UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
KARINA SIMÔES
CICLO REPRODUTIVO ANUAL E CARACTERÍSTICAS
MORFO-FISIOLÓGICAS TESTICULARES DO PATO DOMÉSTICO (Anas platyrhynchos)
Tese apresentada ao Instituto de Biologia para a obtenção do Título de Doutor em Biologia Celular e Estrutural na área de: Anatomia
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA – UNICAMP
Simões, Karina
Si51c Ciclo reprodutivo anual e características morfo-fisiológicas testiculares do pato doméstico (Anas platyrhynchos) / Karina
Campinas, SP: [s.n.], 2004.
Orientador: Antônio Marcos Orsi
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual de Campinas . Instituto de Biologia.
1. Ave. 2. Testículos. 3. Espermatozóides. 4. Metabolismo energético.
I. Orsi, Antônio Marcos. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Campinas, 23 de julho de 2004.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Antonio Marcos Orsi (Orientador) _________________________________
(Assinatura)
Profa. Dra. Valéria Helena Alves Cagnon Quitete _________________________________
(Assinatura)
Prof. Dr. Francisco Eduardo Martinez _________________________________
(Assinatura)
Profa. Dra. Sandra Maria Miraglia Valdeolivas _________________________________
(Assinatura)
Profa. Dra. Mary Anne Heidi Dolder _________________________________
(Assinatura)
Prof. Dr. Humberto Santo Neto _________________________________
(Assinatura)
Prof. Dr. Ruberval Armando Lopes _________________________________
Dedico esta Tese de Doutorado:
Aos meus pais Joaquim Simões Filho e Maria Celeste Moschin Simões, à minha irmã
Adriane Simões Ramos e ao meu cunhado Marcus Vinícius Ramos pelo amor, carinho,
estrutura familiar e incondicional apoio em minha lida pelo ideal.
Ao meu amigo e namorado Claudinei da Cruz pelo seu amor, companheirismo, incentivo,
apoio emocional e constante colaboração na execução deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Antônio Marcos Orsi, Departamento de Anatomia, UNESP/Botucatu, pela orientação, confiança, respeito, estímulo, amizade, disponibilidade constante durante a realização deste trabalho. Professor Orsi, o verdadeiro “Mestre”, exemplo de competência, humanismo, humildade, me ensinou as coisas mais importantes de vida, a lutar pelos meus ideais e a crescer como profissional e pessoa.
Aos professores doutores Márcia Rita Fernandes Machado (Anatomia/UNESP/Jaboticabal), Silvana Martinez Baraldi Artoni (Anatomia/UNESP/Jaboticabal) e Elizabeth Criscuolo Urbinati (Fisiologia e CAUNESP/UNESP/Jaboticabal) pela cordial colaboração, disponibilidade constante, amizade e incentivo durante a execução do trabalho.
Aos meus amigos Claudinei da Cruz (Setor de Técnicas Morfológicas e CAUNESP/UNESP/Jaboticabal), Flávio Daólio Gonçalves (Laboratório de Fisiologia e CAUNESP/UNESP/Jaboticabal), Damares Perecim Roviero (técnica do Laboratório de Fisiologia/UNESP/Jaboticabal), Nilton de Araújo e Iara Maria Messiano (técnicos do Laboratório de Anatomia/UNESP/Jaboticabal), graduandos e pós-graduandos da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP/Jaboticabal por me ajudarem nas trabalhosas coletas, no processamento do material histológico e fisiológico e pela amizade e companheirismo incentivador.
À minha amiga Kátia Aparecida da Silva Viegas (Anatomia/USP/São Paulo) por me ajudar na finalização dos artigos e na formatação da tese; aos meus amigos pós-graduandos
do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural/UNICAMP/Campinas pela amizade, solidariedade, incentivo, apoio durante as disciplinas e adorável convivência, contribuindo muito para minha evolução científica durante o curso de pós-graduação.
Ao Centro de Microscopia Eletrônica (IB/UNESP/Botucatu) pelo processamento do material de pesquisa e atenção dispensada durante o desenvolver do nosso trabalho.
À Seção de Fotografias (UNESP/Botucatu), especialmente ao Sílvio, Silvinho e Daniel pela amizade, cordialidade e auxílio fotográfico prestado no decorrer deste trabalho.
Aos amigos do Departamento de Anatomia (UNESP/Botucatu), Departamento de Biologia Celular (UNICAMP/Campinas), Departamento de Anatomia (UNICAMP/Campinas) e Laboratório de Anatomia (UNESP/Jaboticabal) pela convivência, amizade e colaboração na execução deste trabalho.
Á Comissão Examinadora pelas inúmeras e valiosas sugestões dispensadas ao nosso trabalho de tese de doutorado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de Doutorado durante o curso de pós-graduação e suporte financeiro para a realização do projeto de pesquisa (Processo nº 00/05079-4).
A todos aqueles que participaram da minha formação e me incentivaram direta ou indiretamente, aqui omitidos, porém nunca esquecidos, meu
SUMÁRIO
I. Resumo 1
II. Abstract 3
III. Introdução Geral 5
IV. Objetivos 12
V. Artigos Artigo 1: Ciclo reprodutivo anual e variabilidade dos níveis plasmáticos de testosterona no pato doméstico (Anas platyrhynchos) 13
Artigo 2: Variabilidades morfométricas testiculares e níveis de glicose, glicogênio e lipídeo durante o ciclo reprodutivo anual do pato doméstico (Anas platyrhynchos) 37
Artigo 3: Características ultra-estruturais dos espermatozóides do pato doméstico (Anas platyrhynchos) 63
VI. Conclusões Gerais 85
RESUMO
Em aves, a reprodução é um processo cíclico definido, onde a cada ano os órgãos reprodutores crescem e regridem sob a influência de fatores ambientais. Durante o processo de maturação das gônadas e reprodução, o organismo do animal mobiliza energia intensamente. O processo reprodutivo é bem elaborado, incluindo operações especializadas como produção, maturação e liberação de gametas, bem como a síntese de hormônios esteróides sexuais e comportamento sexual. O objetivo do estudo foi conhecer a morfologia testicular do pato doméstico (Anas platyhrynchos) e estabelecer seu ciclo reprodutivo anual, relacionando-o ao nível do hormônio testosterona e a alguns parâmetros do metabolismo energético interligados ao processo reprodutivo. Para isto foram utilizados 36 animais, sendo coletados testículos de 3 animais por mês, visando a descrição morfológica e o estabelecimento do ciclo reprodutivo anual da espécie por meio de microscopia de luz e análise morfométrica. Os espermatozóides foram analisados através de microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Os níveis de testosterona plasmática total foram dosados mensalmente por meio do “Kit Cout-A-Count (DPC)” e os níveis de glicose sangüínea pelo método colorimétrico. Também foram dosados o glicogênio hepático e muscular pelo método Glicogênio Trinder e lipídeos totais hepático e muscular pelo método de extração com solvente orgânico. O ciclo reprodutivo anual do pato doméstico é caracterizado por quatro fases distintas, se iniciando com a fase reprodutiva no começo do inverno (Julho) e com pico da reprodução na primavera (Outubro), apresentando maiores peso e volume testiculares, e maiores diâmetro dos túbulos seminíferos e altura do epitélio
seminífero. A fase regressiva ocorre no final da primavera (Novembro) e início do verão (Dezembro). A fase de quiescência ou repouso testicular é observada durante o verão (Janeiro, Fevereiro), sendo sucedida pela fase de recrudescência que ocorre no outono (Março a Junho), correspondendo à fase mais longa do ciclo. O processo completo da espermatogênese em termos de maturação dos espermatozóides e a espermiação foram notados durante a fase reprodutiva, coincidindo com o pico de testosterona plasmática. Os espermatozóides são caracterizados pela presença de cabeça, curta peça intermediária e uma longa peça principal. No conjunto os espermatozóides são longos, filiformes e cilíndricos. O espermatozóide do pato doméstico é similar ao de outras aves não-passeriformes correspondendo a um tipo básico de espermatozóide. Concernente ao metabolismo energético somente a glicose sangüínea estava correlacionada ao ciclo reprodutivo anual da espécie, fornecendo energia para o processo reprodutivo.
