LILIANA MARCELA FRANCO ACOSTA
‘’ESTUDO DE FONTES DE CARBONO ORGÂNICOS NO CULTIVO HETEROTRÓFICO DA MICROALGA Chlorella vulgaris’’
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CAMPINAS – SP 2012
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PROCESSOS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: PROCESSOS EM TECNOLOGIA QUÍMICA - ACPTQ
LILIANA MARCELA FRANCO ACOSTA
“ESTUDO DE FONTES DE CARBONO ORGÂNICOS NO CULTIVO HETEROTRÓFICO DA MICROALGA Chlorella vulgaris”
Orientadora: Profa. Dra. Telma Teixeira Franco
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Engenharia Química, na área de Processos em Tecnologia Química.
Este exemplar corresponde à versão final da Dissertação de Mestrado em Engenharia Química apresentada e aprovada pela banca examinadora em 18 de Dezembro de 2012.
Profa. Dra. Telma Teixeira Franco
CAMPINAS – SP, Dezembro, 2012
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP
Ac72e
Acosta, Liliana Marcela Franco
Estudo de fontes de carbono orgânicos no cultivo heterotrófico da microalga Chlorella vulgaris / Liliana Marcela Franco Acosta. --Campinas, SP: [s.n.], 2012.
Orientador: Telma Teixeira Franco.
Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.
1. Microalga. 2. Chlorella . 3. Cultivo. I. Franco, Telma Teixeira, 1957-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. III. Título.
Título em Inglês: Studies the organic carbon sources for heterotrophic culture from microalgae Chlorella vulgaris
Palavras-chave em Inglês: Microalgae, Chlorella , Cultivation Área de concentração: Processos em Tecnologia Química Titulação: Mestra em Engenharia Química
Banca examinadora: Telma Teixeira Franco, João Carlos Monteiro de Carvalho, Leonardo Brantes Bacellar Mendes
Data da defesa: 18-12-2012
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PROCESSOS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: PROCESSOS EM TECNOLOGIA QUÍMICA - ACPTQ
A comissão examinadora, abaixo assinada aprova a Dissertação de Mestrado ESTUDO DE FONTES DE CARBONO ORGÂNICOS NO CULTIVO HETEROTRÓFICO DA MICROALGA Chlorella vulgaris, elaborada por Liliana Marcela Franco Acosta, como requisito parcial para obtenção do titulo de Mestre em Engenharia Química.
Comissão Examinadora:
Profa. Dra. Telma Teixeira Franco
Prof. Dr. João Carlos Monteiro de Carvalho
Dr. Leonardo Brantes Bacellar Mendes
AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho de mestrado marca o fim de uma importante etapa da minha vida. Gostaria de agradecer a todos aqueles que de uma forma ou outra contribuíram de forma decisiva para sua concretização.
Agradeço primeiramente a Deus e a meus pais, por a força e apoio incondicional ao longo destes anos.
A professora Telma Teixeira Franco, minha orientadora, pela oportunidade em executar este projeto de pesquisa.
Aos meus colegas e amigos, Renato, Talita e Lucy, obrigada pelo enorme apoio e pela sua total disponibilidade.
Aos amigos do LEBBPOR, obrigada por seu carinho e amizade.
A todos meus amigos, às pessoas especiais da minha vida, por me completarem, por me tornarem na pessoa que sou hoje e por me fazerem crescer. Obrigada pelo apoio, compreensão, paciência e enorme carinho. Deus abençoe vocês sempre! Vocês sempre estarão no meu coração.
RESUMO
Em cultivos heterotróficos, fontes orgânicas de carbono são utilizadas para fornecer energia e carbono ao micro-organismo. A glicose é uma das fontes mais utilizadas em cultivos de microalgas, gerando elevadas taxas de crescimento. Outras fontes como frutose, xilose, glicerol, sacarose, arabinose também podem ser utilizadas e a escolha entre essas fontes orgânicas é função principalmente das taxas de crescimento e do custo de aquisição. Visando elevadas produtividades e a redução do custo do cultivo heterotrófico da Chlorella vulgaris, diferentes fontes de carbono orgânico foram avaliadas (glicerol, sacarose, frutose e melaço de cana). Os máximos valores de concentração celular, pH e produtividade, foram para a sacarose hidrolisada na concentração inicial de 20 g.L-1obtidos após 122 horas de cultivo (5,3g.L-1; 8.80 e 0.040 g.L-1.h-1, respectivamente) e para o melaço de cana hidrolisado na concentração de 30 g.L-1 obtidos após 60 horas de cultivo (3,92 g.L-1; 8,55 e 0,059 g.L-1.h-1, respectivamente). Glicerol, sacarose e frutose não foram consumidos pelas células. As melhores concentrações de sacarose hidrolisada (20 g.L-1) e melaço de cana hidrolisado (15 g.L-1) foram utilizadas em fermentador de 3 L em regime de batelada alimentada, as velocidades específicas de crescimento para o melaço de cana aumentaram após cada alimentação desde 0,0512 h-1 até 0,0644 h-1. No entanto, para a sacarose hidrolisada a velocidade diminuiu de 0,0251 h-1 até 0,0143 h-1. A concentração de lipídeos foi para a sacarose hidrolisada (23,77 %), e (10,72%) para o melaço de cana. Paralelamente, foram analisadas condições de estocagem da microalga Chlorella vulgaris, em ultrafreezer, empregando-se três criopreservantes: glicerol, metanol e DMSO, nas concentrações de 5 e 10%. Os resultados, após 270 dias de estocagem, indicam que a microalga Chlorella vulgaris não sobrevive nas condições estabelecidas. No entanto, para uma estocagem de até 180 dias pode-se empregar 10% de glicerol ou 10% de DMSO, necessitando somente 2 repiques da microalga após o armazenamento para atingir sua velocidade normal de crescimento (0,2686 d-1), velocidade reportada para a microalga sem armazenamento no ultrafreezer.
ABSTRACT
In heterotrophic culture, sources of organic carbon are utilized to give energy and carbon to microorganisms. Glucose is one of the main sources utilized in micro algae culture which produces high growing rates. Another sources such as fructose, xylose, glycerol, saccharose and arabinosa, could also be utilized. The function of growing rates and acquisition costs is precisely to help us to choose the best one between these sources. With the idea of getting high productivities and to reduce costs of heterotrophic crops of Chlorella vulgaris, different sources of organic carbon where studied (glycerol, saccharose, fructose and sugar cane honeydew). The highest values of cellular concentration, pH and productivity, were obtain from hydrolyzed saccharose with an initial concentration of 20 g.L-1after 122 hours of cultivation (5,3g.L-1; 8.80 y 0.040 g.L
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.h-1, respectively). Glycerol, saccharose y fructose were not consumed by the cells. The best concentrations of hydrolyzed saccharose (20 g.L-1) and hydrolyzed sugar cane honeydew (15 g.L-1) were utilized in a 3 L fermenters in feed batch. The growing speed of the sugar cane honeydew increased after each feeding from 0,0512 h-1to 0,0644 h-1. However, the growing speed for hydrolyzed saccharose decreased from 0,0251 h-1 to 0,0143 h-1. The concentration of fat acids for the hydrolyzed saccharose was 23,77 % and for the sugar cane honeydew was 10,72%. Storage conditions in ultrafreezer for the microalgae Chlorella vulgaris were studied at the same time using three different protectants such as glycerol, methanol and DMSO, all of them in 5% and 10% concentrations. The outcomes obtained after 270 days showed that the Chlorella vulgaris microalgae could not survive with the given conditions. However, 10% of glycerol or DMSO could be used in a 180-day storage and only 2 periodic transfer of the microalgae were needed after the storage to obtain the normal growing speed (0.2686 d
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SUMÁRIO
ÍNDICE DE TABELAS...I ÍNDICE DE FIGURAS ...III NOMENCLATURA ... VII 1. INTRODUÇÃO ...1 2. OBJETIVOS ...3 2.1 Objetivo geral ...3 2.2 Objetivos específicos ...3 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...3 3.1 Biodiesel...3 3.2 Microalgas ...4
3.2.1 Microalgas como fonte de biodiesel...6
3.2.2 Chlorella vulgaris ...12
3.3 Cultivos heterotróficos ... 14
3.3 Criopreservação de microalgas...19
4. MATERIAIS E MÉTODOS...22
4.1 Micro-organismo e condições de cultivo ...22
4.2 Preparo do Ágar inclinado para cultivo heterotrófico...22
4.3 Preparo do inóculo e condições de axenia...23
4.4 Condições experimentais ...24
4.4.1 Cultivo em incubadora rotatória ...24
4.4.2 Cultivo em biorreator ...24
4.5 Metodologia Analítica ...25
4.6 Condições de cultivo ...27
