UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Tese
Seleção de oócitos suínos através do corante
Brilliant Cresyl Blue
Elisa Caroline da Silva Santos
ELISA CAROLINE DA SILVA SANTOS
Seleção de oócitos suínos através do corante Brilliant Cresyl Blue
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do Conhecimento: Biotecnologia da Reprodução Animal).
Orientador: Thomaz Lucia Junior Coorientadores: Arnaldo Diniz Vieira
Ligia Margareth Cantarelli Pegoraro Rafael Gianella Mondadori
Dados de catalogação na fonte:
Maria Beatriz Vaghetti Vieira – CRB-10/1032 Biblioteca de Ciência & Tecnologia – UFPel
S237s Santos, Elisa Caroline da Silva
Seleção de oócitos suínos através do corante Brilliant Cresyl Blue / Elisa Caroline da Silva Santos. – 69f. : il. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia da Reprodução Animal. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2014. – Orientador Thomaz Lucia Junior; co-orientador Ligia Cantarelli Pegoraro, Rafael Gianella Mondadori e Arnaldo Diniz Vieira.
1.Biotecnologia. 2. Suinos. 3. Competência oocitária. 4. BCB. 5. Meios. 6. Toxicidade. 7. Maturação in vitro. I.Lucia Junior, Thomaz. II. Pegoraro, Ligia Cantarelli. III. Mondadori, Rafael Gianella. IV. Vieira, Arnaldo Diniz. V.Título.
CDD: 636.40824
Santos, Elisa Caroline da Silva
Seleção de oócitos suínos através do corante Brilliant Cresyl Blue / Elisa Caroline da Silva Santos. – 69f. : il. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia da Reprodução Animal. Universidade Federal de Pelotas. Centro de
Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2014. – Orientador Thomaz Lucia Junior; co-orientador Ligia Cantarelli Pegoraro, Rafael Gianella Mondadori e Arnaldo Diniz Vieira.
1.Biotecnologia. 2. Suinos. 3. Competência oocitária. 4. BCB. 5. Meios. 6. Toxicidade. 7. Maturação in vitro. I.Lucia Junior, Thomaz. II. Pegoraro, Ligia Cantarelli. III. Mondadori, Rafael Gianella. IV. Vieira, Arnaldo Diniz. V.Título.
Banca examinadora
Prof. Dr. Thomaz Lucia Junior, Universidade Federal de Pelotas (Orientador). Prof. Dr. Augusto Schneider, Universidade Federal de Pelotas.
Prof. Dr. Bernardo Garziera Gasperin, Universidade Federal de Pelotas.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus pela minha vida e por ser fonte de inspiração, força, determinação e sabedoria.
Ao meu orientador Thomaz Lucia Junior: agradeço por ter acreditado em mim e confiado esta responsabilidade. Aos meus coorientadores: Rafael Mondadori, Arnaldo Vieira e Ligia Pegoraro: agradeço pela ajuda no desenvolvimento dos trabalhos, ensinamentos prestados, amizade e bons conselhos.
Ao pesquisador Hisataka Iwata e mestrando Daichi Sato, que auxiliaram o desenvolvimento de parte da tese na Tokyo University of Agriculture.
Aos colegas do ReproPEL, Karina, Fabiana, Raquel, Gustavo Gastal, Zilah, Kauê, Carlos Eduardo, Carine e à todos os estagiários e professores, pela boa convivência, ajuda sempre que necessária e pelos bons momentos que passamos!
Aos colegas da Embrapa, Dona Ledi, Giovane, Elisângela, Jorgea, Miriane, Bruna, Alexander, José, Tainã e Andressa: pela ajuda prestada na condução da tese, convivência alegre e palavra amiga de sempre. Levo vocês no coração!
A minha família, mãe (Zélia Tavares da Silva), irmãos (Paulo, Patricia, Gonçalo, Regina), tia (Catarina Tavares) e amigos incondicionais (Cláudia, Ariadne, Renata, Andressa, Paulo Schmidt) que entenderam minha ausência, minhas falhas, momentos difíceis, souberam lidar com as distâncias, saudades, sempre com amor. Ao Frigorífico Castro pela disponibilização dos ovários suínos, especialmente ao funcionário Nilo, sempre prestativo.
