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Estudo da eficiência de extração de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos por extração em ponteira descartável aplicando estratégias multivariadas seguido de detecção por GC-MS

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Academic year: 2021

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMATICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

ESTUDO DA EFICIÊNCIA DE EXTRAÇÃO DE HIDROCARBONETOS

POLICÍCLICOS AROMÁTICOS POR EXTRAÇÃO EM PONTEIRA DESCARTÁVEL APLICANDO ESTRATÉGIAS MULTIVARIADAS SEGUIDO DE DETECÇÃO POR

GC-MS

ANGELA CONCER

Florianópolis Novembro/2020

(2)

Angela Concer

ESTUDO DA EFICIÊNCIA DE EXTRAÇÃO DE HIDROCARBONETOS

POLICÍCLICOS AROMÁTICOS POR EXTRAÇÃO EM PONTEIRA DESCARTÁVEL APLICANDO ESTRATÉGIAS MULTIVARIADAS SEGUIDO DE DETECÇÃO POR

GC-MS

Relatório apresentado ao Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial da disciplina de Estágio II (QMC 5512)

________________________________ Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira

________________________________ Msc. Marina Pereira Coelho

Florianópolis Novembro/2020

(3)

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, quero agradecer aos meus pais por me concederem a vida, acreditarem em mim e por sempre me incentivarem a estudar e correr atrás dos meus objetivos.

Aos meus irmãos e suas respectivas famílias que estão sempre presentes em minha vida, mesmo com a distância.

Ao meu orientador professor Dr. Luiz Madureira por me possibilitar esses anos de aprendizado no laboratório, pela confiança e pela oportunidade de desenvolver esse trabalho de conclusão de curso.

A minha amiga e coorientadora Msc. Marina Pereira Coelho, pela paciência, pelo conhecimento transmitido, pelos conselhos e por não desistir de mim!

Aos colegas do LaGOAmb que tive o imenso prazer de trabalhar e conviver nesses anos, obrigada pelas conversas, almoços e toda a força.

Aos meus primos queridos, amigos de infância e amigos que fiz no intercâmbio que mesmo com a distância estão sempre me apoiando e me dando forças para nunca desistir. Obrigada amigos, não sei o que seria de mim sem vocês!!!

À Universidade Federal de Santa Catarina pela possibilidade de ensino público, gratuito e de qualidade.

Aos professores e colegas de curso que compartilharam seus conhecimentos comigo e permitiram que eu chegasse até aqui.

Ao CNPq pela bolsa PIBIC e à Petrobras pelo apoio financeiro que permitiu a realização deste trabalho.

(4)

SUMÁRIO

1. Introdução ... 9

2. Revisão da Literatura ... 11

2.1 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos ... 11

2.2 Preparo de Amostra ... 14

2.3 Extração em Ponteiras Descartáveis ... 15

2.4 Análise Multivariada ... 18

2.5 Cromatografia a Gás Acoplada à Espectrometria de Massas ... 19

3. Objetivos ... 20

3.1 Objetivo Geral ... 20

3.2 Objetivos específicos ... 20

4. Material e Métodos ... 21

4.1 Materiais e Reagentes ... 21

4.2 Instrumentação e Condições Cromatográficas ... 21

4.3 Procedimento Experimental ... 22

4.3.1 Etapa I: Limpeza e fortificação da matriz sólida ... 22

4.3.2 Etapa II: Extração sólido líquido ... 23

4.3.3 Etapa III: Extração em ponteira descartável (DPX) ... 23

4.3.3.1 Preparo da ponteira e delineamento experimental ... 23

4.3.3.2 Otimização do procedimento de extração (DPX) ... 23

4.4 Segurança no laboratório e tratamento de resíduos ... 26

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 27

5.1 Separação Cromatográfica... 27

5.2 Otimizações dos Parâmetros ... 29

5.2.1 Otimização da proporção de material sorvente ... 29

5.2.2 Otimização etapa de extração... 30

5.2.3 Otimização da etapa de dessorção ... 31

5.2.4 Otimização dos solventes da dessorção ... 32

5.3 Perspectivas ... 33

6 CONCLUSÃO ... 35

(5)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema do dispositivo de extração por DPX. Adaptado de BORDIN et al, 2016. ... 16 Figura 2. Etapas do procedimento da DPX. Adaptado de OLIVEIRA et al, 2018. ... 17 Figura 4. Cromatograma da separação dos 16 PAH de estudo a partir de 1 µL de solução com concentração 1 mg L-1. 1-naftaleno; 2-acenaftileno; 3-acenafteno; 4-fluoreno; 5-fenantreno; 6-antraceno; 7-fluoranteno; 8-pireno; 9-benzo(a)antraceno; 10-criseno; 11-benzo(b)fluoranteno; 12-benzo(k)fluoranteno; 13-benzo(a)pireno; 14-indeno(1,2,3-cd)pireno; 15-dibenzo(a,h)antraceno; 16-benzo(g,h,i)perileno... 28 Figura 5. Gráfico de barras obtido pela otimização da massa de material sorvente. 30 Figura 6. Superfície de resposta obtida para a otimização do número de ciclos e tempo de extração. ... 31 Figura 7. Superfície de resposta obtida para a otimização do número de ciclos e tempo de dessorção. ... 32 Figura 8. Superfície resposta Simplex Lattice da otimização dos solventes da dessorção líquida. ... 33

(6)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. PAH prioritários em estudos ambientais segundo USEPA ... 13

Tabela 2. Fases extratoras disponíveis comercialmente para DPX e seus usos. Adaptado de PINTO et al, 2015. ... 18

Tabela 3. Planejamento da otimização univariada da proporção de Silica Gel e Alumina como material sorvente ... 24

Tabela 4. Planejamento Doehlert para a etapa da extração ... 25

Tabela 5. Planejamento Doehlert para a etapa de dessorção... 25

(7)

LISTA DE ABREVIATURAS

ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas ACN – Acetonitrila

CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente DCM – Diclorometano

DPX – Extração em ponteira descartável, do inglês Disposable Pipette Extraction GC – Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography

GC-MS – Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas, do inglês Gas Chromatography – Mass Spectrometry

IARC – Agência Internacional de Pesquisa em Câncer, do inglês International Agency for Research on Cancer

IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada, do inglês International Union of Pure and Applied Chemistry

LLE – Extração Líquido-Líquido, do inglês Liquid-Liquid Extraction MeOH - Metanol

PAH – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos, do inglês Polycyclic Aromatic Hydrocarbons

POPs – Poluentes Orgânicos Persistentes

SPE – Extração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Extraction

UAE – Extração assistida por ultrassom, do inglês Ultrasound Assisted Extraction USEPA – Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos do inglês United States Environmental Protection Agency.