ABSTRACT
In birds, reproduction is a defined cyclic process; in which each year the reproductive organs grow and regress under the influence of environmental factors. During the process of gonadal maturation and reproduction, the organism of the animal intensively mobilizes energy. The reproductive process is well elaborated, including specialized operations such as the production, maturation and release of gametes, as well as the synthesis of sex steroid hormones and sexual behavior. The aim of the present study was to determine the morphology of the testes of the domestic duck (Anas platyrhynchos) and to establish its annual reproductive cycle, correlating it with testosterone levels and some parameters of energy metabolism associated with the reproductive process. Using a total of 36 ducks, testes were collected from 3 animals per month, and the morphology and annual reproductive cycle of the species were determined by light microscopy and morphometric analysis. Spermatozoa were analyzed by transmission and scanning electron microscopy. Total plasma testosterone levels were measured monthly using the Cout-A-Count (DPC) kit and blood glucose levels were determined by a colorimetric method. Hepatic and muscle glycogen was measured by the Trinder glycogen method and total hepatic and muscle lipids using extraction with organic solvents. The annual spermatogenic cycle of the domestic duck is characterized by four distinct phases, starting with the reproductive phase at the beginning of winter (July) and peak reproduction in spring (October), with higher testicular weight and volume, a larger seminiferous tubular diameter and greater seminiferous epithelium height being observed during these periods. The regressive phase occurs at the
end of spring (November) and the beginning of summer (December). The phase of quiescence or testicular resting is observed during summer (January, February), followed by the phase of recrudescence that occurs in autumn (March to June), corresponding to the longest phase of the cycle. The complete process of spermatogenesis in terms of spermatozoon maturation and spermiation is noted during the reproductive phase, coinciding with peak plasma testosterone levels. The spermatozoa are long, filiform and cylindric and are characterized by the presence of a head, short middle piece and long principal piece. The spermatozoon of the domestic duck resembles that of other non-passeriform birds, corresponding to the basic type of spermatozoon. Considering energy metabolism, only blood glucose was correlated with the annual reproductive cycle of the domestic duck, providing energy for the reproductive process.
INTRODUÇÃO GERAL
1 - Morfologia Testicular e dos Espermatozóides
As aves da família Anatidae (Ordem Anseriforme) constituem importante reserva econômica para o país, na medida em que representam alimento apreciado e fonte de renda resultante do comércio ligado à cinegética (Sick, 1988). O pato doméstico, Anas
platyhrynchos, é uma espécie introduzida no país, que habita partes da América do Norte e
Eurásia, e no inverno do hemisfério norte, migra para o sul do México, norte da África e sudeste da Ásia (Harrison e Greensmith, 1995).
Atualmente, maior ênfase tem sido dada aos aspectos fisiológicos e endocrinológicos da biologia reprodutiva aviária. A morfologia gonadal tem sido pouco estudada e seu conhecimento está limitado a um pequeno número de espécies quando comparada ao de outras classes de vertebrados (Breucker, 1982; Baraldi-Artoni et al., 1999).
O sistema reprodutor masculino de aves é constituído pelos testículos e via espermática extratesticular, que compreende os ductos eferentes, a região epididimária e o ducto deferente, e pelo órgão copulador. Estas estruturas, exceto o órgão copulador, são intra-abdominais, pois as aves são animais endórquidos (King, 1975; Breucker, 1982; Mercadante et al., 1983).
O parênquima testicular é composto pelos túbulos seminíferos, rede testicular e dúctulos eferentes, nas aves. Cada túbulo seminífero está formado pelo epitélio espermatogenético com dois tipos celulares funcionalmente diferentes, denominados de células germinativas e células de sustentação. As células germinativas são constituídas, da parede dos túbulos em direção à luz, pelas espermatogônias, espermatócitos primários (I), espermatócitos secundários (II), espermátides e espermatozóides (Lake, 1981; Baraldi-Artoni, 1993). As células de sustentação são denominadas células de Sertoli, sendo responsáveis pela transferência de nutrientes para as células germinativas e sustentação do epitélio germinativo (Sturkie, 1967; Lake, 1981). Usando rádioisótopos, De Reviers (1974) demonstrou que a duração da espermatogênese em aves é mais curta quando comparada à dos mamíferos, onde a prófase meiótica dura cerca de 5 a 6 dias, e a espermiogênese cerca de 6 dias, durando ambas em mamíferos de 15 dias em média. Entre os túbulos seminíferos se localiza o tecido intersticial, cujo principal componente estrutural é a célula de Leydig, responsável pela produção de andrógenos (Lake, 1981).
Estruturalmente os testículos das aves apresentam túnica albugínea delgada que se continua com o estroma intratesticular pouco desenvolvido, estando ausentes septos testiculares e um mediastino testicular definido (Sisson e Grossman, 1981).
Os espermatozóides de aves domésticas têm sido estudados desde o século passado, entretanto, a literatura sobre espermatozóides de aves não é extensa (Vernon e Woolley, 1999). Atualmente, há grande interesse em saber o significado evolucionário da competição dos espermatozóides em aves; para tanto, se torna necessário o conhecimento da morfologia dos espermatozóides, principalmente a estrutura do flagelo, com o intuito de se estabelecer um padrão de motilidade para cada espécie (Vernon e Woolley, 1999).
Vernon e Woolley (1999) estudando os espermatozóides de várias espécies de aves, por meio de microscopia eletrônica de varredura, verificaram que os espermatozóides do estorninho são típicos de espécies de passeriformes, tendo acrossoma, núcleo e cadeia simples de mitocôndrias fusionadas que contribuem para dar à porção proximal da célula uma superfície de encaixe helicoidal. Já os espermatozóides da codorna doméstica possuem um flagelo muito mais longo (208µm) em relação aos do galo doméstico (82 µm). Os espermatozóides do pombo são típicos de espécies não passeriformes, tendo cabeça encurvada, flagelo longo (132 µm) e mitocôndrias dispostas em 4 ou 5 cadeias paralelas.
Estudos ultra-estruturais comparativos dos espermatozóides de peru, galo e galinha d’angola foram realizados por Thurston e Hess (1987). A forma dos espermatozóides destas espécies é similar quando são observados ao nível de microscopia eletrônica de varredura, quando aparecem longos, estreitos e com aparência vermiforme, tendo acrossoma, núcleo, peça intermediária e flagelo facilmente distinguíveis, diferindo, entre si, somente no comprimento flagelar.
2 - Ciclo Reprodutivo Anual e Ação Hormonal
Em aves, a reprodução é um processo cíclico definido. A cada ano, principalmente nas aves silvestres, os órgãos reprodutores masculinos crescem e regridem sob a influência de fatores ambientais como luz, temperatura, índice pluviométrico e disponibilidade de alimento (Kemp, 1973). Durante o processo de maturação das gônadas e reprodução, o organismo do animal mobiliza energia intensamente. O processo reprodutivo é bem
elaborado, incluindo operações especializadas como produção, maturação e liberação de gametas, bem como síntese de hormônios esteróides sexuais e comportamento sexual. Parte da energia utilizada para sustentar estes processos é fornecida pelos carboidratos, lipídeos e proteínas ingeridos pela dieta ou estocados nos tecidos corpóreos (Mommsen et al., 1980; Andriguetto et al., 1981; Lehninger, 1995).
