Sensoresebiossensores_MestradoPoli_Rosana_16_10_14.pdf

Universidade de Pernambuco

Programa de PósGraduação em Engenharia de Sistemas

-PPGES

BIOSSENSORES: FUNDAMENTOS,

POTENCIALIDADES E APLICAÇÕES

Profa. Dra. Rosana Fonseca

Objetivo Geral:

Fornecer subsídios para que os alunos sejam capazes de

entender e aplicar os princípios e fundamentos dos

biossensores aliados às técnicas eletroanalíticas na

realização de análises quantitativas e qualitativas em

diferentes meios com a utilização de diferentes

superfícies eletródicas.

Objetivos Específicos:

 Introduzir os fundamentos de técnicas eletroanalíticas, sensores e

biossensores;

Demonstrar a influência da otimização das técnicas

eletroanalíticas nas análises e na obtenção do limite de detecção;

Discutir as diferentes possibilidades de uso das superfícies eletródicas;

O uso de novos dispositivos, como os eletrodos quimicamente modificados;

 Demonstrar a importância da etapa de preparação da amostra e o tempo total de análise;

Objetivos Específicos:

Sensores químicos/eletroquímicos

 Definição

 Classificação

 Células eletroquímicas

 Eletrodo de trabalho  Eletrodo de referência  Eletrodo auxiliar

 Eletrodos quimicamente modificados

Métodos eletroquímicos de análise

Teste de eletroatividade e determinação do potencial de trabalho

 Escolha da técnica eletroanalítica

 Otimização dos parâmetros da técnica

 Construção de curvas de trabalho e determinação do limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)

Objetivos Específicos

Biossensores

 Definições dos biossensores

 Desenvolvimento dos biossensores  Classificação dos biossensores

 Escolha do material biológico

 Formas para imobilização de biomoléculas  Escolha do transdutor mais adequado;

Sensores químicos/eletroquímicos e biossensores

A Idéia Geral de um Método Instrumental

Métodos eletroquímicos

i trás a informação

sobre a concentração

t i

i

Fonte de tensão

Métodos eletroanalíticos

Métodos analíticos baseados em medidas elétricas;

Medidas eletroquímicas são específicas para diferentes estados de oxidação;

Métodos de alta sensibilidade;

Instrumentação relativamente barata e simples; permite automação;

Informações a respeito da atividade;

Microeletrodos _– análise in vivo;

Biossensores;

Considerações práticas



Eletrodos

Celas eletroquímicas

Eletrólito suporte

instrumentação

Sensores químicos

Dispositivos que transformam uma informação

química de uma determinada espécie em um

sinal analítico.



Reconhecimento

relacionado com uma

interação química



Transdução

conversão do sinal

físico-químico

Sensores químicos

Características de

um sensor ideal:



Resposta rápida e reversível;



Elevada sensibilidade, seletividade e reprodutibilidade;

Sensores químicos

Classificação de acordo

com a transdução



Térmicos:

utilizam o calor como parâmetro físico.



Eletroquímicos:

se baseiam na transferência de elétrons.

1.

Amperométricos:

medem a corrente produzida em uma

reação química.

2.

Potenciométricos:

medem o

potencial significativo no

eletrodo operante por acúmulo da carga na superfície do

eletrólito.

3.

Condutimétricos:

medem a condutividade.

Sensores químicos



Óticos

:

são baseados nas mudanças das propriedades

ópticas do reagente imobilizado através de medidas de

reflexão, dispersão, difusão de luz, refração e difração.



Piezoelétricos (acústicos):

baseiam-se na diferença de

frequência de vibração de um cristal devido à deposição de

massa na superfície de um eletrodo. É detectada por um

frequencímetro e convertida em unidades de massa.

Sensores eletroquímicos

_{Muito utilizado}



Potenciométricos: fazem medidas da diferença de potencial

entre dois eletrodos imersos em uma solução.

Célula eletroquímica = eletrodos + solução

Potencial:



eletrodo de referência

potencial constante

Sensores químicos



Amperométricos: fazem medidas da diferença de corrente

entre 2 eletrodos imersos em uma solução.

Célula eletroquímica = eletrodos + solução

Potencial constante

Corrente varia

A corrente varia proporcionalmente à

concentração de um analito de interesse

Sensores químicos



Amperométricos:

Três eletrodos:

Eletrodo de

referência (potencial

constante; Ag/AgCl)

Eletrodo auxiliar ou

contra-eletrodo (ex:

Pt)

Eletrodo de trabalho

(ex: ouro; carbono

vítreo)

N

2 1 3

Sensores químicos

Amperométricos: tipos

Sensores químicos

J. Chil. Chem. Soc, 57, No_{4 (2012), págs.: 1336-1139}

Amperométricos: medidas

Sensors (Basel). 2009; 9(7): 5368–5378.

Sensores químicos

_{Mais utilizados}

Tipo de Sensor Potenciométrico Amperométrico Modo de operação Medida de potencial a

i=0

Medida de corrente Cinética do eletrodo Deve ser rápida O potencial do eletrodo

conduz a reação Resposta Potencial é função

exponencial da concentração

Corrente é função linear da concentração

Voltametria/Polarografia

A polarografia se enquadra na voltametria.(Koltoff e Laitinen).

1922: Jaromir Heyrowsky (Nobel 1959) apresentou pela primeira vez a polarografia.

Inicialmente, uma célula de dois eletrodos (indicador ou de trabalho e referência) era utilizada. O potencial variava linearmente entre o potencial inicial e o final e a corrente que fluía entre os dois eletrodos era monitorada.

1. A voltametria envolve a medida de corrente obtida sob condições que favorecem a polarização do eletrodo de trabalho, em função do potencial aplicado.

Celas eletroquímicas

Eletrodos de trabalho

Eletrodo de ouro Eletrodo de

Instrumentação

Frequencímetro _{Potenciostato + microbalança de cristal de quartzo} (EQCM)

Ag magnético

N

Potenciostato/galvanostato

Registrador/ computador

2 1 3

1.Elet. de trabalho 2.Elet. de referência 3.Elet. auxiliar Pt (fio)

Instrumentação:

1. Potenciostato/galvanostato acoplado a um

microcomputador dotado com o programa GPES.