(8)

RESUMO 1

2

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAH) são compostos amplamente 3

conhecidos como poluentes orgânicos persistentes presentes em diversas matrizes 4

ambientais. Portanto, o monitoramento desses compostos é de suma importância, e a 5

busca por técnicas de preparo de amostra é uma etapa fundamental para o sucesso 6

da metodologia analítica empregada para quantificação. Neste trabalho, o objetivo foi 7

estudar a eficiência da extração de PAH presentes em amostras sólidas explorando a 8

técnica de extração com ponteiras descartáveis (DPX) para extração simultânea de 9

16 PAH. Primeiramente, os compostos orgânicos foram recuperados da amostra 10

sólida a partir da técnica de extração assistida por ultrassom (UAE) seguido da limpeza 11

e pré-concentração por DPX e, por fim, o extrato foi submetido a análise por 12

cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). De acordo com 13

o delineamento experimental, a ponteira comercial foi preenchida com 30 mg de sílica 14

gel e 10 mg alumina, materiais com características ideais para extração de PAH. As 15

otimizações dos parâmetros significativos utilizados na etapa de preparo de amostra, 16

bem como a avaliação da eficiência de extração e dessorção foram realizadas por 17

meio de abordagens univariadas e multivariadas. As condições compromissos ótimas 18

para o estudo foram encontradas com 2 ciclos de extração de 10 s em cada alíquota 19

e 2 ciclos de dessorção de 40 s em 200 µL de metanol e acetonitrila (2:1). O 20

procedimento de extração requer em torno de 5 min, sendo considerado um método 21

rápido e utiliza pouco volume de solventes, quando comparado a técnicas de 22

extrações convencionais, o que corrobora com princípios da química analítica verde. 23

24

Palavras-chave: Otimização, amostra sólida, PAH, DPX, GC-MS. 25

(9)

1. Introdução 1

2

A importância de estudar e identificar compostos conhecidos como poluentes 3

orgânicos persistentes (POPs) vem crescendo em decorrência da sua toxicidade e da 4

sua persistência no meio ambiente. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAH, 5

do inglês Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) são compostos caracterizados como 6

POPs pois são capazes de persistir no meio ambiente e até sofrer bioacumulação, 7

sendo esse um fator de grande importância para estudar esses compostos. Entre os 8

compostos orgânicos considerados poluentes, os PAH são encontrados em 9

concentrações geralmente muito baixas (em nível de ng kg-1), tornando difícil sua

10

determinação em matrizes complexas. Sendo assim, é necessária uma etapa de 11

preparo de amostra para isolar e pré-concentrar os analitos presentes em amostras 12

complexas. 1

13

Técnicas analíticas convencionais de extração como a SPE (Extração em Fase 14

Sólida, do inglês Solid Phase Extraction) apresentam limitações, como por exemplo, 15

o uso excessivo de solventes, reagentes e requerem volumes grandes de amostras, 16

além de serem laboriosas. Atualmente, há um crescente interesse em utilizar técnicas 17

analíticas de microextração, com uso reduzido de solventes e reagentes, bem como a 18

redução do tempo de preparo de amostra, uma vez que esta etapa é crucial em um 19

procedimento analítico. 2

20

Dentre as técnicas de microextração desenvolvidas recentemente, a extração 21

em ponteiras descartáveis (DPX) vem sendo amplamente utilizada em virtude de 22

utilizar menor quantidade de material extrator, volume reduzido de solventes e ser de 23

fácil e rápido manuseio. A DPX é uma variação da SPE e é uma alternativa promissora 24

para substituir o preparo de amostras com técnicas clássicas. A DPX permite uma 25

interação entre os analitos e o material sorvente presente no interior de uma ponteira. 26

Dessa forma é possível que ele seja extraído e pré-concentrado a fim de ser analisado 27

posteriormente. 3

28

Com base no exposto acima, o objetivo deste trabalho é otimizar os parâmetros 29

utilizados em um preparo de amostra utilizando a DPX para extrair os 16 PAH 30

presentes em amostras sólidas, seguido de análise por GC-MS. O estudo tem o 31

propósito de maximizar a eficiência extratora da ponteira, otimizando seus parâmetros 32

com a finalidade de obter uma rápida e eficiente extração dos analitos, tendo em vista 33

(10)

a recorrente busca por alternativas mais sustentáveis e simplificadas de técnicas 1

analíticas de extração. 2

(11)

2. Revisão da Literatura 1

2

2.1 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos 3

4

Os PAH são compostos orgânicos constituídos apenas de átomos de carbono 5

e hidrogênio. Possuem pelo menos dois anéis polinucleados em sua estrutura sendo 6

organizados de forma linear, angular ou agrupada. São originários de fontes 7

antropogênicas e naturais, sendo os oriundos de atividades humanas os mais 8

frequentes. Alguns exemplos de PAH emitidos por fontes humanas são: a combustão 9

incompleta de carvão e derivados de petróleo, queima da madeira, escapamentos de 10

veículos motores, combustão de óleos, e até fumaça de cigarro. A formação desses 11

compostos bastante estáveis ocorre em altas temperaturas por meio de precursores 12

contendo átomos de carbono e hidrogênio. Os PAH também são provenientes de 13

fontes naturais tais como atividades vulcânicas, exsudação natural e biossíntese de 14

algas. 4, 5

15

Em geral, a maioria dos PAH são utilizados apenas para fins de pesquisas, 16

como indicadores geoquímicos, porém alguns são utilizados na indústria na produção 17

de corantes, plásticos e agrotóxicos. Existem mais de 100 PAH reconhecidos pela 18