Ao Laboratório de Neurobiotecnologia da UFPel, Professora Luciele Savegnago e Débora Martinez, pelo auxílio na condução do ensaio cometa.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (Capes) pela bolsa concedida durante o Doutorado e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida durante o Doutorado Sanduiche.
A Universidade Federal de Pelotas e à Pós-Graduação em Biotecnologia, pelo qualificado curso de Doutorado.
A todos que de alguma forma auxiliaram no desenvolvimento desta tese...
“Para quem tem pensamento forte, o impossível é só questão de opinião”.
RESUMO
SANTOS, Elisa Caroline da Silva. Seleção de oócitos suínos através de Brilliant
Cresyl Blue. 2014. 69f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas.
Para a obtenção de embriões suínos produzidos in vitro faz-se necessário que a maturação in vitro (MIV) ocorra de forma eficiente, o que exige a seleção dos complexos cumulus-oócitos (CCOs) mais competentes. O corante Brilliant Cresyl
Blue (BCB) permite selecionar os CCOs que completaram seu crescimento,
mediante a avaliação dos níveis da enzima G6PDH. Entretanto, existe um possível efeito nocivo relacionado ao processo de seleção com BCB, o qual pode ser devido a uma toxicidade intrínseca do corante ou aos vários fatores relacionados à composição dos meios para a realização do teste. Desta forma, esta pesquisa teve como objetivos: averiguar a existência de toxicidade após exposição ao BCB e avaliar o efeito de diferentes meios para a coloração com BCB sobre a capacidade de suporte ao desenvolvimento oocitário. Na primeira pesquisa, após a coloração com BCB e após a MIV, vários testes foram realizados para avaliar os efeitos de sua potencial toxicidade sobre a atividade e a funcionalidade mitocondrial: análises de espécies reativas de oxigênio (ROS), ATP, potencial de membrana mitocondrial e número de cópias de DNA mitocondrial. Como resultados, obteve-se que oócitos corados com BCB produziram altos níveis de ROS quando comparados com o controle imediatamente após a coloração e após a MIV. O ATP e potencial de membrana mitocondrial apresentaram resultado similar entre os grupos após a coloração, porém, após a MIV oócitos BCB apresentaram menor potencial de membrana e ATP. Não ocorreu diferença no número de cópias do DNAmt nos grupos avaliados. Já, no teste do conteúdo de ATP em embriões iniciais, o ATP foi inferior em oócitos BCB, porém, não ocorreu diferença significativa. Na segunda pesquisa, comparou-se o meio mais utilizado, D-PBS, com um meio mais elaborado para o BCB, chamado de ReproPEL. Os CCOs submetidos aos dois meios foram submetidos à MIV e avaliados quanto à maturação nuclear e citoplasmática, ativação partenogenética e ao teste cometa. Na MIV nuclear, as maiores taxas de MII (P<0,05) foram obtidas no DPBS+ (63,1%), ReproPELc (55,1%) e ReproPEL+ (50,2%). Quanto à densidade dos GC, os grupos com menor área (P<0,05), evidenciando melhor migração, foram ReproPELc, D-PBS+, D-PBS- e ReproPEL+. A ativação partenogenética demonstrou que o meio ReproPEL possui boa capacidade de manutenção oocitária, possibilitando taxas aceitáveis de desenvolvimento até o estágio de blastocisto: ReproPEL+ (13,0%); e ReproPELc (12,7%). Desta forma, o meio ReproPEL pode ser indicado para a manutenção oocitária, porém não foi o meio mais indicado para o corante BCB. Com relação à toxicidade, após a exposição ao BCB e após a MIV, os oócitos BCB apresentaram alterações em nível mitocondrial, devido ao aumento na produção de ROS, diminuição do potencial de membrana e ao comprometimento da produção de ATP. Porém, a função mitocondrial foi restaurada no início do desenvolvimento embrionário. Com tudo isso, conclui-se que o BCB foi responsável por toxicidade em oócitos suínos imaturos, sendo necessários novos estudos para avaliar as alterações causadas pelo BCB em nível embrionário.
ABSTRACT
SANTOS, Elisa Caroline da Silva. Selection of swine oocytes through Brilliant
Cresyl Blue. 2014. 69f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas.