Célula Eletroquímica:

1. Compartimento único e/ou encamisada para controle da temperatura

2. Tampa em Teflon®

adaptada para encaixe dos eletrodos

Eletrodos:

1. Referência: Ag/AgCl (em KCl 3,0 mol L-1)

Influência do O₂ dissolvido em solução

Quando se trabalha na região catódica, há necessidade da remoção do

oxigênio atmosférico dissolvido nas soluções. Isto porque o O₂ é eletroativo e produz duas ondas voltamétricas, uma com potencial ao redor de -0,10V

vs SCE e a outra com potencial ao redor de -0,75V vs SCE.

A primeira onda catódica é devido à reação:

O₂+ 2H₂O + 2e- _H

2O2+ 2OH

-Os gases mais usados para remover o O₂ das soluções são: N₂, Ar e He. O Nitrogênio é o mais usado por ser mais barato e poder ser facilmente

obtido com pureza alta.

A segunda onda catódica (E~ -1,0V vs SCE)é devido à reação:

-Métodos eletroquímicos de análise



Surgem como alternativa simples e de baixo custo.



Possibilitam a análise de amostras contendo partículas sólidas

dispersas.



Medidas confiáveis

pré-tratamento mínimo da

amostra; monitoramento in situ.



Concentração do analito

Corrente, potencial,

condutividade, resistência e

carga elétrica.

Técnicas eletroanalíticas

Impedimétrico

TEMPO

POTE

NC

IAL

Principais técnicas eletroanalíticas

Polarografia Voltametria cíclica Voltametria de redissolução anódica

Técnicas eletroanalíticas

Polarografia

Voltametria cíclica

Voltametria de redissolução anódica

Amperometria

Voltametria de pulso diferencial

Técnicas eletroanalíticas

Polarografia

Voltametria cíclica

Voltametria de redissolução anódica

Amperometria

Voltametria de pulso diferencial

Técnicas eletroanalíticas

Polarografia

Voltametria cíclica

Voltametria de redissolução anódica

Amperometria

Voltametria de pulso diferencial

Técnicas eletroanalíticas

Voltametria cíclica

Clássica para:

 Testes de eletroatividade

 Estudos mecanísticos

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 Corrente/  A

Técnicas eletroanalíticas

Voltametria de onda quadrada - SWV



 A corrente faradaica pode ser coletada em um intervalo de tempo adequado para que a contribuição da corrente capacitiva tenha se minimizado.

 É possível, pela observação dos sinais das varreduras direta e inversa, se obter as informações análogas àquelas obtidas utilizando-se a VC.

 Dá informações sobre a cinética e mecanismo do processo eletródico.

Técnicas eletroanalíticas

Teste de eletroatividade.

 Escolha da técnica.

 Variação dos parâmetros da técnica.

 Curvas de trabalho e limite de detecção - LD.

 Comparação com técnicas convencionais (ex.: Elisa, Cromatografia).

Técnicas eletroanalíticas

A eletroquímica estuda

São reações químicas onde ocorre troca de elétrons entre os reagentes, resultando na redução de um deles e na oxidação de outro.

Oxidante: a espécie que recebe elétrons (ocorre aumento no estado de oxidação;

Redutor: a espécie que doa elétrons (ocorre diminuição no estado de oxidação)

Reação Redox: A + B A+ _{+ B}

-Obs. Não se pode dizer que uma espécie é oxidante ou redutora, pois seu

comportamento depende do meio em que está presente. Ela só será um redutor se no meio reacional houver uma outra espécie que possa receber elétrons.

Durante uma reação de oxidação-redução ocorre variação do estado de oxidação das espécies envolvidas na reação.

As reações redox podem ser consideradas em duas semi-reações separadas

Exemplo:

Semi-reações:

Redução: ClO- _{+ 2e}- _Cl- _{agente oxidante}

Oxidação: NO₂- _NO

3- + 2e- agente redutor

Reação global: ClO- _{+ NO}

2- NO3- + Cl

-Estados de oxidação X

A reação pode ser qualitativamente realizada pela escolha adequada do potencial (ou energia) aplicado na superfície do eletrodo.

Neste caso, em uma solução aquosa

contendo as espécies eletroativas “A” e “B”, apenas A seria oxidada.

Porém, se o potencial for alto o suficiente, ambas “A” e “B”serão oxidadas na superfície do eletrodo.

Controle de reações redox

Em uma reação sobre um eletrodo, basicamente, pode-se controlar duas variáveis:

1. Potencial: pode-se adequadamente aplicar um potencial específico (ou energia) no eletrodo e, com isso, é possível escolher qual a reação que será realizada na superfície do eletrodo.

2. Corrente: pode-se controlar a taxa de uma reação redox, ou seja, fixando o valor de corrente (número de elétrons por unidade de área) que deverá ser fornecida (no caso de uma reação de redução) ou recebida (reação de oxidação) em um determinado intervalo de tempo. Este tipo de reação também é conhecida como galvanostática = corrente constante.

Controle de reações redox

Célula Galvânica:

Células onde ocorre a produção de energia

O Potencial de 1,1 V indica que o sistema está longe do equilíbrio. Assim, a reação prosseguirá no sentido da dissolução do eletrodo de Zn e depósito de Cu até que o equilíbrio seja atingido, ou seja, o potencial indicado no voltímetro seja ZERO volts.

Célula Eletrolítica:

Contrariamente às células galvânicas,

as células eletrolíticas consomem

energia

Assim, se no caso anterior conectarmos o terminal negativo de uma fonte de tensão ao eletrodo de Zn e aplicarmos um potencial maior que 1,1 V, forçaremos a reação a prosseguir no sentido inverso, ou seja, o cobre do anodo se dissolverá e Zn se depositará no catodo:

Cu0 _{+ Zn}2+ _Cu2+_{+ Zn}0

Quando um metal é imerso em uma solução aquosa, imediatamente se inicia a reação, com formação dos íons em solução e com a

permanência dos elétrons no metal.

Elétrons carregam eletricamente o metal;

Criação de um campo elétrico;

Íons carregados positivamente, tendem a ficar retidos na vizinhança do metal;

Formação da dupla camada elétrica;

O metal é responsável pela formação da dupla camada e é chamado de eletrodo.

Dupla Camada Elétrica: transferência de cargas na interface eletrodo-eletrólito para que haja a red./ox. de um determinado íon sobre a superfície do eletrodo.

Na interface metal-solução há uma distribuição de cargas elétricas tal que uma diferença de potencial se estabelece entre o metal e a solução. A magnitude dessa diferença de potencial é dependente do sistema em consideração.