Estudos têm sido conduzidos sobre a influência de diferentes fotoperíodos no controle de funções reprodutivas de aves, fêmeas e machos, de acordo com os seus interesses econômicos. Em uma avicultura conduzida com controle de luminosidade, a duração pré-estabelecida da luz ou a sua ausência é de fundamental importância para cada fase do ciclo reprodutivo do animal (Baraldi-Artoni et al., 1997). Para se determinar o ciclo testicular anual de uma ave, alguns parâmetros morfológicos e morfométricos têm sido utilizados tais como: diâmetro dos túbulos seminíferos, altura do epitélio seminífero, número de células intersticiais, número e cinética de células germinativas, espessura da túnica albugínea e diâmetro nuclear das células germinativas (Fuenzalida et al., 1989; Baraldi-Artoni et al., 1997).
Os ciclos testiculares anuais foram estudados em algumas espécies de pássaros (Bailey, 1953), no cisne europeu (Breucker, 1982), no pingüim antártico (Fuenzalida et al., 1989) e na codorna doméstica (Baraldi-Artoni et al., 1997), utilizando-se principalmente os parâmetros propostos por Fuenzalida et al. (1989), os quais estão associados ou não aos níveis hormonais testiculares. Estes ciclos apresentam geralmente quatro fases distintas denominadas de repouso, recrudescência, proliferação e regressão. As fases sucedem-se ao longo do ano, nos diferentes meses, ou nas diferentes estações, e apresentam aparentemente
como principal influência exógena sobre as suas freqüência e duração, o comprimento do fotoperíodo (Baraldi-Artoni, et al., 1997).
Considerando os fatores endógenos e exógenos da cinética testicular de aves, a codorna doméstica mostrou atividade espermatogenética máxima em setembro e mínima em outubro, no hemisfério sul (Baraldi-Artoni, 1993). O peso testicular, forma dos túbulos seminíferos e composição do epitélio germinativo da codorna revelaram grande variação ao longo do ano, quando o maior peso testicular detectado foi observado no final do outono e durante o inverno, períodos de dias curtos, tendo níveis máximos em setembro. Em contraste, o peso corpóreo e a atividade espermatogenética foram marcadamente diminuídos no final da primavera e durante o verão austral, sendo períodos de dias longos (Baraldi-Artoni et al., 1999).
As variações circanuais da atividade espermatogenética foram observadas no pato andino (Breucker et al., 1989). Segundo os autores, um ciclo testicular anual foi verificado, baseado na aparência dos testículos, no peso testicular, volume testicular e diâmetro dos túbulos seminíferos. A melhor evidência de fases cíclicas da espermatogênese, naquele estudo foi o aumento e diminuição do diâmetro dos túbulos seminíferos, correspondendo às diferentes etapas de atividade e de involução testiculares. Uma diminuição pequena no diâmetro dos túbulos seminíferos foi observada no final do verão (outubro/dezembro) e no início do inverno (julho/agosto). No pato andino, o período de atividade reprodutiva é bastante prolongado, enquanto que as fases de regressão e quiescência testiculares são reduzidas a um período mínimo.
Dawson (1983) estudando o estorninho selvagem (Sturnus vulgaris) observou mudanças significativas na concentração do hormônio testosterona durante o ciclo testicular
anual, atingindo os valores máximos somente no mês de abril, diminuindo em maio e permanecendo baixo durante todo o verão. O autor concluiu que o ciclo testicular anual do estorninho está restrito à estação reprodutiva, quando o peso testicular e as concentrações de testosterona permanecem reduzidos durante todo o ano, aumentando rapidamente para atingir o pico máximo em abril (primavera na Inglaterra), coincidindo também com os maiores valores séricos de LH e FSH (Dawson e Goldsmith, 1982). Esses autores também enfatizaram que níveis máximos de testosterona, em muitas espécies de aves, coincidem com o estabelecimento e defesa territorial e comportamento reprodutivo.
3 - Metabolismo Energético
O estoque de energia de um organismo animal é importante para o suporte de vários processos fisiológicos, incluindo o reprodutivo. Parte dessa energia é fornecida pelos carboidratos, e parte pelos lipídeos e proteínas (Lehninger, 1995).
O metabolismo de carboidratos tem sido estudado extensivamente como fonte de energia para a manutenção das atividades dos espermatozóides, não somente na atuação em funções naturais dos espermatozóides, mas também para o desenvolvimento de técnicas de manutenção de espermatozóides “in vitro”, visando a inseminação artificial em aves (Freeman, 1984).
Os possíveis processos metabólicos para sustentar os espermatozóides durante as várias fases de seu ciclo de vida, desde os testículos até atingirem o oócito na fase de fertilização, têm sido estudados. Os espermatozóides podem utilizar monossacarídeos exógenos, onde poucos ou quase nenhum estão naturalmente presentes nos ductos
deferentes (Freeman, 1984), os órgãos de estoque de zóides em aves. Alguns estudos têm sido realizados para investigar quais as substâncias importantes como fontes de energia para o processo de ejaculação em aves. Uma das principais alternativas de substrato para o metabolismo energético seria a utilização de lipídeos ou compostos lipídicos, pois espermatozóides e plasma seminal no fluído do ducto deferente contém lipídeos, compostos lipídicos ou outros compostos associados com o metabolismo lipídico (Lake, 1971; Howarth, 1983; Freeman, 1984). Experimentos têm sido realizados para se determinar o papel de compostos lipídicos, como o colesterol, na capacitação dos espermatozóides (Cerolini et al., 1997; Cross, 1998; Wolfe et al., 1998).
Variações sazonais no conteúdo de proteínas, lipídeos e carboidratos dos músculos corpóreos e fígado correlacionadas com crescimento, maturação das gônadas e espermatogênese têm sido analisadas também em animais pecilotérmicos, principalmente em peixes. É conhecido que nestas espécies os estoques destes nutrientes no fígado e músculos corpóreos são transferidos para as gônadas e utilizados como fontes de energia para o metabolismo, crescimento gonadal e maturação (Eliassen e Vahl, 1982 a, b). Tanto as proteínas como o material lipídico são depositados no fígado e músculos corpóreos, durante os períodos de repouso e de maturação gonadal. A fase de estoque de carboidratos no fígado e músculos corpóreos ocorre somente na etapa de maturação gonadal, sendo os carboidratos utilizados como fonte de energia para a atividade espermatogenética (Ochiai e Tanaka, 1980).
OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivos a investigação morfológica da estrutura testicular, o estabelecimento do ciclo reprodutivo anual do pato doméstico (Anas
platyrhynchos), correlacionando-o aos níveis de testosterona plasmática e metabolismo
energético, e a análise ultra-estrutural dos espermatozóides, visando contribuir para o entendimento da biologia reprodutiva e melhor desempenho na produção comercial desta espécie.
Ciclo reprodutivo anual e variabilidade dos níveis plasmáticos de testosterona no pato doméstico (Anas platyrhynchos)
Annual reproductive cycle and variability in plasma testosterone levels in the domestic duck (Anas platyrhynchos)
K. Simões1, A. M. Orsi2, C. Cruz3, E. C. Urbinati4, F. D. Gonçalvez3, K. A. S. Viegas5 1
Departament of Anatomy, Institute of Biology, State University of Campinas, UNICAMP, Campinas, São Paulo, Brazil, 13083-970
2
Departament of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazil, 18618-000
3
Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, São Paulo, Brazil, 148700-000
4
Departament of Physiology and Animal Morphology, São Paulo State University, UNESP, Jaboticabal, and Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, São Paulo, Brazil, 148700-000
5
Departament of Surgery, São Paulo University, USP, São Paulo, Brazil, 05508-000
Running headline: Testicular cycle and testosterone levels in the domestic duck
Corresponding Author: Karina Simões, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, Departamento de Anatomia, Distrito de Rubião Júnior, S/N, Botucatu, São Paulo, Brasil, CEP 18618-000.
