Faculdade de Farmácia
O ESTUDO DA COINFECÇÃO LEISHMANIOSE-HIV EM MULHERES GRÁVIDAS: PREVENÇÃO DA TRANSMISSÃO VERTICAL E INFEÇÃO
CONGÉNITA
Stefanie Paixão Baptista
Relatório de estágio orientado pela Prof. Doutora Quirina dos Santos Costa e coorientado pelo Dr. Carlos Cardoso
Mestrado em Análises Clínicas
Prefácio
Tendo em mente que o incrível corpo humano sempre me fascinou, bem como tudo o que está relacionado com a área da saúde, licenciei-me no curso de Ciências da Saúde pela Universidade de Lisboa, que me deu bases nas várias áreas da saúde. Durante os três anos adquiri conhecimentos teóricos e práticos, principalmente ao nível da Bioquímica, Microbiologia, Imunologia e Biologia Molecular. Com isto, conclui que o meu desejo era trabalhar na área laboratorial e como o curso não é profissionalizante, decidi continuar o 2º ciclo de estudos na área das Análises Clínicas. Assim, ingressei no Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, cujo plano curricular é apelativo e enriquecedor, de forma a complementar os meus conhecimentos e alcançar o alvo de trabalhar nesta fascinante área. O presente relatório diz respeito ao estágio curricular realizado no âmbito do mestrado.
Relativamente à organização, este relatório encontra-se dividido em cinco partes: na Parte I apresentam-se o prefácio, o resumo em português e inglês, os índices e lista de abreviaturas; na Parte II expõe-se o relatório de estágio, onde é apresentado um resumo do local de estágio, descrevendo os conhecimentos adquiridos nos mesmos, para as valências de Pré-Analítica, Hematologia, Bioquímica (incluindo o Radioimunoensaio e a Química Analítica) e Microbiologia (incluindo a Biologia Molecular); a Parte III diz respeito à monografia, desenvolvida no âmbito da valência de Microbiologia, com o título “O estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV em mulheres grávidas: prevenção da transmissão vertical e infeção congénita”. Na Parte IV, apresentam-se as conclusões e perspetivas futuras. Por último, a Parte V apresenta os Anexos.
Este relatório está de acordo com o disposto no Artigo 37.º do Regulamento Geral do Ciclo de Estudos conducente ao Grau de Mestre da FFULisboa, nº 134/2016, DR, 2.ª série — N.º 26, de 8 de fevereiro de 2016.
Resumo
O estágio descrito neste relatório integra o plano de estudos do Mestrado em Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa decorreu no Laboratório Dr. Joaquim Chaves nas áreas de Pré-Analítica, Hematologia, Bioquímica e Microbiologia.
Este relatório apresenta um resumo da experiência e conhecimentos adquiridos ao longo dos cerca de seis meses, descrevendo os produtos biológicos, a execução dos parâmetros analíticos, bem como as metodologias, sistemas e equipamentos utilizados. Refere ainda os procedimentos adotados para a implementação do Controlo de Qualidade Interno e Avaliação Externa da Qualidade.
O estágio realizado foi, sem dúvida, uma mais valia pois permitiu colocar em prática os conhecimentos teóricos obtidos durante o mestrado, aprender metodologias avançadas e ainda adquirir experiência profissional.
Neste documento é também apresentada, no âmbito da área de Microbiologia, uma revisão bibliográfica sobre o seguinte tema: o estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV em mulheres grávidas: prevenção da transmissão vertical e infeção congénita.
Abstract
The interneship described in this report integrates the study plan of the Masters in Clinical Analysis by the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon. It was carried out at the Dr. Joaquim Chaves Laboratory with respect to the areas of Pre-Analytical, Hematology, Biochemistry and Microbiology.
This report summarizes the experience and knowledge over six months, describing the biological products needed to implement the respective analytical parameters, as well as the methodologies and equipment used for this purpose. It also refers to the procedures adopted for the implementation of Internal Quality Control and External Quality Assessment.
This internship was, undoubtedly, an added value because it allowed to put into practice the theoretical knowledge obtained during the Master's degree, learning advanced methodologies and still gain professional experience.
In this document is also presented a bibliographic review entitled: the study of Leishmaniasis-HIV coinfection in pregnant women: prevention of vertical transmission and congenital infection.
Agradecimentos
Agradeço primariamente a todos os docentes e convidados pelos conhecimentos transmitidos, bem como pela acessibilidade demonstrada ao longo do Mestrado em Análises Clínicas.
Quero agradecer também ao Dr. Carlos Cardoso pela oportunidade de estagiar num laboratório tão conceituado, ao Dr. Rui Pimentel pela sua grande disposição em ajudar, bem como a toda a equipa do Laboratório Dr. Joaquim Chaves, que me recebeu muitíssimo bem e me fez sentir tão integrada.
Em especial, quero expressar o meu agradecimento à Prof. Doutora Quirina Santos Costa pela orientação, disponibilidade e apoio.
Acima de tudo, quero agradecer à minha família e amigos, especialmente aos meus pais, por todos os sacrifícios que têm feito para eu poder concluir os estudos.
Aos meus avós por me terem acolhido nos últimos anos. E ao meu querido Andrei, por todo o amor, carinho, paciência e compreensão que tem demonstrado nestes últimos meses. Sem o vosso apoio, isto não teria sido possível. Agradeço do fundo do meu coração!
Lista de Abreviaturas
Parte II
Relatório de Estágio
aa Aminoácidos
Ac Anticorpo
AEQ Avaliação Externa da Qualidade
Ag Antigénio
AgHBs Antigénio de superfície do vírus da Hepatite B Anti-HBs Anticorpo do antigénio de superfície da hepatite B ALP Fosfatase alcalina
ALT Alanina aminotransferase AST Aspartato aminotransferase AT Antidepressivos Tricíclicos ATCC American Type Culture Collection
ATP Trifosfato de adenosina AVC Acidente Vascular Cerebral BASO Basófilos
Ca2+ Ião cálcio
CCR Recetor de quimiocinas do grupo CC, do inglês, CC Chemokine Receptor CHOD Colesterol oxidase
CK Creatina Quinase
CK-MB Isoenzima MB da creatina Quinase Cl- Ião cloro
CLED Gelose Cistina Lactose Deficiente em Eletrólitos CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMI Concentração Mínima Inibitória
CNA Gelose Columbia ANC + 5% de sangue de carneiro CO2 Dióxido de carbono
CQ Controlo da Qualidade
DIG Diagnóstico Imunológico de Gravidez DGS Direção-Geral da Saúde
DNA Ácido Desoxirribonucleico, do inglês, Deoxyribonucleic acid EAM Enfarte agudo do miocárdio
ECLIA Eletroquimioluminescência EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EIA Ensaio imunoenzimático, do inglês, Enzyme Immunoassay
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática, do inglês, Enzime-linked immunosorbent assay EPO Eritropoietina FA Fosfatase Alcalina GGT γ-glutamil transferase GI Gastrointestinal GN Gram negativo
GOT Glutamato Oxalacetato Transaminase
Gp Glicoproteína
GP Gram positivo
GPT Glutamato Piruvato Transaminase
Hb Hemoglobina
HbA1c Hemoglobina Glicada
HBV Vírus da Hepatite B, do inglês, Hepatitis B Virus hCG Gonadotropina coriónica humana
HCO3 Ião bicarbonato
HDL Lipoproteína(s) de alta densidade, do inglês, High Density Lipoprotein HEKT Gelose Hektoen
HFLC Células linfocitárias de elevada fluorescência
HFR Reticulócitos de Alta Fluorescência, do inglês, High-Flourescence Reticulocytes