The production of swine embryos in vitro requires efficient in vitro maturation (IVM), which can be achieved by selection the most competent cumulus-oocyte complexes COC).The Brilliant Cresyl Blue (BCB) dye allows the selection of COC with complete growth by assessing their levels of the G6PDH enzyme. However, there is a possible negative effect of selection with BCB. This effect may be due to its intrinsic toxicity or to factors related to the composition of the media used during the test. This research had the objectives: to determine potential toxicity after exposure to BCB and to evaluate the effect of different medias for BCB staining on the ability to support oocyte development. On the first research, after BCB staining and after IVM, several tests were performed to evaluate the effects of their potential toxicity on mitochondrial activity and functionality: reactive oxygen species (ROS), ATP, mitochondrial membrane potential and the number of copies of mitochondrial DNA. The results showed that oocytes stained with BCB produced high levels of ROS, compared with control immediately after staining and after the IVM. The ATP and mitochondrial membrane potential showed similar results between groups after staining, however, after IVM oocytes BCB showed lower membrane potential and ATP. There was no difference in the number of copies of mtDNA in the evaluated groups. Already, on test of ATP content in early embryos, ATP was lower in BCB oocytes, however, there was no difference statistical. In second study, the most commonly used media, D-PBS, was compared with a more elaborate media for BCB called here: ReproPEL. The COC’s submitted to both media were submitted to nuclear and cytoplasmatic maturation, parthenogenetic activation, and to the comet test. The great rates of nuclear IVM (P<0.05) were obtained for DPBS+ (63.1%), ReproPELc (55.1%) and ReproPEL+ (50.2%). The group with smaller area of CG (P<0.05), showing better migration, were ReproPELc, D-PBS+, D-PBS- and ReproPEL+. The parthenogenetic activation indicated that ReproPEL media presented satisfactory capacity of oocyte maintenance, resulting in acceptable rates of development to blastocyst stage: 13.0% for ReproPEL+; and 12.7% for ReproPELc. So, the ReproPEL media can be used for maintenance of swine oocytes, but it was not the most appropriate media for BCB staining. Moreover, after exposure to BCB and after IVM, BCB oocytes presented high toxicity at mitochondrial level, due to increased production of ROS, decreased membrane potential and compromised ATP production. However, the mitochondrial function was restored in early embryonic development. In conclusion, BCB was responsible for toxicity in immature swine oocytes, nevertheless, further studies must be performed to evaluate the changes caused by BCB in the embryonic level.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ATP- Adenosina tri-fosfato
BCB- Brilliant Cresyl Blue (Azul de Cresyl Brilhante)
BCB(+) Oócito com baixos níveis da G6PDH, corado com Brilliant Cresyl Blue BCB(-) Oócito com altos níveis da G6PDH, não corado com Brilliant Cresyl Blue CO2 - Gás carbônico
COCs- Complexo Cumulus-Oophorus DNAmt- DNA mitocondrial
GC- Grânulos corticais GSH- Glutationa
G6PDH- Glicose- 6- fosfato - desidrogenase
m-DPBS- Salina tamponada com Fosfato segundo Dulbecco’s MIV- Maturação in vitro
MII- Metáfase II
NaDPH- Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina NCSU23- Meio 23 da Universidade da Carolina do Norte VG- Vesícula Germinativa
PIV- Produção in vitro
PIVE- Produção in vitro de embriões PZM- Porcine zygote medium
RNAm- RNA mensageiro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL...12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...14
2.1 Seleção oocitária com Brilliant Cresyl Blue(BCB)...14
2.2 Maturação in vitro de oócitos suínos...15
2.3 Maturação Citoplasmática...16 2.3.1 Grânulos Corticais ...17 2.3.2 Mitocôndrias...18 3. HIPÓTESES...20 4. OBJETIVOS...21 5. ARTIGO 1 Brilliant Cresyl Blue staining negatively affects mitochondrial functions in porcine oocytes...22
