HELENTON CRISTHIAN BARRENA
AVALIAÇÃO DA CETOGÊNESE EM PERFUSÃO DE
FÍGADO DE RATOS DIABÉTICOS SUBMETIDOS À
HIPOGLICEMIA DE CURTO PRAZO INDUZIDA POR
INSULINA
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Ciências
Biológicas (Área de concentração -
Biologia Celular e Molecular) da
Universidade Estadual de Maringá,
para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Biológicas.
Maringá 2009
AVALIAÇÃO DA CETOGÊNESE EM PERFUSÃO DE
FÍGADO DE RATOS DIABÉTICOS SUBMETIDOS À
HIPOGLICEMIA DE CURTO PRAZO INDUZIDA POR
INSULINA
Prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte – Orientador
Profª. Drª. Vilma A F Godoi Gazola - Co-orientador
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Barrena, Helenton Cristhian
B271a Avaliação da cetogênese em perfusão de fígado de ratos diabéticos submetidos à hipoglicemia de curto prazo induzida por insulina / Helenton Cristhian Barrena. -- Maringá : [s.n.], 2009.
32 f. : il.
Orientador : Prof. Dr. : Roberto Barbosa Bazotte. Co-orientadora: Prof. Dr.: Vilma A. F. Godoi Gazola
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Celular e Molecular, 2009.
1. Diabetes - Corpos cetônicos. 2. Diabetes - Cetogênese. 3. Diabetes - Hipoglicemia - Insulina. 4. Diabetes tipo 1. I. Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Celular e Molecular. II. Título.
BIOGRAFIA
Helenton Cristhian Barrena nasceu em Maringá, PR, em 03 de março de 1980. Durante o período de graduação, na condição de bolsista do CNPq
desenvolveu atividades de iniciação científica no grupo de pesquisa do prof. Dr.
Roberto Barbosa Bazotte. Licenciado em Ciências Biológicas pela
Universidade Estadual de Maringá – UEM (2006) deu prosseguimento a sua
formação científica na condição de mestrando junto ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas da mesma universidade. Possui experiência
na área de Biologia Celular e Bioquímica, atuando principalmente nos
seguintes temas: Diabetes, Hipoglicemia Induzida por Insulina e Metabolismo
AGRADECIMENTOS
À Deus, minha fonte de amor;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Roberto B. Bazotte, que abriu as portas para que
eu pudesse ingressar no mundo da pesquisa e cuja paciência e dedicação
contribuíram para a realização deste trabalho;
A minha co-orientadora, Profª. Drª. Vilma A F Godoi Gazola, que com muito
carinho, empenho e toda paciência do mundo me ensinou praticamente tudo
que sei dentro do laboratório, tornando-se uma referência pessoal e
profissional para mim;
Às professoras de Fisiologia Humana, Rosângela e Montserrat, do
Departamento de Ciências Morfofisiológicas, pela transmissão de
conhecimentos nos momentos em que a dúvida se fazia presente;
Às técnicas Elizete e Valéria, do laboratório de Fisiologia Humana, que desde a
iniciação científica partilham momentos de trabalho e, principalmente, alegria;
Aos companheiros de trabalho dos laboratórios de Fisiologia Humana e
Farmacologia Endócrina da Universidade Estadual de Maringá: Carlos
Eduardo, Solidalva, Fabiana, Adriana, Ananda, Franciele, Julio, Paulo, Antônio,
Ao grande amor da minha vida, Leriane, que nos últimos dois anos tem
partilhado comigo momentos bons e ruins, sonhos e realidades;
À minha mais nova paixão, Beatriz Fernanda, minha sobrinha de dois anos,
que sendo tão pequena me mostra a grandeza e perfeição de Deus em suas
obras;
Ao Departamento de Ciências Morfofisiológicas, em especial ao laboratório de
Fisiologia Humana, pelo acolhimento e apoio;
Ao Departamento de Bioquímica, em especial aos professores e técnicos do
laboratório de metabolismo hepático, pelo auxílio nas horas de necessidade;
Aos mestres e amigos do programa de pós-graduação em Biologia Celular e
Molecular;
Aos amigos e amigas Jeferson, João Paulo, Henrique, Mayse, Érica, Alyne,
pelos momentos que passamos juntos;
Àqueles que ao passar pelas nossas vidas, sutilmente, deixam marcas em
nossos corações...