União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC), dentre eles, apenas 16 são 19

considerados prioritários no monitoramento ambiental. A grande importância de 20

estudar e monitorar a presença desses compostos no ambiente se dá pela razão de 21

serem considerados poluentes orgânicos persistentes (POPs), tóxicos, 22

carcinogênicos e genotóxicos segundo a Agência de Proteção Ambiental dos Estados 23

Unidos (USEPA). 6, 7

24

Os PAH podem formar partículas com diversos tamanhos, além de permanecer 25

e serem transportados em diversas áreas ambientais como ar, água, solo, sedimento 26

e biota aquática. 8 Como são encontrados em diversas concentrações, os fatores de

27

bioacumulação podem oscilar de 10 a 10000, dependendo do tipo de PAH. Além de 28

serem capazes de acumular no solo, bioacumular principalmente em organismos 29

aquáticos, também podem sem volatilizados e biodegradados. 9 A capacidade de

30

retenção do solo pode fazer com que os contaminantes fiquem retidos no meio e a 31

presença e disponibilidade dos compostos pode ser influenciada também pela 32

composição da matéria orgânica. Como os PAH apresentam baixa solubilidade 33

(12)

aquosa e alta hidrofobicidade, por consequência, são encontrados adsorvidos em 1

partículas sólidas do solo. 10, 11

2

A presença dos PAH no meio ambiente pode ser bastante prejudicial devido a 3

sua toxicidade que pode causar efeitos carcinogênicos e mutagênicos em seres vivos, 4

causando variados tumores, além de serem potentes imunossupressores, tornando-5

se nocivos ao meio ambiente e consequentemente à saúde humana. A contaminação 6

humana pode ser causada através da contaminação ambiental, pela inalação, 7

absorção através da pele, bem como da ingestão de alimentos contaminados. 12

8

Segundo a Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC, do inglês 9

International Agency for Research on Cancer), a Agência de Proteção Ambiental dos 10

Estados Unidos (USEPA, do inglês United States Environmental Protection Agency) e 11

a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) os 16 PAH prioritários são 12

divididos em grupos conforme índice cancerígeno para o ser humano. 13 O

13

benzo(a)pireno classificado como cancerígeno (Grupo 1); o dibenzo(a,h)antraceno 14

como provável cancerígeno para ser humano (Grupo 2A); o benzo(a)antraceno, 15

benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(j)fluoranteno, criseno e o 16

indeno(1,2,3-c,d)pireno como possíveis cancerígenos humanos (Grupo 2B); o 17

acenafteno, antraceno, benzo(e)pireno, benzo(g,h,i)perileno, fluoranteno, fluoreno, 18

fenantreno e o pireno, entre outros como não classificáveis quanto a sua 19

carcinogenicidade para o ser humano (Grupo 3). As estruturas moleculares dos 16 20

PAH estão apresentadas na Tabela 1. 14, 15

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

(13)

Tabela 1. PAH prioritários em estudos ambientais segundo USEPA 1 Nomenclatura IUPAC Estrutura molecular Nomenclatura

IUPAC Estrutura molecular

Naftaleno Criseno Acenaftileno Benzo(a)antraceno Acenafteno Benzo(b)fluoranteno Fluoreno Benzo(k)fluoranteno Antraceno Benzo(g,h,i)perileno Fenantreno Benzo(a)pireno Fluoranteno Dibenzo(a,h)antracen o Pireno Indeno(1,2,3-c,d)pireno

(14)

No Brasil os níveis aceitáveis de material presente em sedimentos são 1

encontrados na Resolução do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA) (nº 2

420/2009), que estabelece diretrizes e procedimentos para a avaliação de resultados 3

analíticos em casos de disposição em solo. 16

4 5

2.2 Preparo de Amostra 6

7

Os PAH encontrados dispostos em solos geralmente estão presentes em 8

baixas concentrações, o que influencia o processo de monitoramento dos analitos em 9

matrizes orgânicas complexas. Sendo relevante levar em consideração todas as 10

etapas desde a coleta da amostra até o tratamento de dados para que a análise 11

obtenha o resultado esperado. Além de manter a qualidade e reprodutibilidade dos 12

dados, são necessários procedimentos para garantir que a análise obtenha resultados 13

confiáveis. 17

14

Dentre as etapas existentes para analisar uma amostra, a etapa de preparo de 15

amostra é essencial para que uma análise química instrumental obtenha os resultados 16

esperados. O preparo de amostra é necessário pois tem a finalidade de eliminar 17

potenciais interferentes na matriz. As características da matriz e dos analitos são 18

fundamentais para obter sucesso nesta etapa, sendo necessário otimizar os 19

parâmetros que influenciam o processo analítico. 18

20

Na etapa de preparo de amostra, algumas características devem ser levadas 21

em consideração como rapidez, facilidade, aumento da seletividade, custo reduzido e 22

uso de menor quantidades de solventes orgânicos. Sendo o principal objetivo desta 23

etapa extrair a matriz, com a finalidade de isolar e pré-concentrar os analitos de 24

interesse em uma fase extratora sólida para que possam ser submetidos a análise em 25

equipamento analítico adequado. 19,20

26

Existem diversas técnicas de preparo de amostras, e a escolha depende das 27

propriedades tanto dos analitos quanto da fase extratora. Como exemplo de técnicas 28

conhecidas e comumente empregadas em laboratórios para análises rotineiras há a 29

LLE (Extração Líquido-Líquido, do inglês Liquid-Liquid Extraction) e SPE (Extração em 30

Fase Líquida, do inglês Solid Phase Extraction) que são muito utilizadas em métodos 31

analíticos convencionais. Porém, ambas possuem limitações por serem laboriosas, 32

lentas e danosas ao meio ambiente por utilizarem grandes quantidades de solventes 33

