PRÓ
–
REITORIA DE PÓS -GRADUAÇÃO E PESQUISA - PRPGP
PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS GENÔMICAS E
BIOTECNOLOGIA
PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA (DRM) EM CRIANÇAS PORTADORAS DE LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA TRATADAS NO
DISTRITO FEDERAL
LARISSA LEMOS MENDANHA CAVALCANTE
Brasília – DF Dezembro, 2011
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia
PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA (DRM) EM CRIANÇAS PORTADORAS DE LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA TRATADAS NO DISTRITO FEDERAL
Brasília - DF
2012
Autora: Larissa Lemos Mendanha Cavalcante
Orientadora: Drª. Rosângela Vieira de Andrade
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia
PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO MOLECULAR PARA DETECÇÃO DE
DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA (DRM) EM CRIANÇAS PORTADORAS
DE LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA TRATADAS
NO DISTRITO
FEDERAL
Brasília - DF
2012
LARISSA LEMOS MENDANHA CAVALCANTE
PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO MOLECULAR PARA DETECÇÃO DE DOENÇA
RESIDUAL MÍNIMA (DRM) EM CRIANÇAS PORTADORAS DE LEUCEMIA
LINFÓIDE AGUDA TRATADAS NO DISTRITO FEDERAL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas
e
Biotecnologia
da
Universidade Católica de Brasília, para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Genômicas e Biotecnologia.
Orientadora: Drª. Rosângela Vieira de Andrade
Co-orientador: Msc. Luis Henrique Toshihiro Sakamoto
Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB
11/04/2012D649c Cavalcante, Larissa Lemos Mendanha.
Padronização de método molecular para detecção de doença residual mínima (DRM) em crianças portadoras de leucemia linfóide aguda tratadas no Distrito Federal. / Larissa Lemos Mendanha Cavalcante – 2012.
95f. : il.; 30 cm
Dissertação (Mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2012. Orientação: Rosângela Vieira de Andrade
Coorientação: Luis Henrique Toshihiro Sakamoto
1. Inovação tecnológica. 2. Tecnologia da informação. 3. Desempenho. 4. Pesquisa e desenvolvimento. I. Nehme, Claudio Chauke, orient. II. Título.
Dissertação de autoria de Larissa Lemos Mendanha Cavalcant
e, intitulada “Padronização de m
étodo
molecular para detecção de Doença Residual Mínima (DRM) em crianças portadoras de Leucemia
Linfóide Aguda tratadas
no Distrito Federal”, apresentada
como requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, em
06 de março de 2012, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter iluminado meus caminhos, pela constante
presença em minha vida e por ter me concedido o dom de viver e aprender.
À Prof. Drª. Rosângela Vieira de Andrade, por ter acreditado em mim e ter me aceitado
como aluna, me concedendo a oportunidade de aprender, aprofundar meu conhecimento e me
envolver na pesquisa científica, e acima de tudo, pelo apoio incondicional e o incessante estímulo
e incentivo.
Ao Mestre e Médico Oncologista Pediátrico do Hospital da Criança de Brasília, Luis
Henrique Toshihiro Sakamoto, pela obtenção das amostras clínicas estudadas, pela sua excelente
co-orientação, paciência, atenção e disponibilidade em me ajudar e passar todos os seus
ensinamentos, que foram vitais para a execução deste trabalho. Além de ser um exemplo de
sabedoria, dedicação e competência.
Ao Prof. Dr. Robert Edward Pogue, pela troca de experiências, pela presença nos
momentos de questionamentos e sugestões dadas em relação a alguns problemas obtidos durante
o trabalho.
Ao Prof. Dr. Ruy de Araújo Caldas, pela confiança, apoio e principalmente, pela
solidariedade prestada nos momentos mais difíceis.
Aos colegas de bancada Nina, Jônatas e Laureane, pelo importante auxílio nas
atividades rotineiras, e constante prestatividade e dedicação.
Aos colegas do Laboratório de Ciências Genômicas e Biotecnologia, Getúlio, Tainá,
Natália, Jônatas, Ester e Túlio, por terem cedido amostra de sangue para composição do pool de
DNAs normais.
À Rafaela e Carol, da Universidade de Brasília, pelo apoio em algumas etapas
Aos técnicos de laboratório Jefferson, Patrícia e Idacuy, pela importante ajuda na
parte experimental.
Aos meus amigos de laboratório Laureane, Nina, Laiane, Natália, Jônatas, Davi, Éric,
Letícia, Ana, Osmar, Loiane e Dianny pelo apoio em todos os momentos, forte companheirismo,
paciência, amizade, pelas opiniões valiosas e pelos momentos de descontração.
À todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho, bem
como meus pais e minhas irmãs, que sempre me apoiaram e me incentivaram, estando presentes
nos momentos mais difíceis, todos os familiares e especialmente as minhas amigas Michelly
Ayres Oliveira e Lara dos Anjos Gomes.
Ao Rodrigo Nogueira, meu companheiro, pelo amor e compreensão nos momentos de
ausência, e por estar ao meu lado durante essa caminhada.
À todos os membros da banca examinadora, Drª. Isis Quezado Magalhães, Prof. Drª.
Andréa Barretto Motoyama e Prof. Dr. Robert Edward Pogue, que aceitaram gentilmente
participar da banca desta dissertação. Tenho certeza que as suas observações serão muito valiosas.
Ao corpo docente da Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, pelo
incentivo à pesquisa e ao crescimento profissional.
À todas as crianças e adolescentes do Hospital da Criança de Brasília e seus familiares,
por contribuir com a pesquisa e permitirem o desenvolvimento deste projeto, e a todos que posso
ter esquecido de mencionar.
Ao CNPq, FAPDF e UCB, por permitirem o desenvolvimento deste trabalho através
RESUMO
CAVALCANTE, LLM.
Padronização de método molecular para detecção de
Doença Residual Mínima (DRM) em crianças portadoras de Leucemia Linfóide Aguda
tratadas no Distrito Federal.
2012. 95 folhas
.
Mestrado em Ciências Genômicas e
Biotecnologia. Universidade Católica de Brasília, Brasília.
A leucemia linfóide aguda (LLA) é uma neoplasia proveniente da expansão clonal de
precursores linfóides imaturos, sendo o câncer mais comum na infância. O tratamento das
LLAs da infância constitui exemplo de sucesso terapêutico, e as taxas de sobrevida livre
globais de 70-80% alcançadas nos últimos anos são decorrentes da melhora no diagnóstico,
estabelecimento de fatores prognósticos e utilização de tratamentos ajustados ao grupo de
risco de cada paciente. Entretanto, pacientes considerados em remissão podem apresentar
conteúdo de células leucêmicas residuais, chamadas de Doença Residual Mínima (DRM), as
quais são indetectáveis pelas técnicas convencionais de análise morfológica. Vários estudos
têm demonstrado o valor prognóstico da DRM e a importância do seu monitoramento para o
acompanhamento da evolução clínica dos pacientes. Neste contexto, esse projeto teve como
objetivo padronizar uma técnica para detecção de DRM, utilizando tecnologias de PCR
quantitativo em tempo real (qPCR) para amplificação dos rearranjos dos genes das
imunoglobulinas (Ig) e receptores de células T (TCR) em crianças em tratamento
quimioterápico para LLA. A metodologia adotada seguiu as recomendações do consórcio
internacional BIOMED-1 que utiliza PCR com 25 pares de primers consenso direcionados
para as recombinações VDJ das Ig e
TCR seguida por análise de homo/heteroduplex. Foram
testados 34 pacientes classificados e tratados pelo protocolo GBTLI-93. Destes, foi possível
detectar rearranjos em 11 pacientes (32,4%). O rearranjo mais freqüente foi TCRG (62,5%),
seguido por IgK-Kde (37,5%). Os primers foram capazes de detectar pelo menos 2 rearranjos
em 27,2% dos pacientes estudados para o estabelecimento do nível de DRM. A análise de
DRM de 16 rearranjos em diferentes pontos do tratamento (dias 15 e 29 da terapia de indução)
foi compatível com a evolução clínica apresentada por 10 pacientes. Esse dado foi obtido pelo
nível de DRM, o qual sofreu diminuição considerável do dia 15 para o dia 29, o que explica
totalmente o fato da ausência de recaída nos 10 pacientes. A metodologia aplicada para
análise de DRM foi considerada eficiente e reprodutível, apesar de complexa, demandar
tempo e apresentar custo elevado. Contudo, é importante ressaltar que a detecção da DRM é
necessária para determinar individualmente a resposta antes e após o tratamento com maior
precisão.