Resumo
O ciclo reprodutivo anual do pato doméstico é caracterizado por quatro fases distintas, se iniciando com a fase reprodutiva no começo do inverno (Julho) e com pico da reprodução na primavera (Outubro), seguida pela fase regressiva no final da primavera (Novembro) e início do verão (Dezembro). A fase de quiescência ou repouso testicular é observada durante o verão (Janeiro, Fevereiro), sendo sucedida pela fase de recrudescência que ocorre no outono (Março a Junho), correspondendo a fase mais longa do ciclo. Uma completa espermatogênese em termos de maturação dos espermatozóides e espermiação é notada durante a fase reprodutiva, coincidindo com o pico de testosterona plasmática. Na fase regressiva uma descamação do epitélio seminífero é observada, acompanhada aparentemente pelo aumento na quantidade de fibras colágenas. Um aumento no diâmetro dos túbulos seminíferos ocorre durante a fase de quiescência testicular, com predominância de espermatogônias e células de Sertoli e um segundo pico de testosterona plasmática foi também constatado durante esta fase (Janeiro), provavelmente representando a preparação para um retorno gradual do processo espermatogenético durante a fase de recrudescência. Esta última fase é caracterizada pela retomada da recuperação do epitélio seminífero, sendo acompanhada pelo aumento de espermatogônias, início de divisão meiótica e presença de espermatócitos primários e espermátides em maturação.
Introdução
A reprodução em vertebrados está sob regulação endógena e geralmente é dependente também de fatores ambientais ou parácrinos. Logo, os modelos reprodutivos se desenvolvem alternando períodos de atividade e quiescência gonadal. Nas aves, os ciclos reprodutivos sazonais são constantes, influenciados por fatores parácrinos, onde os órgãos reprodutores crescem e regridem com a luz, temperatura, índice pluviométrico e disponibilidade de alimento (Kemp, 1973), estando sujeitos também a constantes variações em virtude da latitude e altitude geográfica (Breucker et al., 1989).
Os ciclos reprodutivos de vertebrados silvestres se sincronizam com as variações ambientais, visando a sobrevivência das espécies, apresentando uma característica sazonalidade. Muitas aves tropicais têm conservado esta sazonalidade apesar de habitarem regiões de condições ambientais relativamente constantes ao longo do ano (Fuenzalida et al., 1989). Em aves de reprodução sazonal, a disponibilidade de gametas maduros está restrita a uma determinada época do ano, sendo variável entre as espécies. As alterações morfofuncionais das gônadas apresentam um ciclo anual onde, nos testículos, pode-se distinguir 4 fases denominadas de quiescência (repouso), recrudescência, proliferação (reprodução) e regressão, baseadas em modificações histológicas do epitélio seminífero (Fuenzalida et al., 1989; Breucker et al., 1989; Baraldi-Artoni et al., 1997). Estas fases distintas se sucedem ao longo do ano, nos diferentes meses, ou nas diferentes estações e apresentam aparentemente como principal influência exógena sobre a sua freqüência e duração, o comprimento do fotoperíodo (Baraldi-Artoni, et al., 1997).
O comprimento do fotoperíodo é responsável pelo desenvolvimento das gônadas e pela sincronização da reprodução, atuando na hipófise e no hipotálamo, estimulando as gonadotrofinas gonadais. As gonadotrofinas FSH e LH atuam no desenvolvimento das células germinativas e na formação e liberação dos hormônios esteróides gonadais. O FSH estimula a espermatogênese, enquanto que o LH estimula as células de Leydig a produzirem testosterona, um esteróide necessário para a maturação dos espermatozóides (Bentley, 1998).
Nas aves, o hormônio testosterona é responsável pela estimulação da agressividade territorial, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, produção de espermatozóides e pelo comportamento sexual em machos (Hau et al., 2000). Em geral, os níveis plasmáticos de testosterona circulante aumentam próximos à primavera e mantêm-se elevados durante o período reprodutivo (Follett, 1984; Wingfield e Farner, 1993; Hau et al., 2000). Já em algumas espécies de aves tropicais terrestres, as mudanças nos níveis de testosterona durante o ciclo reprodutivo são pequenas ou até ausentes (Wingfield et al., 1990; Lormée et al., 2000).
O objetivo do estudo foi determinar o ciclo reprodutivo anual do pato doméstico, de acordo com as características histológicas do epitélio seminífero e estabelecer os níveis plasmáticos de testosterona durante as fases deste ciclo reprodutivo, relacionando-os às diferentes estações do ano.
Material e Métodos
No estudo do ciclo reprodutivo anual e dos níveis plasmáticos de testosterona foram utilizados 36 patos domésticos adultos da espécie Anas platyrhynchos, com peso corpóreo de 2,5 a 4,0 Kg, provenientes de criação comercial extensiva. Os animais foram eutanasiados ao longo de 1 ano, mediante saturação anestésica com uma mistura de cloridrato de quetamina (20mg/Kg) e cloridrato de xilazina (1,5 mg/Kg) aplicada intramuscularmente. Os órgãos reprodutores foram abordados por meio de laparotomia abdominal, rebatimento do plastrão esternal e evisceração do trato gastrointestinal.
Para a determinação do ciclo reprodutivo anual, 3 animais foram sacrificados por mês e os testículos retirados, seccionados longitudinalmente e imersos em solução de Bouin ou McDowell (McDowell e Trump, 1976) por 24 horas e incluídos em Histosec® (Merck, USA) ou Historesin® (Leica, Germany). Secções histológicas de 5 a 3 µm de espessura foram coradas com Hematoxilina-Eosina, Heidenhain Scheleicher (Behmer et al., 1976) e Hematoxilina-Floxina, Azul de Toluidina 1%-Fucsina Básica 0,5%.
Na dosagem de testosterona plasmática total coletou-se mensalmente amostras de sangue dos animais nos período da manhã, por punção no ventrículo cardíaco esquerdo, com a utilização de seringa heparinizada. Após a centrifugação refrigerada, o plasma obtido foi congelado a -20°C para posterior análise dos níveis de concentração do andrógeno.
A dosagem de testosterona total plasmática foi efetuada por radioimunoensaio com o uso de Kit comercial Coat-A-Count® (DPC, USA), usado em duplicata para eventual
para cada tubo, com incubação de 3 horas a 37°C e decantação por 1 hora. A leitura procedeu-se por 1 minuto/amostra no Contador Gama (DPC, USA). O coeficiente de variabilidade inter-ensaio foi de 9,6%.
Os dados foram estatisticamente analisados, sendo submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao Teste de Tukey 5 %, utilizando-se o software SAS® (Statistical Analyses System, USA).
Resultados
O ciclo reprodutivo anual de Anas platyrhynchos pode ser dividido em quatro fases cíclicas e sucessivas ao longo do ano, baseadas nas modificações morfológicas do epitélio seminífero, sendo caracterizadas como fases de reprodução (proliferação), regressão, quiescência (repouso) e recrudescência gonadal.
A fase de reprodução se iniciou no inverno (Julho) e atingiu seu pico reprodutivo no início da primavera (Outubro). Esta se caracterizou pela presença de um processo completo de espermatogênese, túbulos seminíferos amplos com espermatogônias, espermatócitos primários em diferentes estágios da prófase I meiótica, diferençiacão da espermátides e espermatozóides no lúmen tubular (Figs. 1, 2, 3). Ainda durante a fase reprodutiva, a túnica albugínea era delgada e o interstício pouco desenvolvido, aparentemente com redução na quantidade de células de Leydig e vasos sangüíneos (Figs. 1, 2).
A fase de regressão ocorreu no final da primavera (Novembro) e início de verão (Dezembro), com a involução do epitélio seminífero, meiose e espermatogênese
incompleta. A principal característica desta fase regressiva foi a descamação do epitélio seminífero, que recobria o lúmen tubular (Figs. 4, 5). A túnica albugínea e a membrana basal dos túbulos seminíferos apresentaram-se, aparentemente, mais espessas (Fig. 5) e ocorreu no interstício um predomínio fibrilar de colágeno e presença de vários vasos sangüíneos (Fig. 4).