(15)

orgânicos. Com isso, podem acarretar um aumento e erros experimentais, diminuindo 1

a eficiência da análise. 21,22

2

Dentre as técnicas tradicionais, a SPE utiliza fase sólida (materiais sorventes) 3

como fase extratora compactada em um cartucho. Na SPE, a amostra e o solvente 4

são eluidos com auxílio de uma seringa na qual utiliza uma bomba a vácuo para 5

permitir completa interação dos componentes no interior do cartucho. A SPE possui 6

como limitação o tempo de extração consideravelmente longo e a dificuldade de 7

utilizar fase extratora pois ela pode sofrer adsorção ou absorção dependendo do tipo 8

de material utilizado na extração. Outra limitação é a geração de resíduos pois utiliza-9

se grandes quantidades de materiais sorventes em cada análise feita. 23

10

Atualmente há uma procura por técnicas mais eficientes visando os princípios 11

da química analítica verde, que busca maximizar a eficiência de técnicas 12

miniaturizadas, a fim de restringir os impactos negativos à saúde humana e ao meio 13

ambiente. 24 Para aprimorar as técnicas clássicas, recentemente foi desenvolvida a

14

técnica de extração em ponteiras descartáveis (DPX, do inglês Disposable pipette 15

extraction), a qual foi baseada nos fundamentos da SPE e desenvolvida com algumas 16

modificações. 25

17 18

2.3 Extração em Ponteiras Descartáveis 19

20

A extração por DPX foi desenvolvida em 2003, por Dr. William E. Brewer, e 21

surgiu como uma variação em menor escala do método tradicional SPE. 26 A DPX é

22

uma técnica onde a extração dos analitos é operada em uma ponteira padrão 23

descartável de volume igual a 1 ou 5 mL contendo fase extratora livremente disposta 24

no seu interior entre dois filtros. A ponteira é acoplada a uma seringa ou micropipeta 25

conforme Figura 1. 27, 28

(16)

Figura 1. Esquema do dispositivo de extração por DPX. Adaptado de BORDIN et al, 1 2016. 2 3 4

A técnica consiste na aspiração da amostra, juntamente com ar, com a 5

finalidade de extrair os analitos de forma rápida, migrando-os para a fase extratora. 6

Para que essa interação seja possível, primeiramente a ponteira passa por uma etapa 7

de condicionamento, em que os materiais sorventes entram em contato com um 8

solvente que tenha uma afinidade adequada e possibilite a ativação dos sítios 9

sorventes. Em seguida, a amostra é aspirada, juntamente com o ar, para que ocorra 10

um equilíbrio fase extratora-amostra e os analitos de interesse sejam extraídos. 11

Depois, existe uma etapa de limpeza para remover possíveis interferentes. Por último, 12

é realizada a dessorção dos analitos da fase extratora na etapa de dessorção líquida, 13

onde a amostra entra em contato com um solvente que seja capaz de romper a 14

interação fase extratora-analito. O extrato orgânico resulta em uma amostra onde os 15

analitos estão isolados em uma concentração adequada, podendo ser submetidos a 16

análise instrumental adequada. As etapas do procedimentos da DPX podem ser 17

observadas na Error! Reference source not found.. 29,30,31

18 19

(17)

Figura 2. Etapas do procedimento da DPX. Adaptado de OLIVEIRA et al, 2018. 1

2

A DPX possui vantagens, quando comparada a SPE, por usar menor volume 3

de amostra e de solvente orgânico, menor tempo de extração, não usar bomba a 4

vácuo para eluir, bem como menor massa de material sorvente, além de ser de fácil 5

manuseio, simples operação e também ter a possibilidade de automação. 6

Diferentemente da SPE que possui a fase extratora compactada, nas ponteiras ela 7

está dispersa, o que facilita a interação da amostra e torna a técnica mais eficiente 8

pois a extração ocorre de forma mais rápida. A DPX é uma técnica aplicada em 9

diversas áreas de análise como alimentar, forense e ambiental tendo como diferencial 10

o tipo de materiais sorventes utilizado para cada matriz. 32

11

Existem diferente materiais sorventes que funcionam como fase extratora 12

disponíveis para a DPX, cada uma de acordo com a funcionalidade de cada amostra 13

a ser analisada. Os principais modelos de fases extratoras para DPX disponíveis 14

comercialmente podem ser observados na Tabela 2. 32

15 16 17 18 19 20 21

(18)

Tabela 2. Fases extratoras disponíveis comercialmente para DPX e seus usos. 1

Adaptado de PINTO et al, 2015. 2

Tipos de

Ponteiras Tipo de Fase Uso

DPX-RP Estireno-Divinilbenzeno Pesticidas

DPX-CX Grupos ácidos-sulfônicos Compostos básicos

DPX-WAX Grupos Poliamino Compostos ácidos

DPX-WCX Grupos Policarboxilato Compostos básicos

DPX-Si Silica Gel Limpeza de amostras

ambientais

DPX-C18 C18 (20% Silica Gel) Remoção de interferentes na matriz

DPX-SC Vazio ou com areia Coleta de amostras sólidas

DPX-Blank - Desenvolvimento de novos

métodos analíticos 3

2.4 Análise Multivariada 4

5

O uso de técnicas estatísticas são fundamentais para estudos em áreas como 6

a química analítica com a finalidade de solucionar diversos problemas. A medida que 7

os estudos evoluem, a estatística vem sendo bastante utilizada na análise e avaliação 8

de dados com diversas variáveis que são relevantes para entender o caso estudado. 9

Dentre os métodos para avaliar os fatores importantes de um estudo, a análise 10

multivariada estuda o comportamento de três ou mais variáveis de modo simultâneo. 11

É bastante utilizada para encontrar e eliminar a variável menos representativa em um 12

determinado estudo, além de correlacionar as variáveis, identificar os fatores de 13

interferência, bem como criar modelos estatísticos e de probabilidade a partir das 14

informações obtidas. 33

(19)