4.6.2 Cultivo com sacarose e sacarose hidrolisada...28
4.6.3 Cultivo com melaço hidrolisado ...28
4.6.4 Condições de cultivo...28
4.7 Hidrólise da sacarose...28
4.8 Hidrólise do melaço de cana e detoxificação ...29
4.9 Criopreservação de microalgas...30
4.9.1 Micro-organismo ...30
4.9.2 Condições de cultivo e protocolo de criopreservação...30
4.9.3 Estocagem e amostragem ...31
4.10 Cálculo dos parâmetros cinéticos ...32
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...33
5.1 Cultivo em glicerol ... 33
5.2 Cultivo em glicose/Glicerol ...36
5.3 Cultivo em sacarose...41
5.4 Hidrólise da sacarose...42
5.5 Cultivo em sacarose hidrolisada ...43
5.5.1 Comparação dos cultivos com glicose e com sacarose hidrolisada. ...50
5.6 Inibição pela frutose ...52
5.6.1 Calculo da constante de inibição Ki... 56
5.7 Hidrólise do melaço de cana ...58
5.8 Cultivo em melaço de cana hidrolisado... 60
5.8.1 Comparação dos cultivos com glicose, sacarose hidrolisada e melaço de cana hidrolisado...66
5.9 Batelada alimentada com sacarose hidrolisada ...68
5.10 Batelada com melaço de cana hidrolisado ...73
5.10.1 Comparação dos cultivos com glicose, sacarose hidrolisada e melaço de cana hidrolisada. ...78
5.11 Criopreservação de microalgas...80
6. CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ...92
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Composição de ácidos graxos da microalga Chlorella vulgaris. ...5
Tabela 2: Comparação da eficiência da produção estimada de biodiesel a partir de plantas vasculares e microalgas ...8
Tabela 3: Comparação do conteúdo de lipídeos de alguns micro-organismos oleaginosos. ...9
Tabela 4: Comparação dos principais parâmetros de qualidade do diesel e biodiesel de microalga...10
Tabela 5: Companhias que investem atualmente na produção para comercialização de combustíveis de algas. ...11
Tabela 6: Estudos realizados em sistema heterotrófico com diferentes fontes de carbono e tipo de cultivo para a espécie Chlorella vulgaris...13
Tabela 7: Composição química do melaço de cana da América do Sul. ...18
Tabela 8: Crioprotetores utilizados na conservação de micro-organismos...20
Tabela 9: Composição do meio sintético BBM (pH 6,8). ...22
Tabela 10: Parâmetros cinéticos avaliados. ...32
Tabela 11: Parâmetros cinéticos no cultivo com 10g/L de glicose (cultivo controle). ....34
Tabela 12: Parâmetros cinéticos obtidos nos cultivos avaliados ...38
Tabela 13: Resultados da hidrólise da sacarose (10 g.L-1) em autoclave (T:121ºC) e banho termostático (T: 80 °C). ...43
Tabela 14: Resultados da hidrólise da sacarose em banho termostático com diferentes concentrações de ácido clorídrico. ...43
Tabela 15: Parâmetros cinéticos obtidos a partir dos experimentos com sacarose hidrolisada. ...47
Tabela 17: Parâmetros cinéticos nos cultivos com glicose e frutose. ... 53 Tabela 18: Composição do melaço de cana...58 Tabela 19: Resultados da hidrólise do melaço de cana em banho termostático com diferentes concentrações de ácido clorídrico. ... 59 Tabela 20: Composição do melaço de cana hidrolisado e detoxificado. ...59 Tabela 21: Parâmetros cinéticos obtidos a partir dos experimentos com melaço de cana hidrolisada. ...63 Tabela 22: Comparação dos cultivos com glicose, sacarose hidrolisada e melaço de cana hidrolisado. ...66 Tabela 23: Parâmetros cinéticos obtidos durante a batelada alimentada e incubadora rotatória para o cultivo de C. vulgaris em sacarose hidrolisada. ...71 Tabela 24: Comparação dos cultivos com glicose e com sacarose hidrolisada ...72 Tabela 25: Parâmetros cinéticos obtidos durante a batelada alimentada e incubadora rotatória para o cultivo de C. vulgaris em melaço de cana hidrolisado...77 Tabela 26: Comparação dos cultivos com glicose e com sacarose hidrolisada ...79 Tabela 27: Velocidades específicas de crescimento da microalga Chlorella vulgaris após armazenagem em ultrafreezer nos tempos avaliados. ...82 Tabela 28: Velocidades específicas de crescimento da microalga Chlorella vulgaris após armazenagem em ultrafreezer nos tempos avaliados. ...83 Tabela 29: Velocidades específicas de crescimento da microalga Chlorella vulgaris após armazenagem em ultrafreezer nos tempos avaliados. ...84
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Perfis de concentração de glicose (‘ ’), glicerol (‘ ’) celular no cultivo com glicose (‘ ’) e celular no cultivo com glicerol (‘ ’) para a Chlorella vulgaris nos experimentos estudados. ... 35 Figura 2: Perfis de pH e crescimento celular nos cultivos com glicose (a) e glicerol (b). ...35 Figura 3: Fotografia do cultivo com glicose 10 g.L-1. a: 0h; b: 96h. ... 36 Figura 4: Fotografias do cultivo com glicerol 2g.L-1. a: 0h; b: 48h; c:120h...36 Figura 5: Perfis de concentração de glicose (‘ ’), glicerol (‘ ’), e celular nos cultivos (‘ ’) para a Chlorella vulgaris nos experimentos estudados. Controle (a), 8 g.L-1 de glicose e 2 g.L-1de glicerol (b), 6 g.L-1de glicose e 4 g.L-1de glicerol (c). ...39 Figura 6: Perfis de pH nos cultivos controle e nas proporções de glicose e glicerol avaliadas. ...40 Figura 7: Comparação dos valores máximos dos principais parâmetros cinéticos obtidos nos experimentos com diferentes proporções de glicose e glicerol.. ...40 Figura 8: Perfis de pH, concentração celular e de sacarose do experimento com concentração inicial de 2g.L-1 de sacarose. Perfil de crescimento celular e de pH com sacarose (a), perfil de consumo de substrato e crescimento celular com sacarose (b). 41 Figura 9: Perfis de pH (‘ ’) e concentração celular (‘ ’) para os experimentos com diferentes concentrações de sacarose hidrolisada. 2 g.L-1 (a), 5 g.L-1 (b), 8 g.L-1 (c), 10 g.L-1(d) e 20 g.L-1(e), ...45 Figura 10: Perfis de concentração de glicose (‘ ’), frutose (‘ ’) e celular (‘ ’) para os experimentos com diferentes concentrações de sacarose hidrolisada. 2 g.L-1 (a), 5 g.L-1 (b), 8 g.L-1(c), 10 g.L-1(d) e 20 g.L-1(e). ...46 Figura 11: Comparação dos valores máximos dos principais parâmetros cinéticos obtidos nos experimentos com diferentes proporções de glicose e glicerol.. ...48
Figura 12: Perfis de pH, concentração celular e concentração de frutose. Perfil de crescimento celular e de pH com frutose (a), perfil de consumo de substrato e crescimento celular com frutose (b). ...49 Figura 13: Perfis de concentração celular e consumo de glicose dos experimentos com glicose (‘ ’) e sacarose hidrolisada (‘ ’). ...51 Figura 14: Perfis de concentração de glicose (‘ ’), frutose (‘ ’) e celular (‘ ’) para os experimentos avaliados. Cultivo controle, 10 g.L-1glicose (a), 1 g.L-1 frutose (b), 2 g.L-1 frutose (c), 5 g.L-1frutose (d), 8 g.L-1frutose (e), 10 g.L-1frutose (f). ... 54 Figura 15: Perfis de pH (‘ ’) e concentração celular (‘ ’) para os experimentos com diferentes concentrações de frutose. 1 g.L-1frutose (a), 2 g.L-1frutose (b), 5 g.L-1frutose (c), 8 g.L-1frutose (d), 10 g.L-1frutose (e). ...55 Figura 16: Linearização dos valores de concentração e velocidade específica de crescimento por o método de Lineweaver-Burk. (‘ ’) Linearização obtida das fermentações sem frutose no meio de cultivo; (‘ ‘) Linearização obtida das fermentações adicionadas de frutose no meio de cultivo. ...56 Figura 17: Perfis de pH (‘ ’) e concentração celular (‘ ’) para os experimentos com diferentes concentrações de melaço de cana hidrolisado. 5 g.L-1melaço de cana h (a), 10 g.L-1melaço de cana h (b), 15 g.L-1melaço de cana h (c), 20 g.L-1melaço de cana h (d), 25 g.L-1melaço de cana h (e), 30 g.L-1melaço de cana h (f)...61 Figura 18: Perfis de concentração de glicose (‘ ’), frutose (‘ ’) e celular (‘ ’) para os experimentos com diferentes concentrações de melaço de cana hidrolisado. 5 g.L-1 melaço de cana h (a), 10 g.L-1melaço de cana h (b), 15 g.L-1melaço de cana h (c), 20 g.L-1melaço de cana h (d), 25 g.L-1melaço de cana h (e), 30 g.L-1melaço de cana h (f). ...62 Figura 19: Comparação dos valores máximos dos principais parâmetros cinéticos obtidos nos experimentos com diferentes concentrações de melaço de cana hidrolisada.. ...64 Figura 20: Perfis de concentração celular dos experimentos com glicose (‘ ’), sacarose hidrolisada (‘ ’) e melaço de cana hidrolisado (‘ ’). 2 g.L-1glicose (a), 5 g.L
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glicose (b), 10 g.L-1glicose (c). ...67 Figura 21: Perfis de concentração celular da batelada alimentada da C. vulgaris em sacarose hidrolisada. Crescimento celular (‘ ’) e glicose(‘ ’). ...69