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana, do inglês, Human Immunodeficiency Virus
HK Hexoquinase
HPLC Cromatografia Líquida de alta eficiência, do inglês, High performance liquid chromatography
IgM Imunoglobulina M IG Granulócitos imaturos
INSA Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge
ISSO Organização Internacional de Normalização, do inglês, International Organization for Standardization
IRMA Ensaio Imunoradiométrico
K+ Ião potássio
KCl Cloreto de potássio
Lac Lactose
LCR Líquido Cefalorraquidiano LDH Lactato desidrogenase
LFR Reticulócitos de Baixa Fluorescência, do inglês, Low-Flourescence Reticulocytes
LJC Laboratório Joaquim Chaves MCK Gelose MacConkey
MFR Reticulócitos de Média Fluorescência, do inglês, Median-Flourescence Reticulocytes
MRSA Staphylococcus aureus Meticilina-resistentes, do inglês, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Na+ Ião sódio
NADP Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato reduzida
nm Nanómetros
NRBC Eritrócitos nucleados, do inglês, Nucleated Red Blood Cells PBJ Proteínas de Bence-Jones
PCR Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês, Polymerase Chain Reaction pH Potencial de hidrogénio
PCT% Plaquetócrito
PLT Plaquetas
PNAEQ Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade PSOF Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes
PTGO Prova de Tolerância à Glicose Oral RBC Eritrócito, do inglês, Red Blood Cell RET Reticulócito
RIA Radioimunoensaio, do inglês, Radioimmunoassay
RN Recém-nascido
Rpm Rotações por minuto
RT-PCR Reação em Cadeia da Polimerase com Transcriptase Reversa, do inglês, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SCA Síndrome Coronária Aguda
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida SHBG Globulina Ligante de Hormonas Sexuais SRC Síndrome da Rubéola Congénita
T3 Tiroxina
T4 Triiodotironina
TA Temperatura ambiente
TBG Globulina Ligadora de Tiroxina TMB Tetrametilbenzidina
TSA Teste(s) de Suscetibilidade aos Antibióticos TSH Hormona Estimulante da Tiroide
TVP Trombose Venosa Profunda UFC Unidades Formadoras de Colónias
UK-NEQAS Serviço Nacional de Avaliação Externa da Qualidade do Reino Unido, do inglês, The United Kingdom National External Quality Assessment Service UV Ultravioleta
VCAT Meio de gelose chocolate polyvitex
VLDL Lipoproteínas de muito baixa densidade, do inglês, Very Low Density Lipoprotein
VS Velocidade de Sedimentação
Parte III
O estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV em mulheres grávidas:
prevenção da transmissão vertical e infeção congénita
AmB Anfotericina B, do inglês, Amphotericin B
ART Terapêutica Antirretroviral, do Inglês, Antiretroviral Therapy Ca2+ Cálcio
CDC Centros para o Controlo e Prevenção de Doenças, do inglês, Centers for Control and Prevention
CL-AmB Complexo lipídico de anfotericina B, do inglês, Amphotericin B lipid complex
CMSPs Células Mononucleares do Sangue Periférico
DAT Teste de aglutinação direta, do inglês, Direct agglutination test DGS Direção-Geral da Saúde
DNA Ácido Desoxirribonucleico, do inglês, Deoxyribonucleic acid
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática, do inglês, Enzime-linked immunosorbent assay
EP4 Recetor da Prostaglandina E2 do tipo 4
Gp Glicoproteína
HAART Terapêutica Anti-retroviral Altamente Ativa
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana, do inglês, Human Immunodeficiency Virus
IFAT Teste de imunofluorescência indireta, do inglês, Immunofluorescence antibody test
IFN Interferão, do inglês, Interferon
IkB Molécula inibidora do fator nuclear-kB
IL Interleucina
L-AmB Anfotericina B lipossomal, do inglês, Liposomal Amphotericin B LC Leishmaniose Cutânea
LCD Leishmaniose Cutânea Difusa LCDS Leishmaniose Cutânea Disseminada
LCL Leishmaniose Cutânea Localizada LCR Líquido Cefalorraquidiano
LMC Leishmaniose Mucocutânea LPG Lipofosfatoglicano
LTR Terminal de Longa Repetição LV Leishmaniose Visceral
NK Assassinas Naturais, do inglês, Natural Killer
Nm Nanómetro
NRTIs Nucleoside reverse transcriptase inhibitors
PCR Reação de Polimerase em Cadeia, do inglês, Polymerase Chain Reaction PGE2 Prostaglandina E2
PIs Inibidores de Protease Viral, do inglês, Protease Inhibitors PKA Proteína quinase A
PKC Proteina quinase C POC Point of care
PTK Proteína Tirosina Quinase
p65/p50 Elementos ativos do fator nuclear kB
qPCR Reação de Polimerase em Cadeia quantitativo, do inglês, quantitative Polymerase Chain Reaction
R Recetor do LPG e/ou o seu núcleo de fosfatidil inositol
rK39 Antigénio K39 recombinante
RNA Ácido Ribonucleico, do inglês, Ribonucleic acid Sb Antimónio (símbolo químico)
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida TAN Técnica dos Ácidos Nucleicos
Tat Proteína Transativadora da transcrição, do inglês, Trans-Activator of Transcription
TGF-ß Fator de Crescimento Transformante Beta Th1 Células T Auxiliares do tipo 1
Th2 Células T Auxiliares do tipo 2 Th17 Células T Auxiliares do tipo 17 TNF- Fator de Necrose Tumoral
WB Western Blot
ÍNDICE GERAL
PARTE I ... III PREFÁCIO ... V RESUMO ... VI ABSTRACT ... VII AGRADECIMENTOS ...VIII LISTA DE ABREVIATURAS ... IX ÍNDICE DE FIGURAS ... XXI ÍNDICE DE TABELAS ... XXVPARTE II ... 1
RELATÓRIO DE ESTÁGIO ... 3
INTRODUÇÃO ... 5
1. FASE PRÉ-ANALÍTICA - COLHEITAS E TRIAGEM ... 7
2. HEMATOLOGIA ... 13
2.1. HEMOGRAMA ... 13
2.2. VELOCIDADE DE SEDIMENTAÇÃO ... 20
2.3. HEMOGLOBINA GLICADA (HBA1C) ... 21
2.4. ELETROFORESE DAS HEMOGLOBINAS ... 22
2.5. AVALIAÇÃO DA HEMOSTASE E COAGULAÇÃO ... 24
2.6. IMUNOHEMATOLOGIA ... 28
3. BIOQUÍMICA ... 31
3.1. IONOGRAMA ... 31
3.2. QUÍMICA CLÍNICA E IMUNOENSAIOS... 32
3.2.1. Metabolismo dos Hidratos de Carbono ... 33
3.2.2. Metabolismo Lipídico ... 34
3.2.3. Metabolismo Proteico ... 36
3.2.4. Função Hepática e Tracto Biliar ... 36
3.2.5. Função Renal ... 38 3.2.6. Função Pancreática ... 40 3.2.7. Metabolismo Fosfocálcico ... 40 3.2.8. Função Cardíaca ... 42 3.2.9. Marcadores Tumorais... 45 3.2.10. Doenças Infeciosas ... 47
3.2.11. Rastreio Serológico da Grávida ... 50
3.3. URIANÁLISE ... 58
3.3.1. Diagnóstico Imunológico da Gravidez (DIG) ... 66
3.4. ELETROFORESE DAS PROTEÍNAS ... 68
3.5. LIPIDOGRAMA ... 73
4. RADIOIMUNOENSAIO (RIA) ... 74
5. QUIMIOLUMINESCÊNCIA ... 77
6. QUÍMICA ANALÍTICA ... 79
6.1. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA DEFINIÇÃO (HPLC) ... 79
6.2. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO ... 81
6.3. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO ATÓMICA ... 82
6.4. ESPECTROMETRIA DE EMISSÃO ÓTICA POR PLASMA ACOPLADO INDUTIVAMENTE (ICP)... 83
6.5. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA E NO VISÍVEL ... 84
6.6. CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA (GC/MS) ... 85
7. MICROBIOLOGIA ... 87 7.1. HEMOCULTURA ... 87 7.2. URINA ASSÉTICA ... 88 7.3. EXSUDADO VAGINAL ... 92 7.4. EXSUDADO FARÍNGEO ... 95 7.5. EXSUDADO NASAL ... 95 7.6. EXPETORAÇÃO ... 96 7.7. EXSUDADO AURICULAR ... 97 7.8. ESPERMOCULTURA ... 98 7.9. COPROCULTURA ... 99 7.10. EXAME MICOLÓGICO ... 100 7.11. EXAME URETRAL ... 101
7.12. PESQUISA DE OVOS,QUISTOS E PARASITAS ... 104
7.13. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES (PSOF) ... 105
8. BIOLOGIA MOLECULAR... 106
8.1. EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ... 106
8.2. AMPLIFICAÇÃO E DETEÇÃO -PCR ... 107