A técnica multivariada tem como objetivo disponibilizar modelos estatísticos 1

capazes de analisar um conjunto de dados multivariados que a análise estatística 2

unidimensional não permite. Corresponde a métodos e técnicas que simultaneamente 3

estabelecem uma interpretação teórica de todos os dados obtidos fornecendo ao 4

analista melhor compreensão dos resultados obtidos para tomar decisões perante o 5

caso estudado. Sua importância se baseia na capacidade do indivíduo analisar 6

diversas variáveis simultaneamente em certo estudo, levando em consideração os 7

objetivos do desenvolvimento, e assim, diminuindo os erros cometidos em análises 8

mais simples. A técnica explora os dados de maneira que haja uma confirmação mais 9

exata a respeito do trabalho estudado. 34

10 11

2.5 Cromatografia a Gás Acoplada à Espectrometria de Massas 12

13

A cromatografia a gás é uma técnica instrumental analítica que promove a 14

separação de substâncias voláteis contidas em uma amostra por meio de uma coluna 15

capilar. O que difere a técnica das demais técnicas cromatográficas é a presença de 16

uma fase móvel que não interage com os analitos. Na coluna cromatográfica a 17

separação ocorre a partir da diferença de afinidade com a fase estacionária e as 18

propriedades dos compostos contidos em uma amostra. O aumento da temperatura 19

garante a eluição dos compostos sendo, em seguida, detectados com o auxílio de um 20

detector. 35

21

Dentre as técnicas analíticas instrumentais a técnica de GC-MS é bastante 22

utilizada na separação e identificação de componentes presentes em misturas 23

orgânicas. Neste aparelho a mistura contendo os analitos são inseridos em uma 24

coluna capilar, separados em função da afinidade com a fase estacionária e depois 25

são transportados pela linha de transferência para uma câmara de ionização do 26

espectrômetro. Nessa câmara são submetidos a uma ionização com um feixe 27

ionizante de elétrons. Os íons moleculares juntamente com os fragmentos gerados 28

formados são mantidos sob vácuo e rapidamente acelerados para o analisador de 29

massas a fim de não colidirem com moléculas neutras. Os íons formados são 30

separados pela razão massa/carga (m/z) no analisador de massas para que possam 31

ser identificados no detector. 36

(20)

3. Objetivos 1 2 3.1 Objetivo Geral 3 4

Otimizar os principais parâmetros de extração da técnica de extração em 5

ponteira descartável (DPX) através de estratégias univariadas e multivariadas para 6

obtenção das condições ótimas que maximizem a extração de PAH em amostras 7

sólidas, seguido de análise por GC-MS. 8

9

3.2 Objetivos específicos 10

11

Avaliar a capacidade de extração dos PAH por sílica gel e alumina como fase 12

extratora em DPX. 13

Otimizar a proporção de material sorvente no interior da ponteira por ensaio 14

univariado. 15

Otimizar por meio de ensaios multivariados os seguintes parâmetros de 16

extração: tempo e número de ciclos. 17

Otimizar por meio de ensaios multivariados os seguintes parâmetros de 18

dessorção: tempo e número de ciclos, bem como o solvente ótimo de dessorção. 19

Estabelecer, por meio dos resultados obtidos neste trabalho e em trabalhos 20

anteriormente relatados na literatura, metas futuras para a validação da metodologia 21

analítica proposta, bem como a aplicação em amostras reais. 22

(21)

4. Material e Métodos 1 2 4.1 Materiais e Reagentes 3 4

Os padrões analíticos de PAH utilizados no trabalho foram adquiridos da 5

Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Os solventes orgânicos n-hexano, diclorometano 6

(DCM), acetonitrila (ACN) e metanol (MeOH) utilizados nas etapas de extração, 7

dessorção e preparo de amostras foram de grau HPLC obtidos da Tedia (Rio de 8

Janeiro, RJ, Brasil). Como matriz, foram utilizadas amostras de resíduo sólido 9

previamente limpas. As ponteiras descartáveis de 1 mL, sem material sorvente (DPX-10

Black), acompanhadas de filtros superiores e inferiores, foram adquiridas da DPX 11

Technologies (Columbia, SC, EUA). Foram utilizados como materiais sorventes Sílica 12

gel 60 e Alumina obtidos da Sigma-Aldrich. Os materiais foram submetidos à etapa de 13

ativação em mufla a 300 ºC por 2 horas e posteriormente mantidos em estufa a 60 ºC 14

até a realização do procedimento de extração. Para a limpeza das vidrarias, utilizou-15

se Extran 5% (v/v) obtido da Merck (Darmstadt, Alemanha) e calcinação em mufla a 16

400 ºC por 4 h para que possíveis fontes de contaminação fossem eliminadas por 17

completo. 18

19

4.2 Instrumentação e Condições Cromatográficas 20

21

Para fortificar a matriz sólida, foi utilizado um agitador magnético modelo DI-03 22

obtido da Dist (Florianópolis, SC, Brasil). A extração dos analitos foi realizada em 23

banho ultrassônico com frequência de 25 kHz modelo USC 1450 provindo da Unique 24

(Indaiatuba, SP, Brasil). Foi utilizado um cromatógrafo a gás GC Claurus 680 acoplado 25

a um espectrômetro de massas Claurus SQ8 da Perkin Elmer (Shelton, CT, EUA). O 26

aparelho foi operado a partir das condições a seguir: o modo fixado em splitless (1 27

min), a rampa de temperatura foi iniciada em 50 ºC por 5 min, continuado de uma taxa 28

de 6 ºC min-1 até a temperatura de 300 ºC, sendo essa temperatura prosseguida

29

constante por 10 min. A coluna capilar utilizada com modelo SLB®-5ms com 30

dimensões de 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm de espessura de filme, sendo obtida da 31

Supelco (Bellefonte, PA, EUA). O injetor teve temperatura preservada em 280 ºC. O 32

gás de arraste utilizado foi o gás Hélio (99,999% de pureza) com fluxo de 1 mL min-1.

