3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1- POPULAÇÃO
Neste trabalho foi realizado um estudo do tipo caso-controlo em 175 mulheres.
Todas as amostras estudadas foram provenientes de indivíduos da região norte de Portugal.
INDIVÍDUOS CONTROLO
O grupo de mulheres controlo consistiu em 80 mulheres sem patologia oncológica conhecida, constituído por mulheres com uma idade media de 38 anos e desvio padrão de 11.9.
PACIENTES COM CANCRO DA MAMA
Foram analisadas amostras referentes a 175 mulheres com cancro da mama diagnosticado no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de Oncologia do Porto e que deram entrada no laboratório de Patologia Molecular entre 1998 e 2005. A idade média de diagnóstico foi de 49 anos e desvio padrão de 14.8.
Aquando o diagnóstico foram observadas as seguintes características clinico- patológicas: tipo e grau de lesão, tipo histológico do tumor e estadio, de acordo com a AJCC – American Joint Committee on Cancer. Em alguns casos não foi possível a
obtenção de informação relativamente ao estadio do tumor. Estes dados estão descritos no quadro 2.
Quadro 2. Características clínico-patológias dos casos analisados. Quimioterapia (QT);vivo sem evidência de doença (VSED); vivo com evidência de doença (VCED); morto sem evidência de doença (MSED); morto com evidência de doença (MCED).
Características Casos (Ntotal-175)
No.(%)
Controlos (Ntotal-80) No.(%) Idade, anos
Idade ± desvio padrão 49±14.8 38 ±11.9
Histologia
Carcinoma Ductal Invasor 125(71.4)
Carcinoma Lobular Invasor 7(4)
Carcinoma Medular 2(1.1)
Carcinoma Papilar 2(1.1)
Carcinoma Ductal in Situ 5(2.9)
Outros – dados não disponíveis 11(6.3) Grau
Desconhecido 6(3.43)
1 13(7.43)
2 77(44)
3 47(26.8)
Tumor stage
I 34(19.4)
II 69(39.4)
III 39(22.3)
IV 7(4)
Dados indisponíveis 26(15.0)
Tratamento
Cirurgia 154(88)
QT 22(12.6)
QT neo-adjuvante 12(6.86)
Hormonoterapia 144(82.3)
Estado Actual
VSED 116(66.3)
VCED 19(10.8)
MSED 1(0.6)
MCED 16(9.1)
Dados indisponíveis 23(13.1)
Recidiva Nao 105(60)
Sim 33(18.8)
Dados indisponíveis 37(21.1)
3.2- PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS E ISOLAMENTO DE DNA
Foram recolhidos aproximadamente 8 ml de sangue periférico dos indivíduos atrás referidos, através de uma técnica padronizada de colheita intravenosa, para tubos contendo uma solução de EDTA. A separação do plasma foi efectuada após centrifugação dos tubos contendo sangue periférico por 10 minutos a 2500 rpm (rotações por minuto) e após recolha do plasma e guardado a -70 ºC.
O isolamento de DNA genómico em plasma foi efectuado com um kit de extracção comercial, QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN). Iniciou-se o isolamento do DNA através da adição de 20µL de proteinase K nos tubos de microcentrífuga e seguidamente pipetaram-se 200µL da amostra de plasma e 200µL Buffer AL (Quiagen), seguindo-se o vortex das soluções durante 15 segundos. Os tubos com a amostra foram posteriormente incubados a 56 ºC durante dez minutos e seguidamente foi feita uma centrifugação breve. Foram adicionados 200µL de etanol (96-100%) à amostra seguido de vortex por 15 segundos e centrifugação breve. Esta mistura foi recolhida para uma
“QIAamp Spin Column” e centrifugada a 8000 rpm por 1 minuto, para que ocorra a ligação do DNA à coluna, tendo-se eliminado o tubo contendo o filtrado. Adicionou-se 500µL de Buffer AW1 (fase da lavagem) e centrifugado a 8000 rpm por 1 minuto e eliminado em seguida o filtrado. Foi adicionado 500µL do Buffer AW2 (Quiagen) e centrifugado a 14.000 rpm por 3 minutos e eliminado o filtrado. Por fim, colocou-se a QIAamp Spin Column (Quiagen) num tubo e adicionou-se 70µL do Buffer AE à coluna, tendo-se deixado durante 5 minutos à temperatura ambiente (para se eluir o DNA da
coluna para o tubo com maior eficiência) e em seguida centrifugado a 8.000 rpm por 1 minuto. O tubo que contem o filtrado (DNA genómico de amostras de plasma) foi guardado a – 20 ºC.
3.3- QUANTIFICAÇÃO DO DNA LIVRE CIRCULANTE EM PLASMA
Para a quantificação de DNA circulante em plasma, utilizou-se a metodologia PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real baseado no método 5’-nucleótido.