8.3. MICROARRAYS DE BAIXA INTENSIDADE –CLART-STRIP... 108
8.4. SONDAS EM LINHA -DNASTRIP ... 109
8.5. ELISA ... 110
8.6. IMMUNOCAPISAC SIGE112 ... 110
8.7. TESTES RÁPIDOS -IMUNOCROMATOGRAFIA ... 111
9. HIGIENE E SEGURANÇA ... 112
10. CONTROLO DA QUALIDADE ... 114
BIBLIOGRAFIA ... 119
PARTE III ... 127
O ESTUDO DA COINFECÇÃO LEISHMANIOSE-HIV EM MULHERES GRÁVIDAS: PREVENÇÃO DA TRANSMISSÃO VERTICAL E INFEÇÃO CONGÉNITA ... 129
RESUMO ... 131 ABSTRACT ... 132 OBJETIVOS ... 133 MATERIAL E MÉTODOS ... 134 INTRODUÇÃO ... 135 1. EPIDEMIOLOGIA ... 139 1.1. EUROPA ... 141 1.2. ÁSIA ... 143 1.2.1. Índia ... 144 1.3. AMÉRICA ... 145 1.3.1. Brasil ... 146 1.4. ÁFRICA ... 146 1.4.1. Burkina Faso ... 147 1.4.2. Etiópia ... 147 1.4.3. Somália ... 148 1.4.4. Uganda ... 148 1.4.5. Quénia ... 148 1.4.6. Sudão ... 148 2. ASPETOS CLÍNICOS ... 150 2.1. COINFECÇÃO ASSINTOMÁTICA ... 151
2.2. COINFECÇÃO LEISHMANIOSE VISCERAL/HIV ... 151
2.2.1. Coinfecção Leishmaniose Dérmica Pós Kala-Azar (LDPK)/HIV ... 152
2.2.2. Coinfecção Leishmaniose Visceral/HIV em Mulheres Grávidas ... 153
2.3. COINFECÇÃO LEISHMANIOSE CUTÂNEA/HIV ... 153
2.3.1. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Localizada/HIV ... 154
2.3.2. Coinfecção Leishmaniose Recidiva Cutis/HIV ... 154
2.3.3. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Disseminada/HIV ... 154
2.3.4. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Difusa/HIV ... 155
2.3.5. Coinfecção Leishmaniose Mucocutânea/HIV em Mulheres Grávidas 155 2.4. COINFECÇÃO DOENÇA DE RECONSTITUIÇÃO IMUNOLÓGICA (DRI)/HIV ... 155
3. IMUNOPATOGÉNESE ... 157 4. DIAGNÓSTICO ... 161 4.1. PARASITOLÓGICO ... 161 4.1.1. Microscopia ... 161 4.1.2. Cultura ... 161 4.2. SEROLÓGICO ... 162 4.3. ANTIGÉNICO... 163
4.4. MOLECULAR ... 163
4.5. ESTRATÉGIA DE DIAGNÓSTICO NOS SERVIÇOS DE SAÚDE DE ÁREAS ENDÉMICAS 164 5. TERAPÊUTICA ... 168
5.1. LEISHMANIOSE ... 169
5.1.1. Antimoniais Pentavalentes (AP) – Sb5+... 169
5.1.2. Desoxicolato de Anfotericina B (ANB) ... 170
5.1.3. Anfotericina B Lipídica (ANB-L) ... 170
5.1.4. Miltefosina ... 171
5.1.5. Sulfato de Paramomicina ou Aminosidina ... 172
5.1.6. Isotionato de Pentamidina ... 172
5.1.7. Outros Fármacos ... 173
5.1.8. Combinações ... 173
5.2. OUTRAS ABORDAGENS TERAPÊUTICAS ... 173
5.3. PREVENÇÃO ... 173
CONCLUSÃO ... 175
BIBLIOGRAFIA ... 177
PARTE IV ... 181
CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS ... 183
PARTE V ... 185
Índice de Figuras
Parte II
Relatório de Estágio
Figura 1. Sistema de vácuo da BD Vacutainer® utilizado para a colheita de sangue ... 8
Figura 2. Tubo coletor para pesquisa de sangue oculto nas fezes para o aparelho OC-Sensor Diana® (Eiken) ... 11
Figura 3. Cobas conection modules (CCM) e sua conexão com analisadores e sistemas pré-analíticos e pós-analíticos da cobas ... 12
Figura 4. Sysmex XN-1000™ Hematology Analyzer ... 14
Figura 5. Gráfico WDF scattergram obtido pelo Sysmex XN-1000™ ... 14
Figura 6. Canal de análise diferencial de leucócitos ... 15
Figura 7. Canal WNR obtido pelo Sysmex XN-1000™ ... 15
Figura 8. Método de impedância utilizado no canal RBC/PLT Sysmex XN-1000™ ... 16
Figura 9. Exemplo de gráficos obtidos para RBC e PLT com equipamento Sysmex XN-1000™ ... 16
Figura 10. Método de acumulação da altura dos impulsos dos eritrócitos num volume fixo para obtenção do valor do hematócrito (HCT%) ... 17
Figura 11. Representação esquemática da determinação da hemoglobina pelo método de deteção SLS ... 17
Figura 12. Canal Ret/PLT-O obtido através do Sysmex XN-1000™ ... 19
Figura 13. Aparelho VES-MaticTM Cube-200 ... Erro! Marcador não definido. Figura 14. Método de Westergren modificado para determinar a VS ... Erro! Marcador não definido. Figura 15. Sistemas automáticos para determinação da HbA1c... 22
Figura 16. Resultado de uma eletroforese de hemoglobinas obtidos por HPLC com o VARIANT™ II TURBO Hemoglobin Testing System ... 23
Figura 17. Aparelho BCS® XP System ... 25
Figura 18. Aparelho ORTHO AutoVue® Innova System ... 28
Figura 19. Esquematização do Teste de Coombs ... 30
Figura 20. Cobas 8000 modular analyzer series. ... 31
Figura 22.Evolução dos marcadores serológicos durante a Hepatite B aguda ... 48 Figura 23. Resposta serológica à infeção por Toxoplasma gondii ... 51 Figura 24. Aparelho Cobas 6500 urine analyzer series ... 59
Figura 25. Tiras Siemens Multistix 10 SG ... 63
Figura 26. Eritrócitos no sedimento urinário... 64 Figura 27. Leucócitos segmentados na urina ... 64 Figura 28. Células escamosas. ... 65 Figura 29. Cilindros urinários... 65 Figura 30. Cristais urinários. ... 66 Figura 31. Resultados possíveis obtidos com o kit hCG Pregnancy Test ... 67 Figura 32. Eletroforese das proteínas séricas. ... 68 Figura 33. Perfil eletroforético de situações clínicas em que há redução da fração
albumina ... 69
Figura 34. Perfil eletroforético das proteínas de fase aguda e na Síndrome Nefrótica.. 70 Figura 35. Estrutura esquemática de Ig ... 70 Figura 36. Perfil eletroforético de pico policlonal, pico monoclonal de
hipoglobulinemia/agamaglobulinemia ... 71
Figura 37. Aparelho HYDRASYS 2® da Sebia... 72
Figura 38. Eletroforese em gel obtida com o kit Hydragel Bence Jones ... 72 Figura 39. Eletroforese em gel obtida com o kit Hydragel 7 LIPO +Lp (a) ... 73 Figura 40. Contador de Raios Gama Wallac Wizard... 74 Figura 41. Aparelho IMMULITE® 2000 da Siemens ... 77 Figura 42. Sistema HPLC Shimadzu ... 80 Figura 43. Determinação do interferograma ... 82 Figura 44. Espectrofotómetro de Absorção Atómica Shimadzu AA 6800. ... 83 Figura 45. Equipamento Varian Vista MPX – ICP/OES ... 84 Figura 46. Espectrofotómetro Genesys 5 UV-VIS ... 84 Figura 47. Determinação de substâncias por GC/MS ... 85 Figura 48. Equipamento BacT/ALERT ... 88 Figura 49. Equipamento Sysmex UF-1000iTM ... 89
Figura 50. Meios de cultura utilizados para identificação e TSA da bactéria
Staphylococcus aureus em amostra de urina ... 91
Figura 52. Amostras de urina em Meio CLED... 92 Figura 53. Exame direto com coloração Gram do exsudado vaginal ... 94 Figura 54. Trichomonas vaginallis em exame citológico vaginal ... 94 Figura 55. Diplococcos GN no exame direto corado pelo Gram, com morfologia
sugestiva de Neisseria gonorrhoeae ... 102
Figura 56. Aparelho MagNA Pure LC 2.0 Instrument ... 106 Figura 57. Componentes necessários para a realização da RT-PCR e respetivo produto
... 107
Figura 58. Equipamento cobas 4800 System da Roche ... 108
Figura 59. Equipamento LigthtCycler 2.0 da Roche ... 108
Figura 60. Esquema do método de visualização das sondas CLART-Strip ... 109
Figura 61. Padrão específico de bandas nas DNA-STRIP para vários genótipos do
Mycobacterium ... 110
Parte III
O estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV em mulheres grávidas:
prevenção da transmissão vertical e infeção congénita
Figura 1. Formas promastigotas de Leishmania sp em cultura. ... 135 Figura 2. Phlebotomus papatasi, flebótomo responsável pela transmissão do parasita
Leishmania ... 135
Figura 3. Estrutura do HIV ... 136 Figura 4. Endemicidade da LV no mundo em 2015 ... 139 Figura 5. Endemicidade da LC no mundo em 2015 ... 140 Figura 6. Prevalência do HIV nos adultos de idades compreendidas entre os 15 e os 49
anos, em 2016 ... 141
Figura 7. Ciclo de Vida da Leishmania sp no ser humano... 150 Figura 8. Lesões de Leishmaniose Cutânea ... 154 Figura 9. Representação esquemática dos mecanismos de sinalização envolvidos na