Figura 22: Perfis de crescimento celular e DOD na batelada alimentada da microalga C. vulgaris em sacarose hidrolisada. Crescimento celular (‘ ’) e concentração de oxigênio dissolvido DOD (‘ ’). ...70 Figura 23: Fermentação empregando sacarose hidrolisada como fonte de carbono para a C. vulgaris. ...70 Figura 24: Perfis de concentração celular da batelada alimentada da C. vulgaris em melaço de cana hidrolisada. Crescimento celular (‘ ’) e glicose(‘ ’)... 75 Figura 25: Perfis de crescimento celular e DOD na batelada alimentada da microalga C. vulgaris em melaço de cana hidrolisado. Crescimento celular (‘ ’) e concentração de oxigênio dissolvido DOD (‘ ’). ...75 Figura 26: Fermentação empregando melaço de cana hidrolisado como fonte de carbono para a C. vulgaris. Início da fermentação (a), final da fermentação (b). ...76 Figura 27: Cinética de crescimento para a microalga Chlorella vulgaris antes de ser armazenada no ultrafreezer. (cinética zero). ...81 Figura 28: Perfis de crescimento da Chlorella vulgaris após de 15 dias de armazenagem no ultrafreezer empregando diferentes criopreservantes. Cinética zero (‘ ’), primeiro repique (‘ ’), segundo repique (‘ ’), terceiro repique (‘ ’)...86 Figura 29: Perfis de crescimento da Chlorella vulgaris após de 30 dias de armazenagem no ultrafreezer empregando diferentes criopreservantes. Cinética zero (‘ ’), primeiro repique (‘ ’), segundo repique (‘ ’), terceiro repique (‘ ’)...87 Figura 30: Perfis de crescimento da Chlorella vulgaris após de 60 dias de armazenagem no ultrafreezer empregando diferentes criopreservantes. Cinética zero (‘ ’), primeiro repique (‘ ’), segundo repique (‘ ’), terceiro repique (‘ ’), quarto repique(‘ ‘). ...88 Figura 31: Perfis de crescimento da Chlorella vulgaris após de 90 dias de armazenagem no ultrafreezer empregando diferentes criopreservantes. Cinética zero (‘ ’), primeiro repique (‘ ’), segundo repique (‘ ’), terceiro repique (‘ ’), quarto repique(‘ ‘). ...89 Figura 32: Perfis de crescimento da Chlorella vulgaris após de 180 dias de armazenagem no ultrafreezer empregando diferentes criopreservantes. Cinética zero (‘ ’), primeiro repique (‘ ’), segundo repique (‘ ’), terceiro repique (‘ ’), quarto repique(‘ ‘). ...90
Figura 33: Perfis de crescimento da Chlorella vulgaris após de 270 dias de armazenagem no ultrafreezer empregando diferentes criopreservantes. Cinética zero (‘ ’), primeiro repique (‘ ’), segundo repique (‘ ’)...91
NOMENCLATURA
Abreviaturas
Abs Absorbância
C/N DMSO
Razão mássica de Carbono/Nitrogênio Dimetilsulfóxido
(m/v) Relação massa por volume (m/m) Relação massa por massa Siglas
cel/ml Concentração celular por mililitro cel/ml
Concentração do inibidor g.L-1
n Número de amostragens analisadas
-Ki Constante de inibição g.L-1
Km -1/x0
Px, Px_max Produtividade celular, Produtividade celular máxima g.L-1.h-1
rs Taxa de consumo de substrato g.L-1.h-1
S Concentração do Substrato g.L-1
s variância
T0, t Tempo inicial e tempo de residência H
tg Tempo de geração D
X0, Xmax, X Concentração celular inicial, máxima e no tempo t g.L-1
x Média
-xi Intercepto da reta com presença de inibidor
-x0 intercepto da reta sem inibidor
-YX/S Fator de conversão g.g-1
VVM Volume de ar por volume de meio por minuto VVM
Símbolos Gregos
Duração da fase lag h-1
Velocidade específica de crescimento h-1, d-1
max, Velocidade máxima específica de crescimento de um dado ensaio h -1
1. INTRODUÇÃO
Um dos principais desafios das sociedades modernas são as crescentes demandas por energias limpas e menos poluentes. Com as questões relativas à poluição ambiental e ao aquecimento global, as preocupações sobre o futuro levaram a ciência a se concentrar em fontes alternativas de energia renovável, sustentável e ambientalmente amigável a fim de encontrar soluções rápidas e efetivas para essas questões.
A alta do petróleo apresentada nos últimos anos tornou o biodiesel uma alternativa viável para o uso conjunto ao diesel, ou até mesmo sua completa substituição. As principais matérias primas comerciais para biodiesel nos últimos anos incluem óleo de soja, colza, palma, milho, gordura animal e óleos residuais, dependendo da abundância local. Contudo, apesar de serem renováveis e produzidas em grande escala, a produção de biodiesel não é satisfatória para suprir a demanda global, além de utilizar grandes áreas de terra para seu cultivo. O cultivo de palma produz óleo em baixas quantidades (menos de 5% da biomassa total) em comparação com as microalgas (10-40% da biomassa total). Cerca de 80% do custo total de produção de biodiesel são derivados dos custos da matéria-prima. Este fato exerce uma clara pressão sobre a produção de fontes de óleo vegetais mais baratas. Por estas razões, o biodiesel de microalgas emerge como uma promessa de fonte de energia alternativa, apresentando vantagens como, por exemplo, cultivo em pequenas áreas de plantação.
Embora a produção de lipídeos de microalgas para combustíveis seja promissora, em escala industrial ainda são um processo inviável, devido os custos elevados da matéria-prima e das tecnologias de coleta da biomassa e extração dos lipídeos.
Deste modo, para tornar o biodiesel de microalgas a um processo competitivo no mercado são necessárias novas pesquisas, visando o desenvolvimento e principalmente, o aperfeiçoamento dos sistemas de produção em escala comercial, a fim de reduzir custos e aumentar a produtividade.
Neste sentido, o cultivo heterotrófico de microalgas pode oferecer vantagens quando comparada ao sistema fotossintético, como a ausência de luz, diminuindo gastos com a iluminação constante. A utilização de efluentes ou subprodutos agroindustriais com alto conteúdo de carbono orgânico (água de maceração de milho, bagaço de mandioca, melaço de cana de açúcar, melaço e vinhaça de soja, resíduos de frutas, entre outros) podem ser empregados em tais cultivos. Essas características poderiam reduzir o custo dos sistemas heterotróficos, sendo uma alternativa econômica e ambiental viável para obtenção de lipídeos a partir de biomassa de microalgas.
O presente trabalho de mestrado estudou sistemas heterotróficos de microalgas, cujo objetivo foi avaliar o crescimento da microalga Chlorella vulgaris CPCC90, empregando diferentes fontes de carbono orgânico visando aumentar seu crescimento e produtividade em lipídeos.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a produção de biomassa e de lipídeos da microalga Chlorella vulgaris em meios de cultura contendo carbono orgânico.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar a conversão das fontes de carbono orgânico glicerol, sacarose e melaço de cana em biomassa e lipídeos;
Maximizar o acúmulo de lipídeos associado a elevadas produtividades celulares; Avaliar a viabilidade de estocagem em ultrafreezer da microalga Chlorella
vulgaris empregando três crioprotetores: Dimetilsulfóxido, metanol e glicerol, nas concentrações de 5 e 10%,e tempos de 15, 30, 60, 90, 180 e 270 dias.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Biodiesel
Na última década, o desenvolvimento de biocombustíveis foi considerado uma das maiores estratégias para minimizar os problemas ambientais e de geração de energia em muitos países (Gao, Zhai et al., 2010). Dentre estas fontes alternativas de energia se encontra o biodiesel (Lam e Lee, 2012).
O biodiesel segundo a resolução brasileira n. 7, de 19/03/2008, da Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP), é um combustível
composto de alquilésteres de ácidos graxos de cadeia longa, derivados de óleos vegetais ou gorduras animais (Brasil, 2008; Soares, 2010). O mesmo possui propriedades fisico-químicas semelhantes ao diesel de petróleo e pode substituir, parcial ou totalmente o diesel fóssil em motores a combustão do ciclo diesel ou em outros sistemas (Chisti, 2008). Este pode ser misturado com o diesel mineral em diferentes concentrações, sendo conhecida a mistura pela letra B, acrescentada ao número que corresponde à fração mássica de biodiesel. Por exemplo, se uma mistura contem 5% de biodiesel é chamada B5. No Brasil foi estabelecida a obrigatoriedade da adição de 5% de biodiesel ao diesel mediante a Lei n. 11.097, de 13 de janeiro de 2005, após a obrigariedade de 2% (Brasil, 2005).