5.1 Summary...24
5.2 Introduction...25
5.3 Materials and methods...26
5.4 Statistical Analysis...30 5.5 Results...31 5.6 Discussion...32 5.7 Conclusion...34 5.8 References...34 5.9 Figures...38 6. MANUSCRITO 2 Efeito do meio para a seleção de oócitos suínos através do Brilliant Cresyl Blue na Maturação in vitro, Produção Embrionária e Genotoxicidade...43
6.1 Resumo... ...45 6.2 Abstract...46 6.3 Introdução...47 6.4 Materiais e Métodos...48 6.5 Análise Estatística...51 6.6 Resultados...51 6.7 Discussão...52 6.8 Conclusões...54
6.9 Referências...54
6.10 Figuras...58
7. CONCLUSÕES...62
1. INTRODUÇÃO GERAL
Existe um grande interesse na PIV em suínos com a finalidade de investigação biomédica, devido à similaridade fisiológica com a espécie humana (Abeydeera, 2002). Contudo, os resultados obtidos nesta espécie ainda são considerados insatisfatórios, quando comparados com resultados in vivo ou com demais espécies, como bovinos e camundongos (Kikuchi et al., 1999) em decorrência da MIV citoplasmática incompleta. Durante a MIV na espécie suína, é sabido existir falhas na migração e conteúdo dos grânulos corticais, acarretando em altas taxas de fertilização polispérmica (Dang-Nguyen et al., 2011). Como resultado, esta ineficiência também limita outras biotécnicas que necessitam de blastocistos de qualidade, como a transgenia, produção de células e órgãos para xenotransplantes (Dang-Nguyen et al., 2011).
Desta forma, um dos pré-requisitos para o sucesso da PIV é a qualidade oocitária. Porém, a maior parte das falhas durante a PIV suína é decorrente da seleção de oócitos de baixa qualidade, os quais não apresentam todas as características morfológicas, bioquímicas, celulares e metabólicas para completarem seu desenvolvimento (Naruse et al., 2006). Atualmente são utilizados para os procedimentos in vitro, oócitos provenientes de fêmeas pré-púberes, devido ao baixo custo e abundância destas fêmeas em abatedouros. Contudo, estes oócitos são considerados mais heterogêneos e apresentam competência de desenvolvimento reduzida (Pawlak et al., 2011).
Desta forma, metodologias que possibilitem acesso à determinação da viabilidade, sem causar danos ao oócito, são alternativas para selecionar os gametas mais competentes e melhorar a eficiência dos protocolos de PIV (Goovaerts et al., 2010). Dentre as metodologias de seleção oocitária, o corante
Brilliant Cresyl Blue (BCB) é um método não invasivo que permite acessar a
viabilidade celular através da atividade metabólica do oócito. Porém, este método apresenta-se atualmente bastante controverso. Existem relatos de bons resultados utilizando oócitos selecionados através do BCB (Roca et al., 1998; Wongsrikeao et
al., 2006) entretanto, existe a possibilidade de efeito prejudicial ao oócito, causado
ou pelo BCB (Pawlak et al., 2011) ou devido ao tempo, meio e condições da metodologia utilizada para esta seleção (Goovaerts et al., 2010). Desta forma, o BCB e sua atuação na MIV de oócitos suínos, possível toxicidade, assim como, o desenvolvimento de melhorias neste teste foram o tema deste estudo.
2. REVISÃO BIBIOGRÁFICA
2.1 Seleção oocitária com Brilliant Cresyl Blue (BCB)
O BCB é um corante vital que atua na seleção de oócitos através da avaliação da atividade intracelular da enzima Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Esta enzima da via pentose-fosfato apresenta importante papel de fornecimento de energia para as células, através da liberação de NADPH, sendo produzida em altas quantidades pelo oócito, enquanto este está em sua fase de crescimento (Manglia & Epstein, 1975). Da mesma forma, a atividade da G6PDH decresce enquanto o oócito finaliza esta fase (Ericsson et al., 1993). O teste BCB consiste na avaliação da capacidade da G6PDH em degradar o BCB (Alm et al., 2005). Os oócitos que completaram o crescimento e apresentam maior potencial de competência mantém a cor azul (BCB+), pois a atividade da G6PDH é baixa, sendo incapazes de degradar o corante. Os oócitos que conseguem degradar o corante (BCB-) apresentam alta atividade da G6PDH (Rodríguez-González et al., 2002).