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação de Mestrado foi redigida na forma de um artigo
científico “Ketogenesis evaluation in perfused liver of diabetic rats submitted to short term insulin-induced hypoglycaemia”. Este estudo representa a continuidade dos trabalhos desenvolvidos pelo grupo de pesquisa
do Laboratório de Farmacologia Endócrina que investigam os mecanismos de
manutenção e recuperação da glicemia durante hipoglicemia induzida por
insulina (HII) e, de certa forma, é uma extensão do trabalho “Gluconeogenesis
and ketogenesis in perfused liver of rats submitted to short-term insulin-induced
hypoglycemia”, que investigou a contribuição da administração oral de glicerol,
lactato e piruvato para recuperação da glicemia, além de avaliar a capacidade
cetogênica hepática durante a administração de octanoato em ratos não
diabéticos submetidos a HII de curto prazo. No presente estudo investigou-se a
capacidade cetogênica hepática durante a administração de octanoato
(precursor de corpos cetônicos) em ratos diabéticos submetidos à HII de curto
prazo. Esse trabalho tem grande importância, pois ajuda a explicar a
exagerada taxa de cetogênese durante a fase de recuperação da hipoglicemia
em pacientes diabéticos. Em consonância com as normas estabelecidas pelo
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o artigo foi redigido de
acordo com as normas da revista Cell Biochemistry and Function.
RESUMO GERAL
INTRODUÇÃO – A hipoglicemia induzida por excesso de insulina administrada e a
hipercetonemia resultante da severa deficiência de insulina são as principais
complicações agudas de pacientes diabéticos tipo 1. Além disso, pacientes diabéticos
tipo 1 mostram uma exagerada cetogênese após a hipoglicemia induzida por insulina
(HII). Considerando que a cetogênese elevada é o principal fator para o
desenvolvimento da cetoacidose diabética, a obtenção de informações sobre a
capacidade cetogênica hepática durante a HII pode ajudar a entender a fisiopatologia da
cetoacidose nestes pacientes. Dentro deste contexto, demonstramos em estudo anterior
que a capacidade hepática em produzir acetoacetato e ß-hidroxibutirato a partir de
octanoato durante a HII em ratos não-diabéticos foi mantida. No entanto, há uma
carência em estudos mostrando o efeito da HII sobre a cetogênese hepática em ratos
diabéticos. OBJETIVOS – Uma vez que o diabetes induzido pela aloxana constitui
modelo adequado para o estudo do diabetes tipo 1, nos propomos investigar a
capacidade cetogênica hepática a partir de octanoato em ratos diabéticos submetidos à
HII de curto prazo. Além disso, considerando que a administração de glicose reduz a
cetogênese, decidimos avaliar, através do mesmo protocolo, o efeito da oferta oral de
glicose sobre a capacidade cetogênica hepática. MATERIAIS E MÉTODOS –
Utilizamos nesse estudo ratos machos Wistar (Rattus norvegiccus) pesando entre
180-220 g. O diabetes foi induzido por injeção intravenosa de aloxana (40 mg kg-1
dissolvida em salina). Os ratos diabéticos foram jejuados a partir das 8 h da manhã e os
experimentos começaram 24 h depois. Os procedimentos experimentais seguiram as leis
brasileiras de proteção de animais e foram aprovados pelo comitê de ética. A HII em
ratos diabéticos (grupo HII) foi obtida por injeção intraperitoneal (i.p) de insulina
regular (1.0 U kg-1). O grupo controle (grupo COG) recebeu o mesmo volume de salina.