Na estação de verão (Janeiro, Fevereiro) iniciou-se a fase de quiescência testicular, somente com a presença de espermatogônias, de células de Sertoli e diâmetro dos túbulos seminíferos reduzidos (Figs. 6, 7). A túnica albugínea, a membrana basal e o tecido peritubular dos túbulos seminíferos eram espessos e o interstício desenvolvido, com vários fibroblastos e células de Leydig (Fig. 7).
A fase de recrudescência ocorreu durante todo o outono (meses de Março a Junho), sendo esta a mais longa do ciclo reprodutivo. Caracterizou-se pela recuperação do epitélio seminífero, com presença marcante de espermatogônias e início da meiose, com espermatócitos primários em diferentes estágios da prófase I meiótica e espermátides em maturação (Figs. 8, 9). A túnica albugínea, a membrana basal e o tecido peritubular dos túbulos seminíferos eram delgados e o interstício escasso, com algumas células de Leydig (Fig. 8).
A concentração do hormônio testosterona no plasma sangüíneo do pato doméstico variou sazonalmente. Os maiores valores médios ocorreram durante o pico da reprodução (76,91 ± 0,20 ng/dL) em outubro e, também, durante o início da quiescência (70,84 ± 5,71 ng/dL) em janeiro, sem diferença significativa entre essas duas fases (Gráfico 1), porém diferindo significativamente das demais fases do ciclo reprodutivo.
Os níveis intermediários de testosterona foram observados durante todo o período de recrudescência, sem diferença significativa entre os meses desta fase. Entretanto, os valores médios mais baixos de testosterona foram notados entre as fases de quiescência, reprodução e regressão, sem diferença significativa entre estas fases (Gráfico 1).
Gráfico 1. Valores médios dos níveis de testosterona plasmática total (ng/dL) durante o
ciclo reprodutivo anual do pato doméstico
*Valores seguidos pelas mesmas letras não diferem entre si (teste de Tukey 5%).
**Fases do Ciclo: Janeiro e Fevereiro (fase de quiescência); Março a Junho (fase de recrudescência); Julho a Outubro (fase de reprodução); Novembro e dezembro (fase de regressão). 0 25 50 75 100 Januar y Feb rua ry Marc h April May Jun e July Augus t Septembe r Octo ber Nov em ber Dec em ber
M onth of the year
mean a a b bc cd d d d d d d d (ng/dL)
Figs. 1, 2, 3 Fotomicrografia na fase de pico da reprodução, mostrando amplos túbulos seminíferos (estrelas), espermatogônias (G), espermatócitos primários (cabeças de seta), espermátides redondas (asteriscos pequenos) e alongadas (setas). Note os espermatozóides (Z) no lúmen tubular na Fig. 1, o interstício (asteriscos grandes) nas Figs. 1 e 2, células de Leydig (L) nas Figs. 1 e 2. Bar = 10 µm na Fig. 1; Bar = 2,5 µm nas Figs. 2 e 3.
Fig. 4 Fase de regressão, evidenciando a descamação celular do epitélio seminífero no lúmen tubular (rosáceas), interstício (asteriscos) com predomínio fibrilar de colágeno e vaso sangüíneo (V). Bar = 10,0 µm.
Fig. 5 Epitélio seminífero na fase de regressão, mostrando células de Sertoli (setas largas pequenas), espermatogônias (G), espermatócitos primários (cabeças de seta), membrana basal e tecido peritubular desenvolvidos (seta larga grande) e descamação celular do epitélio seminífero (rosácea). Bar = 2,5 µm.
Fig. 6 Fase de quiescência testicular, mostrando pequenos túbulos seminíferos (estrelas). Bar = 5 µm.
Fig. 7 Fase de quiescência, com epitélio apresentando somente espermatogônias (G) e células de Sertoli (setas largas). Nota-se um interstício desenvolvido (asterisco), com vários fibroblastos (F). Bar = 2,5 µm.
Fig. 8 Fase de recrudescência, epitélio seminífero com espermatogônias (G), espermatócitos primários (cabeças de seta), espermátides redondas (asteriscos pequenos), células de Sertoli (setas largas pequenas), interstício (asterisco grande), membrana basal e tecido peritubular (seta larga preta). Bar = 2,5 µm.
Fig. 9 Fase de recrudescência testicular, com epitélio mostrando espermatogônias (G), espermatócitos primários (cabeças de seta), espermátides redondas (asteriscos pequenos) e células de Sertoli (setas largas). Bar = 2,5 µm.
Discussão
O ciclo reprodutivo anual de codorna doméstica foi estudado por Baraldi-Artoni et al. (1997), que definiram quatro fases distintas, sucessivas e seqüentes, denominadas de quiescência (final da primavera), recrudescência (outono), fase de atividade (final de inverno, começo da primavera) e de regressão (final da primavera e verão). As quatro fases na codorna doméstica foram similares às previamente descritas para alguns passeriformes (Riley, 1936;1937) e para uma espécie de pingüim antártico (Fuenzalida et al., 1989), sendo também similares as fases e suas respectivas durações observadas no ciclo reprodutivo anual do pato doméstico.
As variações circanuais da atividade espermatogenética têm sido também reportadas no pato andino (Breucker et al., 1989). A melhor evidência do estágio da espermatogênese naquele estudo foi o aumento e/ou diminuição do diâmetro dos túbulos seminíferos, correspondendo às diferentes fases da atividade testicular e/ou a involução desta. Uma pequena diminuição no diâmetro dos túbulos seminíferos foi observada durante o verão (outubro a dezembro) e no inverno (julho a agosto). De acordo com Breucker et al. (1989) e baseado nas presentes observações, o período de atividade reprodutiva é bastante prolongado no pato doméstico, enquanto que as fases de regressão e quiescência testicular são reduzidas a um período mínimo, caracterizando um padrão de atividade testicular anual cíclica, como fora afirmado pelos últimos autores para o pato andino.
Assim, no pato doméstico, as fases reprodutiva e de recrudescência testicular apresentaram-se relativamente longas quando comparadas aos períodos de regressão e quiescência gonadal. A fase de reprodução, conforme as observações feitas, iniciou-se no
inverno (julho) e se estendeu até agosto, também inverno, atingindo o seu pico máximo na primavera (outubro), sendo esta fase caracterizada pela atividade espermatogenética completa. A fase de regressão se iniciou em novembro, no final da estação da primavera, com a descamação do epitélio seminífero e a fase de quiescência ocorreu nos meses de janeiro e fevereiro, estação de verão, quando foi caracterizada por apresentar somente espermatogônias e células de Sertoli no epitélio seminífero. Já a fase de recrudescência se estendeu por todo o outono, nos meses de março a junho, quando houve recuperação do epitélio seminífero, caracterizando-se pela espermatogênese incompleta, porém com preparação para a fase subseqüente de reprodução. Estes dados são aparentemente inéditos e espécie-específicos.
Ademais, estudos realizados com o cisne europeu (Breucker, 1982) e a codorna doméstica (Baraldi-Artoni et al., 1997) demonstraram uma fase de maior atividade reprodutiva ocorrendo na primavera, apesar do cisne apresentar espermatozóides apenas durante umas poucas semanas nesta estação. Já os testículos da codorna exibiram espermátides em maturação e espermatozóides, com pequenas variações, durante todo o ano. Segundo Baraldi-Artoni et al. (1997) esta diferença na produção de espermatozóides é devido, provavelmente, ao fato de que as condições climáticas serem diferentes nos hemisférios Sul e Norte. A produção de espermatozóides no pato doméstico ocorre durante todo o inverno e também durante a primavera, quando atinge o seu pico máximo de produção (outubro), conforme os resultados obtidos.