ABSTRACT
Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a neoplasm derived from clonal expansion of
immature lymphoid precursors, being the most common cancer in childhood. The treatment of
LLA’s childhood
is an example of therapeutic success, and overall free survival rates of
70-80% are achieved in recent years due to improved diagnosis, establishment of prognostic
factors and use of treatments adjusted to each risk group patient. However, patients considered
in remission may provide content of residual leukemic cells, called Minimal Residual Disease
(MRD), which may be undetectable by conventional techniques of morphological analysis.
Several studies have demonstrated the prognostic value of MRD and the importance of
monitoring for clinic evaluation of patients. In this context, this project aimed to standardize a
technique for detection of MRD using real time quantitative technologies (qPCR) for
amplification of the gene rearrangements of immunoglobulin (Ig) and T cell receptor (TCR) in
children undergoing chemotherapy for ALL. The methodology followed the recommendations
of the international consortium BIOMED-1 using PCR with 25 pairs of consensus primers
targeted to the VDJ recombination of Ig and TCR analysis followed by homo/heteroduplex.
We tested 34 patients classified and treated by protocol GBTLI-93. Of these, it was possible
to detect rearrangements in 11 patients (32,4%). The TCRG rearrangement was more frequent
(62,5%), followed by IgK-Kde (37,5%). The primers were able to detect at least two
rearrangements in 27,2% of studied patients to establish the MRD level. MRD analysis of 16
rearrangements in different points of treatment (days 15 and 29 of induction terapy) was
compatible with the clinical evolution obtained by 10 patents. This was done by the DRM
level, which suffered considerable decrease of day 15 to day 29, which fully explain the
absence of relapse in 10 patients. The methodology for analysis of DRM was considered
efficient and reproducible, although complex, time consuming and costly. However, it is
important to note that detection of MRD is required to determine individual response before
and after treatment with greater precision.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
: Esquema de uma imunoglobulina evidenciando o processo de formação dos
rearranjos gênicos nas regiões variáveis que contém os sítios de ligação de antígeno ... 25
Figura 2:
Mecanismo molecular da formação do rearranjo dos segmentos gênicos de
imunoglobulinas ... 25
Figura 3:
Esquema mostrando rearranjo e exp
ressão dos genes de cadeias α e d
o
receptor de células T (TCR) ... 26
Figura 4:
Diagrama esquemático da técnica de análise de homo/heteroduplex de rearranjos
dos genes de Ig e TCR ... 28
Figura 5:
DNA extraído de pacientes com LLA coletados ao diagnóstico e nos dias 15 e
29 após o tratamento ... 49
Figura 6:
Diferentes concentrações de cloreto de magnésio utilizadas na PCR ... 50
Figura 7:
Diferentes temperaturas de anelamento utilizadas na reação de PCR ... 51
Figura 8:
Testes de diferentes concentrações de Taq platinum utilizados na PCR ... 52
Figura 9:
Homo/heteroduplex em diferentes pacientes com LLA ... 54
Figura 10:
Homo/heteroduplex em gel de poliacrilamida 8% e agarose 1% ... 55
Figura 11:
Eletroferograma dos picos de alelos obtidos pelo primer J
1.γ/β.γ
-
5’ no
paciente 105/1 ... 56
Figura 12:
Análise de sequência pelo software IMGT ... 56
Figura 13:
Sequência do rearranjo J 1.γ/β.γ
-
5’ relativa ao paciente 105/1
... 57
Figura 14:
Gráfico da curva de eficiência do primer específico relativo ao rearranjo
V 9
-J 1
.2 no paciente 146 ... 63
Figura 15:
Análise de qPCR para testar o ensaio da albumina ... 64
Figura 16:
Análise de qPCR no paciente 272 relativo ao rearranjo
V βγ
-
J 1.1/β.1
... 65
Figura 17:
Análise de qPCR no paciente 114 relativo ao rearranjo
VκII
-Kde ... 68
Figura 18:
Análise de qPCR no paciente 299 relativo ao rearranjo
VκI
-Kde ... 68
Figura 19:
Análise de qPCR no paciente 272 com o alvo
V βγ
-
J 1.1/β.1
... 69
Figura 20:
Análise de qPCR no paciente 157 com o alvo
V β.γ0
-Kde ... 69
Figura 21:
Determinação de DRM no paciente 105 com o alvo
V 10
-
J 1.γ/β.γ
... 73
Figura 22:
Curvas de quantificação relativas ao alvo
V 9
-
J 1.β
no paciente 272 e no
paciente 295 ... 77
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
D15
–
Dia 15 da terapia de indução
D29
–
Dia 29 da terapia de indução
DNA
–
ácido desoxirribonucléico
dNTP
–
desoxirribonucleotídeos
DRM
–
doença residual mínima
FAB
–
French-American-British group
GBTLI
–
Grupo Brasileiro de Tratamento das Leucemias na Infância
HAB
–
Hospital de Apoio de Brasília
Ig
–
imunoglobulina
LLA
–
leucemia linfóide aguda
MO
–
medula óssea
µL
–
microlitro
mL
–
mililitro
NOHP
–
Núcleo de Onco-Hematologia Pediátrica
OMS
–
Organização Mundial de Saúde
pb
–
pares de bases
PCR
–
polymerase chain reaction
qPCR
–
quantitative real time PCR
rpm
–
rotação por minuto
SES/DF
–
Secretaria de Saúde do Distrito Federal
SNC
–
sistema nervoso central
SUS
–
Sistema Único de Saúde
Taq
–
enzima Thermus aquaticus
TCR
–
receptor de célula-T
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 14
1.1 Leucemia Linfóide Aguda ... 14
1.2 Doença Residual Mínima ... 21
1.3 Valor prognóstico da DRM ... 29
2. JUSTIFICATIVA ... 31
3. OBJETIVOS ... 32
3.1 Geral ... 32
3.2 Específicos ... 32
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 33
4.1 Seleção de pacientes ... 33
4.2 Extração de DNA de células mononucleares ... 33
4.3 Amplificação por PCR ... 35
4.4 Análise de homo/heteroduplex dos produtos de PCR ... 38
4.5 Sequenciamento de rearranjos dos genes de imunoglobulinas e receptores de
células T ... 38
4.6 Desenho de primers alelo-específicos ... 40
4.7 Padronização da qPCR ... 42
4.8 Critérios utilizados para definir a sensibilidade do método ... 45
4.9 Critérios para definir DRM positiva ou negativa nas amostras de seguimento ... 46
4.10 Análise estatística ... 46
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 48
5.1 Coleta de amostras, extração e quantificação de DNA ... 48
5.2 Padronização da reação de PCR ... 49
5.2.1 Concentração de Cloreto de Magnésio ... 50
5.2.2 Temperatura de anelamento dos primers ... 50
5.2.3 Concentração de Taq polimerase ... 52
5.3 Análise homo/heteroduplex ... 53
5.4 Padronização de método de re-amplificação por PCR (Re-PCR) para o
seqüenciamento ... 54
5.5 Sequenciamento e desenho de primers alelo-específicos ... 55
5.6 Frequência dos rearranjos encontrados nos pacientes estudados ... 57
5.7.1 Curvas de eficiência do primer específico e do gene constitutivo ... 62
5.7.2 Curva de quantificação ... 64
5.7.3 Análise da presença de doença residual em amostras nos dias 15 e 29 da
terapia de indução ... 70
5.8 Método quantitativo para detecção de DRM ... 79
6. CONCLUSÕES ... 83
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 84
1. INTRODUÇÃO
1.1. Leucemia Linfóide Aguda
A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é uma neoplasia proveniente da expansão clonal desenfreada de precursores linfóides imaturos de linhagem B ou T, ou células linfóides indiferenciadas (linfoblastos). Os linfoblastos se expandem e se acumulam em diferentes etapas da maturação no processo de diferenciação linfóide, mas não apresentam capacidade para se diferenciar em formas maduras e normais (Farias & Castro, 2004).