Segundo Meng, Chen et al. (2008) o biodiesel apresenta vantagens frente à outras fontes alternativas de combustíveis tais como, caráter renovável e biodegradável, maior ponto de fulgor, boa lubricidade, menor emissão de gases poluentes, menor impacto ambiental, possibilidade de ser adicionado ao diesel de petróleo formando blendas; possibilidade de ser utilizado diretamente em motores ou após pequenas modificações do equipamento, dentre outras (Meng, Chen et al., 2008; Song, Fu et al., 2008; Huang, Zong et al., 2009).
3.2 Microalgas
Microalgas pertencem a um grupo grande e heterogêneo de micro-organismos de ambientes aquáticos (marinhos e de água doce) e do solo. Este grupo inclui uma enorme diversidade de formas e funções ecológicas e são responsáveis por pelo menos 60% da produção primária da terra (Chisti, 2008). Muitas das espécies ainda não foram identificadas. No entanto, relata-se a existência de 200.000 até alguns milhões de microalgas. São seres com alto potencial comercial, por sua composição bioquímica, e diversidade ilimitada de bioprodutos, dando às microalgas, uma alternativa de estudo para o aproveitamento em diferentes atividades econômicas (Pulz, 2004; Amaro, Guedes et al., 2011).
As microalgas podem ser cultivadas em água doce ou em situações de salinidade extrema, e são capazes de produzir inúmeros bioprodutos, dentre eles: ácidos graxos,
carotenóides, ficobilinas, polissacarídeos, vitaminas, esteróis, bioativos dentre outros (Revsbeck, 1983; R., 2006; Song, Fu et al., 2008). De forma geral, os cultivos de microalgas apresentam elevadas taxas de crescimento, fato que proporciona alta produção de biomassa em curtos intervalos de tempo. A produtividade de alguns sistemas algáceos é superior a de quaisquer culturas agrícolas conhecidas (Pulz, 2004). Cabe comentar que, tanto a quantidade quanto a qualidade dos bioprodutos é variável em função das condições de cultivo utilizadas.
Diferentes espécies de algas produzem variadas quantidades de óleo, algumas delas produzem até 50% de óleo por massa seca (Morowvat, Rasoul-Amini et al., 2010). Os ácidos graxos das microalgas conhecidas apresentam composição semelhante a dos ácidos graxos utilizados na produção de biodiesel, neste caso é importante dizer que para a produção de biodiesel são desejáveis os ácidos graxos C16:0, C16:1, C18:0 e indesejáveis os C18:3 (Song, Fu et al., 2008).
A Tabela 1 descreve a composição de ácidos graxos presente na microalga Chlorella vulgaris de acordo com a literatura.
Tabela 1: Composição de ácidos graxos da microalga Chlorella vulgaris.
Acido Graxo Conteúdo %
16:0 (Acido Hexadecanóico) 15,2 - 22,6 17:0 (Acido Heptadecanóico) 0,1 18:0 (Acido esteárico) 14,6 16:1n9c (Acido palmitoleico) 0,35 - 1,17 18:1 16,3 18:2 79,4 18:3 0,1 18:1n9c (Acido Oleico) 5,6 - 50,8 18:2n6,9c (Acido linoleico) 3,39 - 9,73 18:3n6 (γ-linoleico) 24,42
3.2.1 Microalgas como fonte de biodiesel
As primeiras publicações sobre o potencial de microalgas como fonte de combustível foram no início dos anos 1980 (Wake e Hillen, 1980; Sawayama, Inoue et al., 1995) e tais estudos tem aumentado de maneira considerável nos últimos anos, sendo catalogadas como candidatas promissoras de sistemas de energia eficiente (Chisti, 2007). As maiores vantagens do cultivo de microalgas são não competir com a agricultura por terras aráveis e o uso de água salgada nos sistemas de cultivo, possibilitando a redução da demanda por água potável. O cultivo e coleta de microalgas não é restrito a poucos períodos do ano, já que seu cultivo é menos susceptível as condições meteorológicas (Rupprecht, 2009).
A literatura descreve três gerações de biocombustíveis: os biocombustíveis de primeira geração obtidos a partir de produtos alimentícios com alto conteúdo de açúcares (por exemplo, beterrabas, mandioca, cana de açúcar, batatas) ou de óleo (soja, canola); biocombustíveis de segunda geração, produzidos a partir de fontes lignocelulósicas (por exemplo, resíduos florestais, bagaço de cana de açúcar); e biocombustíveis de terceira geração, produzidos a partir de microalgas e outros micro-organismos (Meng, Yang et al., 2009). A segunda geração de biocombustíveis é significativamente mais sustentável do que a primeira. Alguns estudos da literatura têm mostrado que os biocombustíveis de primeira geração podem economizar até 60% das emissões de carbono em comparação aos combustíveis fósseis, enquanto biocombustíveis de segunda geração elevam esse número para 80% (Pronina, 1998; Miao e Wu, 2006; Meng, Yang et al., 2009). Os combustíveis de primeira geração têm também restrição ao uso de terra cultivável e, mesmo as reservas de grãos para fins alimentícios, parecem ser escassas. Esta promove o efeito “dominó” com aumento expressivo no preço dos mesmos, acarretando inclusive aumento dos preços de outros alimentos (Gressel, 2008).
Service (2009) cita algumas desvantagens da produção de biocombustíveis a partir de matérias primas alimentares, tais como o aumento potencial do valor dos
alimentos, o grande volume de água utilizado para a irrigação de tais culturas e a poluição de corpos d’água por fertilizantes nitrogenados, e enfatiza que, futuramente, bicombustíveis provenientes de cadeias produtivas de elevado valor entrarão em declínio e deverão ser substituídos por aqueles derivados de resíduos.
A produção de biodiesel a partir de lipídios microbianos pode ser vista como uma excelente alternativa para redução do custo dos combustíveis obtidos a partir de matérias primas alimentares. Os organismos unicelulares produtores de óleos (single cell oils, SCO), definidos como aqueles que apresentam um conteúdo lipídico acima de 20%, tem atraído grande atenção mundial. Dentre os micro-organismos, tais como microalgas, bactérias, fungos e leveduras. A primeira produção comercial de SCO iniciou em 1995, durando apenas seis anos, e após esse período ela foi encerrada por não ser rentável (Ratledge, 2008). Segundo Francisco et al. (2009), as microalgas, produtoras de lipídeos microbianos são promissoras matérias-primas para a produção de biodiesel, visto que diversas características essenciais de seus óleos são desejáveis e adequadas à substituição de diesel.
Neste sentido o biodiesel de terceira geração apresenta vantagens frente os outros, podendo representar uma importante tecnologia a ser desenvolvida para a nova matriz energética que as sociedades estão buscando.
Muitos trabalhos reportam que o rendimento em óleo obtido por área de cultivo é bastante mais significativo em cultivos de microalgas quando comparado ao rendimento obtido com o cultivo de oleaginosas (Tabela 2), o que de acordo com algumas estimativas o rendimento por acre de óleo de algas é 200 vezes maior que o rendimento de óleo de vegetais (Abou-Shanab, Matter et al., 2011).
Tabela 2: Comparação da eficiência da produção estimada de biodiesel a partir de plantas vasculares e microalgas
Matéria-prima de biodiesel
Área necessária para atender a demanda mundial de óleo (106 hectares) Porcentual de superfície terrestre global necessária Percentual de área global de terra arável necessária Algodão 15000 101 757 Soja 10900 73 552 Semente de mostarda 8500 57 430 Girassol 5100 34 258 Colza/Canola 4100 27 207 Pinhão manso 2600 17 130 (0)a Óleo de Palma 820 5,5 41 Microalga (10 g/m2/dia, 30% TAG) 410 2,7 21 (0)b Microalga (50 g/m2/dia, 50% TAG) 49 0,3 2,5 (0)b
aPinhão manso cultivado principalmente em terras marginais.
bAssumindo que as lagoas de microalgas e bioreatores estão localizados em área de terra não
arável. Fonte: (Smith, Sturm et al., 2010).
As microalgas apresentam elevadas concentrações dos ácidos graxos: C16:0, C16:1 e C18:1, ditos compostos desejáveis na produção de biodiesel (Meng, Yang et al., 2009). A Tabela 3 traz uma comparação entre os conteúdos de lipídeos de microalgas e de outros micro-organismos produtores de lipídeos.