expressão da Leishmania sp-Lipofosfoglicano-mediada pelo HIV-1 através dos monócitos/macrófagos e linfócitos T ... 159
Figura 10. Resposta Imunológica de células T maternas e os seus efeitos durante a
gravidez coexistente com infeção por Leishmania sp ... 160
Figura 11. Microscopia ótica de formas amastigotas de Leishmania spp. num aspirado
de medula óssea ... 162
Figura 12. Algoritmo para o diagnóstico de LV em indivíduos infetados com HIV .. 165 Figura 13. Algoritmo para o diagnóstico de HIV ... 167
Índice de Tabelas
Parte II
Relatório de Estágio
Tabela 1. Índices eritrocitários e respetivas fórmulas ... 18 Tabela 2. Resultados das tiras-teste para a Esterase Leucocitária ... 60 Tabela 3. Resultados das tiras-teste para as Proteínas ... 61 Tabela 4. Resultados das tiras-teste para os Eritrócitos ... 62 Tabela 5. Descrição de análises executadas por radioimunoensaio competitivo ... 75 Tabela 6. Descrição de análises executadas por ensaio IRMA ... 76 Tabela 7. Descrição de análises executadas por HPLC ... 80 Tabela 8. Produtos Biológicos e respetivos meios de cultura ... 103
Parte III
O estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV em mulheres grávidas:
prevenção da transmissão vertical e infeção congénita
Tabela 1. Técnicas predefinidas para o diagnóstico de Leishmaniose Visceral em áreas
altamente endémicas, por nível de sistema de saúde, segundo a estratégia da WHO ... 164
Universidade de Lisboa
Faculdade de Farmácia
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
Stefanie Paixão Baptista
Relatório de Estágio orientado pelo Dr. Carlos Cardoso
Mestrado em Análises Clínicas
INTRODUÇÃO
O estágio descrito neste relatório integra o plano de estudos do Mestrado em Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e foi realizado no Laboratório de Análises Clínicas Dr. Joaquim Chaves (LJC) em Miraflores, Lisboa para as seguintes valências: Pré-Analítica, Hematologia, Bioquímica e Microbiologia, orientado pelo Dr. Carlos Cardoso.
A Joaquim Chaves Saúde (JCS) é um grupo português que, desde 1959, opera exclusivamente no sector da saúde, participando com competência e elevada qualidade no progresso da medicina, num percurso de rigor e qualidade na prestação de cuidados de saúde às populações. Após a criação do Laboratório de Análises Clínicas Dr. Joaquim Chaves, a primeira empresa a ser constituída, a JCS cresceu de forma sustentada no sector da saúde com a sucessiva abertura de modernas unidades em Portugal Continental, Madeira e Açores, com particular destaque para as áreas de Laboratório - Análises Clínicas, Clínicas Médicas, Tratamento Oncológico e Saúde Mental. A motivação e o compromisso da empresa é proporcionar o acesso às melhores soluções existentes no sector da saúde, aliando uma elevada competência e especialização humana à disponibilização das tecnologias mais avançadas (1).
O LJC adotou um Sistema de Gestão da Qualidade, em que são aplicados e cumpridos os requisitos da Norma 9001:2015 da Organização Internacional de Normalização (ISO, do inglês, International Organization for Standardization), Normas para o Laboratório Clínico da Ordem dos Farmacêuticos e do Manual de Boas Práticas Laboratoriais.
Neste relatório resumo a experiência e conhecimento adquiridos nas várias áreas do laboratório, ao longo dos cerca de sete meses, mais concretamente 1080 horas, distribuídas da seguinte forma: 104 horas na Fase Pré-Analítica, 280 horas na Hematologia, 368 horas na Bioquímica e 256 horas na Microbiologia. As imagens aqui apresentadas foram obtidas a partir da bibliografia indicada, bem como dos folhetos informativos e datasheets das técnicas e equipamentos disponibilizadas pelo próprio Laboratório Dr. Joaquim Chaves, referentes especificamente ao período de estágio indicado.
Os objetivos da realização do estágio passaram por promover a integração no meio profissional, aplicando os conhecimentos adquiridos ao longo das unidades curriculares do mestrado e desenvolver capacidades como a organização, trabalho em equipa e
capacidade crítica. Este relatório descreve a metodologia utilizada em cada área, os parâmetros analisados e ainda o seu significado clínico. Por fim, é brevemente descrito o sistema de higiene e segurança no LJC, bem como o Controlo de Qualidade.
1. FASE PRÉ-ANALÍTICA - COLHEITAS E TRIAGEM
De modo a corresponder às necessidades da população, o Laboratório Dr. Joaquim Chaves conta com uma rede de mais de 150 Postos de Colheitas a nível nacional. Nestes, realiza-se a colheita das amostras biológicas, formação e informação relacionada com o material de colheita de acordo com a natureza do produto e a determinação analítica a efetuar. Todos os procedimentos das colheitas são seguidos conforme descrito abaixo, a fim de garantir a fiabilidade dos resultados (2).
Colheita de Produtos Biológicos:
Antes de realizar a colheita é importante certificar-se que o utente está em condições de a fazer (preparação prévia) e se aplicável preencher os questionários e modelos. O material utilizado deve ser todo identificado com código de barras na presença do utente e as informações clínicas relevantes devem ser referidas na Ficha Individual de Utente (3).
Sangue
A colheita de sangue deve ser efetuada durante o período da manhã e o utente deve estar em jejum (mínimo de 8h), à exceção dos casos de urgência ou quando há indicação em contrário. No entanto, nas colheitas para o estudo do Metabolismo Lipídico o jejum deve ser de 10-12h. Nos recém-nascidos e nos lactentes, a colheita deve ser feita nos 30 minutos antes da refeição.
Usar luvas descartáveis, selecionar o sistema de vácuo ou sistema de seringa-agulha, desinfetar a região a puncionar com algodão embebido em solução de Etanol a 70% (substituir o Etanol por Betadine® na determinação da alcoolemia) e aplicar o
garrote. A ordem de colheita dos tubos deve ser a seguinte (conforme recomendado pela casa comercial BD Vacutainer® e de forma a evitar contaminações):
1º Frascos para hemocultura
2º Tubos para coagulação (citrato de sódio) 3º Tubos para soro, com gel separador 4º Tubos isentos de metais
5º Tubos com heparina
Seguidamente pressionar com o algodão a zona puncionada durante alguns minutos e homogeneizar cuidadosamente por inversões sucessivas (5-10 vezes) todas as amostras colhidas para tubos com aditivos e depois colocá-las na posição vertical. As agulhas devem ser colocadas em contentos próprios para cortantes (3).
Urina
- Urina tipo II/ 2 – Exame Sumário de Urina
A colheita da urina tipo II deve ser a primeira da manhã ou com uma retenção vesical de pelo menos 4h, para um tubo próprio. Limpa-se os genitais externos, da frente para trás na mulher e a glande nos homens, ou a região perineal nas crianças. A colheita deve ser efetuada, preferencialmente 7 dias depois da administração de produtos de contraste radiológico (TAC ou ressonância magnética) (3).
- Urina assética
A colheita da urina assética deve corresponder à primeira urina da manhã ou após duas a três horas de retenção vesical. Antes de efetuar a colheita lavar as mãos, depois limpar os genitais externos, de seguida desprezar as primeiras gotas de urina e finalmente recolher o jato médio para o coletor. Deve ser enviado o coletor, estável 24h refrigerado, juntamente com o tubo com conservante, estável 24h à TA (3).