O potencial gerado por uma célula eletroquímica, depende:

• Temperatura absoluta;

• Concentração das espécies envolvidas;

• Pressão parcial (no caso de gases).

Ao contrário da técnica galvanostática, a escolha de um potencial adequado pode fornecer um maior controle da reação a ser desenvolvida no eletrodo.

Potencial de eletrodo

Para que ocorra o equilíbrio entre os potenciais químicos, ocorre a difusão de A para a superfície do eletrodo e a difusão de M para o seio da solução.

Potencial de eletrodo

 A cronoamperometria é a técnica amperométrica que mede a

corrente que flui através do eletrodo de trabalho em função do tempo em um potencial constante.

 Esse fluxo de corrente está correlacionado com o gradiente de

concentração das espécies oxidadas ou reduzidas na superfície do eletrodo de trabalho e é calculada por meio da equação de Cottrell:

Onde: i é a corrente a um tempo t, n é o número de elétrons, F é a constante de Faraday, A é a área do eletrodo, C é a concentração das espécies oxidadas e D é o coeficiente de difusão das espécies oxidadas.

Esta técnica, a cronoamperometria, é largamente empregada em

eletroanalítica, onde a intensidade de corrente é diretamente proporcional à concentração da espécie eletroativa no seio da solução.

O valor do potencial gerado por uma célula eletroquímica, depende em maior parte:

 Natureza dos eletrodos

 Cada eletrodo possui um potencial característico associado a um

determinado processo redox, determinado por condições padrão.

 O potencial das espécies redox depende da:

(1)Temperatura padrão 25 _°C (298,15 K);

(2)Concentração unitária para todas as espécies e solução envolvidas; (3)Pressão de 1 atm para todas as espécies gasosas envolvidas.

Série eletroquímica

_–

potencial padrão de eletrodo

 Condições padrão:

P = 1 atm; T = 25o_{C; [H}+_{] = 1 M.}

Quanto mais positivo o potencial

de redução de uma reação, quando comparada com outra

reação, maior é a tendência desta reação ocorrer neste sentido.

Seja EMo _{e EM}+ _{o potencial do metal num ponto remoto da solução.}

Assim, a diferença de potencial dentro da dupla camada será:

EM = EMo _{– EM}+

 A medida do valor absoluto dessa diferença de potencial é inviável,

pois qualquer que seja o sistema de medida adotado, o mesmo implicará a imersão dentro da solução de um terminal metálico que irá dar origem a um outro eletrodo. O que se faz é medir uma diferença de potencial relativa com relação a um eletrodo de referência.

 Convencionou-se, assim, definir um eletrodo de referência padrão

(universal), de potencial _“zero” (0,000 V), com relação ao qual todas as medidas de potencial que seriam referidas, porém, não necessariamente medidas. Trata-se do eletrodo padrão de hidrogênio, que consiste de uma barra de platina platinizada imersa em uma solução ácida padrão (1 mol/L), mantida a 25o_{C e através da qual se}

 Houve necessidade da escolha de um eletrodo de referência, pois

não era possível a determinação do potencial isolado de uma meia-célula.

 O eletrodo padrão de hidrogênio (EPH) foi escolhido como eletrodo

de referência universal, ao qual foi atribuído o potencial de 0,000 V em qualquer temperatura.

Potencial padrão de eletrodo

 Eletrodo gasoso, onde uma placa de platina

platinizada atua como suporte para o gás hidrogênio, fornecido sob pressão de 1 atm

A solução desta meia-célula é formada por H₂SO₄

A outra meia-célula é formada por um eletrodo

metálico (ex. Zn0), imerso em solução de seus íons

 E° = 0,000 V tanto para reação de redução como

 O potencial do eletrodo em teste, é denominado potencial padrão de

redução do respectivo eletrodo (E_°Mn+/M).

Este potencial será positivo sempre que este eletrodo possuir maior

tendência para redução que o eletrodo de hidrogênio, ou seja, a reação global da célula é:

Mn+

(aq) + n/2 H2(g) M(s) + n H+(aq) EPH = anodo

Caso o eletrodo de hidrogênio tenha maior tendência para redução

que o eletrodo em teste, tem-se a reação global é:

M_(s) + n H+

(aq) Mn+(aq) + n/2 H2(g) EPH = catodo

O potencial global da célula é definido pela fórmula:

Assim, para o primeiro caso, tem-se:

E_°célula = E_°Mn+_/M – _{0,000 E}°

célula = E°Mn+/M = positivo

E_°célula = positivos reação espontânea

Para o segundo caso:

E_°célula = 0,000 _– E_°Mn+_{/M E}°

célula = E°Mn+/M = negativo

E_°célula = negativos reação não-espontânea

 A espontaneidade de uma reação está relacionada com a energia livre.  As seguintes relações devem ser avaliadas para se determinar se uma

reação eletroquímica será ou não espontânea.

G_° = - nFE_°

G_° < 0 _– reação espontânea, quando E_° > 0 G_° > 0 _– reação não espontânea, quando E_°<0 G_° = 0 _– reação em equilíbrio, quando E_°=0

 Quanto mais positivo o valor de E° da célula, mais negativo torna-se o

valor de _ΔG°. Isto é, quanto mais afastadas as semi-reações estiverem na escala de potencial, mais fortemente a reação será favorecida no sentido de formação dos produtos.

 Potencial de Eletrodo fora das Condições Padrão

Pode-se ter a célula eletroquímica em temperaturas diferentes de 25_°C e/ou concentrações diferentes da unidade para as espécies químicas envolvidas nas reações eletródicas;

Nestes casos, o potencial da célula ou da semi(meia)-célula será definido pela equação de Nernst, que é:

E_célula = potencial da célula nas condições experimentais

E_°célula = potencial da célula nas condições padrão

R = constante dos gases ideais = 8,314 J mol L-1 _K-1

T = temperatura absoluta = Kelvin

F = constante de Faraday = 96485 C (um Faraday é a quantidade de carga elétrica transportada por um mol de elétrons)

n = número de elétrons envolvidos na reação redox equilibrada

Q = quociente da reação (expressão que relaciona as concentrações dos produtos e dos reagentes elevadas a potência apropriada, conforme definido pelos coeficientes estequiométricos na equação global balanceada.