A ocupação física da medula óssea e a competição nutricional entre as células leucêmicas são importantes fatores que impedem o desenvolvimento e diferenciação das células hematopoiéticas normais (Oliveira et al, 2004). Ao se acumularem na
medula óssea, há uma substituição progressiva dos elementos hematopoiéticos normais por células do clone leucêmico, implicando em infiltração de tais células no sangue periférico na maioria dos casos, podendo ser observadas alterações quantitativas e qualitativas (Oliveira & Neto, 2004).
Por ser uma doença clonal, a LLA é originada a partir da ocorrência de mutações somáticas progressivas e aleatórias em uma única célula, a qual adquire vantagem de expansão e/ou sobrevivência, se acumulando em um único clone celular completo de células malignas (Greaves, 2000).
A LLA corresponde a 25-30% de todos os cânceres infantis, e é o tipo mais comum de leucemia na infância, representando cerca de 75% dos casos em crianças com idade menor que 15 anos e apenas 20% dos casos em adultos (Oliveira et al,
2004; Jabbour et al, 2005). O fato de a leucemia ser mais comum em crianças pode
estar relacionado com a intensa atividade da hematopoese, em vertebrados, tanto durante o desenvolvimento fetal, bem como nos primeiros anos de vida (Pui et al,
2004).
Embora possa ocorrer em qualquer faixa etária, o pico de incidência da doença ocorre aos 2-5 anos de idade, diminui entre adolescentes e adultos jovens e volta a aumentar em adultos com mais de 60 anos (Guimarães, 2006). No caso de crianças, a LLA acomete maior proporção de meninos em relação às meninas (1,2:1) e de raça branca em relação à negra (1,8:1) (Pedrosa & Lins, 2002).
a alguns eventos ambientais e genéticos, que inclui a exposição a fatores de risco como o tabagismo, estilos de vida, alimentação, ocupação e agentes carcinógenos específicos, a maior parte das causas dos tumores pediátricos ainda é pouco conhecida, e os mecanismos que levam a célula a se transformar não estão totalmente claros, sendo acompanhados de considerável complexidade (Oliveira et al, 2004; Reis
et al, 2007).
No entanto, alguns trabalhos descreveram possíveis fatores de risco relacionados ao desenvolvimento da leucemia na infância. Os fatores ambientais incluem principalmente a exposição à radiação ionizante (Belson et al, 2007),
quimioterápicos e ao benzeno e seus derivados (Greaves, 1997). O uso de determinados medicamentos e a exposição a agentes tóxicos pela mãe durante a gravidez são fatores que podem levar ao desenvolvimento de más formações congênitas ao feto, baixo peso ao nascer e atrasos físicos no desenvolvimento da criança (Spector et al, 2007). Pombo de Oliveira et al (2009) constataram que a
exposição a pesticidas e terapia hormonal materna estão altamente associados à leucemia do lactente. Nas leucemias pediátricas, em geral os clones leucêmicos têm origem pré-natal, com conseqüentes eventos pós-natais, mutação secundária e completo estabelecimento da doença (Greaves, 1999; Greaves, 2006).
É descrito, ainda, que existe maior freqüência de LLA em portadores de outras afecções, tais como distúrbios genéticos (síndrome de Down, síndrome de Schwachman) ou síndromes de imunodeficiência, mas na grande maioria dos casos não há uma explicação causal possível (Nathan & Orkin, 1998). Há o conhecimento de que, do ponto de vista clínico, os tumores pediátricos apresentam menores períodos de latência, crescem de forma rápida e são mais invasivos, contudo respondem melhor ao tratamento (Reis et al, 2007).
De acordo com o INCA (Instituto Nacional do Câncer), baseado em referências obtidas pelos Registros de Câncer de Base Populacional (RCBP), no Brasil são estimados mais de 9000 casos novos de câncer infanto-juvenil por ano. Em estudo proposto por Reis et al (2007), a maior incidência foi observada em crianças de 1 a 4
anos de idade e pertencentes ao sexo masculino. As taxas médias de incidência, ajustadas por idade, variaram entre 0,33 e 3,19 por 100.000 habitantes por ano.
Os genes supressores de tumor que regulam as vias funcionais, como ciclo celular, diferenciação, reparo e apoptose (Klumb & Júnior, 2002), e os proto-oncogenes ativados também estão relacionados principalmente ao desenvolvimento patogênico das leucemias agudas ao sofrerem acúmulo de mutações, levando as células a perderem suas funções normais. Nas LLAs derivadas tanto de linhagem B como T, os proto-oncogenes podem ser ativados por desregulação transcricional ao serem justapostos aos genes de receptores de células T (TCR) ou imunoglobulinas (Ig) (Bacher et al, 2006).
As manifestações clínicas das leucemias agudas são observadas com base na fisiopatologia da doença e decorrem basicamente de dois processos, tais como o impedimento da hematopoese normal pelas células leucêmicas e os efeitos da infiltração leucêmica de vários órgãos e sistemas. Os sintomas mais comuns estão relacionados à insuficiência da medula óssea, em que a criança se torna suscetível a infecções, tendo fraqueza, palidez cutânea e taquicardia resultantes da anemia; dores ósseas, sangramento gengival e outras manifestações hemorrágicas resultantes da trombocitopenia; febre em razão das infecções associadas à neutropenia; ou presença de infiltração leucêmica extra-medular (Oliveira et al, 2004).
A classificação e o diagnóstico da LLA eram realizados, essencialmente, com base na análise morfológica e citoquímica das células neoplásicas na medula óssea (Oliveira et al, 2004). Em 1976, o grupo French American British (FAB) classificou as
leucemias quanto à morfologia, e para a LLA apontou três subtipos morfológicos - L1, L2 e L3, baseados no diâmetro celular, forma do núcleo e nucléolos e quantidade e aspectos relativos do citoplasma (Bennett et al, 1976). No entanto, não se entendia
porque indivíduos com leucemia apresentavam aspectos morfológicos idênticos, mas possuíam diferentes características clínicas e diferentes respostas à terapêutica. Por isso, tal classificação não refletia a grande diversidade biológica da doença. Assim, tornou-se necessário inter-relacionar as características morfológicas e citoquímicas a outras, como as imunofenotípicas, citogenéticas e moleculares, para se obter um diagnóstico preciso e facilitar a distinção entre os diferentes subtipos de leucemia (Oliveira et al, 2004; Mendonça, 2003). Os testes imunofenotípicos, baseados na
expressão de antígenos intracelulares e de superfície específicos, conseguem nos dias atuais identificar com exatidão as linhagens envolvidas no processo leucêmico (B ou T) e caracterizar o estágio maturativo das mesmas (Casasnovas et al, 2003).
as células B passam a ser produzidas no baço, e após o nascimento, na medula óssea. Existem vários estágios normais de diferenciação do ciclo do linfócito B, os quais podem ser caracterizados tanto em nível molecular, através do rearranjo das cadeias de imunoglobulinas (Ig), como pelas moléculas de superfície indicadas por anticorpos monoclonais (que reagem com antígenos presentes em determinada linhagem e/ou determinada fase de diferenciação das células hematopoiéticas). O primeiro rearranjo da célula B precursora é formado pela sequência do gene que codificará a cadeia pesada da imunoglobulina (IgH) e ocorre em células pró-B com expressão de CD34. As células pré-B precoces são determinadas pela expressão de HLA-DR, CD19 e rearranjo do gene IgH. Após o aparecimento do CD19, tais células expressam o antígeno CD10 (CALLA). No estágio de diferenciação de célula pré-B é possível observar a expressão de cadeia µ intracitoplasmática, sem cadeia leve, e dos antígenos CD19 e CD22. No estágio de linfócito B maduro ocorre a expressão de IgM na superfície da célula B. A partir desses estágios, essas células seguem dois caminhos: apoptose dentro da medula óssea para aquelas células cuja porção variável de sua imunoglobulina de superfície é capaz de reagir contra epítopos próprios, ou a migração para os órgãos linfóides periféricos onde amadurecem e se diferenciam em células produtoras de imunoglobulinas. Essas células perdem o CD19 e expressam os antígenos CD38 e PCA-1 (Rudin&Thompson, 1998).