Um grupo adicional que recebeu glicose via oral (gavagem) (100 mg kg-1) 15 min após
injeção de insulina (grupo HII + glicose) foi incluído nos estudos. Uma vez que a HII
está bem estabelecida 15 min após injeção de insulina, este foi o tempo escolhido para a
administração oral de glicose (100 mg kg-1) (grupo HII + glicose). Trinta minutos após
injeção de insulina ou salina os ratos foram anestesiados com injeção i.p de tiopental
sódico (40 mg kg-1). Após laparotomia, foi coletado sangue da veia cava para
determinação da concentração sanguínea de acetoacetato e ß-hidroxibutirato. Os fígados
perfundidos in situ usando sistema de perfusão livre de hemoglobina. Amostras do
líquido efluente da perfusão foram coletadas em intervalos de 5 min e a concentração de
acetoacetato e ß-hidroxibutirato foram determinadas. A diferença na produção de corpos
cetônicos antes e durante a infusão de octanoato permitiu calcular a área sob a curva
(AUC), expressa em µmol g-1
. Foi realizada a infusão de concentrações crescentes de
octanoato (0.15 mM, 0.30 mM e 1.50 mM) até que o nível saturante fosse alcançado, ou
seja, a menor concentração do precursor na qual a máxima produção de corpos
cetônicos era obtida. A produção máxima de corpos cetônicos, alcançada com octanoato
0.30 mM, o qual reflete a capacidade hepática máxima de produzir acetoacetato +
ß-hidroxibutirato a partir de níveis saturantes de octanoato, foi obtida tanto para o grupo
COG quanto para o grupo HII. RESULTADOS – A administração de insulina e
insulina + glicose em ratos diabéticos diminuiu (p<0.05) a concentração sanguínea de
glicose (COG vs. grupo HII e COG vs. grupo HII + glicose), mas a concentração de
corpos cetônicos no sangue não foi alterada (COG vs. grupo HII e COG vs. HII +
glicose). A cetogênese hepática basal, ou seja, antes da infusão de octanoato, mostrou
diminuída (p<0.05) produção de β-hidroxibutirato e β-hidroxibutirato + acetoacetato no
grupo que recebeu insulina (COG vs. grupo HII) ou insulina + glicose (COG vs. grupo
HII + glicose). A razão β-hidroxibutirato:acetoacetato diminuiu (p<0.05) no grupo que
recebeu insulina (COG vs. grupo HII), mas não se modificou no grupo que recebeu
insulina + glicose (COG vs. Grupo HII + glicose). Por outro lado, a produção de
acetoacetato apresentou-se diminuída (p<0.05) no grupo que recebeu insulina + glicose
(COG vs. Grupo HII + glicose), mas sem alterações no grupo que recebeu apenas
insulina (COG vs. grupo HII) (Table 3). A cetogênese hepática durante infusão de
octanoato, ou seja, produção de β-hidroxibutirato e β-hidroxibutirato + acetoacetato, não
difere (COG vs. grupo HII e COG vs. grupo HII + glicose). Além disso, fígados do
grupo HII mostraram menor (p<0.05) produção de acetoacetato e maior (p<0.05) razão
β-hidroxibutirato:acetoacetato (HII vs. grupo COG e HII vs grupo HII + glicose).
DISCUSSÃO – Os resultados demonstraram que apesar de a insulina inibir a
cetogênese hepática basal, a concentração sanguínea de corpos cetônicos não foi
influenciada pela administração da mesma. Assim, é provável que o aumento na
liberação de hormônios contrarreguladores durante HII sobrepõe o efeito inibitório da
insulina e/ou glicose sobre a cetogênese hepática em ratos diabéticos, como mostrado
anteriormente em ratos não-diabéticos. Além disso, a cetogênese basal (antes da infusão
ratos HII (HII vs. grupo COG) e essa redução foi intensificada pela administração oral
de glicose. Isto ocorreu provavelmente devido ao mais intenso efeito inibitório residual
da insulina do que propriamente dos hormônios contrarreguladores sobre o complexo
carnitina aciltransferase o qual está envolvido no transporte de ácidos graxos de cadeia
longa através da membrana mitocondrial. Além do mais, a intensificação do efeito
anti-cetogênico da insulina após administração de glicose oral pode ser consequência do
aumento transitório da glicemia, o qual promove uma redução dos níveis sanguíneos
dos hormônios contrarreguladores e conseqüente redução da atividade cetogênica.