A espontaneidade de reação e o potencial

Tem-se que:

Potencial do eletrodo fora das condições padrão

E_célula = E_°célula - (RT/nF) x ln Q qualquer temperatura

ou

 Ag/AgCl, KCl saturado 0,222 V  Depósito Ag/AgCl

 Solução de KCl (3,0 M)  Fio de platina

 Extremidade porosa (troca de íons)

Depósito Ag/AgCl

Solução de KCl (3,0 M)

Fio de platina

Extremidade porosa (troca de íons)

Eletrodo de referência

Medida de corrente é realizada entre o eletrodo de trabalho e o auxiliar

Metal condutor e inerte

Placa ou fio de Platina

Contato

Tubo de vidro

Vidro fundido

Resina epóxi

Fio de cobre

Ponto de solda

Terminação de platina

Quando um íon se move de um lugar para outro, o transporte de massa no interior do eletrólito é descrito por três diferentes processos:

Difusão: movimento espontâneo dos íons sob influência do gradiente de concentração, ou seja, de regiões de maior concentração para regiões de menor concentração, tendendo a anular o gradiente de concentração.

Migração: movimento das partículas carregadas que estão sob influência de um campo elétrico externo.

Convecção: transporte de massa devido ao gradiente de densidade do fluido (convecção natural), ou devido a movimentos de vibração e rotação dos eletrodos (convecção forçada)

Transporte de massa

Os processos de difusão e convecção podem ocorrer para todas as espécies presentes no eletrólito, entretanto a migração ocorre apenas para partículas eletricamente carregadas .

Durante o processo de redução dos íons no catodo (considerando íons positivos e a célula eletrolítica) há uma diminuição na concentração na interface, levando ao surgimento do gradiente de concentração, que por sua vez, é responsável pelo processo de difusão dos íons da região mais concentrada para a região menos concentrada.

O fluxo das espécies pode ser obtido pela primeira lei de Fick para a difusão, e pode ser escrita como:

Onde:

𝐽(_𝑥) é o fluxo das espécies (_{𝑚𝑜𝑙 𝑠}−1_𝑐𝑚−2₎ 𝐷 é o coeficiente de difusão (_𝑐𝑚2_𝑠−1₎

𝜕𝐶 ( _𝑥) / _𝜕𝑥 é o gradiente de concentração (_{𝑚𝑜𝑙 𝑐𝑚}−4₎

 A lei de Fick descreve bem o fluxo das espécies quando o gradiente de

concentração é o parâmetro de maior relevância na equação do fluxo das espécies.

 Entretanto, na presença de um sobrepotencial aplicado externamente é

necessário considerar também o efeito da migração iônica, pois há fluxo de espécies devido à presença do campo elétrico. Isso leva a adição de um termo extra na lei de Fick, que pode ser reescrita como:

Onde o termo t_N (i/nF) representa a contribuição da migração iônica no fluxo total e

t_N = é o número de transporte

i = é a densidade de corrente (A _𝑐𝑚-2₎

F = constante de Faraday (C mol-1₎

 Eletrólito suporte

 Para que o efeito da migração iônica seja diminuído ou quase anulado, faz-se necessário utilizar um sal inerte, ácido ou base, escolhido de maneira apropriada para a faixa de sobrepotencial em que se deseja trabalhar

O sal é adicionado ao eletrólito em altas concentrações fazendo com que o número de transporte tenda a zero para as espécies eletroativas, pois o número de transporte representa a fração de corrente transportada por cada íon

Este número deve ser o menor possível para que o processo seja basicamente controlado por difusão

Biossensores

Problema enfrentado com o uso de sensores químicos tradicionais

Por que modificamos o eletrodo?

A modificação é efetuada para alcançar propriedades eletroquímicas diferentes do eletrodo

“puro”

 Uma vez modificado, podemos alterar a composição/arquitetura do depósito para que estas “novas” propriedades sejam potencializadas

 Estas propriedades são basicamente relacionadas com aspectos cinéticos da transferência

de elétrons (catálise) ou para que efeitos difusivos sejam aumentados

 Economia de materiais e energia

Passivação da superfície (devido a adsorção de produtos da própria reação)

Alternativa simples e de baixo custo BIOSSENSORES

sores

IUPAC:_” um biossensor é um dispositivo capaz de fornecer

informação analítica usando um elemento de

reconhecimento biológico o qual está em contato direto com um elemento de _{transdução”}

Considerações

Componente biológico Subgrupo dos sensores químicos (reconhecimento)

Material biológico conectado a um transdutor

Converte um sinal biológico em sinal elétrico

Desaparecimento de reagente

Aparecimento do produto da reação entre o material

biológico e seu substrato

Analito Elemento de

Ilustração adaptada: MENDES, R. K. Tese (Doutorado)-Instituto de Química, Unicamp, 2006.

Nariz eletrônico: responsável pelo cheiro = instrumento

excepcionalmente sensível e seletivo, muito difícil de “imitar”

artificialmente.

 Pode distinguir entre muitas substâncias químicas diferentes

qualitativamente e pode dar uma idéia geral de quantidade até limites muito baixos.

 Os produtos químicos a serem detectados passam através da membrana

olfativa que são os componentes biológicos que detectam o substrato.

 A resposta é um sinal elétrico que é transmitido para o cérebro por meio

dos nervos olfativos. O cérebro, então, traduz esta resposta na sensação que conhecemos pelo cheiro.

Língua: percepção de diferentes sabores = quimiorrecepção

Os receptores gustativos são ativados por substâncias químicas

presentes nos alimentos

 Essa propriedade química está ligada ao aroma e sabor e ela

existe porque precisamos distinguir e classificar tudo que ingerimos

 A maior quantidade de quimiorreceptores se encontra na língua, e

o que permite a diferenciação de sabor são os sensores dos terminais nervosos presentes nas papilas gustativas que nos permite degustar e diferenciar os mais diferentes sabores.

 1º eletrodo enzimático - Clark e Lyons (1962)

Imobilização da enzima glicose oxidase entre duas membranas

O analito (glicose) e o oxigênio atravessam a primeira membrana para

reagir com a enzima

O oxigênio penetra na segunda membrana (permeável) e difunde até o

eletrodo (redução sobre a platina, -0,7V aplicado entre o catodo de Pt e o anodo de Ag = amperométrico)

[glicose] ~ diminuição da quantidade de oxigênio (consumido na reação

enzimática)

Histórico

Biosensors: an Introduction, 1997, Brian R. Eggins –Wiley, second edition

Reação:

Updike e Hicks (1967): melhoraram este biossensor (imobilização da

glicose oxidase por aprisionamento em matriz de poliacrilamida)

Guilbault e Montalvo (1969)

 Construíram o primeiro biossensor potenciométrico para a uréia imobilizando a enzima urease em uma matriz de poliacrilamida sobre um eletrodo de vidro seletivo a íons amônio

 A uréia é hidrolisada pela enzima urease, formando amônia e dióxido de

carbono. O potencial é proporcional a concentração de amônia, que é diretamente proporcional à concentração de uréia.