Tabela 3: Comparação do conteúdo de lipídeos de alguns micro-organismos oleaginosos. Micro-organismos Conteúdo de lipídeos (%) peso seco
Composição do conteúdo total de lipídeos (m/m)
C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
Microalga Botryococcus braunii 25-75
12-21 55-57 1-2 58-60 4-20 14-30 Cylindrotheca sp 16-37 Nitzschia sp. 45-47 Schizochytrium sp 50-77 Chlorella sp 15-50 Bacteria Arthrobacter sp >40 8-10 10-11 11-12 25-28 14-17 -Acinetobacter calcoaceticus 27-38 Rhodococcus opacus 24-25 Bacillus alcalophilus 18-24
Leveduras Candida curvata 58
11-37 1-6 1-10 28-66 3-24 1-3 Cryptococcus albidus 65 Lypomyces starkeyi 64 Rhodotorula glutinis 72
Fungos Aspergillus oryzae 57
7-23 1-6 2-6 19-81 8-40 4-42
Mortierella isabellina 86 Humicola lanuginosa 75 Mortierella vinacea 66
A Tabela 4 apresenta uma comparação dos principais parâmetros de qualidade do biodiesel de microalga obtido da Chlorella protothecoides com o diesel e as especificações estabelecidas por normas internacionais ASTM para biodiesel. Vale ressaltar que o biodiesel de microalga encontra-se dentro das especificações das normas internacionais para combustíveis.
Tabela 4: Comparação dos principais parâmetros de qualidade do diesel e biodiesel de microalga. Propriedades Biodiesel de C. protothecoides Combustível Diesel ASTM Padrão Biodiesel Densidade (Kg L-1) 0,864 0,838 0,840 - 0,90 Viscosidade (mm2s-1a 40 °C) 5,2 1,9 – 4,1 3,5 – 5,0
Ponto flash (°C) 115 75 Min 100
Ponto de solidificação (°C) -12 -50 a 10
-Ponto de entupimento de filtro a frio (°C)
-11 -3,0 Max -6,7 Verão Max 0
Inverno Max < -15
Acidez mg KOH g-1 0,374 Max 0,5 Max 0,5
Poder Calorífico MJ Kg-1 41 40 – 45
-Relação H/C 1,81 1,81
-Número de cetano min 50 40 47
Índice de estabilidade de oxidação a 110°C min. (h)
9,1 9 6
Fonte:(Xu, Miao et al., 2006)
Xu, Miao et al. (2006), citaram que, se a produção de microalgas fosse escalonada industrialmente, menos de 41 milhões de hectares no mundo seriam necessários para responder à atual demanda de combustíveis, o que seria uma meta representativa para a agricultura global. No entanto, os combustíveis de algas ainda não são produzidos em escala comercial, devido os altos custos das tecnologias de coleta da biomassa, extração dos lipídeos, da matéria-prima e as baixas produtividades
obtidas no processo de produção de microalgas. Suas perspectivas econômicas são promissoras, portanto muitas empresas estadounidenses buscam um processo comercialmente rentável, algumas delas estão apresentadas na Tabela 5 (Chisti e Yan, 2011).
Tabela 5: Companhias que investem atualmente na produção para comercialização de combustíveis de algas.
Companhia Localização Site
Algenol Biofuels Bonita Springs, FL, USA www.algenolbiofuels.com
Aquaflow Nelson, New Zealand www.aquaflowgroup.com
Aurora Algae, Inc. Hayward, CA, USA www.aurorainc.com
Bioalgene Seattle, WA, USA www.bioalgene.com
Bionavitas, Inc. Redmond, WA, USA www.bionavitas.com
Bodega Algae, LLC Boston, MA, USA www.bodegaalgae.com
LiveFuels, Inc. San Carlos, CA, USA www.livefuels.com
PetroAlgae Inc. Melbourne, FL, USA www.petroalgae.com
Phyco Biosciences Chandler, AZ, USA www.phyco.net
Sapphire Energy,Inc. San Diego, CA, USA www.sapphireenergy.com
Seambiotic Ltd. Tel Aviv, Israel www.seambiotic.com
Solazyme, Inc. South San Francisco, CA, USA www.solazyme.com Solix Biofuels, Inc. Fort Collins, CO, USA www.solixbiofuels.com Synthetic Genomics Inc. La Jolla, CA, USA www.syntheticgenomics.com
Fonte: (Chisti e Yan, 2011).
Desde que resolvidos os problemas dos altos custos e baixas produtividades no processo, que impedem a produção comercial de biodiesel, a partir de microalgas, estas provavelmente serão uma importante matéria-prima energética; e o óleo de algas poderá substituir fontes derivadas dos combustiveis fósseis (diesel, gasolina e
querosene), e se tornar uma das matérias primas renováveis, gerando um impacto positivo para o meio ambiente (Chisti e Yan, 2011).
3.2.2 Chlorella vulgaris
Chlorella vulgaris é uma microalga verde unicelular, pertencente ao Reino: Protista, Filo: Chlorophyta, Classe: Chlorophyceae, Ordem: Chlorococcales, Família: Oocystaceae, e Gênero: Chlorella (Lee, Park et al., 2008)(algaebase, 2012). São de forma esférica, com cerca de 2-10 μm de diâmetro, sem flagelo, e contém pigmentos verdes fotossintéticos nos seus cloroplastos (Lourenço, 2007).
A Tabela 6 apresenta um resumo dos estudos realizados para a espécie Chlorella vulgaris com diferentes condições de cultivo e de fontes de carbono para a produção de lipídeos.
Tabela 6: Estudos realizados em sistema heterotrófico com diferentes fontes de carbono e tipo de cultivo para a espécie Chlorella vulgaris.
Fonte de carbono Tipo de cultivo T °C Meio de cultivo Biomassa (mg/L.d)
Lipídeos (mg/L.d)
Referência
Glicose Erlenmeyers 25 Bristol
modificado
125 3,5 (Yeh e Chang, 2012)
Glicose/CO2 125 67,4
Glicose Semi-contínuo 30 Água residual
artificial/Glicose
114 147 (Feng, Y., Li, C. et al., 2011)
Glicose Batelada Bristol
modificado
500 129,5 (Yeh, Chen et al., 2012b)
Frutose 120 20
Sacarose 20 2,4
Glicerol 8 1,1
Acetato de sódio 15 1,76
Acetato de sódio Erlenmeyers 25 - 87 4 (Liang, Sarkany et al., 2009)
Glicose 151 35
Glicerol 91 31
Glicose/luz 254 54
Glicose Erlenmeyers 28 Basal modificado 1400 325 (Mitra, Van Leeuwen et al., 2012)
Soro de leite de soja - 625 75
Vinhaça de milho - 1450 525
3.3Cultivos heterotróficos
Com relação à forma de utilização da fonte de carbono as microalgas apresentam três tipos de metabolismo: autotrófico, heterotrófico e mixotrófico. No metabolismo autotrófico a luz é a fonte de energia e o CO2 a fonte de carbono sendo
convertidos em energia química pelas reações fotossintéticas das células. No metabolismo heterotrófico as células utilizam somente compostos orgânicos como fonte de carbono e energia e no metabolismo mixotrófico os organismos utilizam tanto o autotrófico como o heterotrófico, dependendo da concentração de compostos orgânicos e intensidade de luz disponível (Lourenço, 2007).
Apesar das microalgas serem frequentemente consideradas fotoautotróficas, requerendo luz para seu crescimento, segundo Wen e Chen (2003), um número considerável de microalgas é capaz de crescer heterotroficamente, com um ou mais substratos orgânicos como fonte de energia. Para este tipo de microalga, tecnologias de fermentação podem ser adotadas e modificadas para produção em grande escala de bioprodutos.
As células da Chlorella possuem um sistema de transporte ativo induzido para a glicose, fato que poderia ser controlado pela síntese da proteína ligada à membrana citoplasmática, tendo assim um aumento significativo na captação da glicose. A captação é acompanhada por uma absorção estequiométrica de prótons de 1-1 e uma despolarização do potencial da membrana. No caso de aminoácidos, como arginina, são ativamente transportados pelas membranas celulares. O pequeno tamanho molecular de alguns ácidos orgânicos (ácido acético, ácido láctico) e álcool (etanol) permitem sua difusão para dentro das células. Em termos de crescimento e produtividade é amplamente observado que a taxa de crescimento específico de algas cultivadas heterotroficamente, empregando açúcares simples (glicose) e ácidos orgânicos (ácido acético, ácido láctico), são menores do que em sistemas autotróficos. A Chlorella vulgaris é uma das exceções, pois seu crescimento em sistemas heterotróficos é maior do que em sistemas autróficos (Abeliovich, 2004).
O cultivo heterotrófico de microalgas pode ser uma alternativa viável frente ao cultivo autotrófico, pois este tipo de cultivo utiliza fontes orgânicas de carbono tais como açúcares ou ácidos orgânicos como únicas fontes de energia, deste modo se elimina a necessidade de luz, oferecendo em muitos casos um aumento significativo na produtividade da biomassa (Chen, 1996). O volume de água utilizada também é um fator representativo em cultivos heterotróficos que utilizam efluentes agroindustriais com elevado teor de carboidratos, minimizando custos com água e favorecendo o reuso de efluentes que originalmente seriam enviados para tratamento antes de seu despejo em corpos de água (Feng, Yujie, Li, Chao et al., 2011).