- Urina de 24h
A colheita da urina de 24h realiza-se, tal como o nome indica, durante 24h. Por exemplo, iniciando-se a colheita às 8h, esta deve ser rejeitada e a partir daí, recolhe-se toda a urina até às 8h do dia seguinte, inclusive. Antes de cada micção, limpar os genitais externos, da frente para trás na mulher e a glande nos homens, ou a região perineal nas crianças (3).
Figura 1. Sistema de vácuo da BD Vacutainer® utilizado para a colheita de sangue. a) tubo para soro b) tubo para
hemograma c) tubo para coagulação d) agulha butterfly e) agulha e adaptador de tubo de vácuo [Adaptado de (4)].
a) b) c) d)
Esperma
- Espermocultura
A colheita para espermocultura deve ser uma colheita de esperma recente após higiene prévia das mãos e órgãos genitais, com uma abstinência sexual nos 3 dias anteriores à colheita. A estabilidade é de 12h à TA (3).
- Espermograma
A colheita para o espermograma trata-se de uma colheita de esperma realizada no laboratório, que necessita de um período de abstinência sexual de 3 dias antes do exame (3).
Expetoração
A colheita da expetoração deve ser realizada de manhã, para um coletor estéril, após higiene nasal e oral apenas com água, e deve ser resultante de tosse provocada (3).
Exsudado
- Exsudado amigdalino
A colheita do exsudado amigdalino realiza-se pressionando a língua para baixo com a espátula e passando a zaragatoa sobre toda a superfície de aspeto patológico (vermelho ou com pus), evitando tocar nos lábios, língua e úvula. A zaragatoa deve ser introduzida no meio de Stuart. O doente não deve comer ou beber 2 a 3 horas antes da colheita (3).
- Exsudado Ano rectal
A colheita do exsudado Ano rectal realiza-se com um zaragatoa ao nível do reto devendo ser colocada no meio de Stuart e torna-se importante na grávida para pesquisa de Streptococcus do grupo B. É estável 24h refrigerado (3).
- Exsudado auricular
A colheita do exsudado auricular realiza-se no canal auditivo externo, com 2 zaragatoas. Uma deve ser introduzida no meio de Stuart e outra é utilizada para o esfregaço de duas lâminas. É estável 12h à TA (3).
- Exsudado faríngeo
A colheita do exsudado faríngeo realiza-se pressionando a língua para baixo com a espátula e passando a zaragatoa sobre toda a superfície de aspeto patológico (vermelho ou com pus), evitando tocar nos lábios, língua e úvula. A zaragatoa deve ser introduzida no meio de Stuart. O doente não deve comer ou beber 2 a 3 horas antes da colheita (3).
- Exsudado nasal
A colheita do exsudado nasal realiza-se introduzindo uma zaragatoa na mucosa nasal e rodando-a até encontrar resistência. Repete-se o processo na outra narina e introduz-se as zaragatoas no meio de Stuart. O Utente não deve assoar-se e a colheita é estável 24h refrigerada (3).
- Exsudado ocular
A colheita do exsudado ocular deve ser realizada com zaragatoa na parte interna da pálpebra inferior, introduzindo-a em meio de Stuart. Caso seja necessário, pode-se humedecer a zaragatoa com soro fisiológico. Devem ser feitos também dois esfregaços com outra zaragatoa. A amostra é estável 12h à TA (3).
- Exsudado uretral
A colheita do exsudado uretral deve ser realizada de manhã, antes de urinar, ou no mínimo 3h após a última micção. Colher o exsudado com uma zaragatoa e colocá-la no meio de Stuart e com outra zaragatoa realizar dois esfregaços. No caso do homem, pressionar a uretra de modo a estimular a saída de corrimento e efetuar os esfregaços. De seguida, utilizar a outra zaragatoa, colher mais corrimento e colocá-la em meio de Stuart. Quando não há corrimento introduzir uma zaragatoa fina e flexível cerca de 2 cm no meato uretral. A colheita é estável 12h a TA (3).
- Exsudado vaginal
A colheita do exsudado vaginal realiza-se após a limpeza dos genitais externos, introduz-se o espéculo estéril até expor corretamente o colo do útero e efetua-se a colheita com zaragatoa, introduzindo-a no meio de Stuart. Seguidamente utiliza-se outra zaragatoa para fazer dois esfregaços. A colheita é estável 12h à TA. Se pedido pesquisa de Chlamydia juntar também uma zaragatoa ao kit Chlamydia (3).
- Exsudado vulvar
A colheita do exsudado vulvar realiza-se passando uma zaragatoa sobre a região inflamada e realizar dois esfregaços e colocando uma segunda zaragatoa no meio de Stuart (3).
Fezes
A colheita de fezes deve ser feita para um tubo estéril, uma amostra do tamanho de uma noz. Estabilidade variável conforme a análise (3).
- Pesquisa de Sangue Oculto nas fezes
A colheita para a pesquisa de sangue oculto nas fezes não deve ser realizada durante o período menstrual nem em situações de hemorroidas com hemorragia e deve-se evitar que as fezes deve-sejam contaminadas com urina. A amostra deve deve-ser colhida com a vareta, no caso do coletor para sangue oculto (Figura 2) e é estável 7 dias refrigerada, ou deve ser colhida uma amostra do tamanho de noz, no caso do coletor estéril e é estável 3 dias refrigerada (3).
- Pesquisa de ovos, quistos e parasitas nas fezes
A colheita para pesquisa de ovos, quistos e parasitas nas fezes deve ser realizada para o coletor próprio ou para um coletor lavado e seco. A amostra é estável 3 dias refrigerada (3).
- Coprocultura
A colheita para a coprocultura deve ser realizada para um coletor com meio de transporte ou para um coletor estéril. Colocar fezes até à linha com a seta vermelha no caso do coletor com o meio de transporte, que é estável 4 dias à TA. Colocar uma amostra do tamanho de uma noz no caso do coletor estéril e entregar no próprio dia (3).
Figura 2. Tubo coletor para pesquisa de sangue oculto nas fezes para o
Triagem dos Produtos Biológicos:
As amostras colhidas nos postos próprios da Joaquim Chaves Saúde, bem como as dos postos de terceiros, de outros laboratórios e de hospitais chegam ao Laboratório à área da triagem, que é responsável pela execução e controlo da fase pré-analítica do Laboratório, nomeadamente pela receção, verificação, processamento e manipulação primária das amostras biológicas. Aqui são também registadas as falhas de colheitas e comunicadas aos postos, laboratórios ou hospitais (6).
A partir da triagem, as amostras são encaminhadas até às respetivas áreas. Nesta fase, o cobas conection modules (CCM) desempenha um papel importante, já que este aparelho automático permite a conexão com analisadores e sistemas pré-analíticos e pós-analíticos da cobas, conforme a Figura 3.
Figura 3. Cobas conection modules (CCM) e sua conexão com analisadores e sistemas pré-analíticos e
2. HEMATOLOGIA
A Hematologia é a especialidade que estuda o sangue e os seus componentes nas vertentes clínica e de laboratório, nomeadamente as células sanguíneas – eritrócitos, leucócitos e plaquetas – e os órgãos que os produzem (órgãos hemapoiéticos) – medula óssea, baço e gânglios linfáticos (8).
Ao nível da investigação hematológica, os exames complementares de diagnóstico requisitados incluem o Hemograma, a Velocidade de Sedimentação, a Hemoglobina Glicada, a Eletroforese de Hemoglobinas, a avaliação da Hemostase e Coagulação e parâmetros Imunohematolgógicos. Todos estes serão descritos de seguida.
2.1. Hemograma
O hemograma tem como objetivo analisar os elementos figurados do sangue, nomeadamente o eritrograma, o leucograma e também as plaquetas, bem como determinar os índices de cada série.
O Sysmex XN-1000™ Hematology Analyzer (Figura 4) é um equipamento hematológico que realiza a determinação destes mesmos parâmetros, utilizando a citometria de fluxo com fluorescência, que fornece informação sobre o tamanho e estrutura celulares, assim como sobre o conteúdo das células. Neste método, as células são examinadas enquanto fluem através de uma célula de fluxo muito estreita. Primeiro, a amostra de sangue é aspirada e diluída de acordo com um fator pré-determinado e é marcada com um marcador fluorescente que se liga especificamente aos ácidos nucleicos. Em seguida, a amostra é transportada para a célula de fluxo e iluminada por um laser semicondutor (=639nm), que consegue separar as células utilizando três sinais diretos:
- Luz fluorescente lateral, que indica a quantidade de DNA/RNA presente na célula.