(22)

A temperatura da fonte de íons foi 230 ºC e a da linha de transferência, 275 °C, 1

respectivamente. A operação do espectrômetro de massas se manteve em modo de 2

ionização por elétrons (EI) a 70 eV. Para a realização das análises foi usado o modo 3

de monitoramento seletivo de íons (modo SIM) e janelas seletivas com íons 4

selecionados (m/z): Janela 1: 128; Janela 2: 152, 153 e 154; Janela 3: 165, 166; Janela 5

4: 178; Janela 5: 202; Janela 6: 228: Janela 7: 252 e 253: Janela 8: 276, 277, 278 e 6 279. 7 4.3 Procedimento Experimental 8 9

4.3.1 Etapa I: Limpeza e fortificação da matriz sólida 10

11

Para realizar a etapa de otimização do método proposto, o material utilizado 12

como amostra sólida foi submetido a uma prévia limpeza para garantir a ausência de 13

possíveis interferentes. Para tal fim, 10 g de material sólido foram pesados e 14

transferidos para um frasco de vidro com capacidade de 40 mL. Seguidamente, 15

adicionou-se 15 mL de uma mistura de DCM:MeOH (2:1) (v/v) e agitou-se por 30 s em 16

agitador vortex. O frasco contendo o material sólido foi então submetido a um banho 17

ultrassônico por 30 min e finalmente o sobrenadante foi descartado. Esse 18

procedimento foi realizado por quatro vezes para garantir uma limpeza satisfatória. O 19

material limpo foi mantido a temperatura ambiente (25 °C) por 48 h para completa 20

evaporação dos resíduos de solvente. 21

A fortificação da matriz sólida previamente limpa foi realizada pela adição de 22

200 µL de uma solução estoque com concentração de 10 mg L-1 de 16 PAH a 10 g de

23

resíduo sólido. Para melhor interação entre os compostos e o resíduo sólido, foram 24

adicionados 15 mL de solvente orgânico ACN pelo fato de ser bastante volátil, sendo 25

posteriormente mantidos sob agitação magnética por 2 h e mantida em repouso por 26

24 h. Ao término a amostra foi aberta até a secura total em temperatura ambiente (25 27

°C) para posterior uso na otimização do método. 28

Os padrões analíticos utilizados na fortificação da matriz foram obtidos de uma 29

solução estoque preparada previamente. A solução foi preparada a partir da adição 30

em acetonitrila de um mix dos 16 PAH (naftaleno; acenaftileno; acenafteno; fluoreno; 31

fenantreno; antraceno; fluoranteno; pireno; benzo(a)antraceno; criseno; 32

benzo(b)fluoranteno; benzo(k)fluoranteno; benzo(a)pireno; indeno(1,2,3-cd)pireno; 33

(23)

dibenzo(a,h)antraceno e benzo(g,h,i)perileno) que resultou em uma concentração final 1

igual a 10 mg L-1.

2 3

4.3.2 Etapa II: Extração sólido líquido 4

5

Para a extração dos analitos foi feito previamente uma extração assistida por 6

ultrassom (UAE) modificada conforme método padrão da Environmental Protection 7

Agecy EPA 3550c. 37Esta extração teve a finalidade de recuperar os analitos

8

presentes no solvente orgânico. Na qual, uma porção de 0,5 g da amostra sólida 9

fortificada foi adicionada em 1,5 mL de n-hexano. O frasco foi submetido a banho 10

ultrassônico por 30 min e em seguida retirou-se o sobrenadante. O procedimento foi 11

realizado três vezes, totalizando em um volume de sobrenadante igual a 4,5 mL de 12

extrato que foram submetidos ao procedimento da DPX. 13

14

4.3.3 Etapa III: Extração em ponteira descartável (DPX) 15

16

4.3.3.1 Preparo da ponteira e delineamento experimental 17

18

Foi utilizada uma ponteira descartável com capacidade de 1 mL e adicionado 19

no seu interior 40 mg de material sorvente (fase extratora), composta por 30 mg de 20

sílica gel e 10 mg de alumina. O filtro superior foi inserido no interior da ponteira para 21

evitar contaminação dos materiais. Então, a ponteira foi acoplada a uma micropipeta 22

com capacidade total avolumada em 1 mL. Na etapa de condicionamento, o solvente 23

foi aspirado juntamente com o ar para ativar os sítios sorventes e possibilitar uma 24

melhor interação entre o sorvente e analito. O condicionamento foi realizado em um 25

frasco contendo 800 µL solvente n-hexano utilizando 3 ciclos de 30 segundos. Em 26

seguida a etapa de condicionamento, foi iniciada a etapa de otimização do 27

procedimento de extração em ponteiras descartáveis. 28

29

4.3.3.2 Otimização do procedimento de extração (DPX) 30

(24)

Para otimizar os fatores, foram utilizadas abordagens univariadas e 1

multivariadas e os dados foram tratados nos softwares Microsoft Excel (Microsoft, 2

EUA) e Statistica 8.0 (StatSoft, EUA). 3

Para tal fim, fixou-se inicialmente os ciclos e tempo da etapa de extração e 4

dessorção, onde o extrato obtido foi distribuído em 3 alíquotas de 800 µL e realizado 5

o procedimento utilizando 3 ciclos de 30 segundos em cada frasco. Em seguida, a 6

dessorção líquida foi efetuada utilizando 5 ciclos de 30 s em um frasco contendo 200 7

µL de solvente MeOH. 8

A variação na proporção da quantidade de material sorvente presente no 9

interior da ponteira foi otimizada de forma univariada, sendo os experimentos 10

realizados em triplicata (n=3). A proporção da massa de cada material está ilustrada 11

na Tabela 3. 12

13

Tabela 3. Planejamento da otimização univariada da proporção de Silica Gel e 14

Alumina como material sorvente 15

Experimento Silica Gel (mg) Alumina (mg)