O papel do fotoperíodo, na regulação do desenvolvimento gonadal tem sido documentado em um grande número de vertebrados (Farner, 1985). Entretanto, poucos estudos em aves revelaram que o comprimento do dia atuaria como um “start” para o
desenvolvimento testicular (Farner e Follett, 1979; Farner e Gwinner, 1980; Follett, 1984; Wingfield, 1993). No caso do pato doméstico, observou-se que a diminuição do comprimento do dia, na passagem das estações de outono para inverno, talvez possa desencadear o desenvolvimento gonadal, iniciando o período reprodutivo desta espécie, similarmente ao observado no pardal e codorna doméstica (Wingfield, 1993), onde a mudança do fotoperíodo influenciava na atividade testicular. Mas, efetivamente, é no período da primavera (outubro), quando o comprimento do dia começa a se alongar, é que o pico da reprodução ocorre. Esta seria talvez, a maior contribuição deste estudo, consoante aspectos de cronobiologia e dinâmica dos ritmos biológicos na reprodução, com uma óbvia interdependência entre fatores parácrinos e endócrinos, no processo reprodutivo de aves.
Algumas espécies de aves exibem um ciclo reprodutivo anual e variações cíclicas em hormônios reprodutivos, associados às mudanças estruturais dos testículos e das células espermatogenéticas. Os andrógenos desempenham importante papel na reprodução aviária, quando os seus níveis plasmáticos se modificam em paralelo com a atividade espermatogênica dos testículos (Kim e Yang, 2001).
Hau et al. (2000), estudando os níveis de testosterona plasmática, o comportamento reprodutivo, o ciclo reprodutivo da espécie Hylophylax naevioides (Passeriformes), observaram que os níveis da testosterona aumentavam no início da primavera e permaneciam elevados durante o período reprodutivo, situações não observadas no pato doméstico. Para os autores, o nível de testosterona desta espécie territorial, além de desencadear um comportamento agressivo, durante a corte e o acasalamento, é importante para a expressão dos caracteres sexuais secundários, produção de espermatozóides e comportamento sexual típico dos machos.
A atividade gonadal de várias espécies de aves selvagens, que habitam as regiões temperadas, mostra uma variação sazonal em conseqüência da interação de fatores ambientais parácrinos e de fatores hormonais (Tsutsui et al., 1994). Nestas espécies, o LH e os esteróides sexuais se elevam na primavera; permanecem relativamente altos durante a fase reprodutiva e declinam, para níveis basais, no final da reprodução (Ball e Wingfield, 1987).
O pato doméstico mostrou uma sazonalidade nos níveis de testosterona plasmática, com picos elevados durante o ápice da fase reprodutiva, e no início da fase de quiescência. Similarmente este modelo hormonal foi encontrado na espécie de pássaro subtropical
Ploceus philippinus (Tsutsui et al., 1994) e também no canário Serinus canarius
(Nottebohm et al., 1987).
O ciclo reprodutivo da espécie Ploceus philippinus demonstrou ser sazonal, estando dividido nas fases de reprodução, regressão, quiescência e progressão. Altos níveis de testosterona plasmática circulante na espécie foram observados, não somente na fase de reprodução, mas também na fase de repouso testicular (Tsutsui et al., 1994), de modo similar ao encontrado, neste trabalho, no pato doméstico. De acordo com Tsutsui et al. (1994), este perfil talvez mostre um aumento no número de receptores de gonadotrofinas, pois fora observado neste estudo níveis máximos de gonadotrofinas nas fases de reprodução e de quiescência durante o ciclo reprodutivo.
No pato doméstico, de forma inédita, o pico de testosterona na fase de quiescência (janeiro) poderia estar relacionado com o aumento no número de espermatogônias, que caracteriza esta fase, e também um aumento no número de células de Sertoli. Após esta fase, a concentração de testosterona diminuiu até a fase de reprodução em agosto, posto que
a testosterona estaria envolvida nos processos de espermatogênese e proliferação celular. Já a ocorrência de um pico nos níveis de testosterona plasmática na fase da reprodução, poderia estar relacionada ao comportamento de corte à fêmea e de agressividade na defesa territorial, característico durante o período reprodutivo. Estas afirmações concordam com as descrições prévias elaboradas por Hau et al. (2000), Wikelski et al. (2000) e Hau (2001).
Estudos recentes sobre o controle endócrino do comportamento reprodutivo sazonal
em aves tropicais, revelaram que a testosterona regularia o comportamento agressivo do macho em aves territoriais (Hau et al., 2000; Wikelski et al., 2000; Hau, 2001). Segundo os autores, a testosterona é produzida, muitas vezes, durante a fase não reprodutiva, em que as gônadas talvez segreguem testosterona, mesmo no estágio em que os testículos mostraram-se regredidos, como notado no pato doméstico. Alternativamente, precursores de testosterona poderiam surgir de fontes não gonadais (Wikelski et al., 1999; Soma et al., 2000) e seriam convertidos em testosterona nos sítios alvos cerebrais (Schlinger e Arnold, 1992; Soma e Wingfield, 1999; Hau et al., 2000; Soma et al., 2000).
Agradecimentos
Agradecemos a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro deste projeto (Processo 00/05079-4) e a Sra. Damares Perecim Roviero pelo auxílio técnico.
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Variabilidades morfométricas testiculares e níveis de glicose, glicogênio e lipídeo durante o ciclo reprodutivo anual do pato doméstico (Anas platyrhynchos)
K. Simões1, A. M. Orsi2, E. C. Urbinati3, F. D. Gonçalvez4, C. Cruz4
1
Departament of Anatomy, Institute of Biology, State University of Campinas, UNICAMP, Campinas, São Paulo, Brazil
2
Departament of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazil
3
Departament of Physiology and Animal Morphology, São Paulo State University, UNESP, Jaboticabal, and Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, São Paulo, Brazil
4
Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, São Paulo, Brazil
Corresponding Author: Karina Simões, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, Departamento de Anatomia, Distrito de Rubião Júnior, S/N, Botucatu, São Paulo, Brasil, CEP 18618-000.
Resumo
Estudos quantitativos foram realizados para determinar o ciclo reprodutivo anual do pato doméstico (Anas platyrhynchos) e correlacioná-lo aos parâmetros bioquímicos de glicose sangüínea, glicogênio e lipídeos hepáticos e musculares, substratos metabólicos básicos ligados ao processo reprodutivo. Para o estabelecimento das fases do ciclo reprodutivo anual do pato doméstico foram utilizados parâmetros morfométricos de pesos testiculares, volume testicular, diâmetro de túbulos seminíferos e altura do epitélio seminífero ao longo do ano. Foram avaliados os níveis de glicose sangüínea, glicogênio e lipídeos hepáticos e musculares, nas diferentes fases do ciclo reprodutivo. O ciclo reprodutivo anual do pato doméstico pode ser dividido em quatro fases sucessivas ao longo do ano, denominadas de reprodução, regressão, quiescência e recrudescência gonadal. A fase reprodutiva se iniciou na estação de inverno (julho), atingindo seu pico máximo em outubro, apresentando maiores pesos e volume testiculares, diâmetro dos túbulos seminíferos e altura epitelial. A fase de regressão ocorreu no final da primavera (novembro) e início de verão (dezembro), com reduzidos valores de pesos e volumes testiculares. A fase de quiescência gonadal representou o final do ciclo reprodutivo, ocorrendo no verão (meses de janeiro e fevereiro), quando os parâmetros morfométricos mostraram os menores valores no ciclo reprodutivo. A fase de recrudescência se iniciou no outono (março) e se estendeu até o começo do inverno (junho), com valores reduzidos dos parâmetros analisados. Em relação ao metabolismo energético somente a glicose sangüínea estava correlacionada ao ciclo reprodutivo anual da espécie, fornecendo energia para o processo reprodutivo.