Assim, para simular uma acelerada mobilização de ácidos graxos livres do tecido
adiposo, como ocorre no diabetes tipo 1 não tratado com insulina, fígados isolados
foram infundidos com uma concentração saturante de octanoato. A infusão de octanoato
provocou um aumento acentuado na produção de ß-hidroxibutirato como conseqüência
da maior disponibilidade de equivalentes redutores mitocondriais, demonstrado pelo
aumento da razão ß-hidroxibutirato:acetoacetato. No entanto, estes resultados não
podem ser atribuídos à reação da carnitina aciltransferase, uma vez que o octanoato
entra na mitocôndria por um mecanismo independente da carnitina. Em suma, a
capacidade cetogênica a partir do octanoato em fígados de ratos diabéticos não foi
afetada pela administração de insulina (grupo HII) ou insulina mais glicose (grupo HII +
glicose) em comparação ao grupo COG. CONCLUSÕES – Os resultados obtidos
sugerem que apesar de a insulina inibir a cetogênese, fígado de ratos submetidos a HII
de curto prazo apresentam mantida capacidade de produzir acetoacetato e
ß-hidroxibutirato a partir do octanoato. Além disso, nossos dados são de grande interesse
uma vez que ajudam a explicar a exagerada taxa de cetogênese durante a fase de
recuperação da hipoglicemia em pacientes diabéticos e sugerem um controle mais rígido
dos níveis sanguíneos de ácidos graxos livres e de corpos cetônicos durante o
GENERAL ABSTRACT
INTRODUCTION – Hypoglycaemia induced by excess of administered insulin
and hyperketonemia developed as consequence of severe insulin deficiency are the main
acute complication in type 1 diabetic patients. Moreover, type 1 diabetic patients shown
an exaggerated ketogenesis after insulin induced hypoglycemia (IIH). Considering that
elevated ketogenesis is the main factor for the development of diabetic ketoacidosis,
information about the hepatic ketogenic capacity during IIH could help to understand
the pathophysiology of ketoacidosis in type 1 diabetic patients. In this context, we
previously demonstrated that during short term IIH the ability to produce acetoacetate
and ß-hydroxybutyrate from octanoate in livers of non diabetic rats was maintained.
However, studies showing the effect of short term IIH on liver ketogenesis in diabetic
rats are lacking. AIM - Since alloxan-diabetic rats is a suitable animal model of type 1
diabetes we investigated the hepatic capacity to produce ketone bodies from octanoate
in livers from diabetic rats submitted to short term IIH. Moreover, considering that
glucose administration reduces ketogenesiswe also evaluated the effect of oral glucose
on the liver capacity to produce ketone bodies in alloxan-diabetic rats submitted to short
term IIH. MATERIAL AND METHODS - Male Wistar rats (Rattus norvegiccus),
weighing 180-220 g were used in this study. Diabetes was induced by intravenous
alloxan (40 mg kg-1 dissolved in saline). The diabetic rats were food deprived from 8:00
a.m. and the IIH protocol started 24 h later. The experimental procedures followed the
brazilian laws on the protection of animals and were approved by the Ethics Committee.
IIH in diabetic rats (IIH group) was obtained with an intraperitoneal (i.p) injection of
regular insulin (1.0 U kg-1). Diabetic control group (COG group) received an equal
volume of saline. An additional group which received oral glucose (gavage) (100 mg
kg-1) 15 min after insulin administration (IIH + glucose group) was included. Since IIH
was well-established 15 min after insulin injection this time was selected for the oral
administration of glucose (100 mg kg-1) (IIH + glucose group). Thirty min after the
administration of insulin or saline the rats were anesthetized with i.p sodium thiopental
(40 mg kg-1). After laparotomy, blood was collected from the cava vein for the
determination of the blood concentration of acetoacetate and ß-hydroxybutyrate. Livers
from 24 h fasted diabetic rats, 30 min after receiving insulin or saline, were perfused in
situ using haemoglobin-free liver perfusion. Samples of the effluent perfusion fluid
ß-hydroxybutyrate were determined. The differences in the concentration of ketone bodies
production during and before the infusion of octanoate allowed to calculate the area
under the curves (AUC), expressed as µmol g-1. Liver infusion of octanoate up to a
saturating concentration (0.15 mM, 0.30 mM and 1.50 mM) were done. The addition of
increasing concentrations of octanoate augmented the rate of ketone bodies production
until a saturating level was reached, i.e., the lowest concentration at which the maximal
ketone bodies production was obtained. The maximal ketone bodies production, i.e.,
0.30 mM, which reflects the liver capacity to produce acetoacetate + ß-hydroxybutyrate
from a saturating level of octanoate were obtained not only to COG but also to IIH
group. RESULTS - Insulin and insulin plus glucose administration in diabetic rats
decreased (p<0.05) the blood concentration of glucose (COG vs. IIH group and COG vs.