- Luz dispersa lateralmente, que fornece informação sobre o conteúdo celular, nomeadamente núcleos e grânulos.
- Luz dispersa frontalmente, que indica o tamanho celular (9).
Células com propriedades físico-químicas similares constituem um grupo num gráfico denominado diagrama de dispersão (p.e. Figura 5).
Canal de Análise diferencial de leucócitos - WBC
O Canal de Análise diferencial de leucócitos é obtido através de uma reação citoquímica das células com um reagente que perfura as membranas celulares, deixando-as intactdeixando-as. De seguida, o DNA e o RNA intracelular são marcados com o corante de fluorescência e analisados por citometria de fluxo com fluorescência. A intensidade do sinal de fluorescência é diretamente proporcional ao conteúdo dos ácidos nucleicos presentes. O canal diferencial fornece as contagens de todas as subpopulações celulares normais de leucócitos, sinalizando também a informação referente a anomalias, nomeadamente Granulócitos imaturos (IG) e Células linfocitárias de elevada fluorescência - Linfócitos Atípicos (HFLC), conforme se verifica na Figura 6.
No canal WDF scattergram, as células são diferenciadas de acordo com a sua estrutura interna e fluorescência (9).
Neste sentido, existem seis diferentes parâmetros que descrevem uma população de células (no que diz respeito à nuvem no
diagrama):
- Tamanho da nuvem (tamanho total da população)
- Comprimento da nuvem (distância longitudinal)
- Largura da nuvem (distância transversal) - Posição (centro da nuvem)
- Momentum (forma da nuvem)
- Ângulo (direção dos eixos longitudinais)
Figura 4. Sysmex XN-1000™ Hematology Analyzer [Adaptado de (10)].
Figura 5. Gráfico WDF scattergram obtido
No canal WNR (Figura 7), a membrana celular dos eritroblastos (NRBC) é completamente lisada e apenas os seus núcleos são corados. O pH baixo do reagente estabiliza os basófilos, reduzindo ligeiramente o tamanho de todas as outras células.
(a) (b)
(c)
Figura 6. Canal de análise diferencial de leucócitos. (a) LEFT SHIFT- neutrófilos em banda e com baixa
contagem de Granulócitos Imaturos. Os Neutrófios em banda não interferem com a contagem de granulócitos imaturos. (b) Exemplo de amostra com elevada contagem de Granulócitos Imaturos (IG=7,2%). (c) Exemplo
de amostra com elevada contagem de Linfócitos Atípicos (HFLC=6,0%) [Adaptado de (9)].
Método de deteção de fluxo envolvente de corrente contínua – RBC e PLT
O analisador Sysmex XN-1000™ utiliza ainda o método de deteção de fluxo envolvente de corrente contínua para contar os eritrócitos (RBC) e plaquetas (PLT). Uma parte do sangue é separada do sangue inteiro aspirado e misturada com o diluente. Desta diluição, uma quantidade definida é enviada para a câmara de deteção, passando através de um pequeno orifício, a abertura. Cada lado da abertura apresenta elétrodos, através dos quais passa a corrente contínua (Figura 8). A resistência a essa corrente contínua varia conforme as células suspensas no diluente passam através da abertura. Esta resistência provoca uma alteração do pulso elétrico proporcional ao tamanho da célula sanguínea. Estes dados elétricos são convertidos em representações gráficas, conforme a Figura 9 (9).
O equipamento fornece também o valor do hematócrito (HCT%) através do método de acumulação da altura dos impulsos dos eritrócitos num volume fixo, conforme ilustrado na figura 10. O plaquetócrito (PCT%) é equivalente à soma dos impulsos das plaquetas que são detetadas individualmente pelo princípio da impedância e corresponde ao hematócrito dos eritrócitos (9).
Figura 8. Método de impedância utilizado no canal RBC/PLT Sysmex
XN-1000™ [Adaptado de (9)].
Método de Deteção SLS – Determinação da Hemoglobina
O método de deteção SLS de hemoglobina utiliza laurilsulfato de sódio (SLS) sem cianeto. O reagente hemolisa os eritrócitos e leucócitos da amostra e a reação inicia-se com a alteração da conformação da globina, devido à ligação dos grupos hidrofóbicos da molécula de SLS na molécula de globina e oxidando depois o grupo heme (Fe2+→ Fe3+). Os grupos hidrofílicos da molécula do SLS ligam-se então ao grupo heme, formando um complexo corado estável (SLS-HGB), conforme a Figura 11, e que é analisado fotometricamente a 555nm. Um LED emite uma luz monocromática e, ao passar pela mistura, a luz é absorvida pelos complexos SLS-HGB. A restante luz é medida por um fotossensor e é inversamente proporcional à concentração de hemoglobina da amostra (9).
Ao realizar então a contagem total dos eritrócitos, para determinar o valor da hemoglobina e do hematócrito, o equipamento calcula os restantes índices, tal como exemplificado nas seguintes fórmulas da tabela 1:
(a) (b) (c)
Figura 10. Método de acumulação da altura dos impulsos dos eritrócitos num volume fixo para
obtenção do valor do hematócrito (HCT%) [Adaptado de (9)].
Figura 11. Representação esquemática da determinação da hemoglobina pelo método de deteção SLS. (a) Alteração da conformação da globina (b) Oxidação do grupo heme (c) Ligação dos grupos hidrofílicos da molécula do SLS ao
Tabela 1. Índices eritrocitários e respetivas fórmulas [Adaptado de (11)]
Canal RET/PLT-O
No canal RET, o reagente de lise perfura ligeiramente as membranas celulares dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas, permitindo a penetração do marcador fluorescente nas células, mas deixando-as intactas. Em seguida, os ácidos nucleicos intracelulares são marcados pela fluorescência do corante e o sinal emitido é diretamente proporcional à quantidade de ácidos nucleicos dos reticulócitos. Ao utilizar a dispersão frontal de luz e o sinal de fluorescência, os reticulócitos podem então ser distinguidos das outras células. Os reticulócitos emitem um sinal de fluorescência maior que os eritrócitos (que não têm RNA) e consideravelmente inferior ao sinal dos leucócitos.
Os reticulócitos dividem-se em três categorias, de acordo com a sua intensidade de fluorescência, representando diferentes graus de maturação:
- LFR, reticulócitos de baixa fluorescência. - MFR, reticulócitos de média fluorescência. - HFR, reticulócitos de alta fluorescência.
A IRF (Fração de Reticulócitos Imaturos) reflete a proporção de reticulócitos imaturos e é calculada pela soma de MFR + HFR. A hemoglobina reticulocitária (RET-He) refere-se à medição celular direta da disponibilidade de ferro e é usada na monitorização da eritropoietina (EPO) e/ou na terapia de ferro. Se o valor aumenta, é um indicador de que a terapia está a ser eficaz (9).
O canal RET fornece também a contagem ótica de plaquetas (Figura 12).
Pârametro Fórmula Valor de
Referência
Volume Globular Médio 𝑉𝐺𝑀(𝑓𝐿) = 𝐻𝑇𝐶(𝐿/𝐿) 𝑥 𝐻𝑇𝐶 (𝐿/𝐿)
𝐺𝑉 (𝑥1012/𝐿) 80,0-97,0 fL
Hemoglobina Globular Média 𝐻𝐺𝑀(𝑝𝑔) = 𝐻𝐺𝐵 (𝑔/𝑑𝐿)
𝐺𝑉(𝑥1012)/𝐿)𝑥10 26,0-34,0 pg
Concentração de Hemoglobina
Globular Média 𝐶𝐻𝐺𝑀 =
𝐻𝐺𝐵(𝑔/𝑑𝐿)
O Sysmex XN-1000™ Hematology Analyzer fornece complementarmente alguns alarmes de modo a chamar a atenção para possíveis anormalidades. Nestes casos, são feitas lâminas de esfregaços sanguíneos automaticamente, para serem vistas ao microscópio ótico.