A microalga Chlorella mostra-se capaz de crescer rapidamente entre 7 a 10 dias em sistemas heterotróficos (Shi, Zhang et al., 2000; Miao e Wu, 2006; Heredia-Arroyo, Wei et al., 2010; Shen, Yuan et al., 2010; Ni, Xie et al., 2011). Um organismo cultivado em heterotrofia deve possuir capacidade de se dividir e metabolizar no escuro, ser resistente e capaz de crescer em meios de baixo custo e de fácil esterilização, ter rápida adaptação ao novo ambiente (robustez), com uma fase lag curta ou ausente e resistência a fermentadores e equipamentos periféricos (Tan, 1996; Wen e Chen, 2003).
Segundo Amaro, Guedes et al. (2011) a produtividade de óleos nas microalgas é melhorada no cultivo heterotrófico, gerando maior interesse nestes tipos de cultivos. Um aumento do conteúdo de lipídios de 40% foi observado na Chlorella protothecoides, ao passar de cultivo autotrófico para heterotrófico.
Microalgas heterotróficas são capazes de crescer na ausência de luz, portanto, devem obter energia a partir de pelo menos uma fonte de carbono orgânico, as mais empregadas são o acetato e a glicose (Springer, 1994; Vazhappilly, 1998).
Glicose é a fonte de carbono mais empregada em cultivos heterotróficos de microalgas, atingindo taxas maiores de crescimento quando comparado com outros substratos, tais como açúcares, álcoois de açúcar, fosfato de açúcares, ácidos
orgânicos e álcoois. Isso pode acontecer porque a glicose contém maior concentração de energia por mol em comparação com outros substratos. Por exemplo, a glicose produz 2,8 KJ / mol de energia em comparação com 0,8 KJ /mol de acetato, e promove mudanças fisiológicas em Chlorella vulgaris, afetando as vias metabólicas de assimilação de carbono, tamanho das células e maior armazenamento de materiais, tais como amido e lipídios (Perez-Garcia, Escalante et al., 2011b).
Estudos com Chlorella indicaram a glicose como a melhor fonte de carbono em cultivos heterotróficos, atingindo altas concentrações de biomassa e lipídeos (Huang, Chen et al., 2010; Yeh, Chen et al., 2012b). No entanto a glicose é uma fonte carbono de custo elevado, responsável por 60-75% do custo total do biodiesel (Canakci M, 2008). Neste sentido é importante estudar fontes alternativas de carbono de baixo custo e que gerem produtividades de biomassa e óleo similares ou superiores as obtidas com glicose. Portanto, alguns pesquisadores têm avaliado fontes de carbono orgânico hidrolisadas como, por exemplo, hidrolisado de milho, melaço e sorgo. A utilização de hidrolisados em cultivos heterotróficos, em termos econômicos, pode reduzir em até 50% os custos de produção, o que é importante para a produção de biodiesel (Xu, Miao et al., 2006; Gao, Zhai et al., 2010; Huang, Chen et al., 2010; Yan, Dong, Lu, Yue et al., 2011; Liu, Huang et al., 2012).
Um dos principais subprodutos gerado na produção de biodiesel é o glicerol bruto, sendo que aproximadamente 10% do volume total de biodiesel produzido correspondem ao glicerol (Johnson, 2007; Ethier, Woisard et al., 2011). O aumento na produção de biodiesel levou ao aumento também de glicerol, gerando um excesso de oferta e, consequentemente, a redução do preço no mercado (Johnson, 2007; Tang, 2009). Investigações recentes avaliaram o potencial de aplicação do glicerol bruto em diferentes setores, como por exemplo: na alimentação animal, processos de fermentação para a produção de 1,3 propanodiol (intermediário da síntese de polímeros empregados na fabricação de cosméticos), indústria alimentícia e farmacêutica de acordo com (Tang, 2009), obtenção de pigmentos a partir de microalga Spirulina platensis (Narayan M, 2005; Chi, Pyle et al., 2007), produção de hidrogênio gasoso
(Ethier, Woisard et al., 2011) e ácido docosahexaenóico (DHA), dentre outros (Chi, Pyle et al., 2007).
Glicerol é uma substância que tem a capacidade de aumentar a força osmótica em solução e conseqüentemente, mantém o equilíbrio osmótico nas células, fonte de energia econômica, além de ser um soluto compatível com enzimas e membranas, quase sem efeitos tóxicos em altas concentrações (Perez-Garcia, Escalante et al., 2011b).
A sacarose um dos produtos de armazenamento no citoplasma das células vegetais constitui até 60% da biomassa seca de algumas plantas e pode ser obtida principalmente a partir da cana de açúcar e beterraba. Sua hidrólise produz 1 mol de glicose e 1 mol de frutose por mol de sacarose. Dentre as diversas finalidades da sacarose, ela pode ser utilizada na produção de etanol e em outros processos fermentativos. A produção de etanol a partir da cana de açúcar promove a formação de um resíduo que contém sacarose, podendo ser utilizado em cultivos fermentativos (Olguín, Sánchez-Galván et al., 2008; Satyawali e Balakrishnan, 2008).
Dentre as fontes de carbono orgânico de baixo custo encontra-se o melaço de cana que é um resíduo da indústria açucareira, composto principalmente pelos açúcares sacarose, glicose e frutose, alguns colóides em suspensão, metais pesados (principalmente cobre e zinco), vitaminas e compostos nitrogenados. Sua composição varia de acordo com a variedade de cana, condições agroclimáticas da região, processo de fabricação do açúcar, armazenagem etc (Godbole, 2002). Tem sido utilizado como matéria prima para fermentação de ácidos orgânicos (butírico, succínico, láctico e cítrico ) (Huang, Xiang et al., 2011), produção de biodiesel a partir da Chlorella protothecoides, (Yan, Dong, Lu, Yue et al., 2011), em cultura mista com Rhodotorula glutinis e Chlorella vulgaris na produção de lipídeos (Cheirsilp, Suwannarat et al., 2011), produção de antaxantina por Chlorella zofingiensis (Liu, Huang et al., 2012).
Tabela 7: Composição química do melaço de cana da América do Sul.
Propriedade Composição Propriedade Composição Propriedade Composição
Brix (°)a 87-93 Gordura total (%)c 0,4 Cálcio (%)c 0,74
Gravidade especificaa
1,46 -1,50 Fibra total (%)b 0 Magnésio
(%)c
0,35
Sólidos totais (%)a
81-96 Cinzas (%)b 8.1 Glicina (%)c 0,10
Água (%)b 17,3 Oxido de Cálcio (%)a 1,3 – 3,9 Leucina (%)c 0,01 Açúcar total (%)a 49-54 Fósforo (%)b 0,08 Lisina (%)c 0,01 Açucares redutores (%)a 2,5 – 5,2 Potássio (%)b 2,4 Treonina (%)c 0,06 Sacarose (%)b 52 Sódio (%)b 0,2 Valina (%)c 0,02 Glicose (%)b 12 Cloro (%)b 1,4 Colina (ppm)c 600 Frutose (%)b 9 Enxofre (%)b 0,5 Niacina (ppm)c 48,86 Proteína crua (%)b 3 Acido pantoténico (ppm)c 42,90 Tiamina (ppm)c 0,88 Piridoxina (ppm)c 44 Riboflavina (ppm)c 4,40 a(Godbole, 2002) b(Satyawali e Balakrishnan, 2008) c(Fajardo, 2007)
Outro aspecto que se deve levar em consideração em sistemas heterotróficos é a relação carbono/nitrogênio (C/N), que podem influenciar o teor de lipídeos acumulados pela célula, controlando a síntese de lipídios (Gordillo, 1998). Altas taxas de C/N favorecem o acúmulo lipídico, que é provocado pelo esgotamento de nitrogênio na cultura (Ratledge, 1989). Chen (1991), em seus estudos com a microalga Chlorella sorokiniana estabeleceram uma taxa de 20 como ideal, para a relação de C/N, obtendo um aumento no teor lipídico proporcional ao aumento da taxa C/N. Tais autores também citam que a relação C/N pode ser utilizada para manipular a composição de ácidos graxos, obtendo altas concentrações de ácidos graxos insaturados para baixas taxas de C/N.
3.3 Criopreservação de microalgas
Dentre as técnicas de preservação em longo prazo para microalgas se encontram a liofilização, o congelamento em ultrafreezeres e a criopreservação em nitrogênio (Morgan, 2006a).
A técnica mais utilizada na conservação de microalgas utilizadas na CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa) e UTEX (The culture collection algae) é a criopreservação em nitrogênio líquido (Andersen, 2005). Contudo em nosso laboratório contamos com um ultrafreezer e visamos utilizá-lo no armazenamento e criopreservação das microalgas. Nosso objetivo principal é padronizar uma metodologia definida para preservação da Chlorella vulgaris, a fim de otimizar o espaço físico, custo, material e trabalho da manutenção dos cultivos.