CO(NH₂)₂ + H₂O CO₂ + 2NH₃

O eletrodo íon-seletivo de amônio é um eletrodo de pH de vidro modificado. A enzima é misturada a um gel revestido por uma membrana de rede de nylon que recobre o eletrodo. Ele é conservado em meio de outra membrana (diálise) .

 Biossensores in vivo

Muitos experimentos foram realizados por meio da implantação de eletrodos no cérebro de animais vivos, para monitorar as mudanças nos níveis de dopamina

 Biossensor para dopamina

A determinação quantitativa de dopamina é aumentada com a utilização de biossensores específicos para a dopamina, evitando assim, o efeito de matriz, como a interferência do ácido ascórbico

 Biossensor construído com banana

Uma mistura simples de uma pequena quantidade de pó de grafite modificado com pó a base de banana e parafina líquida gera um biossensor para a

determinação de dopamina.

A dopamina é um derivado do catecol

A enzima polifenol oxidase presente na banana catalisa a oxidação do grupo

di-hidroxila, para formar quinona, na presença de O₂

A redução eletroquímica da quinona gera novamente o catecol e a corrente

gerada é diretamente proporcional à concentração de dopamina. (Sidwell and Rechnitz, 1985; Wang and Lin, 1988).

Polifenol

oxidase -2 e

-+ 2H+

eletrodo

Dopamina

 Analito ou substrato

Qualquer substância que é consumida ou produzida em um

processo bioquímico pode ser analisada por um biossensor.

 Alguns exemplos são:

Açúcares fosfato

Uréia colesterol

Creatina penicilina

Etanol paracetamol

Ácido glutâmico aspirina

Ácido lático pesticidas*

 Componente Biológico

 A importância do componente biológico é que a sua interação com

o substrato é altamente específica, evitando interferências de outras substâncias presentes no sistema.

O componente biológico pode catalisar uma reação (ex. enzima –

substrato) ou ligar-se seletivamente ao substrato.

 Podem ser considerados das seguintes formas:

Enzimas

Microorganismos (ex. bactérias e leveduras) Anticorpos

Ácidos nucléicos

 Construção do biossensor

Envolve as seguintes etapas:

(1) Escolha do material biológico

(2) Imobilização do material biológico

(3) Escolha do transdutor mais adequado

 Deve detectar apenas um reagente ou produto específico

Primeira etapa: Escolha do material biológico

Deverá reagir seletivamente com o analito de interesse

Purificada

Enzimas Tecido vegetal Extrato bruto

‡ Enzimas

Proteínas que funcionam como catalisadores biológicos

 Uso crescente na química analítica alta sensibilidade e especificidade

eliminação do efeito de matriz

 A reação enzimática para um único substrato pode ser representada

pela expressão:

E + S ES E + P

1 Região Fab

2 Região Fc

3 Cadeia pesada com um domínio variável (VH1) seguido por um domínio constante

CH1, uma região dobradiça e dois domínios

constantes (CH2 e CH3)

4 Cadeia leve com uma região de domínio variável (VL) e um constante (CL)

5 Sítio de ligação do antígeno (paratopo)

6 Regiões dobradiças

Componentes biológicos

‡ Anticorpos

Proteínas que se ligam especificamente a outras proteínas (antígenos)  Uso crescente na química analítica alta sensibilidade e especificidade

eliminação do efeito de matriz

Stobiecka, e Hepel, Biosensors and

Bioelectronics 26 (2011).

Changes of apparent mass vs. time during binding of: (1) glutathione and (2) glutathione-capped AuNP, on a AuQC/AHT/Abmono/BSA modified gold piezoelectrode.

The design of an electrochemical and

nanogravimetric immunosensor with positive potential barrier for the detection of

glutathione-capped AuNP.

d a

b c S

N N C C S N N C C S S A u Au

S N

N C C

PBS buffer, pH9.0 AuNP

A u

SH SH S S

A u Au

PBS buffer, pH 7.2 Cystamine

NH2

H2N S S S NH2 S NH2 S NH2 S S A u Au

1,6-hexanedithiol HS SH 1. Glutaraldehyde 2. Anti-TnT O O 3. Glycine

Schematic of functionalized immunosensor

ag + ac

k

ag - ac

k

K

K

K

=

=

Ag - Ac

Componentes biológicos

‡ Ácidos nucléicos – DNA

Polímeros de nucleotídeos que apresentam estrutura em fita dupla

emparelhadas

 Uso crescente na química analítica alta sensibilidade e especificidade

 A reação de emparelhamento de bases obedece a exata seqüência de

Elemento de reconhecimento

Vantagens Desvantagens

Enzimas 1. formam complexos estáveis

com a espécie de interesse 2. são bastante seletivas

1. podem perder a atividade após imobilização

2. são estáveis por um período relativamente curto de tempo

Anticorpos 1. são altamente seletivos 2. são bastante sensíveis

3. a ligação com o anticorpo é muito estável

1. não possuem efeito catalítico

2. o imunocomplexo antígeno-anticorpo formado é

irreversível na maioria das vezes

Ácidos nucléicos 1. são bastante específicos 1. baixas correntes são geradas

Receptores 1. muito utilizados em análises

específicas

1. biossensores difíceis de

construir

2. possuem custo muito elevado

Método interessante

facilita a recuperação no meio de reação

↓

↑

Obs.: A imobilização não deve desnaturar o centro ativo da enzima!!!

Componentes biológicos

As técnicas mais comuns são:

Técnicas de imobilização

1. Oclusão ou apriosionamento

 Aprisionamento da enzima nos espaços intersticiais de polímeros

2. Microencapsulamento _– entre membranas

 Enzimas são confinadas em pequenas esferas (micro cápsulas) de

membranas semipermeáveis com poros de 5 a 300 _μm.