Os valores de referência são os seguintes:
Eritrograma (Homem/Mulher) Eritrócitos 4,30-6,40/ 3,90-5,20 x 1012/L Hemoglobina: 13,6-16,5/ 12,0-16,0 g/dl Hematócrito: 39,8-52,0/ 34,7-46,0% VGM: 80,0-97,0 fL HGM: 26,0-34,0 pg CHGM: 32,0-36,0 g/dL
Índice de dispersão eritrocitária: 11,5-15,0%
Leucograma Leucócitos: 4,0-10,0 x109/L Neutrófilos: 1,5-8,0 x109/L Eosinófilos: <0,5 x109/L Basófilos: <0,3 x109/L Linfócitos: 0,8-4,0 x109/L Monócitos: <1,2 x109/L Trombocitograma Plaquetas: 140-440 x109/L
Plaquetócrito: 0,15-0,42% VPM: 6,5-12,4 fL
Índice de dispersão plaquetária: 9,9-15,3 fL Reticulócitos: 0,5-2,5%
Hemoglobina Reticulocitária: >27,0 pg
Fração de Reticulócitos Imaturos (IRF): 3,0-14,0% Índice de Reticulócitos: 0,5-2,5%
2.2. Velocidade de Sedimentação
A velocidade de sedimentação (VS) representa a velocidade da queda dos eritrócitos existentes no sangue tornado incoagulável (citratado) e colocado num tubo estreito, graduado, vertical.
O fenómeno de sedimentação caracteriza-se por três etapas: a agregação, que corresponde à formação de pilhas de eritrócitos; a sedimentação ou queda rápida, que corresponde à queda das pilhas de eritrócitos a uma velocidade constante; e a sedimentação final, que corresponde ao seu empilhamento no fundo do tubo.
A VS é expressa pela distância percorrida pelos eritrócitos durante uma hora, em milímetros. A sua determinação é clinicamente útil em doenças associadas ao aumento de produção de proteínas de fase aguda (12).
O VES-MaticTM
Cube-200 (Figura 13) é um analisador automático para determinar a VS.A amostra a utilizar é sangue total colhido em tubo de EDTA, com volume mínimo de 1,5 mL. O equipamento realiza uma homogeneização automática, mantendo a amostra em repouso por tempo predefinido e permitindo que a sedimentação ocorra. Através de sensores analógicos, é determinado o nível de sedimentação dos eritrócitos e calculado automaticamente o valor. As leituras são efetuadas por feixe de luz visível e os resultados são obtidos em 26 minutos e comparáveis com os obtidos pelo método de Westergren em 1 hora (13).
Por vezes, recorre-se ao Método de Westergren modificado, conforme a figura 14, para fazer a confirmação de resultados muito elevados obtidos com o VES-MaticTM
Cube-200 ou quando a quantidade de amostra não é suficiente. Nestes casos, dilui-se 1 ml da amostra de sangue total colhido em tubo de EDTA em citrato de sódio na proporção de 4 volumes de sangue para 1 volume de anticoagulante. Depois introduz-se a pipeta de Westergren, graduada de 0 a 150 mm, no suporte adequado e em posição vertical, inicia-se a contagem no cronómetro e deixa-inicia-se 1 hora à temperatura ambiente. Ao fim de 1 hora
faz-se a leitura em milímetros, ao nível da coluna dos glóbulos que se separam do plasma (14).
Os valores de referência para a VS são os seguintes: – 20 mm/h no Homem
– 30 mm/h na Mulher – 10 mm/h na criança
Valores superiores a 120 mm/h são reportados como 120 mm/h.
2.3. Hemoglobina Glicada (HbA1c)
A hemoglobina é a principal proteína no interior dos eritrócitos e quando os níveis de glicose no sangue estão altos, parte desta proteína é sujeita a uma reação química não enzimática com a glicose em excesso.
A ligação entre a HbA e a glicose é um tipo de glicação não-enzimática, contínua, lenta e irreversível. A quantidade de hemoglobina glicada que é formada depende assim da concentração de glicose no sangue e do tempo de vida médio dos eritrócitos (cerca de 120 dias). Desta forma, a medida da quantidade de glicose ligada à hemoglobina pode fornecer uma avaliação da glicémia média no período de 90 a 120 dias antes da análise (16).
Os sistemas automáticos D-100™ System e o VARIANT™ II TURBO Hemoglobin Testing System (Figura 15) utilizam a tecnologia de Cromatografia Líquida de alta eficiência (HPLC) com troca iónica, em que a coluna é composta por uma resina de troca catiónica de fase reversa. O aparelho é capaz de utilizar uma amostra de sangue
Figura 13. Aparelho VES-MaticTM Cube-200 [Adaptado de
(13)]. Figura 14. Método de Westergren modificado
total em tubo com anticoagulante EDTA e de a diluir, hemolisar e remover a base de schiff (HbA1c lábil), permitindo a obtenção de resultados precisos para HbA1c (17, 18).
O doseamento da hemoglobina glicada é importante para o diagnóstico da diabetes, bem como na monitorização do controle glicémico. Esta análise apresenta vantagens em relação à determinação da glicemia em jejum uma vez que não é necessária a condição de jejum, o seu valor não é influenciado pela ingestão alimentar ou prática de exercício recente, não sofre alterações em casos de stress ou doença e tem ainda uma maior estabilidade.
Os valores de referência para a hemoglobina glicada são os seguintes: - 5,7-6,4%: risco de diabetes mellitus
- >6,4%: diabetes mellitus
2.4. Eletroforese das Hemoglobinas
A eletroforese de hemoglobinas tem como objetivo separar e quantificar os diferentes tipos de hemoglobinas presentes no sangue periférico, com o interesse de diagnosticar patologias que envolvem formas anormais de hemoglobina (hemoglobinopatias) (19).
Os tipos de hemoglobina mais comuns são a hemoglobina A (maior percentagem de hemoglobina encontrada nos adultos), a hemoglobina F (principal hemoglobina presente no feto e no recém-nascido e após o nascimento decresce e é substituída pela HbA) e a hemoglobina A2 (encontrada em pequenas quantidades nos adultos).
Figura 15. Sistemas automáticos para determinação da HbA1c a) D-100™ System e b) VARIANT™ II
TURBO Hemoglobin Testing System [Adaptado de (17,18)]).
As hemoglobinopatias podem ser classificadas como hemoglobinopatias qualitativas - resultantes de alterações na estrutura das globulinas, onde se inclui as variantes de hemoglobina HbS, HbC, HbE e HbD - ou quantitativas - em que há ausência ou diminuição da síntese das cadeias globínicas originando talassémias (20).
Sempre que é pedida a Eletroforese das Hemoglobinas, o LJC recorre ao sistema automático VARIANT™ II TURBO Hemoglobin Testing System (Figura 15) que utiliza a tecnologia de HPLC com troca iónica, em que a coluna é composta por uma resina de troca catiónica de fase reversa. A amostra utilizada é sangue total em tubo com anticoagulante EDTA. A análise da área sob a curva dos picos de absorção obtidos fornece a percentagem relativa a cada fração detetada (Figura 16). O tempo de eluição, ou de retenção, de qualquer hemoglobina presente é comparado com o de hemoglobinas conhecidas, permitindo a quantificação tanto das hemoglobinas normais A, F e A2, como de outras variantes. Deve-se ter em consideração que existem variantes com tempos de retenção semelhantes, por isso a identificação é presuntiva. Para identificar definitivamente a Hb é necessário recorrer à análise do DNA ou dos aa da cadeia de globina.
A drepanocitose e as talassemias são as hemoglobinopatias mais comuns mundialmente.
A drepanocitose resulta de uma mutação no gene que codifica a cadeia β-globina, sendo detetada na eletroforese pela presença da HbS. Esta hemoglobina pode estar presente em quantidades moderadas, indicando que se trata de um portador heterozigótico, ou em grandes quantidades (juntamente com presença de HbF e ausência
Figura 16. Resultados das percentagens de hemoglobinas obtidos por HPLC com
de HbA), indicando que se trata de um portador homozigótico, causando uma anemia hemolítica grave (20).
As talassemias podem ser classificadas de acordo com o tipo de cadeia globina afetada. Caso a deficiência se verifique na síntese das cadeias alfa, trata-se de uma α-talassemia, se for na cadeia β trata-se de uma β-talassémia. Estas hemoglobinopatias podem ainda ser classificadas como talassémia minor (um gene com defeito) ou talassémia major (dois genes com defeito). A presença de β-talassémia minor na electroforese é detectada pela diminuição do pico de hemoglobina A e aumento da hemoglobina A2 e HbF, e a β-talassémia major pela ausência da hemoglobina A, acompanhada de níveis elevados de hemoglobina fetal F (20).
Níveis elevados de Hb F também se verificam numa condição rara denominada persistência hereditária de hemoglobina fetal, um distúrbio hereditário assintomático.