Este método baseia-se na monitorização contínua de um PCR progressivo flourogénico por um sistema óptico (Gabriella Sozzi et al., 2005). O sistema de PCR utiliza dois primers para a amplificação, um amplicão específico adicional e uma sonda de hibridização flourogénica, a sequência alvo que está localizada no amplicão. A sonda é marcada com dois corantes fluorescentes. Um funciona como reporter da terminação 5’
(VIC dye, Applied Biosystems). O segundo corante fluorescente está situado na terminação 3’(TAMRA, Applied Biosystems) da sonda e é designado por quencher. Se ocorrer amplificação, a actividade exonuclease da DNA polimerase de 5‘ para 3’ do TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) quebra o reporter da sonda durante a fase de extensão, libertando-o do quencher. O aumento na emissão fluorescente do reporter é monitorizada durante o processo de PCR em tempo real (Figura 8).
Os Primers e sondas foram definidos para amplificar especificamente o gene de interesse, o gene hTERT de cópia única localizado no 5p15.33. O tamanho do amplicão do gene hTERT foi de 98bp (posição 13059 a 13156, número de acesso do gene Bank AF 128893). As sequências dos primers e da sonda foram as seguintes: primer forward, 5’- GGC ACA CGT GGC TTT TCG -3’; primer reverse, 5’- GGT GAA CCT CGT AAG TTT ATG CAA-3’; sonda, VIC 5’- TCA GGA CGT CGA GTG GAC ACG GTG-3’ TAMRA.
Os PCRs fluorogénicos foram efectuados num volume de reacção de 25µL, num sistema de detecção de sequências designado por 7300 Real-Time System (Applied Biosystems). A sonda e primers fluorogénicos foram sintetizados pela Metabion. Cada mistura de reacção PCR consistiu em 12.5µL de TaqMan Universal Mastermix (Applied Biosystem), 0.335µL de probe (7.5mmol/L), 0.225µL de primer forward (Metabion) (5 mmol/L), 0.225µL de primer reverse (Metabion) (5mmol/L) e 9.22µL de água bidestilada. As soluções de DNA (2.5µL) foram usadas em cada reacção PCR em tempo real. Os ciclos térmicos do PCR foram iniciados por uma primeira etapa de desnaturação a 50ºC durante 2 minutos e posteriormente 95ºC durante 10 minutos. O perfil térmico para o PCR foi de 95ºC durante 15 segundos e 60ºC durante 1 minuto. Os dados obtidos durante 50 ciclos de amplificação foram analisados.
Cada placa consistiu em amostras duplicadas de pacientes e controlos e múltiplos controlos negativos (água bidestilada). Para a realização da curva de calibração em cada placa, foi usada uma solução de DNA com concentração conhecida (TaqMan Control Human Genomic DNA Standard, Applied Biosystems) de 10ng/µL com diluições seriadas apropriadas a 1, 0.1, 0.01, 0.001 e 0.0001 ng/µL. A amplificação
linear decrescente até ao último ponto de diluição foi obtida em cada experiência (coeficiente de correlação, 0.999 a 0.995).
Todos os dados foram analisados através do Sequence Detection System (Applied Biosystems) para interpolação na curva de amplificação standard do DNA numa quantidade conhecida, obtendo-se assim a quantidade relativa de DNA na amostra experimental.
Figura 8. Esquema representativo das várias etapas do PCR em tempo real.
3.4- MÉTODOS ESTATÍSTICOS
Os dados foram analisados através do software SPSS (Statistical Package for Social Sciences) para Windows (versão 12.0) (SPSS Inc, Chicago, IL).
As concentrações de DNA entre os controlos e pacientes foram analisadas usando o teste Mann-Whitney U- test. O valor de P < 0.05 foi considerado com significado estatístico.
A análise de qui-quadrado foi utilizada para comparar variáveis categóricas, e 5% de nível de significância foi usado para a análise. O odds ratio (OR) e o intervalo de confiança a 95% (95%CI) foram calculados como uma medida da associação entre os níveis de DNA circulante e risco para cancro da mama. A análise de regressão logística foi utilizada para calcular o OR ajustado (aOR) e 95% CI para a influência das quantidades de fcDNA no risco para desenvolver cancro da mama, ajustado à idade.
As probabilidades da sobrevivência foram calculadas, e as médias e as tabelas da idade foram analisadas pelo método estimativo de Kaplan Meier. As curvas foram examinadas pelo teste de Breslow (Wilcoxon), um teste estatístico para calcular as distribuições da sobrevivência A duração da sobrevivência foi definida como o tempo entre o diagnóstico e a morte ou a última avaliação clínica do paciente. Os dados clínico-patológicos e a causa de morte foram determinados pelos registos médicos dos pacientes.