 Difere da anterior, pois permite o aprisionamento de um volume ou nº

3. Adsorção Física

 Interação física simples no substrato, por ex. entre a enzima e a

superfície da matriz (interações do tipo polar, iônico, hidrofóbico

 Superfícies dos suportes são geralmente ativas e funcionam como

4. Ligação Covalente

Baseado na ligação covalente de grupos funcionais não

ativos da enzima a grupos reativos ligados na superfície do suporte insolúvel

 Suportes insolúveis mais utilizados: Polímeros sintéticos:

5. Ligação Covalente Cruzada

 Formação de partículas macroscópicas devido a LCC entre as moléculas da enzima e/ou molécula do suporte inerte com reagentes funcionais.

 Reagentes bifuncionais tem sido muito usados.

Tipo de Imobilização Vantagens Desvantagens

Oclusão 1. podem ser utilizados diversos

materiais

2. preservação da atividade biológica

1. o efeito do tamanho dos poros dos

materiais pode comprometer a adsorção

2. perda da biomolécula por lixiviação Adsorção 1. simples

2. realizados em condições brandas 3. menos destrutiva para o material

biológico

1. ligações das biomoléculas são

dependentes do pH, solvente e temperatura

2. alta taxa de lixiviação para a

solução, comprometendo a estabilidade do sistema

Ligação Covalente 1. complexo estável

biomolécula-substrato

2. lixiviação das moléculas é

minimizada

3. maior sensibilidade

1. procedimentos mais laboriosos

com consumo de tempo

2. possibilidade de perda da atividade

biológica do material

Ligação Covalente Cruzada 1. procedimentos simples

2. forte ligação química das moléculas 3. dificuldade de controle da reação

1. pode ocorrer falta de rigidez da

Desempenho analítico

 Estabilidade: diretamente relacionado com o tipo de

imobilização

Oclusão, microencapsulamento, adsorção física úteis

para 50-100 determinações depende do grau de cuidado dispensado na preparação do polímero ou do material empregado

 Ligação covalente e covalente cruzada geralmente

Tempo de resposta geralmente controlado pela espessura

da camada do material biológico imobilizado. Para se obter uma resposta, o substrato deve:

Difundir do seio da solução até a superfície do biossensor.

Difundir através da membrana externa e reagir com o sítio ativo do

material biológico

Os produtos formados devem difundir -se até a base do sensor

Seletividade depende do grau de pureza e da

seletividade do material biológico usado para construir o biossensor.

As enzimas têm especificidade variada para seus substratos. A

glicose oxidase, a urease, etc., são muito específicas. Por outro lado, a L-aminoacido oxidase, a penicilase, a álcool oxidase, etc., possuem baixa especificidade, levando a uma diminuição da

seletividade dos biossensores que as contém

Transdutor deve responder a um dos reagentes consumidos ou

Biossensores de Primeira Geração: Clark e Lyons

Monitora-se o consumo de reagentes ou a formação dos produtos.

Classificação de acordo com o material biológico

Consumo de O₂ ou a formação de

Biossensores de Segunda Geração

Mediadores artificiais livres em solução ou imobilizados juntamente com o material biológico (enzima)

Biossensores de Terceira Geração

Transferência direta de elétrons entre a superfície do eletrodo e o centro ativo da enzima

 Estabelecem um contato elétrico entre a biomolécula e o eletrodo por

meio do seguinte mecanismo

o mediador sofre um processo redox, reconduzindo-se a seu estado fundamental, para em seguida sofrer um processo redox inverso na superfície do eletrodo, sendo também reconduzido a seu estado fundamental, completando um ciclo que restaura a biomolécula e o mediador

 Se comportam como mensageiro “que conta ao eletrodo inerte” o que

se passou no interior do componente biológico, amplificando o sinal elétrico

 Recurso usado para aumentar a seletividade em biossensores

amperométricos, uma vez que a presença de catalisador ou mediador possibilita um potencial de trabalho numa região próxima de 0 V (pois aumenta a cinética de transferência), mais imune a interferências de outras espécies eletroativas.

Para serem utilizados como mediadores redox, os compostos devem possuir as seguintes características:

Reagir rapidamente com a enzima

Apresentar cinética de transferência de elétrons reversível Baixo potencial de regeneração

Propriedades eletroquímicas independentes do pH Ser estável tanto na forma oxidada como na reduzida Não reagir com oxigênio

Não ser tóxico.

As enzimas desempenham a função de catalisar diversas

reações biológicas

 Podem aumentar a velocidade de uma reação por um fator de

1014 _{quando comparada a uma reação não catalisada}

 Portanto, as enzimas apresentam um alto grau de especificidade

por seus substratos, aceleram reações químicas específicas

 A maioria atua em soluções aquosas e em condições controladas

de temperatura e pH.

É a parte da enzimologia que estuda a velocidade das reações

enzimáticas e os atores que influenciam nesta velocidade. A cinética de uma enzima é estudada avaliando-se a quantidade de produto formado ou a quantidade de substrato consumido por unidade de tempo de reação

 Os princípios gerais da cinética das reações químicas se aplicam às

reações catalisadas por enzimas, porém mostra-se também um aspecto distinto que não se observa usualmente em reações não-enzimática, a saturação com o substrato.

Efeito da concentração de substrato na velocidade da reação (concentração de enzima constante).

 Observa-se que em uma concentração baixa de substrato, a velocidade inicial da reação (v0) é proporcional à concentração do substrato, desta forma a reação é considerada de primeira ordem com relação ao substrato

 Com o aumento da concentração do substrato a velocidade inicial da reação se reduz, não

sendo mais proporcional à concentração do substrato, desta forma a reação é de ordem mista

 Posteriormente, com o aumento da concentração do substrato, a velocidade da reação

A equação de Michaelis-Menten expressa a relação entre a velocidade de uma reação

enzimática e a concentração do substrato, podendo ser facilmente deduzida a partir da reação acima, onde milissegundos após a enzima e o substrato serem misturados, uma concentração ES é obtida e permanece constante enquanto a concentração de S estiver em excesso e k₁ for maior que k₃

 Essa condição é chamada estado estacionário da reação, uma vez que a velocidade de

decomposição de ES se iguala à sua velocidade de formação.

 Considerando que a velocidade máxima (V_máx) é atingida quando os centros ativos das enzimas estiverem completamente saturados com o substrato, a velocidade inicial (V) será, então, proporcional à concentração de enzima presente,

onde:

•V é a velocidade observada a uma dada concentração substrato [S]

• K_m é a constante de Michaelis, expressa em unidades de concentração (mol L-1) •Vmáx é a velocidade máxima na concentração de saturação do substrato

Equação de Michaelis-Menten

Fatores que Influenciam na Velocidade de uma Reação Enzimática

Temperatura: Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da

reação, até se atingir a temperatura ótima; a partir dela, a atividade volta a diminuir, por desnaturação da molécula.

pH: Como na temperatura, existe um pH ótimo, onde a

distribuição de cargas elétricas da molécula da enzima e, em especial do sítio catalítico, é ideal para a catálise. Ponto isoeletrônico.