Introdução
A reprodução nos animais está sob regulação endógena e geralmente é dependente de fatores ambientais, desenvolvendo modelos reprodutivos que alternam períodos de atividade e quiescência gonadal. Nas aves, os ciclos reprodutivos sazonais são constantes, e influenciados por fatores parácrinos, quando os órgãos reprodutores crescem e regridem com a luz, temperatura, índice pluviométrico e disponibilidade de alimento (Kemp, 1973; Silverin, 1975), estando sujeitos também a constantes variações em virtude da latitude e altitude geográfica (Breucker et al., 1989).
Os ciclos reprodutivos de vertebrados silvestres se sincronizam com as variações ambientais, visando a sobrevivência das espécies, apresentando uma característica sazonalidade. Muitas aves tropicais têm conservado esta estacionalidade apesar de habitarem regiões de condições ambientais relativamente constantes ao longo do ano (Fuenzalida et al., 1989). Em aves de reprodução estacional (sazonal), a disponibilidade de gametas maduros está restrita a uma determinada época do ano, sendo variável entre as espécies. As alterações morfofuncionais das gônadas constituem um ciclo anual, de modo que, nos testículos, pôde-se distinguir quatro fases denominadas de quiescência, recrudescência, atividade e regressão, observadas histologicamente e por alterações de peso e volume testicular (Fuenzalida et al., 1989).
Estudos têm sido conduzidos sobre a influência de diferentes fotoperíodos no controle de funções reprodutivas de aves, fêmeas e machos, de acordo com os seus interesses econômicos. Em uma avicultura conduzida com controle de luminosidade, a duração pré-estabelecida da luz ou a sua ausência é de fundamental importância para cada
fase do ciclo reprodutivo do animal (Baraldi-Artoni et al., 1997). Para se determinar o ciclo testicular anual de uma ave, alguns parâmetros morfológicos e morfométricos têm sido utilizados tais como: diâmetro dos túbulos seminíferos, altura do epitélio seminífero, número de células intersticiais, número e cinética de células germinativas, espessura da túnica albugínea e diâmetro nuclear das células germinativas (Fuenzalida et al., 1989; Baraldi-Artoni et al., 1997).
O organismo animal necessita de grande estoque energético para o suporte de vários processos fisiológicos, inclusive o reprodutivo. Parte dessa energia é fornecida pelos carboidratos e, parte pelos lipídeos e proteínas (Lehninger, 1995).
Os carboidratos são uma fonte de energia importante para o metabolismo animal. Estes elementos participam do metabolismo intermediário em vias como glicólise, glicogênese, glicogenólise e gliconeogênese, nas quais há participação central da glicose. A glicose sangüínea e o glicogênio hepático são substratos metabólicos básicos e podem ser importantes parâmetros no estudo do metabolismo animal. O glicogênio hepático é um carboidrato importante como fonte de energia e fornecedor de glicose para a manutenção da homeostase glicêmica (Lehninger, 1995). Os carboidratos, assim como proteínas e lipídeos, têm influência no processo reprodutivo, atuando em períodos de emergência para a produção de energia no músculo (Mommsen et al., 1980), colaborando como fonte de energia para a reprodução (Zaiden, 2000).
A atividade dos espermatozóides depende de carboidratos como fonte de energia utilizada no metabolismo das funções intrínsecas dos espermatozóides, mas também na elaboração de técnicas de manutenção de espermatozóides “in vitro”, visando a inseminação artificial nas aves (Freeman, 1984).
De acordo com o exposto, o objetivo deste trabalho foi determinar o ciclo reprodutivo anual do pato doméstico (Anas platyrhynchos) através de análises morfométricas e correlacioná-lo a parâmetros bioquímicos de glicose, glicogênio e lipídeo total hepático e muscular utilizados como fonte energética para o processo reprodutivo em aves.
Material e Métodos
Para o estabelecimento do ciclo reprodutivo anual foram utilizados 36 patos domésticos adultos da espécie Anas platyhrynchos sp, com peso corpóreo de 2,5 a 4,0 Kg, provenientes de criação comercial extensiva, sendo sacrificados 3 animais por mês ao longo do ano. Todas as aves foram pesadas e sacrificadas mediante saturação anestésica com uma mistura de cloridrato de quetamina (20mg/Kg) e cloridrato de xilazina (1,5 mg/Kg) aplicada intramuscularmente. A seguir, abordaram-se os órgãos reprodutores por meio de laparotomia abdominal, rebatimento do plastrão esternal e evisceração do trato gastrointestinal.
Análises morfométricas
Os testículos foram retirados, pesados em balança semi-analítica (Acculab, USA), e o comprimento dos eixos maior (longitudinal) e menor (transversal) foi medido utilizando-se paquímetro de precisão digital (Mitutoyo, Japão). Para o cálculo morfométrico do
volume total de cada testículo, aplicou-se a fórmula de elipsóide: V = 4/3. π. a. b2
, onde a é o semi-eixo maior e b o semi-eixo menor (Miraglia e Hayashi, 1993).
Os testículos foram então seccionados longitudinalmente, imersos em solução de Bouin por 24 horas e incluídos em Histosec® (Leica, Germany). Secções histológicas de 5 µm de espessura foram coradas com Hematolina-Eosina.
Para a análise morfométrica de diâmetro dos túbulos seminíferos e altura do epitélio seminífero nas diferentes fases do ciclo reprodutivo utilizaram-se 3 animais por mês e 6 secções histológicas aleatórias dos testículos por animal, onde foi mensurado o diâmetro de 30 túbulos seminíferos e obtidas 150 medidas da altura do epitélio seminífero, por animal, através do Programa Computacional de Análise de Imagens Image Pro-Plus (Media Cybernetics, USA).
Análises bioquímicas de glicose sangüínea, glicogênio e lipídeo hepáticos e musculares
Durante as coletas dos testículos, também se coletou sangue e amostras de tecidos hepático e muscular (m. peitoral superficial e m. gastrocnêmio) de 3 animais mensais para a avaliação da glicose sangüínea, glicogênio e lipídeo hepático e muscular.
Na dosagem de glicose sangüínea foi obtido sangue do ventrículo cardíaco esquerdo dos animais, sendo esta determinada pelo método colorimétrico (King e Garner, 1947), com leitura realizada em espectrofotômetro a 540 nm.
Para a análise de glicogênio hepático e muscular, fragmentos de fígado e de músculo branco (músculo peitoral superficial) e de músculo vermelho (músculo
gastrocnêmio) foram coletados e congelados sobre gelo seco e estocados em placas a -70°C até a realização das análises. O glicogênio foi dosado pelo método Glicogênio Trinder, Placa de Elisa (Moon et al., 1989) com leitura em espectrofotômetro a 490- 505 nm.
A determinação do lipídeo total tecidual foi realizada com fragmentos de fígado, músculo branco (músculo peitoral superficial) e de músculo vermelho (músculo gastrocnêmio), segundo Bligh e Dyer (1959). Para isso utilizamos 500 mg de tecido homogeneizado em 5,0 ml da mistura de extração com solvente orgânico (clorofórmio/metanol 2:1). Após a filtragem do homogenado foram obtidas camadas distintas, uma delas contendo fração lipídica (clorofórmio) e outra fração não lipídica (metanol). Após separação da camada que continha lipídeos, esta foi colocada em placas de Petri previamente pesadas e levadas a estufa a 100°C, por 1 hora, para evaporação. A diferença entre os pesos inicial e final das placas permitiu os cálculos para obtenção da porcentagem de lipídeos de cada amostra.
Os resultados obtidos dos parâmetros morfométricos e bioquímicos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e testados pelo Teste de Tukey 5%, utilizando-se o “software SAS” (Statistical Analyses System, USA).
Resultados
Ciclo reprodutivo anual
O ciclo reprodutivo anual do pato doméstico pôde ser dividido em 4 fases sucessivas ao longo do ano, denominadas de reprodução, regressão, quiescência e recrudescência, de acordo com os parâmetros morfométricos utilizados.