Conforme as expressões fenotípicas equivalentes à diferenciação linfocitária precursora B, as LLAs derivadas de células da linhagem B (que ocorrem na maioria dos casos, 80 a 85%) são classificadas em quatro subtipos: pró-B, B comum ou Calla +, pré-B e B maduro (Oliveira et al, 2004; Farias & Castro, 2004).
Os linfócitos T também passam por estágios de diferenciação, sendo caracterizados por anticorpos monoclonais ou por rearranjo das diferentes cadeias do receptor de células T (TCR). Durante a formação do embrião, precursores T da medula óssea e fígado migram para o timo, se diferenciando em células T imunocompetentes. Tais progenitores pró-T expressam CD34, CD45RA, CD7 e TdT e continuam o processo de diferenciação no córtex do timo dando origem às células pré-T (Shortman & Wu, 1996), com expressão de CD1, CD2, CD5 e CD3. No segundo estágio, na cortical tímica, as células T passam a expressar duplamente o CD4 e CD8 juntos. O último estágio ocorre na medular do timo, onde as células T sofrem seleção para células maduras funcionais do tipo CD3+/CD4+/CD8-, ou CD3+/CD4-/CD8+ que expressam altos níveis de TCRα (Leclercq & Plum, 1996).
(ocorre em 15% dos casos), são classificadas em três subtipos (pré-T, T-intermediário e T maduro), (Oliveira et al, 2004; Farias & Castro, 2004).
Nas LLAs, as anormalidades cromossômicas podem ser numéricas ou estruturais (Guimarães, 2006). Tais alterações no número de cromossomos (hiperdiploidia, hipodiploidia e pseudodiploidia) e estruturais (inversões, deleções, mutações pontuais e translocações) são reveladas com base na análise do cariótipo pela citogenética ou genética molecular. As anormalidades estruturais são encontradas em 62% dos casos de LLA da infância, incluindo 20% com translocações. As mais comuns associadas ao imunofenótipo de linfócitos B são: t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4 (3% dos casos), t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL (3 a 5% dos casos pediátricos e 20% em adultos), t(1;19)(q23;q13)/E2A-PBX1 (5 a 6% dos casos), t(12;21)(p13;q22)/TEL-AML1
(20 a 30% dos casos da infância), t(8;14)(q24;q32)/MYC-IgH (2 a 5% dos casos) e rearranjos envolvendo o gene MLL (Friedmann & Weinstein, 2000; Carroll et al, 2003).
Translocações envolvendo os cromossomos 1 e 14, como t(1;14)(p33;q11) e t(1;14)(p32;q11), ocorrem em aproximadamente 3% dos casos de LLA infantil de linhagem T (Farias & Castro, 2004). Existe maior risco de recidiva nas alterações estruturais como t(4;11), t(9;22) e t(1;19), estando associadas a ruim prognóstico, enquanto que a t(12;21) está associada a um prognóstico altamente favorável (Felix et
al, 2000; Sawinska & Ladón, 2004; Tauchi et al, 2008).
O estudo aprofundado e o entendimento das alterações cromossômicas têm contribuído para a melhor determinação prognóstica do paciente e é importante para auxiliar na compreensão e caracterização da doença, bem como a definição de melhores estratégias de tratamento (Rowley, 2000; Felix et al, 2000).
Até a metade do século passado a leucemia era considerada uma doença fatal. Atualmente, o tratamento das LLAs da infância constitui um exemplo de sucesso terapêutico em oncologia, uma vez que as taxas de sobrevida livre globais em 5 anos passaram de menos de 20% antes da década de 70 para 70-80% nos dias atuais (Reiter et al, 1994; Pakakasama et al, 2008; Henze, 2008; Jeha & Pui, 2009). Esse
sucesso é decorrente da melhora no diagnóstico, estabelecimento de fatores prognósticos e utilização de tratamentos ajustados ao grupo de risco de cada paciente (Leite et al, 2007). O crescimento das taxas de cura deve-se não apenas à descoberta
cada etapa do tratamento (Hoelzer et al, 2002; Raetz et al, 2008; van Grotel et al, 2008;
Viana & Vilela, 2008).
Tendo em vista um melhor balanço entre eficácia e efeitos adversos do tratamento, os pacientes são estratificados em grupos de risco de modo a intensificar o tratamento para aqueles que possuem maior chance de recaída e reduzir a toxicidade daqueles com maiores chances de cura (Pedrosa & Lins, 2002). Essa estratificação pode variar conforme o protocolo de terapia adotado em cada instituição, mas, em geral, constituem fatores prognósticos relevantes: idade ao diagnóstico, contagem leucocitária ao diagnóstico, índice de DNA na célula leucêmica, imunofenotipagem, resposta precoce à indução, presença de linfoblastos no sistema nervoso central, hiperdiploidia e análise citogenética de anormalidades cromossômicas (Oliveira et al,
2004; Onciu, 2009). A quimioterapia combinada constitui o eixo principal de tratamento
da LLA há mais de 25 anos (Oliveira et al, 2004).
No Núcleo de Onco-Hematologia Pediátrica (NOHP) da Secretaria de Saúde do Distrito Federal (SES/DF), o tratamento das LLAs segue as orientações do “Grupo Brasileiro de Tratamento das Leucemias na Infância” (GBTLI) conforme o protocolo GBTLI-LLA/93 (GBTLI, 1993). O critério diagnóstico principal utilizado para confirmação de leucemia aguda é a quantidade de blastos (mais de 25%) presentes na medula óssea (Guimarães, 2006). O planejamento terapêutico do GBTLI-LLA/93 compreende as fases de indução, (consolidação) intensificação, reindução e manutenção. O objetivo da primeira fase é induzir a remissão completa clínica e hematológica, com a recuperação da hematopoese normal (Guimarães, 2006). Para esta etapa, atualmente está bem estabelecido que a utilização de um esquema quimioterápico indutório com corticosteróide, vincristina e antraciclina é capaz de levar mais de 80% dos pacientes à remissão completa (Jabbour et al, 2005). Na segunda fase o objetivo é manter o estado
de remissão, bem como prevenir a infiltração do sistema nervoso central (SNC). A terapia de manutenção constitui a última fase do tratamento, cujo objetivo é manter a remissão evitando o ressurgimento de clones resistentes a drogas, reduzindo continuamente as células leucêmicas residuais. Atualmente, tornou-se consenso que a duração de pelo menos 2 anos faz-se necessária para o devido controle da doença (Oliveira et al, 2004; Guimarães, 2006).
Neste protocolo os pacientes são estratificados em dois grupos. O grupo de Risco Básico (RB) inclui pacientes com idade superior a 1 ano e inferior a 10 anos, contagem leucocitária inicial inferior a 50.000/mm3 e SNC negativo. Os pacientes
SNC. Além destes critérios foi recomendado pelo GBTLI LLA-93 que pacientes com imunofenótipo T e/ou achados desfavoráveis na citogenética (hipodiploidia, pseudodiploidia, cromossomo Philadelphia) fossem tratados no grupo de Alto Risco. O envolvimento do SNC foi definido pela contagem de leucócitos em líquor maior que 5/mm3 e demonstração inquestionável de blastos leucêmicos ou pela ocorrência de
sinais clínicos, tais como, paralisia de par craniano, síndrome hipotalâmica e evidência de compressão medular (Leite et al, 2007).
