e setores da área retrosplenial (Risold et al, 1994; Vertes et al., 1995). Na análise dos resultados, observamos as populações neurais da PAGdr, através de injeções iontoforéticas de fluorogold no AHN (Grupo AHN) e PAGvl (Grupo PAGvl). Com isso, observamos duas populações neuronais distintas. Quando a injeção iontoforética de fluorogold é restrita ao AHN (Grupo AHN), notamos nitidamente que as aferências são descendentes para PAG, para as camadas internas e externas desta estrutura. Quando a injeção iontoforética de fluorogold é restrita a PAGvl (Grupo PAGvl), notamos nitidamente que as aferências para PAG são ascendentes para a camada justaquedutal.
Desta forma, podemos inferir que essas populações distintas podem modular a expressão do freezing, através das projeções da PAGdr para PAGvl e a expressão da avaliação de risco, através das projeções da PAGdr para o AHN.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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