1 30 10

2 20 20

3 10 30

16

A etapa de extração foi otimizada a partir de um planejamento Doehlert de duas 17

variáveis. Onde foram variados o tempo (10 a 50 s) e o número de ciclos (2 a 10 ciclos) 18

na etapa de extração. O planejamento foi executado conforme a matriz descrita na 19 Tabela 4. 20 21 22 23 24 25 26 27 28

(25)

Tabela 4. Planejamento Doehlert para a otimização da etapa da extração de PAH 1

utilizando DPX 2

Experimento Ciclos Tempo (s)

1 6 10 2 2 13 3 2 47 4 6 50 5 10 47 6 10 13 7, 8, 9* 6 30 *Ponto central 3 4

Para a etapa de dessorção, similarmente, foi feito um planejamento Doehlert 5

variando o número de ciclos (2 a 10 ciclos) e o tempo de cada ciclo (10 a 50 s). O 6

planejamento foi executado conforme a matriz descrita na Tabela 5. 7

8

Tabela 5. Planejamento Doehlert para a otimização da etapa da dessorção de PAH 9

utilizando DPX 10

Experimento Ciclos Tempo (s)

1 6 10 2 2 13 3 2 47 4 6 50 5 10 47 6 10 13 7, 8, 9* 6 30 *Ponto central 11 12

Em seguida, o solvente utilizado na etapa da dessorção foi avaliado a partir de 13

uma superfície ternária Simplex Lattice, no qual variou-se os solventes conforme a 14

Tabela 6. Para a otimização desta etapa, utilizou-se diferentes proporções de MeOH, 15

DCM e ACN e as condições de extração e dessorção foram fixadas a partir das 16

otimizações anteriores. 17

(26)

Tabela 6. Planejamento Simplex Lattice para otimização da composição dos solventes 1

da dessorção de PAH utilizando DPX 2

Experimento Metanol Diclorometano Acetonitrila

1 1 0 0 2 0 1 0 3 0 0 1 4 0,5 0,5 0 5 0,5 0 0,5 6 0 0,5 0,5 7, 8, 9* 0,33333 0,33333 0,33333 * Ponto central 3 4

4.4 Segurança no laboratório e tratamento de resíduos 5

6

Primeiramente, o aluno fez um treinamento para a utilização dos equipamentos 7

e manipulação de solventes e reagentes garantindo a segurança do mesmo a fim de 8

evitar futuros acidentes. Os resíduos líquidos utilizados foram armazenados em galão 9

e separados em duas categorias, clorados e não-clorados, os resíduos sólidos foram 10

armazenados em caixas e por fim, destinados a tratamento e/ou descarte. 11

(27)

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 1 2 5.1 Separação Cromatográfica 3 4

Antes de otimizar os parâmetros da etapa de extração, foi realizada uma 5

avaliação dos analitos a partir da separação cromatográfica de uma solução padrão 6

contendo os 16 PAH com concentração 1 mg L-1 em ACN. Para isso, foi injetado 1 µL

7

da solução no GC-MS e selecionadas as razões m/z dos 16 PAH, sendo o aparelho 8

foi configurado para operar em modo de monitoramento seletivo de íons (Modo SIM). 9

A partir da análise do cromatograma obtido, foi observada uma separação dos 10

compostos sendo possível identificá-los mediante o tempo de retenção com os 11

fragmentos correspondentes a cada analito identificado. Sendo assim, foi possível 12

prosseguir com o desenvolvimento do método analítico de identificação de PAH 13

utilizando a técnica de DPX. 14

(28)

Figura 3. Cromatograma da separação dos 16 PAH de estudo a partir de 1 µL de solução com concentração 1 mg L-1. 1-naftaleno;

1

2-acenaftileno; 3-acenafteno; 4-fluoreno; 5-fenantreno; 6-antraceno; 7-fluoranteno; 8-pireno; 9-benzo(a)antraceno; 10-criseno; 11-2

benzo(b)fluoranteno; 12-benzo(k)fluoranteno; 13-benzo(a)pireno; 14-indeno(1,2,3-cd)pireno; 15-dibenzo(a,h)antraceno; 16-3

benzo(g,h,i)perileno. 4

(29)

5.2 Otimizações dos Parâmetros

5.2.1 Otimização da proporção de material sorvente

Para ter sucesso na determinação dos analitos, é necessário levar em conta fatores como tempo, materiais e solventes utilizados. Para isso, é necessária uma otimização dos fatores descritos com a finalidade de isolar os analitos presentes na matriz para que possam ser determinados. A otimização dos parâmetros foi iniciada com a análise univariada da proporção da massa de material sorvente que constitui a ponteira. O material sorvente presente no interior da ponteira funciona como fase extratora, então para uma eficiente extração de compostos apolares, como os PAH, foi utilizado uma mistura de sílica gel e alumina. A escolha da sílica e alumina foi baseada em técnicas de separação convencionais, segundo proposto por DE OLIVEIRA et al, por serem compostos capazes de interagir com os analitos, facilitando a extração dos mesmos. 38 A partir dos cromatogramas obtidos, os mesmos foram

comparados resultando no gráfico de barras da Figura 4 que representa a média geométrica do pico cromatográfico dos analitos em cada massa utilizada.

(30)

Figura 4. Gráfico de barras obtido pela otimização da massa de material sorvente.

(*Condições: fortificação de 10 mg L-1 de PAH, 40 mg de material sorvente, 800 µL de

amostra, 3 ciclos de 30 s de extração, 5 ciclos de 30 s de dessorção, 200 µL de solvente MeOH.).

Conforme os resultados obtidos, maiores valores de áreas para a mistura contendo 30 mg de Silica e 10 mg de Alumina apresentaram melhores respostas, pois a sílica demonstrou melhor interação com o solvente do que a alumina. Então, foi fixado uma massa contendo 30 mg de sílica e 10 mg de alumina para prosseguir as otimizações.