Uma vez obtida a otimização utilizando a estratificação dos pacientes por grupos de risco, aproximadamente 95% das crianças com LLA alcançam a remissão, definida por contagem de menos de 5% de células blásticas na medula óssea (Friedmann & Weinstein, 2000; Cazzaniga & Biondi, 2005). No entanto, mesmo os mais intensivos esquemas de quimioterapia não são capazes de curar todos os pacientes, e cerca de 20 a 30% destes ainda apresentarão recaída. Mesmo para os pacientes classificados como baixo risco ainda existe 20% de taxa de recaída. Embora a taxa de cura tenha aumentado para 80% em função dos avanços no tratamento, alguns tipos de leucemia permanecem irresponsivos à terapia (Greaves & Wiemels, 2003).
Desta forma, tem se mostrado útil a determinação da resposta ao tratamento através de métodos mais sensíveis que a citologia convencional, como imunofenotipagem e métodos moleculares (Henze, 2008).
A técnica de citogenética, apesar de ser importante e muito utilizada para detectar várias aberrações cromossômicas, exige que haja alto índice mitótico e grande número de células em metáfase (Silva et al, 2006). Além de ser um método que pode
demorar alguns dias e a sensibilidade da análise microscópica de esfregaços de medula é de apenas 5%, supondo que alterações submicroscópicas mais complexas não sejam identificadas, deixando dúvidas devido ao baixo poder de detecção de algumas deleções e rearranjos estruturais. O rearranjo TEL/AML1, por exemplo,
corresponde à alteração genética mais freqüente na LLA da criança e só é detectada por citogenética convencional em menos de 0,05% dos casos (Guimarães, 2006; Schaffel & Simões, 2008). Em média, 20 a 30% dos casos que inicialmente apresentam prognóstico favorável não são detectáveis pelos métodos laboratoriais convencionais (Pui et al, 2004).
tornando-se um instrumento diagnóstico essencial na avaliação clínica das leucemias. Através dela fica mais fácil distinguir alterações que aparecem idênticas por citogenética, mas que envolvem diferentes genes e implicações terapêuticas (Silva et
al, 2006).
1.2. Doença Residual Mínima
Após o tratamento, o paciente ainda pode apresentar bilhões de células leucêmicas residuais (1010), que estão abaixo do nível de detecção pela microscopia
convencional (Campana & Pui, 1995). Essas células leucêmicas residuais sem evidência clínica de doença recebem o nome de Doença Residual Mínima (DRM) (Counstan-Smith et al, 2000; Almeida & Saddi, 2007).
A Doença Residual Mínima surgiu como uma importante ferramenta com o objetivo de avaliar de forma apurada a resposta ao tratamento, possibilitando o diagnóstico precoce de eventuais recidivas. Através de sua detecção e quantificação, pode-se determinar individualmente a resposta antes e após o tratamento com maior precisão, ainda que o nível da doença esteja muito baixo (Almeida & Saddi, 2007).
O desenvolvimento de técnicas mais sensíveis, com capacidade de detecção de células leucêmicas residuais ou recidivas precoces sem manifestações clínicas, tais como 1 célula leucêmica em meio a 105 e 106 células normais (Friedmann & Weinstein,
2000), tem tornado útil o acompanhamento do nível de DRM para o delineamento de regimes terapêuticos mais adequados. A quantificação de DRM por tais técnicas na medula óssea é um método muito mais específico e sensível do que a análise morfológica de células blásticas (Pui et al, 2004).
As informações relevantes para a DRM podem ser obtidas em LLA por três técnicas: (I) citometria de fluxo pela análise de imunofenótipos aberrantes de superfície presentes apenas em células leucêmicas, sendo raros ou ausentes em células normais da medula óssea ou sangue periférico (Carroll et al, 2003); (II) PCR para detectar
aberrações cromossômicas que resultam em fusão gênica de transcritos ou expressão aberrante de transcritos; (III) PCR quantitativa em tempo real (qPCR), para detectar regiões juncionais paciente-específicas de rearranjos dos genes (recombinação VDJ) de imunoglobulinas (Ig) e receptores de células T (TCR) (Pongers-Willemse et al, 1999;
Hoelzer et al, 2002).
populações leucêmicas se originam. É uma técnica multi-paramétrica realizada por meio de anticorpos monoclonais marcados com fluorescência, os quais reconhecem quantitativa e qualitativamente epítopos específicos de antígenos celulares, que são os CDs (clusters of differentiations) em meio a populações celulares de interesse (Harris et
al, 1999; Silva et al, 2006). A marcação intracitoplasmática ocorre com os marcadores
mais específicos para as linhagens B e T expressos prematuramente e/ou somente no citoplasma (Bene et al, 1995). Esse processo pode ser feito em cortes histológicos,
mas, geralmente, é realizado em suspensões de células do sangue periférico e da MO (Bain, 2003). Nesse caso, as células se movem em uma solução isoeletrolítica e atravessam um canal de fluxo, uma a uma, gerando o desvio da luz incidente, que é medido por um detector de fluorescência (Quixabeira & Saddi, 2008).
O estudo das translocações constitui outra opção para análise de DRM, funcionando como alvos detectáveis por PCR. As translocações cromossômicas são resultado de uma mudança de posição de um gene ou de um fragmento gênico de uma região cromossômica para outra, resultando em genes quiméricos com funções aberrantes (Quixabeira & Saddi, 2008). A análise de PCR é baseada no desenho de primers que detectam as regiões de fusão de pontos de quebra mais freqüentes. Assim, o produto de PCR contém as sequências de translocações tumor-específicas (van Dongen et al, 1999). No entanto, esses transcritos quiméricos derivados de
translocações cromossômicas estão presentes em apenas 38-50% dos casos de LLA da infância. Assim, para os demais casos, não haveria possibilidade de determinação da DRM (Hoelzer et al, 2002). Além disso, sabe-se que essas alterações moleculares
variam de acordo com o tipo de leucemia (Quixabeira & Saddi, 2008).
Como pode ser visto, as diferenças metodológicas entre os vários laboratórios podem confundir a interpretação clínica. Dessa forma, a padronização do método de acordo com o contexto clínico e a realidade local em que o paciente está sendo avaliado é sempre necessária (Carroll et al, 2003). Além disso, tendo em vista que uma
das utilidades da definição do nível de DRM é a melhor estratificação não apenas dos grupos de risco, como também da intensidade da quimioterapia, torna-se necessário que o método adotado seja estritamente sensível, preciso, simples, aplicável, o menos dispendioso possível e economicamente viável (Moppett et al, 2003).
Na tentativa de uma padronização, a técnica que tem sido freqüentemente aplicada na análise de DRM em pacientes com LLA é a que detecta rearranjos clonais dos genes de Ig e TCR por meio de qPCR, uma vez que estes são encontrados com
tanto de origem B quanto de T, além de ser atualmente a técnica mais específica (Willemse et al, 2002).
A qPCR é um método preciso, sensível, estritamente quantitativo (Mejstríková
et al, 2010) e fornece informações legítimas a respeito do número e evolução cinética
das células leucêmicas residuais durante o curso da doença (Almeida & Saddi, 2007). Baseado nas seqüências de regiões juncionais paciente-específicas, essa técnica consegue detectar 1 célula leucêmica em 105-106 células normais (Friedmann &
Weinstein, 2000; Willemse et al, 2002). Apesar de ser ainda muito caro e trabalhoso, a
expectativa é que este método seja implantado o mais rápido possível na rotina clínica, para que sirva não apenas para o tratamento da LLA, mas para as demais leucemias que apresentam marcadores moleculares reconhecidos (Almeida & Saddi, 2007).