O BCB é considerado um teste simples e eficaz para a seleção oocitária em várias espécies, como suínos (Roca et al., 1998; Wongsrikeao et al., 2006), bovinos (Alm et al.,2005; Opiela et al., 2010), bubalinos (Manjunatha et al., 2007), ovinos (Karami-Shabankareh et al., 2012) e equinos (Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2011). Entretanto, mesmo existindo evidências de que os oócitos classificados através do BCB sejam mais competentes, a utilização deste corante ainda é controversa, pois há estudos que não encontraram diferença entre oócitos corados, que seriam mais viáveis e oócitos não expostos ao corante, o que não justificaria a pré-seleção (Opiela et al., 2008; Ishizaki et al., 2009; Pereira et al., 2013). Além disso, as vantagens do uso do BCB também são contraditórias quanto a um possível efeito deletério (Goovaerts et al., 2010; Vandaele, 2008), pois altas taxas de alterações cromossômicas foram observadas em oócitos BCB provenientes de fêmeas pré-púberes (Pawlak et al., 2011).
A manutenção dos oócitos durante o processo de coloração, normalmente realizado entre 60-90 minutos, antes do início da MIV (Goovaerts et al., 2010), é usualmente feita com meio mDPBS (Pujol et al., 2004; Wongsrikeao et al., 2006; Opiela et al., 2008; Ishizaki et al., 2009; Pawlak et al., 2011). Porém, o meio D-PBS
apresenta baixa complexidade e isto poderia influenciar a competência oocitária durante o tempo de coloração. Neste contexto, o uso de um meio mais complexo, em termos de nutrientes, poderia influenciar positivamente a manutenção da viabilidade oocitária durante o teste BCB. Entretanto, não existem informações referentes ao efeito de meios alternativos que possam ser empregados na manutenção dos oócitos durante o processo de coloração.
Em contrapartida, a exposição dos oócitos suínos ao BCB já foi correlacionada com alterações nos níveis de RNAm e proteínas, responsáveis pelo sucesso da fertilização (Kempisty et al., 2011). Como também, o BCB pode ter sido o responsável por alterações cromossomais em oócitos suínos expostos a esse corante (Pawlak et al., 2011). Da mesma forma, existem relatos de pesquisas onde oócitos BCB+ não apresentaram resultados superiores à oócitos que não foram submetidos ao corante (Ishizaki et al., 2009; Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2011). Estas informações sugerem que o BCB pode apresentar algum nível de toxicidade aos oócitos, reduzindo sua capacidade de desenvolvimento.
2.2 MIV de oócitos suínos
A competência de desenvolvimento ou qualidade oocitária é adquirida progressivamente, enquanto o oócito cresce e matura. Esta é uma etapa de suma importância, pois influencia o desenvolvimento embrionário, a manutenção da prenhez e o desenvolvimento fetal (Krisher et al., 2007).
Quando aspirados a partir de ovários colhidos em abatedouro para a MIV, os oócitos suínos se encontram em diferentes estágios de organização nuclear. Nos folículos antrais, os oócitos inicialmente encontram-se no estágio de vesícula germinativa (VG) e assim que a meiose é retomada, avançam para o estágio de metáfase II (MII) em 32-44 h, completando o processo chamado de maturação nuclear (Wu et al, 2002). Uma série de eventos, concomitantes a meiose, devem ocorrer no citoplasma. Coletivamente, estes eventos são chamados de maturação citoplasmática e são independentes da maturação nuclear (Krisher et al., 2007).
Em suínos, em torno de 70-90 % dos oócitos completam a maturação nuclear in
corpúsculo polar não garante que o oócito apresentará o número normal de cromossomos (Dang-Nguyen et al., 2011). Além disso, os oócitos suínos apresentam reduzida habilidade de desenvolvimento in vitro, possivelmente devido à inadequada maturação citoplasmática (Abeydeera 2001; Krisher, 2004). Os gametas nos quais a maturação nuclear ocorre em tempo normal, geralmente apresentam assincronia entre a maturação nuclear e citoplasmática, podendo não ser fecundados ou não ter desenvolvimento embrionário adequado (Izadyar, 1997). Esta assincronia, explica a alta incidência de polispermia e as taxas insuficientes de desenvolvimento até o estágio de blastocisto, quando comparados com oócitos maturados in vivo, assim como ocorre com outras espécies domésticas in vitro (Dang-Nguyen et al., 2011).