As técnicas de preservação empregando congelamento à -80°C requerem a utilização de um agente crioprotetor para evitar o rompimento das células (Zdenek, 2003). Os crioprotetores são compostos que eliminam ou diminuem significativamente a destruição das estruturas celulares durante o congelamento. Para a conservação e preservação da viabilidade dos micro-organismos, morfológica, bioquímica, taxonômica e genéticas é necessário que o criopreservante não seja tóxico, seja hidrofílico, não seja facilmente reativo com a água, previna a hiperconcentração na suspensão,
estabilize as pontes de hidrogênio nos cristais, previna a formação de cristais grandes, e tenha boa penetração celular (somente para crioprotetores endocelulares). A escolha de um criopreservante ou a combinação deles dependerá do micro-organismo e deverá ser determinada empiricamente, pois vários fatores afetarão a eficiência do mesmo, como, por exemplo, a espécie, linhagem, tamanho e forma das células, fase e taxa de crescimento, temperatura de incubação, osmomolaridade, composição do meio criopreservante, quantidade de água dentro da célula, sua densidade quando congelada, taxa de congelamento, entre outros. Dentre esses fatores, o mais importante é a composição do meio em que as células estão suspensas durante o congelamento. (Morgan, 2006b).
Tem-se estudado a capacidade de preservação de diferentes substâncias crioprotetoras, segundo a cepa a armazenar. A Tabela 8 apresenta a utilização de crioprotetores em artigos publicados para diferentes micro-organismos. O numerador indica o número de artigos que utilizaram somente o composto, e o denominador indica a utilização do composto em conjunto com outro crioprotetor (Zdenek, 2003).
Tabela 8: Crioprotetores utilizados na conservação de micro-organismos.
Composto Vírus Bactéria Fungo Alga Protozoo
Dimetilsulfóxido 14/6 42/12 31/8 42/7 76/56 Metanol - 2/0 2/1 17/2 0/1 Etanol - - 1/0 1/0 -Álcool polivinílico - 0/1 1/0 - 1/0 Etilenoglicol - 1/0 3/1 1/1 2/1 propilenoglicol - 1/0 2/0 1/1 0/2 Trietilenoglicol - - - - 1/0 Dietilenoglicol - 2/0 - - -Polietilenoglicol - 3/0 2/0 0/1 0/1 Óxido de polietileno 1/0 3/0 - - -Glicerol 7/6 63/23 79/5 17/4 56/48 Manitol e ducitol - - 1/0 1/0 -Inositol - 0/1 1/0 - -Sorbitol 1/0 - 1/1 2/7 0/3 Glicose 1/0 2/9 5/3 - 0/12 Xylose - - - - 0/2 Sacarose 6/0 14/7 4/5 4/2 0/2
Lactose - 2/3 1/1 - -Maltose - - - 0/1 0/8 Trealose 1/0 ½ 3/1 - -Rafinose - - - 0/1 -Dextrano 1/0 7/1 1/0 1/1 0/1 Hidroxietilamido - - 1/0 - 0/3 Metilcelulose - 1/0 - - -Ficoll - 1/0 0/1 0/1 0/1 Goma arábica - 1/0 - - -Acetamida - 1/0 - - 0/1 Dimetilformamida - 1/0 - - -Dimetilacetamida - 1/0 - - 0/1 Succinimida - 1/0 - - -Metilpirrolidona - 1/0 - - -Polivinilpirrolidona 1/0 7/1 1/0 5/2 0/12 Prolina - - - 2/1 -Acido glutâmico - 3/1 - 1/1 -Acetato de amônio 1/0 - - -Citrato 1/0 - - - --Sangue - 5/16 - - 19/51 Soro de sangue 12/10 11/11 1/9 1/0 10/59 Soro de albumina 7/0 6/2 - - 1/7 Gelatina - 4/1 2/1 - -Peptona 3/0 8/7 1/14 0/1 1/3 Soja tripticase - 0/8 1/1 0/1 0/10 Extrato de concha - 2/0 - - -Glicoproteínas - 2/0 1/2 - -Mucina - 1/0 - - -Valinomicina - 1/0 - - -Gramicidina - 1/0 - - -Extrato de levedura - 3/8 1/14 - 0/10 Extrato de malta - 2/0 1/10 - -Leite desnatado 3/1 32/11 2/6 3/0 0/3 Gema de ovo 1/0 1/0 - 1/0 -Mel - 2/0 - - -Fonte:(Zdenek, 2003)
Tendo como referência a literatura, protocolos de criopreservação encontrados foram adaptados ao uso do ultrafreezer para a conservação de microalgas. Deste modo, foram testados os três crioprotetores mais usados para criopreservação de microalgas, como foi apresentado na tabela 8: Dimetilsulfóxido (DMSO), Metanol e glicerol.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1Micro-organismo e condições de cultivo
Foi utilizada a microalga Chlorella vulgaris CPCC90, obtida do Canadian Phycological Culture Centre, mantida e propagada em ágar inclinado em meio sintético BBM (Stein, 1973). Sua composição encontra-se descrita na Tabela 9 e ao meio foi adicionado ágar numa concentração de 15 g.L-1. As condições de manutenção foram de 20°C e 10 g.L-1de glicose, em ausência de luz.
Tabela 9: Composição do meio sintético BBM (pH 6,8).
Componente (g.L-1) Componente (g.L-1) Na2EDTA 0,050 Fe2SO4.7H2O 0,00498 KOH 0,0031 H2SO4 0,00184 CaCl2.2H2O 0,025 H3BO3 0,01142 MgSO4.7H2O 0,075 ZnSO4.7H2O 0,00882 K2HPO4 0,075 MnCl2.4H2O 0,00144 KH2PO4 0,175 CuSO4.5H2O 0,00157 NaCl 0,025 Co(NO3)2.6H2O 0,00049 NaNO3 0,250 MoO3 0,00071
4.2 Preparo do Ágar inclinado para cultivo heterotrófico
Chlorella vulgaris CPCC90, foi transferida para Erlenmeyers de 250 ml contendo ágar inclinado em meio BBM, acrescentado a fonte de carbono a ser avaliada em concentração de 2 g.L-1 (glicerol, sacarose hidrolisada ou melaço hidrolisado), e
nitrato de sódio em quantidade suficiente para manter a relação de C/N em 20. Os frascos de ágar inclinado foram cultivados na ausência de luminosidade numa temperatura de 26°C, por aproximadamente 8 dias.
4.3 Preparo do inóculo e condições de axenia
Após 8 dias de cultivo, aos frascos inclinados de Chlorella vulgaris (CPCC90) foram adicionados 3 ml de meio BBM e, com a ajuda de uma alça de inoculação descartável, as células foram ressuspendidas na fase líquida, agitando o frasco para sua homogeneização. Todo o volume de células ressuspendidas foi transferido para um novo Erlenmeyer para obtenção de uma concentração de células homogênea. Foram adicionados 2,5 ml de suspensão de células a cada um dos Erlenmeyer contendo 47,5 ml de meio BBM com 5 g.L-1 da fonte de carbono a ser avaliada (glicerol, sacarose hidrolisada ou melaço hidrolisado) e nitrato de sódio em quantidade suficiente para manter a razão C/N em 20. Os Erlenmeyers foram mantidos em incubadora rotatória, sob agitação constante a 140 rpm e temperatura de 26°C, em ausência de luminosidade.
A concentração celular do inóculo foi monitorada diariamente por medida da densidade óptica a 680nm em Espectrofotômetro digital UV-Vis, Genesys-10 UV. O inóculo foi utilizado em sua fase exponencial de crescimento, entre 70 e 96 horas de cultivo, atingindo concentrações entre 5 e 6 g.L-1. O inóculo foi adicionado ao meio de cultivo e cada fermentação foi iniciada em concentração celular de 0,3 g.L-1.
Todos os procedimentos foram executados assepticamente, em câmara de fluxo laminar, e os materiais e meios de cultivo utilizados foram esterilizados em autoclave a 121°C durante 20 minutos. A axenia dos cultivos foi verificada por microscopia ótica, em um Microscópio modelo BVM-100 (Marca Bel Photonics, Milano, Itália).
4.4Condições experimentais
4.4.1 Cultivo em incubadora rotatória
Os cultivos foram incubados em incubadora rotatória (modelo 430-RD- Nova Ética), sob agitação constante a 140 rpm e temperatura de 26°C, na ausência de luminosidade. O volume de trabalho foi de 50 ml e a concentração do inóculo de 0,3 g.L-1. Todos os cultivos foram realizados em duplicata.