5.2.2 Otimização da etapa de extração

Na etapa de extração foi feito um planejamento variando o número de ciclos de extração e tempo em que a amostra fica em contato com o a fase extratora. Para obter uma melhor eficiência da extração dos analitos, a otimização foi baseada em um planejamento Doehlert e os resultados estão apresentados na Figura 5. A superfície de resposta obtida apresentou um coeficiente de determinação da função quadrática igual a r² = 0,9445, resultando em um valor adequado, pois quanto mais próximo de 1, melhor é o ajuste para o modelo matemático utilizado. 39

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 30mg Silica 10mg Alumina 20mg Silica 20mg Alumina 10mg Silica 30mg Alumina Mé d ia g e o m é tri ca d a s á re a s d o s p ico s

(31)

Figura 5. Superfície de resposta obtida para a otimização do número de ciclos e tempo de extração.

(*Condições: fortificação de 10 mg L-1 de PAH, 30 mg de sílica gel, 10 mg de alumina,

800 µL de amostra, 5 ciclos de 30 s de dessorção, 200 µL de solvente MeOH.).

A partir da superfície obtida, pode ser observada uma tendência para menores valores, indicada na cor vermelha. Pois aplicando mais tempo e mais ciclos, há probabilidade dos analitos serem dessorvidos para a amostra, por isso, acredita-se que os menores valores são mais recomendáveis para esse caso. A frequência analítica seria prejudicada com tempos maiores, sendo assim, foi escolhida a condição utilizando 2 ciclos de 10 s em cada alíquota.

5.2.3 Otimização da etapa de dessorção

Para avaliar os parâmetros da etapa de dessorção foi feito um planejamento Doehlert, variando-se o número de ciclos e o tempo de dessorção. A Figura 6 apresenta a superfície de resposta obtida, onde foi obtido um coeficiente de determinação da função quadrática igual a r² = 0,9479, sendo esse um valor satisfatório para o planejamento utilizado. 39

(32)

Figura 6. Superfície de resposta obtida para a otimização do número de ciclos e tempo de dessorção.

(*Condições: fortificação de 10 mg L-1 de PAH, 30 mg de sílica gel, 10 mg de alumina,

800 µL de amostra, 2 ciclos de 10 s de extração, 200 µL de solvente MeOH).

A partir da figura, pode ser observado uma região de máximo (em vermelho) apresentando maiores valores para o tempo. Porém, a quantidade de ciclos não se torna um fator tão relevante nos resultados pois utilizando valores pequenos ou altos de ciclos, a eficiência não foi alterada. Então, quanto maior o tempo em que a amostra fica em contato com o solvente, melhor a quebra da interação, sendo possível a dessorção dos analitos. Sendo assim, a condição utilizando 2 ciclos de 40 s foi escolhida para a etapa.

5.2.4 Otimização dos solventes da dessorção

Nessa etapa foi avaliada a eficiência de solventes orgânicos utilizados na etapa da dessorção através do planejamento da superfície triangular. Foram escolhidos como solventes metanol, diclorometano e acetonitrila de acordo com a compatibilidade com os materiais sorventes e conforme proposto por GONZALEZ-PEÑAS et al. 40 A

partir da superfície ternária apresentada na Figura 7, foi observado melhor resposta para os solventes metanol e diclorometano. A superfície de resposta mostrou uma função quadrática com coeficiente de determinação igual a r² = 0,9815. Este valor é aceitável para o modelo matemático utilizado. 41

(33)

Figura 7. Superfície resposta Simplex Lattice da otimização dos solventes da dessorção líquida.

(*Condições: fortificação de 10 mg L-1 de PAH, 30 mg de sílica, 10 mg de alumina,

800 µL de amostra, 2 ciclos de 10 s de extração, 2 ciclos de 40 s de dessorção, 200 µL de solvente.).

A partir da figura, observa-se que o MeOH e ACN apresentaram melhor eficiência na dessorção dos analitos, pois a região onde a coloração é vermelha representa a mistura dos solventes. Nessa região está representado o maior valor da média geométrica das áreas dos picos dos analitos, isto é, os solventes foram capazes de interromper a interação entre analito e sorvente de uma maneira eficiente. Os solventes estão de acordo com o resultado esperado, considerando que a dessorção foi favorecida devido à interação dos solventes MeOH e ACN com os analitos. Desta forma, facilitando a remoção dos PAH e possibilitando melhor eficiência na dessorção. Sendo esses os solventes que mostraram melhor eficiência na etapa de dessorção, foi escolhido como condição uma mistura contendo MeOH e ACN.

5.3 Perspectivas

Os parâmetros foram otimizados e a partir dos resultados obtidos neste trabalho e em trabalhos anteriormente relatados na literatura, como metas futuras deseja-se a validação do método analítico proposto. Como obter os parâmetros analíticos de

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Diclorometano 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Metanol 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Acetonitrila

(34)

mérito como linearidade, precisão, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão e robustez, bem como aplicar o método em amostras reais para sua validação.

(35)

6 CONCLUSÃO

O estudo foi feito para otimizar os parâmetros da etapa de preparo de amostra da técnica de extração em ponteiras descartáveis utilizando resíduo sólido contendo 16 hidrocarbonetos policíclicos aromáticos considerados prioritários. Uma mistura contendo 30 mg de Silica gel e 10 mg de Alumina foi escolhida como fase extratora, pois mostrou melhor eficiência na extração dos PAH. O preparo das ponteiras utilizadas foi manejado com simplicidade juntamente com as etapas de extração e dessorção para posterior análise das amostras em GC-MS. Foram feitas otimizações multivariadas durante o procedimento da DPX, resultando em um tempo de extração em torno de 5 minutos, o que corrobora para uma boa frequência analítica, bem como a pouca utilização de volumes de solventes orgânicos e amostra, diminuindo a geração de resíduos e confirmando ser uma alternativa eficiente e com aspectos favoráveis à química analítica verde. Apesar do estudo não ter sido concluído, o mesmo colabora no desenvolvimento de pesquisas que buscam aperfeiçoamento de técnicas analíticas de preparo de amostra não danosas ao meio ambiente e ao ser humano.

(36)

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Referências

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