Podem ainda ser detetadas outras hemoglobinopatias como a hemoglobinopatia C e a hemoglobinopatia E, no entanto, são menos frequentes.
Os valores de referência para as hemoglobinas são os seguintes: Hemoglobina A – 96-98%
Hemoglobina A2 – 1,5-3,5% Hemoglobina F – 0-1%
2.5. Avaliação da Hemostase e Coagulação
A Hemostase é um processo fisiológico complexo que protege o sistema vascular aquando de uma lesão, de forma a preservar a integridade da circulação e limitar a perda de sangue. Este processo envolve vasos sanguíneos e células endoteliais, plaquetas e proteínas plasmáticas e pode ser divido em três fases: Hemostase primária (avaliada pela contagem de plaquetas, Agregação Plaquetária e Tempo de Hemorragia), Hemostase secundária (avaliada pelo Tempo de Protrombina, Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada, Fibrinogénio, Tempo de Trombina, Proteína C, Proteína S, ATIII e Fatores de Coagulação) e Fibrinólise (avaliada pelos D-dímeros e Plasminogénio) (22).
A avaliação da hemostase torna-se então muito importante por auxiliar na compreensão do estado do indivíduo quanto a este conjunto de mecanismos fisiológicos por meio dos quais ocorre a paragem de uma hemorragia, incluindo a vasoconstrição, a agregação plaquetária e a coagulação.
O BCS® XP System (Figura 17) é um aparelho automático que realiza testes funcionais para a avaliação da hemostase e da coagulação, com processamento de análises
coagulométricas, cromogénicas e de química imunológica, através do método de fotometria/turbidimetria e recorrendo a uma amostra de plasma obtido em tubo de citrato. Este método utiliza uma fonte de luz intermitente de xénon com um filtro, que permite obter um feixe com comprimento de onda desejado. A luz é direcionada em partes iguais através de um canal de medição e um canal de referência. Ao passar pela cuvete, o feixe de luz diminui de intensidade devido à difusão por partículas ou à absorção na solução. Durante o processo de coagulação, a preparação torna-se cada vez mais turva e, por sua vez, a intensidade é menor. Nas análises cromogéneas, durante a reação é libertado um pigmento, reduzindo a quantidade de luz que passa pela cuvete. A luz desviada é bloqueada por um sistema de diafragma e a luz que passa no outro canal é direcionada até ao segundo detetor. O equipamento tem a capacidade de medir dois pontos por segundo, por cuvete, sendo a intensidade da luz convertida em sinal elétrico.
Tempo de Protrombina (TP) e INR
O TP permite avaliar a via extrínseca da cascata de coagulação através dos fatores V, VII, X, protrombina (II) e fibrinogénio (I). A determinação deste parâmetro baseia-se na adição da tromboplastina tecidular ao plasma do doente, na presença de iões cálcio, iniciando-se assim a ativação da via extrínseca. Com isto, verifica-se a conversão do fibrinogénio em fibrina, sendo que o tempo até à formação deste mesmo coágulo de fibrina é medido em segundos. O resultado é apresentado em tempo (segundos), taxa de protrombina (%) e INR (Razão normalizada Internacional) e é muito requisitado para monitorização de anticoagulantes orais, excluindo os novos anticoagulantes que não requerem monitorização (NOACS). Este último torna-se importante já que podem ser
utilizados diferentes reagentes durante o método e desta forma o resultado obtido é padronizado. O INR é assim calculado do seguinte modo:
𝐼𝑁𝑅 = [ 𝑇𝑃 (𝐷𝑜𝑒𝑛𝑡𝑒)
𝑇𝑃(𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜𝑠)]
𝐼𝑆𝐼
(ISI – Índice de Sensibilidade Internacional, que varia de lote para lote entre 1,0 e 1,4) Nestes casos, os valores de referência são os seguintes:
- INR 2,0-3,0 – profilaxia de TVP recorrente, embolia pulmonar e doenças arteriais (incluindo enfarte agudo do miocárdio).
- INR 3,0-4,5 – prevenção da embolia sistémica recorrente e para válvulas cardíacas artificiais. (22)
Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (aPTT)
O aPTT é o tempo necessário para a formação de um coágulo de fibrina num plasma com citrato. A determinação deste valor consiste na incubação a 37ºC da amostra de plasma com uma quantidade otimizada de fosfolípidos, sílica e iões de cálcio, iniciando a ativação da via intrínseca da coagulação e desencadeando a formação do coágulo. A sua determinação permite detetar anomalias dos fatores envolvidos na via intrínseca: os fatores II, V, VIII, IX, X, XI e XII. Esta análise é ainda útil para a monitorização da terapêutica com heparina. (22)
Os valores de referência são os seguintes: - 26-40 s
- RN: 26-60 s
Fibrinogénio
O Fibrinogénio (Fator I) é uma proteína sanguínea produzida pelo fígado que tem um papel importante na formação do coágulo. Níveis baixos de fibrinogénio podem significar deficiências adquiridas, como a proteólise intravascular do fibrinogénio pela trombina, ou congénitas, como em casos de afibrinogenemia ou hipofibrinogenemia. Níveis temporariamente elevados são encontrados devido ao comportamento do fibrinogénio como proteína de fase aguda. (22)
Os valores de referência são os seguintes: - 150-400 mg/dl
Tempo de Trombina (TT)
O TT é o tempo necessário para que o fibrinogénio da amostra seja convertido em coágulo de fibrina, através da adição de trombina bovina purificada. Este valor é inversamente proporcional à quantidade de fibrinogénio da amostra. (22)
O valor de referência é o seguinte: - 30 s
Proteína C
A Proteína C (PC) é um inibidor da coagulação dependente da vitamina K e que regula a atividade dos fatores V e VIII. Para determinar a quantidade de PC funcionalmente ativa, utiliza-se um substrato cromogénico e cujo produto da reação é lido a 405 nm. A deficiência congénita de PC origina manifestações trombóticas graves, quando em homozigotia. (22)
Os valores de referência são os seguintes: - 64-128%
- RN: 17-53%
Proteína S
A Proteína S (PS) é uma proteína plasmática dependente da vitamina K que atua como cofator da Proteína C ativada na inativação dos fatores Va e VIIIa. Circula no plasma sob a forma livre ativa e sob a forma inativa ligada à proteína de ligação C4b. A deficiência congénita de PS origina manifestações trombóticas graves, quando em homozigotia, e risco elevado de desenvolvimento de trombose venosa em jovens, quando em heterozigotia. (22)
Os valores de referência são os seguintes: - 60-124%
- RN: 12-61%
D-dímeros
Os D-dímeros são produtos de degradação de fibrina ligados transversalmente gerados por fibrinólise reativa. Neste teste, partículas de polistireno covalente com Ac monoclonal reagem com os D-dímeros da amostra, aglutinando. Essa mesma aglutinação é detetada turbidimetricamente pelo aumento da turvação. Este teste é importante para a exclusão de eventos tromboembólicos como trombose venosa profunda ou embolismo pulmonar. Níveis aumentados estão associados ao risco de eventos tromboembólicos recorrentes após interrupção da terapêutica anticoagulante oral (22).
Os valores de referência são os seguintes: - <0,55 g/ml
Plasminogénio
O Plasminogénio é uma proenzima da plasmina e é convertido nesta pelos ativadores internos (uroquinase) ou pelos ativadores externos (estreptoquinase). Utiliza-se um subtrato cromogénico para determinar o plasminogénio biologicamente ativo e o produto da reação é lido a 405 nm. Este teste é requisitado para avaliar desordens fibrinolíticas e para controlo da terapia. Níveis diminuídos estão associados a doenças hepáticas e fibrinólise terapêutica. Níveis elevados relacionam-se com carcinomas e diabetes mellitus (22).
Os valores de referência são os seguintes: - 77-122 %
2.6. Imunohematologia
A imunohematologia é a área que estuda os antigénios presentes nos eritrócitos, os anticorpos correspondentes e o seu significado clínico e relaciona-se ainda com a medicina transfusional.
O ORTHO AutoVue® Innova System (Figura l8) é um equipamento automático para a realização de testes imunohematológicos numa amostra de sangue total. Utiliza o método de aglutinação em coluna (reação de aglutinação Ag-Ac). As colunas contêm reagentes e esferas de vidro e, através da centrifugação de cassetes, os eritrócitos aglutinados formam uma camada no topo da mistura (formação de precipitado), enquanto que os não aglutinados depositam-se na parte inferior da coluna.