A fase reprodutiva se iniciou na estação de inverno (julho), atingindo seu pico máximo no início de outubro, estação de primavera. Durante toda esta fase, os pesos testiculares (Gráfico 1) e o volume dos testículos direito e esquerdo (Gráfico 2) aumentaram significativamente, com valores máximos no pico reprodutivo (outubro). Nesta fase reprodutiva os túbulos seminíferos eram amplos, com maiores diâmetros no pico da reprodução em outubro (Gráfico 3). A variação da altura do epitélio seminífero, durante esta fase, acompanhou, em geral, a modificação anual do diâmetro tubular (Gráfico 4). Os maiores valores ocorreram no pico reprodutivo (outubro) e no início da reprodução (julho). Nos demais meses do período reprodutivo (agosto, setembro) foram observados valores intermediários de altura do epitélio seminífero (Gráfico 4), no pato doméstico.
A fase de regressão ocorreu no final da primavera e início de verão, nos meses de novembro e dezembro. Nesta fase, os pesos dos testículos (Gráfico 1) e o volume testicular (Gráfico 2) eram reduzidos. No término da fase regressiva observou-se um aumento significativo no diâmetro (Gráfico 3) e na altura do epitélio seminífero (Gráfico 4).
A fase de quiescência gonadal representou o final do ciclo testicular. No pato doméstico esta ocorreu no verão, nos meses de janeiro e fevereiro. Tanto os pesos testiculares (Gráfico 1), como o volume dos testículos (Gráfico 2) apresentaram os menores valores médios e também os menores diâmetros (Gráfico 3) e menor altura epitelial (Gráfico 4) dos túbulos seminíferos de todo o ciclo reprodutivo.
A fase de recrudescência se iniciou no outono (março) e se estendeu até o começo do inverno (junho), sendo o período mais longo do ciclo reprodutivo. Nesta fase os pesos testiculares (Gráfico 1) e o volume dos testículos (Gráfico 2) eram reduzidos e o diâmetro dos túbulos seminíferos (Gráfico 3) e a altura do epitélio seminífero (Gráfico 4)
apresentaram valores reduzidos em relação às demais fases do ciclo. No início da recrudescência (março), a altura epitelial dos túbulos seminíferos mostrou valores intermediários em comparação aos outros meses desta fase (Gráfico 4).
Gráfico 1. Pesos testiculares direito e esquerdo (médias ± desvio padrão) durante o ciclo reprodutivo anual do pato doméstico.
Gráfico 2. Volume testicular (médias ± desvio padrão) durante o ciclo reprodutivo anual do pato doméstico. 0 5 1 0 1 5 2 0
ja ne iro fe ve re iro m a rç o a b ril m a io junho julho a g o s to s e te m b ro o utub ro no ve m b ro d e ze m b ro
P es o tes tíc u lo d ireito (g ) P es o tes tíc u lo es q u e rd o (g ) M e s e s d o a n o P e s o s T e s tic u la re s (g ) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400
janeiro fevereiro março abril maio junho julho agosto setembro outubro novembro dezembro
M eses do ano V o lume Testicular (mm3) V olum e testicular esquerdo (m m 3) V olum e testicular direito (m m 3)
Gráfico 3. Médias (± desvio padrão) do diâmetro (µm) dos túbulos seminíferos durante o ciclo reprodutivo anual.
*Letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (5%)
Gráfico 4. Médias (± desvio padrão) da altura epitelial (µm) dos túbulos seminíferos durante o ciclo reprodutivo anual.
*Letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (5%).
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
j anei r o f ev er ei r o mar ç o abr i l mai o j unho j ul ho agos t o s et embr o out ubr o nov embr o dez embr o M e s e s d o a n o
A
ltura do epitélio (um)
mé d ia e e b c e e e a d c a e b 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 ja n e ir o fe v e r e ir o m a r ç o a b r il m a io ju n h o ju lh o a g o s to s e te m b r o o u tu b r o n o v e m b r o d e z e m b r o M e s e s d o a n o Diâ m e tr o ( u m) m é d ia i h g h f g g h f g h c e d a f b
Metabolismo energético
A determinação das concentrações de glicose circulante no sangue do pato doméstico demonstrou variações ao longo do ano (Gráfico 5). A glicemia apresentou-se mais elevada durante toda a fase de recrudescência (março a junho), fase de regressão (novembro, dezembro) e fase de quiescência testicular (janeiro, fevereiro), onde não diferiram entre si. Os menores valores encontrados de glicemia foram durante a fase reprodutiva (julho a outubro), diferindo das demais fases do ciclo reprodutivo anual.
As concentrações de glicogênio hepático e muscular variaram ao longo do ano (Gráfico 6). O glicogênio hepático mostrou maiores valores durante a fase de recrudescência (meses de março a junho), fase reprodutiva (julho, outubro) e fase de quiescência (fevereiro), não diferindo entre si. Entretanto, o menor valor encontrado de glicogênio hepático foi no mês de agosto, na fase de reprodução.
Os níveis de glicogênio do músculo vermelho (Gráfico 6) apresentaram seu maior pico no mês de outubro, na fase reprodutiva, onde este não diferiu significativamente dos valores encontrados nos demais meses da fase de reprodução (julho, agosto, setembro) e também nas fases de quiescência (fevereiro) e recrudescência (maio, junho). Nos outros meses do ano foram encontrados os menores valores de glicogênio para o músculo vermelho.
As concentrações de glicogênio de músculo branco variaram no decorrer do ano (Gráfico 6), com o maior pico observado na fase de recrudescência (abril), não diferindo significativamente das fases de reprodução (julho, outubro), regressão (novembro), quiescência (janeiro) e recrudescência (abril, maio, junho).
As concentrações de lipídeo total hepático e lipídeo total muscular se diferenciaram no decorrer do ano (Gráfico 7). O lipídeo total hepático apresentou maiores valores nas fases de reprodução (agosto), regressão (novembro, dezembro) e quiescência (janeiro), não diferindo entre si. Nos demais meses do ano foram encontrados valores intermediários, sendo o menor valor verificado no início da fase de recrudescência (março).
A concentração de lipídeo total de músculo vermelho mostrou maiores picos durante toda a fase reprodutiva (julho a outubro), diferindo das demais fases do ciclo. O menor valor encontrado foi na fase de recrudescência (abril), não se diferenciando significativamente das outras fases do ciclo reprodutivo. Para o músculo branco, os maiores valores de lipídeo total foram vistos durante as fases de reprodução (julho a outubro), regressão (novembro, dezembro), quiescência (janeiro) e de recrudescência (abril, maio, junho), diferindo dos demais meses do ano, com menor valor em fevereiro, fase de repouso testicular.
Gráfico 5 - Valores médios (± desvio padrão) de glicose sangüínea (mg/100mL) durante o ciclo reprodutivo anual.
*letras diferentes indicam diferença significativa entre as médias pelo Teste de Tukey 5%.
Gráfico 6 – Médias (± desvio padrão) de glicogênio hepático e de glicogênio muscular (músculos vermelho e branco) durante o ciclo reprodutivo anual.
* letras diferentes indicam diferença significativa entre as médias pelo Teste de Tukey
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0
janeiro fevereiro março abril maio junho julho agosto setembro outubro novembro dezembro
Glicose (mg/100mL) Média a a a a a ab ab ab bc c c c Meses do ano 0 ,0 0 2 ,0 0 4 ,0 0 6 ,0 0 8 ,0 0 1 0 ,0 0 j a n e i r o f e v e r e i r o m a r ç o a b r i l m a i o j u n h o j u l h o a g o st o se t e m b r o o u t u b r o n o v e m b r o d e z e m b r o G licogênio (g/100g) hep át ic o mús c ulo v er melho mús c ulo b r anc o a a a a b a b a b a b c a b b c d c d c d d a a b a b a b a b a b b b ba a b b b a b b c b c a b a b a b c b c a b c a b c b c M e s e s d o a n o