 Exemplo de análise de desempenho de um biossensor enzimático.

Para o biossensor Au-CYS-TTF-GOx-GLU, calculou-se a constante aparente de Michaelis-Menten (K_Mapp_{) com base na curva analítica obtida}

experimentalmente.

 De acordo com a equação de Michaelis-Menten, a cinética enzimática pode ser

descrita em princípio por:

V = K₂[GOx] [glicose] / K_M + [glicose]

Para a construção dos eletrodos é desejável obter mais baixo valor de K_M e V mais elevado. Em outras palavras, quanto menor o K_M maior a atividade enzimática.

 Por meio de uma relação recíproca, a equação inicialmente descrita por

Lineweaver-Burk relaciona os valores de correntes obtidos a partir do gráfico I vs concentração de glicose (C) dado por:

1 / I_ss = 1 / Imax + K_Mapp _{/ I}

max C

onde, I_ss é a corrente de estado estacionário após adição de glicose, I_max é a corrente máxima obtida após a saturação da curva e C é a concentração de glicose da solução. Obteve-se K_Mapp _{= 4,16x10}-2 _{mol L}-1_.

Esse valor de K_Mapp _{é alto, em comparação com a literatura. Isto se deve,}

provavelmente, a não saturação completa dos sítios ativos da GOx, não permitindo que esta catalise eficientemente a oxidação da glicose.

Classificação das Enzimas

As enzimas são classificadas em grupos conforme a natureza das reações químicas que catalisam. De acordo com a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB, em inglês), são divididas em seis grupos.

As características apresentadas pelas enzimas depois de imobilizadas dependem principalmente da escolha apropriada do suporte e dos reagentes utilizados no processo de imobilização, visando manter a integridade do sítio ativo da enzima.

 _{Os sensores biomiméticos e/ou quimiosensores são aqueles que usam substâncias}

sintéticas como elemento de reconhecimento (análogos sintéticos)

A partir das informações sobre propriedades físico-químicas e estruturais do sítio

catalítico da enzima natural, inicia-se o processo do desenvolvimento de compostos orgânicos (ligantes) com funções químicas semelhantes aos resíduos de aminoácidos presentes no sítio catalítico da enzima natural

Algumas enzimas que possuem em seus centros ativos íons metálicos são

chamadas de metaloenzimas. Os íons metálicos de transição mais comuns são: Fe2+_,

Fe3+, Cu2+_{, Zn}2+_{, Mn}2+ _{e Co}2+_{, que participam dos processos catalíticos.}

Sensores

 Baseiam-se no uso de análogos sintéticos de enzimas naturais na

construção de sensores que fazem parte da terceira geração de (bio)sensores, nos quais possivelmente ocorra uma transferência direta de elétrons do sítio ativo da enzima para a superfície do eletrodo, sem a necessidade de compostos mediadores de elétrons.

Exemplo:

Sotomayor e colaboradores utilizaram o complexo mononuclear de Cu(II) [CuDipyCl2] (dipiridina) como catalisador biomimético na construção de um sensor para determinação de dopamina.

O sensor foi preparado modificando o eletrodo de carbono vítreo com uma membrana de náfion contendo [CuDipidiryCl2]. O sensor apresentou resposta linear para dopamina de 4,0x10-5 _{a 6,0x10}-4 _{mol L}-1 _e

limite de detecção de 9,0x10-6 _{mol L}-1_.

Journal of Electroanalytical Chemistry 536 (2002) 71-81.

Sensores

Biossensores permitem resultados analíticos quantitativos em poucos minutos. Tempo de resposta do biossensor deve ser otimizado. Ex. glicosímetro apresenta resposta entre 5 a 30s.

Área da saúde:

 Sangue

 Gases Íons

 Metabólitos  Bactérias

Aplicações

Biossensor

?

Glicose _{Colesterol e triglicérides} Lactato

Área da saúde: Imunossensores

A nanostructured piezoelectric immunosensor for detection of human cardiac troponin T

Rosana A.S. Fonseca1_{, Joilson Ramos-Jesus}1_{, Lauro T. Kubota}2_{, Rosa F. Dutra}1,*

 Emprego de nanopartículas de ouro modificadas para promover a detecção piezoelétrica e eletroquímica de troponina cardíaca T.

 Detecção rápida de troponina cardíaca T e relacioná-la ao risco do

ocorrência de infarto

 Esse estudo foi realizado até a etapa de ensaios com soro humano

positivado com a proteína cardíaca troponina T

50 100 150 200 0.8

0.9 1.0

R

[Anti-TnT] / ng.mL-1

Dependence of anti-TnT concentration on immunosensor sensitivity

0 20 40 60 80 100

0 100 200 300 400 500

Changes of freq

uency / Hz

PBS / mmols L-1

6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 0 100 200 300 400 500

Changes of freq

uency / Hz

pH

Effect of pH on response of immunosensor

1 2 3 4 5

94 96 98 100 R el at ive fr equen cy / %

Number of injections

Control serum

Serum spiked with troponin

Immunosensor response to TnT in the human serum

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 10 20 30 40  Fr equen cy / H z

[Troponin T] / ng mL-1

Área da saúde: Genossensores

Desenvolvimento de (bio)sensores magneto eletroquímicos de DNA para a determinação de enterotoxinas de Staphylococcus em amostras de alimentos: Supervisor:

Profa. Dra. María Pedrero Muñoz

Instituição: Universidade Complutense de Madrid

 Emprego de partículas magnéticas modificadas para promover a captura de cadeias selecionadas de ácido desoxirribonucléico (DNA na terminologia inglesa) e a detecção eletroquímica dos processos de hibridização do DNA imobilizado

 Detecção rápida de enterotoxinas de Staphylococcus de interesse em

amostras de alimentos

 Desenvolvimento de uma metodologia eletroanalítica para a determinação

de Staphylococcus em alimentos diversos

 A ação de alguns possíveis interferentes encontrados nestas matrizes não

foi estudada.