4.4.2 Cultivo em biorreator
As melhores condições encontradas em incubadora rotatória, para os substratos testados, foram executadas em um biorreator BioFlo/Celli Gen 115 (New Brusnswick) com volume útil de 2,0 litros. A concentração de oxigênio dissolvido (DOD) e pH foram monitoradas por eletrodos específicos. A velocidade de agitação, temperatura e concentração de oxigênio dissolvido foram registradas pelo software Bio Command Track and Trend. Revisão C. 2011(New Bruswick Scientific). O volume de trabalho foi de 1,5 litros e 0,3 g.L-1de concentração inicial de inóculo. A temperatura do sistema foi mantida constante em 26 ºC e os cultivos foram realizados na ausência de luminosidade cobrindo-se a cuba do fermentador com papel pardo.
A velocidade de agitação foi relacionada com a concentração de oxigênio dissolvido, de modo que a concentração de oxigênio dissolvido fosse mantida no mínimo em 20%. A velocidade de agitação variou entre 150 rpm e 250 rpm. A aeração foi fixada em 1,5 VVM (2,25 litros de ar/min)
Foram realizadas duas alimentações, para todos os experimentos, com meio BBM concentrado 7,5 vezes mantendo sempre a relação carbono/nitrogênio em 20. As alimentações foram realizadas após esgotamento da fonte de carbono no meio de cultivo.
As amostragens foram realizadas em espaços diferentes de tempo, variando com o crescimento da microalga, sendo monitorado o consumo de substrato e crescimento celular.
Todas as fermentações foram realizadas em duplicata.
4.5 Metodologia Analítica
O pH foi monitorado ao longo dos cultivos por método potenciométrico utilizando-se um potenciômetro (QUIMIS, modelo Q-400A).
A concentração celular foi determinada por medida da densidade ótica, a 680nm em um espectrofotômetro digital UV-Vis, Genesys-10 UV. Como branco foi utilizada água destilada para os cultivos com glicerol, pois o meio de cultivo possui tonalidade semelhante a da água e, para os cultivos com melaço de cana hidrolisado e sacarose hidrolisada foram utilizados o próprio meio, isento de células, pois os meios de cultivos possuem uma tonalidade marrom. Paralelamente, a concentração celular foi verificada por massa seca, utilizando filtração a vácuo de 15mL de meio de cultura em membrana de 0,22μm. A biomassa filtrada foi seca em estufa à 60°C e submetida à peso constante. Finalmente foram realizadas curvas de calibração para o cálculo da concentração celular, baseados nas relações obtidas em cada ponto por massa seca e densidade ótica.
O consumo de glicose foi determinado pelo método enzimático colorimétrico glicose-oxidase, marca Laborlab. Para a análise foi empregado 20 μL da amostra e adicionados 2 mL do reagente enzimático, incubados a 37°C por 10 min. Após resfriamento a absorbância foi lida a 505 nm em um Espectrofotômetro digital UV-VIS, Genesys-10 UV.
O consumo do glicerol foi determinado pelo método enzimático colorimétrico para determinação de triglicérides, marca Laborclin. Para a análise foi empregado 10 μL da amostra e adicionados 1 mL do reagente enzimático, incubados a 37°C por 15 min.
Após resfriamento a absorbância foi lida a 505 nm em um Espectrofotômetro digital UV-VIS, Genesys-10 UV.
Os açúcares redutores totais foram determinados pelo método colorimétrico Somogyi-Nelson (Nelson, 1944). Para a análise foi empregado 50 μL da amostra e adicionados 0,5 mL do reagente AB (carbonato de sódio anidro, bicarbonato de sódio, tartarato de sódio e potássio, sulfato de cobre pentahidratado e ácido sulfúrico concentrado), incubados em banho com água fervente por 10 min. Após rápido resfriamento em banho de gelo foram adicionados 0,5 mL do reagente C (molibdato de amônio, ácido sulfúrico concentrado e arseniato de sódio) e, após 10 minutos, 5 mL de água destilada. A leitura de absorbância foi a 620 nm em um Espectrofotômetro digital UV-VIS, Genesys-10 UV. O consumo da frutose foi determinado pela diferença entre açúcares redutores totais e glicose. No final de cada cultivo foram avaliados os açúcares redutores por cromatografia de troca iônica em sistema Metrohm (bomba Professional IC 850 Anion-MCS-LP Gradient, amostrador com injetor automático 863 Compact Auto Sampler, detector amperiométrico 871 Advanced Bioscan; aparelho de interface 771 IC Compact). Duas colunas Metrosep Carb 1-150 (copolímero de poliestireno/ divinilbenzeno), tamanho de partícula 5µm; com dimensões de 150 x 4.0mm) foram conectadas em série utilizando NaOH 100 mM com fluxo de 1,0 mL/min como eluente, temperatura da coluna e do detector de 30°C. O volume de injeção de amostra foi de 20µL.
A verificação da axenia dos cultivos foi por microscopia ótica, em um Microscópio modelo BVM-100 (Marca Bel Photonics, Milano, Itália).
A umidade do melaço de cana foi determinada empregando um Karl Fischer volumétrico modelo 701 KF Titrino; 703 Stand, (Marca Metrohm), forno Thermaprep. A temperatura utilizada foi de 150 ºC, com um fluxo de nitrogênio de 75 mL/min e tempo de extração de 800 segundos.
As cinzas do melaço de cana foram determinadas por incineração da amostra em numa mufla a temperatura de 550ºC durante 4 horas.
O teor de lipídeos foi determinado pelo método de Bligh & Dyer (Bligh, 1959). Foram pesadas 500 mg de biomassa, adicionados 5 ml de HCl 2M e incubadas em banho-maria a 80ºC por 1 hora. Após a incubação a amostra foi centrifugada a 4500 rpm por 15 min. e o líquido foi removido por seringa. A extração dos lipídeos foi feita com uma mistura de solventes orgânicos (metanol e clorofórmio) visando criar um sistema trifásico, no qual os lipídeos ficam dissolvidos em clorofórmio, podendo ser separado da biomassa. Foram adicionados 4 mL de metanol, 2mL de clorofórmio e 3,6 mL de água na biomassa digerida, posteriormente centrifugada a 4500 rpm por 10 min., cuja fase inferior (clorofórmio) foi retirada empregando uma seringa. Foi feita uma re-extração dos lipídeos na biomassa digerida adicionando 4 mL de uma solução 10% v/v de metanol em clorofórmio na amostra, e levada a centrífuga a 4500 rpm por 10 mim. Finalmente foi evaporado o clorofórmio em um evaporador rotatório a 75ºC sob pressão a vácuo de até 30 polegadas de Hg. Os lipídeos extraídos foram secos em estufa até peso constante a 60ºC por 24 horas. Todas as amostras foram analisadas em duplicatas.
4.6Condições de cultivo
4.6.1 Cultivo com glicerol
Para o cultivo em glicerol o ágar inclinado e o inóculo empregados foram preparados utilizando glicose como fonte de carbono numa concentração de 10 g.L-1.
Para a fermentação o meio sintético BBM foi suplementado com: i) glicerol na concentração de 2g.L-1, ii) relações de glicose/glicerol 80:20(m/m), (8 g.L-1 glicose; 2 g.L-1 glicerol) e 60:40(m/m)(6 g.L-1 glicose; 4 g.L-1 glicerol) e iii) controle empregando glicose na concentração de 10g.L-1, sempre mantendo uma relação carbono/nitrogênio constante em 20. A razão C/N foi ajustada pela adição de NaNO3. O pH do meio de
4.6.2 Cultivo com sacarose e sacarose hidrolisada
Meio sintético BBM, suplementado com: i) sacarose na concentração de 2g.L-1, ii) sacarose hidrolisada nas concentrações de 2; 5; 8; 10 e 20g.L-1, e iii) frutose na concentração de 2g.L-1, sempre mantendo uma relação carbono/nitrogênio constante em 20. A razão C/N foi ajustada pela adição de NaNO3. O pH do meio de cultivo foi
ajustado a 6,8 com HCl 1M e NaOH 1 M.
4.6.3 Cultivo com melaço hidrolisado
O meio sintético BBM foi suplementado com: i) melaço hidrolisado nas concentrações de 5; 10; 20; 25 e 30g.L-1, sempre mantendo a relação carbono/nitrogênio constante em 20. A razão C/N foi ajustada pela adição de NaNO3. O
pH do meio de cultivo foi ajustado a 6,8 com HCl 1M e NaOH 1 M.
4.6.4 Condições de cultivo
Os cultivos foram incubados utilizando 20 Erlenmeyer aletados e âmbar de 250 ml contendo 50 ml de meio de cultivo como volume de trabalho, considerando 0,3 g.L-1 de inóculo inicial na fase exponencial de crescimento. Os Erlenmeyers foram mantidos em incubadora rotatória a 140 rpm e 26°C na ausência de luminosidade. Amostragem foi realizada considerando o descarte do frasco para cada tempo avaliado. Os cultivos foram realizados em duplicata e as medições dos dados cinéticos referem-se à média de três repetições.
4.7Hidrólise da sacarose
A sacarose foi hidrolisada segundo o referenciado por Gao, Zhai et al. (2010), a uma solução de 500g.L-1 de sacarose (xarope) foram adicionados 0,0183 L de ácido