Para entender bem o processo de formação dos rearranjos gênicos torna-se necessária uma descrição mais detalhada acerca desse assunto. Os linfócitos apresentam dois tipos de receptores de antígenos, que são as imunoglobulinas (produzidas pelas células B) e os receptores de células T (células T). Desta forma, cada célula B produz uma imunoglobulina com uma especificidade única, a qual é determinada pelo seu sítio de ligação ao antígeno, característica que vale também para as células T. Como cada indivíduo possui bilhões de linfócitos, há a habilidade de responder a uma grande quantidade de antígenos. Isso se deve à grande variação na sequência de aminoácidos no sítio de ligação ao antígeno, o qual é formado pelas regiões variáveis (V) das cadeias protéicas dos receptores. Em cada cadeia, a região V está ligada a uma região constante (C) invariável, responsável pelas funções efetoras ou sinalizadoras da molécula. As regiões V são codificadas por vários fragmentos, os chamados segmentos gênicos. Durante o desenvolvimento dos linfócitos, esses segmentos gênicos são arranjados por recombinação somática do DNA para formar a sequência completa da região V, em um processo conhecido como rearranjo gênico, que é comum tanto para os receptores de células B como T (Janeway et al, 2007).
segmentos DH e 6 segmentos Jh, formando 6000 regiões VH diferentes. Assim, se
levarmos em consideração a diversidade que ocorre nas junções entre os diferentes segmentos, como resultado de adição e subtração de nucleotídeos, aproximadamente 1011 diferentes receptores poderiam fazer parte do repertório das células B virgens.
Esses dois meios de diversidade poderiam produzir teoricamente em torno de 1,9x106
moléculas diferentes de anticorpos (Janeway et al, 2007).
Figura 1: Esquema de uma imunoglobulina evidenciando o processo de formação dos rearranjos gênicos nas regiões variáveis que contém os sítios de ligação de antígeno. Os genes das regiões V de cadeia leve são formados pela junção e recombinação dos segmentos gênicos V e J, e as regiões V da cadeia pesada são formadas pelos segmentos gênicos V, D e J.
Janeway et al, 2007.
Figura 3: Esquema mostrando rearranjo e expressão dos genes de cadeias α e do receptor de células T (TCR). Os genes das regiões V (variáveis) de cadeia α são formados pela junção e
recombinação dos segmentos gênicos Vα e Jα, e as regiões V da cadeia são formadas pelos
segmentos gênicos V , D e J . Janeway et al, 2007.
Os genes das imunoglobulinas (Ig) e dos receptores de células T (TCR) são
submetidos a rearranjos durante o processo de diferenciação normal dos linfócitos B e T, respectivamente. Em contrapartida, os blastos da LLA, por sofrerem transformação em um dos estágios da diferenciação linfóide, exibem rearranjos comuns tanto dos genes dos TCRs quanto de Ig, sem uma especificidade de linhagem. Tendo em vista
que os blastos leucêmicos são possivelmente provenientes de um único clone alterado, todas as células neoplásicas devem conter o mesmo padrão de rearranjos de genes das Ig ou TCR (Langerak, 1997). Durante a formação do rearranjo, há uma
inserção ou deleção randômica de nucleotídeos no sítio de junção. Infinitas regiões juncionais diferentes são formadas, cada uma sendo específica de um linfócito (van der Velden & van Dongen, 2009). Desta forma, os rearranjos dos genes de Ig e TCR
funcionam como alvos específicos para detecção de células residuais, sendo usados como marcadores de LLA paciente-específicos (Carroll et al, 2003), e podem ser
A maioria dos pacientes apresenta rearranjos dos loci de cadeia pesada, e não de cadeia leve, indicando sua origem a partir de uma célula pré-B e consistente com seu fenótipo relativamente indiferenciado. Alguns apresentam rearranjos nas cadeias leves também, originados de um precursor um pouco mais desenvolvido (Janeway et
al, 2007).
Ao sofrer transformação maligna, a célula pára no momento em que está no processo de maturação. Assim, o rearranjo dos seus segmentos gênicos, bem como a ação de enzimas que removem e adicionam nucleotídeos nas junções destes segmentos gênicos geram um perfil particular para cada clone subseqüente. Em uma reação de PCR, onde diferentes linfócitos B e T têm junções gênicas específicas amplificadas, há a geração de fragmentos de tamanho diferente devido à diferença nos segmentos utilizados nos rearranjos (Vasquez, 2007).
Entretanto, a análise de PCR por si só não é suficiente para avaliação de clonalidade, a menos que seja complementada por análises que possibilitem saber se os produtos de PCR obtidos são derivados de populações de células linfóides monoclonais ou policlonais. Alguns métodos têm sido aplicados para resolver o problema de background da PCR, que incluem o seqüenciamento direto dos produtos de PCR, SSCP (single-strand conformation polymorphism) (Davis et al, 1993), DGGE
(denaturing gradient gel electrophoresis) (Theodorou et al, 1996; Greiner et al, 1995),
análise de homo/heteroduplex (Peeters & Kotze, 1994;Szczepański et al, 2003), TGGE
(temperature gradient gel electrophoresis) (Linke et al, 1995) e análises de
escaneamento gênico. Entre essas técnicas, a de homo-heteroduplex têm sido a mais utilizada para análise de produtos de PCR de genes de Ig e TCR rearranjados, sendo
mais barata, simples e rápida (Langerak et al, 1997).
A discriminação entre produtos de PCR derivados de populações de células monoclonais ou policlonais é realizada geralmente com desnaturação/aquecimento dos produtos de PCR a 94ºC e rápida renaturação/resfriamento a 4ºC para induzir a formação de bandas homo ou heteroduplexes, sendo separadas de acordo com a conformação por eletroforese em gel de poliacrilamida não-desnaturante. A técnica deste tipo de análise está evidenciada na Figura 4. O surgimento de bandas homoduplex é caracterizado por bandas únicas visíveis em que os produtos de PCR apresentam regiões juncionais idênticas, indicando a presença de células linfóides monoclonais (Figura 4A).
os fragmentos de PCR de fita simples não se complementam totalmente, formando um duplex heterogêneo, ou seja, duas bandas muito próximas no gel de poliacrilamida, com regiões juncionais diferentes, formando uma espécie de “bolha” nessas regiões. A diferença entre um único nucleotídeo de um fragmento para outro já é suficiente para gerar um heteroduplex. No caso de mistura de células monoclonais em um “background” policlonal, tanto bandas homoduplexes quanto bandas heteroduplexes
são formadas (Figura 4B). No gel de poliacrilamida, bandas homoduplexes com regiões juncionais perfeitamente combinadas migram mais rapidamente no gel do que heteroduplexes com regiões juncionais distintas (Figura 4D). Quando muitos heteroduplexes são formados, um rastro pode ser observado, em decorrência da lenta migração dos fragmentos (Langerak et al, 1997).
Figura 4: Diagrama esquemático da técnica de análise de homo/heteroduplex de rearranjos dos genes de Ig e TCR. Essa análise é importante para observar se o rearranjo amplificado provém
de células linfóides monoclonais ou policlonais. *Adaptado de Langerak et al, 1997.
Através da construção de primers direcionados para as regiões juncionais dos rearranjos dos genes das Ig ou TCR, é possível, após a PCR e a análise
do clone leucêmico daquele paciente e pode ser utilizado durante e após o tratamento para a quantificação da DRM. As bandas homoduplex ou heteroduplex são cortadas do gel de poliacrilamida, e os amplicons são seqüenciados, para confirmar se os rearranjos encontrados são de fato rearranjos, e identificar a sequência precisa de nucleotídeos da região juncional, específica de cada paciente. Primers específicos são desenhados para atuar em conjunto com uma sonda e um primer consenso, formando um ensaio de qPCR, para amplificar a região juncional e, consequentemente, determinar a quantidade de células leucêmicas residuais (DRM) relativa a determinado rearranjo.