IIH + glucose group), but those of ketone bodies remained unchanged (COG vs. IIH
group and COG vs. IIH + glucose group). Liver ketogenesis before octanoate infusion
(basal values) shown decreased (p<0.05) β-hydroxybutyrate production and β
-hydroxybutyrate + acetoacetate production in the group which received insulin (COG
vs. IIH group) or insulin + glucose (COG vs. IIH + glucose group). The β
-hydroxybutyrate:acetoacetate ratio was decreased (p<0.05) in the group which received
insulin (COG vs. IIH group) but unchanged in the group which received insulin +
glucose (COG vs. IIH + glucose group). On the other hand, the acetoacetate production
was decreased (p<0.05) in the group which received insulin + glucose (COG vs. IIH +
glucose group) but unchanged in the group which received insulin (COG vs. IIH group)
(Table 3). Liver ketogenesis during octanoate infusion, i.e., β-hydroxybutyrate
production, β-hydroxybutyrate + acetoacetato, was not different (COG vs. IIH group
and COG vs. IIH + glucose group). Moreover, livers from IIH group showed lower
(p<0.05) acetoacetate production and higher (p<0.05) β-hydroxybutyrate:acetoacetate
ratio (IIH vs. COG group and IIH vs IIH + glucose group). DISCUSSION - Our results
demonstrated that in spite the fact that insulin inhibits liver ketogenesis, the blood levels
of ketone bodies were not influenced by the administration of insulin. Thus, it seems,
that the increased release of counterregulatory hormones during IIH overcome the
inhibitory effect of insulin and/or glucose on liver ketogenesis also in diabetic rats, as
previously demonstrated to non diabetic rats. The basal ketogenesis (i.e., before
octanoate infusion) from endogenous fatty acids was clearly decreased in livers of IIH
rats (COG vs. IIH group) and this change was intensified by oral glucose administration
inhibitory effect of insulin than counteregulatory hormones on carnitine acyltransferase
complex wich is envolved in the transport of long-chain fatty acids across the
mitochondrial membrane. Moreover, the intensification of the antiketogenic effect of
insulin after oral glucose administration could be the consequence of the transitory
increase of glycemia which promotes a decreasing in the blood levels of
counterregulatory hormones and their ketogenic activities. In addition, to simulate an
accelerated mobilization of free fatty acid from adipose tissue, as occurs in type 1
diabetes not treated with insulin, isolated livers were infused with a constant and
saturating concentration of octanoate. The infusion of octanoate caused a sharp increase
in ß-hydroxybutyrate production as consequence of the higher availability of
mitochondrial reducing equivalent, demonstrated by the increased
ß-hydroxybutyrate:acetoacetate ratio. However, these results could not be attributed to the
carnitine acyltransferase reaction, since octanoate enters in the mitochondria by a
carnitine independent mechanism. In summary, the ketogenic capacity from octanoate
in livers from diabetic rats was not affected by insulin (IIH group) or insulin plus
glucose administration (IIH + glucose group) in comparison with COG group.
CONCLUSION - Taken together, the results suggest that in spite the fact that insulin
inhibits ketogenesis, livers from rats submitted to short term IIH showed maintained
capacity to produce acetoacetate and ß-hydroxybutyrate from octanoate. Also, our data
is the of great interest because they help to explain the exaggerated rates of ketogenesis
during the recovery phase of hypoglycemia in diabetic patients and suggest a more rigid