Metodologia:

 Replicação in vitro de moléculas de DNA - PCR (Polymerase Chain Reaction

- reação de polimerização em cadeia)

 A enzima DNA polimerase termoestável produzirá novos segmentos de DNA

com base nas moléculas de DNA fornecida como modelo (DNA-molde)

 Todos os componentes necessários à PCR (incluindo o DNA-molde, a enzima

DNA polimerase, desoxinucleotídeos-trifosfato e oligonucletídeos, dentre outros) são preparados em microtubos, os quais são submetidos a múltiplos ciclos de incubação em temperaturas pré-definidas (termociclagem)

 Os microtubos possuem reações finalizadas de amplificação de DNA, os

produtos de PCR, que são avaliadas quanto à presença dos segmentos que se procurou amplificar a partir do DNA-molde fornecido, os amplicons

 No caso de PCR realizado com finalidade clínica, os amplicons geralmente

As partículas magnéticas (MBs) constituem uma ferramenta versátil para o desenvolvimento de sensores de DNA e proteínas porque:

 Proporcionam uma grande área superficial para a união de DNA, que

podem se separar facilmente da fase líquida com um pequeno imã e dispersar-se novamente de forma imediata ao se distanciar o ímã

 Além disso, as partículas que não se ligam especificamente podem ser

eliminadas mediante uma lavagem controlada magneticamente

 Modificação de eletrodos impressos de ouro com o mediador redox

tetratiafulvaleno (TTF)

 As partículas separadas por meio de um imã de neodímio colocado na parte

inferior dos eletrodos impressos de ouro. A superfície desses eletrodos é modificada com o mediador TTF

 Detecção do processo de hibridização por meio de amperometria,

 Otimização de diferentes variáveis envolvidas no processo, estabelecendo-se

as características analíticas da metodologia desenvolvida

 Estudo da reprodutibilidade dos sinais analíticos obtidos por meio de

diferentes genossensores fabricados da mesma maneira

 Aplicação da estratégia proposta para análise de alimentos contaminados,

sem a necessidade de extrair previamente o material genético da amostra em questão

 Estudar a possibilidade de fabricar um arranjo que permita detectar e/ou

quantificar simultaneamente e rotineiramente a presença das principais enterotoxinas de Staphylococcus em amostras de alimentos

 Genossensores baseados em eletrodos impressos descartáveis = uso de um

Metodologia:

 Imobilização de sondas de DNA biotiniladas sobre partículas magnéticas mo

dificadas com estreptavidina

 Marcação do híbrido biotinilado resultante, com um polímero comercial de

estreptavidina-HRP

 Depois de imobilizar as partículas assim obtidas, colocando-se um imã de

neodímio na parte inferior de eletrodos impressos de ouro modificados com o mediador redox tetratiafulvaleno (TTF), a detecção do processo de hibridização será realizada por amperometria, monitorizando a variação da corrente de redução do TTF a qual é gerada quando se adiciona peróxido de hidrogênio na presença de HRP

 Determinação de DNA de enterotoxinas de Staphylococcus aureus = cadeias de

(Monocamadas Auto-Organizadas (SAMs)

 Uma alternativa para prevenir a desnaturação da enzima

 Promover uma orientação específica e preferencial da enzima à

superfície do eletrodo.

Monocamada auto-organizada

SAM

Constituem um método bastante interessante de obtenção de uma superfície com alto grau de orientação

São formadas espontaneamente como conseqüência da imersão de uma superfície sólida em uma solução constituída de moléculas anfóteras

Esquema do emparelhamento entre os alcanotióis e o retículo do ouro numa camada auto-organizada. Átomos de enxofre representados em rosa e átomos de ouro representados em dourado .

SAMs

Cadeia carbônica

Grupo ligante

Substrato metálico

Interface orgânica

•Atua como barreira física

•Altera a condutividade eletrônica

Interface meta-enxofre Interface orgânica

•determina as propriedades superficiais

Representação esquemática dos processos de imobilização de biomoléculas por adsorção física (a) encapsulamento por ligação cruzada (b) e acoplamento orientado por monocamadas auto-organizadas (c).

Efeito positivo no ambiente e disposião dos elementos biologicamente ativos

Aumenta o desempenho analítico dos biossensores

SAMs

São fáceis de serem formadas  Formam estruturas ordenadas

 A versatilidade na variação, por meio de grupos funcionais diferentes,

permite que se obtenham superfícies com características hidrofóbicas ou hidrofílicas e ainda permitindo reações de imobilização

 Apresentam razoável estabilidade por um período longo de tempo,

permitindo que sejam utilizadas para a realização de um grande número de medidas

 Reagentes e Soluções:

 Tiol – cistamina = 1x10-3 mol L-1 (Sigma)  Enzima – glicose oxidase (Sigma)

 Enzima – frutose dehidrogenase (Sigma)

 Substratos – D-glicose e D-frutose = 5x10-2 mol L-1 (Sigma)  Mediador de elétrons – tetratiafulvaleno (sigma)

 Glutaraldeído – (Sigma)

As medidas eletroquímicas foram realizadas em tampão fosfato 0,1 mol L-1_{, pH= 6,5; T = 35ºC.}

Metodologia: Preparação usando

Instrumentação:

 Potenciostato/galvanostato AUTOLAB® PGSTAT (ECO CHEMIE,

Holanda) acoplado a um microcomputador dotado com o programa GPES.

Eletrodos:

 Referência: Ag/AgCl (em KCl 3,0 mol L-1)  Auxiliar: placa de platina

Célula Eletroquímica:

 Compartimento único e encamisada para controle da

temperatura

Tampa em Teflon® adaptada para encaixe dos eletrodos

Metodologia: Preparação usando

Eletrodo de referência

Eletrodo de trabalho Eletrodo de trabalho

ou contra-eletrodo

Eletrodo de Trabalho: eletrodo de ouro modificado com monocamadas de cistamina (Au/Cistamina) _– 2 horas

Metodologia: Preparação usando

(1) Formação da SAM:

Construção do biossensor

Contato elétrico

Solução de cistamina Ouro

SAM de cistamina

Cistamina

2-aminoetil dissulfeto

N H₂

Cys

TTF

Gox

FDH

Glutaraldeído

TTF = tetratiafulvaleno

Voltamogramas cíclicos de K₄Fe(CN)₆/K₃Fe(CN)₆ na concentração de 1,00x10-3 _{mol L}-1 _{em tampão fosfato 0,10 mol L}-1 _{(pH = 6,5) para:}