1.3. Valor prognóstico da DRM
A DRM têm sido objeto de estudo de muitos grupos de pesquisa (Cavé et al,
1998; Pongers-Willemse et al, 1999; Counstan-Smith et al, 2000; Willemse et al, 2002;
Nyvold et al, 2002; Szczepański et al, 2002; Almeida & Saddi, 2007; Borowitz et al,
2008) devido à importância que ela tem como fator prognóstico para as LLAs da infância, associando-a às decisões terapêuticas e ao desenho de novos protocolos de tratamento e estratificando de maneira apurada os pacientes em grupos de risco (Cazzaniga & Biondi, 2005).
O monitoramento seqüencial da DRM durante o tratamento e após a remissão clínica constitui uma ferramenta moderna imprescindível para se avaliar de forma sensível e específica se o tratamento está sendo efetivo ou não (Brisco et al, 2001). De
acordo com Izraeli & Waldman (2004), a redução da carga leucêmica durante as primeiras semanas de terapia constitui um indicador prognóstico de grande valor que substitui quaisquer outros fatores prognósticos convencionais.
O tempo de tratamento aliado à porcentagem de células leucêmicas remanescentes são os principais quesitos utilizados na análise de DRM. Geralmente, os pacientes que apresentam remissão morfológica, mas têm alto nível de DRM (≥0,01% - 0,001%) nos dias 15 (D15) e 29 (D29) (Nyvold et al, 2002) e no final da sexta
semana da terapia de indução têm alto risco de recaída, estando associados a pior prognóstico (Moppett et al, 2003; Carroll et al, 2003; Pui et al, 2004). Ao final da terapia
de indução, o nível de DRM ≤0,0001% está relacionado a baixo risco de recaída, enquanto o nível ≥0,001% está relacionado a um alto risco de recaída (Cavé et al,
1998; van Dongen et al, 1998; Brisco et al, 2001).
estão relacionados a um prognóstico extremamente ruim, sendo necessária a intensificação do tratamento (Campana et al, 2001).
A significância prognóstica da DRM negativa, ou seja, pacientes que apresentam remissão molecular ou por imunofenotipagem (definida como a ausência total ou a presença de menos que 0,01% de linfoblastos na medula óssea) após a terapia de indução se situam em grupos de baixo risco e possuem prognóstico mais favorável (podendo alcançar taxa de sobrevida livre de 86%) (Izraeli & Waldman, 2004), do que aqueles com DRM positiva (0,01% ou mais) (Hoelzer et al, 2002; Carroll
et al, 2003; Rawstron et al, 2007).
A persistência de blastos leucêmicos residuais depois de 4 a 6 meses ou o ressurgimento de doença residual, mesmo no nível de 1x10-4, representa um fator
fortemente relacionado à recaída clínica (Marshall et al, 2003).
Análises estatísticas têm mostrado que o status de DRM registrado ao final da terapia de indução constitui o fator prognóstico mais significativo, independente de outros fatores de risco clinicamente relevantes, tais como idade, contagem de blastos, imunofenotipagem e presença de aberrações cromossômicas ao diagnóstico (Hoelzer
et al, 2002).
O monitoramento periódico da resposta do paciente ao tratamento constitui importante valor clínico, o que permite realizar a inclusão de novas drogas, possíveis modificações na dosagem de medicamentos e a introdução de terapias alvo-específicas e técnicas terapêuticas alternativas, como o transplante alogênico de medula óssea (Almeida & Saddi, 2007).
Assim sendo, pelo monitoramento da DRM, o paciente é avaliado periodicamente durante e depois do tratamento em relação ao seu risco de recaída, e aquele que apresenta alto risco de recaída molecular tem tratamento retomado ou intensificado, utilizando-se medicamentos alternativos ou mais agressivos, a fim de prevenir a recaída hematológica (Vasquez, 2007). Os pacientes que são bons respondedores aos regimes terapêuticos e, portanto, têm baixo risco de recaída, podem ter tratamento mais simplificado, com utilização de medicamentos mais brandos, visando diminuir a toxicidade e as seqüelas.
2. JUSTIFICATIVA
A utilização de técnicas moleculares mais sensíveis para detectar alterações específicas e precisas sobre o nível de DRM é de suma importância, para que haja maior entendimento da biologia da célula leucêmica e para que os pacientes sejam estratificados em grupos de risco, possibilitando o emprego de um tratamento diferenciado para cada paciente e conseqüentemente maior controle da doença.
O estudo multicentro nacional GBTLI-2009 já agrega a ferramenta de análise de DRM por citometria de fluxo ou métodos moleculares (análise de transcritos quiméricos ou de rearranjos de genes de Ig ou TCR). O Núcleo de Onco-Hematologia Pediátrica
(NOHP) do Hospital da Criança de Brasília (HCB) constitui o único serviço público em referência de tratamento de leucemias infantis no Distrito Federal, onde são diagnosticados, em média, 70 a 80 novos casos de LLA por ano. A casuística do NOHP, além de ser uma das maiores do país, se considerada uma única instituição, representa a quase totalidade de portadores de leucemia atendidos em uma única região, o que reduz o viés de seleção de amostra e aumenta a possibilidade de obtenção de uma casuística estatisticamente relevante. No entanto, o NOHP ainda não teve a oportunidade de implantar em sua rotina o monitoramento de DRM por nenhum dos três métodos.
Torna-se necessária a construção de um laboratório de diagnóstico molecular no NOHP para detecção de rearranjos gênicos e monitoramento de doença residual mínima (DRM), considerando que o mesmo é um centro de referência e atende pacientes provenientes das regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste do país.
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Padronização da técnica para detecção de DRM, por meio do uso de qPCR para amplificação dos rearranjos dos genes das imunoglobulinas (Ig) e receptores de
células T (TCR) em crianças em tratamento quimioterápico para LLA
3.2. Específicos
Detectar, utilizando os rearranjos de imunoglobulinas (Ig) e receptores
de células T (TCR) como marcadores, o status de DRM nas diferentes
fases do tratamento quimioterápico:
- Após 15 dias de tratamento (terapia de indução –D15)
- Após 29 dias de tratamento (terapia de indução –D29)
Determinar possíveis associações entre o status de DRM e características clínicas dos pacientes.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Seleção de pacientes
Neste estudo foram incluídas amostras de medula óssea de 30 crianças com LLA-B e 4 crianças com LLA-T, admitidos para tratamento no Núcleo de Onco-Hematologia Pediátrica (NOHP) do Hospital da Criança de Brasília (HCB).
O diagnóstico de LLA foi estabelecido por citologia, imunofenotipagem por citometria de fluxo, citogenética e análise das translocações cromossômicas clássicas por PCR convencional. Tal procedimento é realizado rotineiramente nos laboratórios do NOHP.
As amostras de aspirado de medula óssea (por meio de punção da crista ilíaca póstero-superior) foram coletadas ao diagnóstico e no D15 e D29 da terapia de indução. As coletas já fazem parte da rotina diagnóstica e de seguimento do tratamento dos pacientes, e nenhuma punção adicional foi realizada. A presente pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da FEPECS, cujo número identificador do projeto corresponde a 0528.0.013.012-11. O termo de consentimento livre e esclarecido foi lido e assinado pelos pais e/ou guardiões legais, os quais foram devidamente informados sobre os objetivos da pesquisa (Anexo I).
Os dados clínicos dos pacientes foram coletados retrospectivamente através do preenchimento de ficha clínica composta por identificação, idade, gênero, características epidemiológicas e citomorfológicas, classificação da leucemia por imunofenotipagem, grupo de risco, grau de resposta à terapia indutória por citologia convencional, presença de recaída e status da doença no último seguimento. Essas informações foram armazenadas em fichas individuais com acesso controlado e restrito aos profissionais do HAB.
Os pacientes foram classificados em básico ou alto risco com base nas normas do “Grupo Brasileiro de Tratamento das Leucemias Infantis” (GBTLI-LLA/93).
4.2. Extração de DNA de células mononucleares
AB). Foram utilizados 2mL de ficoll para cada 4mL de aspirado. Ao tubo falcon de 15mL, já contendo ficoll, foram adicionados 4mL de aspirado de medula cuidadosamente para manter as duas fases separadas. Em seguida, o tubo foi centrifugado a 3.000rpm por 20 min. Com esta etapa, é possível verificar a formação de 3 fases, compostas pelo plasma, células mononucleares (linfócitos, monócitos e plaquetas) e os outros componentes do sangue, como eritrócitos e granulócitos. Em seguida, o plasma foi retirado com uma pipeta e descartado. A fase de mononucleares foi então aliquotada e colocada em um tubo de 1,5 mL, onde foi adicionado PBS 1x (phosphate buffered saline) (até o volume máximo do tubo) para lavar. O mesmo foi centrifugado a 5.000 rpm por 5 min. Após essa etapa, o PBS foi retirado e o pellet foi diretamente utilizado para extração de DNA.
O DNA do pellet formado a partir das células mononucleares foi extraído utilizando-se os kits comerciais Invisorb Spin Micro DNA Kit (Invitek) e Wizard®
Genomic DNA Purification Kit (Promega). Algumas adaptações, descritas abaixo, foram realizadas em relação aos protocolos de ambos os kits:
Primeiro kit: Ao pellet composto de células mononucleadas foram adicionados 100 µL de Lysis Buffer M e 30 µl de proteinase K, misturados por vórtex por pelo menos 10 seg, seguido de incubação a 56°C por 30 min. Ao tubo foram acrescentados 100 µL de Binding Buffer B6, e gentilmente misturado por pipetagem. Tal mistura foi passada para um tubo de 2 mL contendo uma coluna de filtro, sendo centrifugada a 12.000rpm por 1 min. Feita essa etapa, foram adicionados 300 µL de Wash Buffer I e o tubo foi novamente centrifugado como na etapa anterior. O tubo contendo o material filtrado foi descartado e o filtro foi transferido em outro tubo de 2 mL. Um volume de 750 µL de Wash Buffer II foi adicionado ao filtro e novamente foi realizada centrifugação como nas etapas anteriores. O filtro foi transferido para novo tubo, o qual foi centrifugado a 12.000rpm por 2 min, a fim de eliminar completamente o etanol residual. A coluna do filtro foi novamente transferida para um novo tubo de 1,5 mL, em que foram adicionados 120 µL de Elution Buffer D (pré-aquecido a 56ºC). Após a adição deste buffer, o sistema foi incubado à temperatura ambiente por 1min. Para eluição do DNA, agora retido no filtro, o tubo foi centrifugado a 8.000rmp por 1 min, e o material eluído foi armazenado a -20°C.
foram acrescentados 200 µL de Protein Precipitation Solution (dependendo do tamanho inicial do pellet foi adicionado o dobro ou triplo dessa quantidade). A mistura foi agitada vigorosamente (vórtex) e deixada a -20ºC durante 10 min, seguida de centrifugação a 13.200 rpm por 10 min. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo contendo 600 µL de isopropanol, misturados por inversão. A próxima etapa incluiu centrifugação na rotação máxima por 2 min. O sobrenadante foi removido, e o pellet foi lavado com etanol 70% e o tubo foi novamente centrifugado, como no passo anterior. Após evaporação completa do etanol em temperatura ambiente, o DNA foi ressuspenso em 100 µL de DNA Rehydration Solution, deixando-se por 1 hora a 65°C ou overnight a 4°C.
A qualidade dos DNAs extraídos foi analisada em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo (1mg/mL). Foram aplicados 4,0 µL de DNA de cada amostra e 4,0 µL de tampão de carregamento. Foi utilizado como padrão de tamanhos de fragmentos o DNA ladder 1Kb plus (Invitrogen).
Para determinar a concentração exata de DNA, 1,0 µL de cada amostra foi quantificado no aparelho NanoVue™ Plus Spectrophotometer (GE Healthcare Life Sciences). Além do valor da quantificação, a razão A260/A280 também foi observada. A partir da concentração dada, todas as amostras foram diluídas com água milli-Q para a concentração de trabalho a 50ng/μL, sendo armazenadas a -20ºC para uso posterior.
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4.3. Amplificação por PCR
A amplificação dos DNAs foi realizada por PCR singleplex, com primers consenso desenvolvidos pelo estudo BIOMED-1 Concerted Action (Pongers-Willemse
et al, 1999), os quais flanqueiam rearranjos dos genes TCRD (incompleto), TCRG
(famílias V I-IV e J 1-3), IgK-Kde e TAL1 (Tabela 1). O gene TAL1 foi incluso neste
estudo como um alvo extra para PCR, pois deleções nesse gene podem ocorrer em 5-15% de LLA-T. Essas deleções sítio-específicas resultam da junção do gene SIL com o
gene TAL1 no cromossomo 1, produzindo regiões de ponto de quebra similares às
Tabela 1: Seqüências dos primers utilizados na PCR segundo o estudo BIOMED-1 Concerted Action.
Gene Segmento Seqüência TCRD Vδ1-5’ 5’-ACTCAAGCCCAGTCATCAGTATCC-γ’
Vδβ-5’ 5’-ACCAAACAGTGCCTGTGTCAATAGG-γ’
Vδγ-5’ 5’-GACCAGACGGTGGCGAGTGGC-γ’
Dδβ-5’ 5’-ACTCCATGTTCAAATAGATATAGTATT-3' Jδ1-γ’ 5’-ACCTCTTCCCAGGAGTCCTCC-γ’
Dδβ-γ’ 5’-CGGGTGGTGATGGCAAAGTGCC-γ’
Dδγ-γ’ 5’-GAAATGGCACTTTTGCCCCTGCAG-γ’
TCRG V I-5’ 5’-CAGGCCGACTGGGTCATCTGC-3'
V II-5’ 5´-CAGCCCGCCTGGAATGTGTGG-γ’
V III-5’ 5’-GACATACCTTGCAAGATATCGAGC-γ’
V IV-5’ 5’-CTGAAATATCTATTTCCAGACCAGC-γ’
J 1.1/β.1-γ’ 5’-TTACCAGTGAAGTTACTATGAGC-γ’
J 1.β-γ’ 5’-AAGAAAACTTACCTGTAATGATAAGC-γ’
J 1.γ/β.γ-γ’ 5’-CCGTATATGCACAAAGCCAAATC-γ’
IgK-Kde VκI-5’ 5’-GTAGGAGACAGAGTCACCATCACT-γ’
VκII-5’ 5'-TGGAGAGCCGGCCTCCATCTC-3'
VκIII-5’ 5'-GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG-3' VκIV-5’ 5’-GGCGAGAGGGCCACCATCAAC-γ’ Intron-5’ 5’-GTTATTCCCAAAAGCTCAATCTCAAAG-γ’
Kde-γ’ 5’-CCCTTCATAGACCCTTCAGGCAC-γ’
TAL1 Sildb-5’ 5’-AAGGGGAGCTAGTGGGAGAAA-γ’
tal1db1-γ’ 5'-AGAGCCTGTCGCCAAGAA-3'
tal1db2-γ’ 5'-TTGTAAAATGGGGAGATAATGTCGAC-3'
Na técnica de PCR singleplex, cada par de primers foi testado individualmente para cada paciente, totalizando 25 reações. Os pares de primers foram enumerados a fim de facilitar a nomenclatura e o manuseio (Tabela 2).
O protocolo sugerido para as reações de PCR em todos os rearranjos foi descrito por van der Velden & van Dongen (2009) composto de: 5,0 µL de tampão a 10X (PE Buffer II); 1,0 µL de albumina sérica de bovino (BSA) a 20 mg/mL; 0,5 µL desoxirribonucleotídeo (dNTP) a 20 mM; 3,0 µL de MgCl2 a 25mM; 0,7 µL de cada