Um fator que têm melhorado a MIV dos oócitos suínos é a redução do estresse oxidativo durante o processo in vitro, causado pela intensa liberação de ROS, através do uso de antioxidantes (Dang-Nguyen et al., 2011). Desta forma, os meios de PIV suína estão sendo aprimorados, em termos de composição, para que suportem da melhor forma o desenvolvimento do oócito suíno in vitro.
2.3 Maturação Citoplasmática
Durante a maturação citoplasmática ocorrem alterações no número, no tamanho e/ou na posição das organelas celulares, em decorrência de uma reestruturação intracelular. Em oócitos imaturos, as mitocôndrias e o complexo de Golgi estão localizados perifericamente. Durante a maturação, as mitocôndrias migram para a região perinuclear, próxima à placa metafásica. Já, o complexo de Golgi se reorganiza centralmente, diminuindo seu desenvolvimento, com agrupamento com o retículo endoplasmático liso (Abeydeera et al., 2002). Os grânulos corticais (GC) migram da região central para a região cortical (Yoshida et al., 1993).
No citoplasma, durante a MIV, ocorre acúmulo de RNAm e proteínas, substratos, nutrientes, reorganização do citoesqueleto e organelas e alterações no metabolismo celular (Krisher et al., 2007). Estas alterações são importantes para que ocorra a ativação, a formação de pró-núcleos e a sustentação do desenvolvimento embrionário pré-inplantação (Ptak et al., 1999).
importante que ocorre durante a maturação. Como a GSH confere proteção celular contra o estresse oxidativo, através de sua medição é possível obter um indicativo da maturação citoplasmática (Maedomari et al., 2007). A concentração intracelular de GSH em oócitos suínos maturados in vivo (36,26 pmol/oócito) é inferior à observada em oócitos maturados in vitro (7.98 pmol/oócito) (Luberda, 2005). Entretanto, um acréscimo nos níveis de GSH foi observado em oócitos suínos maturados in vitro, quando antioxidantes, como a cisteína ou a cistina, são adicionados ao meio de MIV na presença de células do cumulus oophurus, pois estas produzem a GSH, e a transferem para o oócito, através das junções gap (Maedomari et al., 2007).
2.3.1 Grânulos corticais
Os grânulos corticais (GC) são vesículas secretórias que contem enzimas hidrolíticas, proteinases e peroxidades, específicas dos gametas femininos, que são derivadas do complexo de Golgi e formadas enquanto o oócito se encontra em fase de crescimento (Liu et al., 2011). Estas vesículas se direcionam do interior para a região cortical do oócito, durante a maturação. Uma vez relocados, os GC ficam próximos da membrana plasmática. A redistribuição dos GC é um dos passos para a reação cortical, um processo exocitótico cálcio dependente (Tsai et al., 2011).
No momento da fusão do espermatozoide com a membrana plasmática do oócito, ocorre a exocitose do conteúdo dos GC no espaço perivitelino, caracterizando o evento chamado de reação cortical (Dunbar et al., 1994). A reação cortical apresenta extrema importância para a fecundação monospérmica, por promover o bloqueio da zona pelúcida, impedindo a penetração de mais de um espermatozoide, evitando a polispermia (Coy et al., 2008).
Porém, nos sistemas de MIV em suínos, a exocitose dos GC é incompleta e/ou atrasada. Este fato é resultado da liberação de GC com conteúdo imaturo, principalmente devido ao uso de oócitos procedentes de fêmeas pré-púberes (Funahashi, 2003). Assim, a maturação citoplasmática insuficiente e a polispermia nos oócitos suínos maturados in vitro são fatores associados com a baixa eficácia da PIV (Dang-Nguyen et al., 2011).
2.3.2 Mitocôndrias
As mitocôndrias são as organelas mais abundantes no oócito e no embrião em desenvolvimento, sendo responsáveis pela produção de energia em forma de ATP, sinalização do cálcio e apoptose (Iwata et al., 2011). A função mitocondrial pode ser predita com base no conteúdo de ATP e também através do potencial de membrana mitocodrial (Iwata et al., 2011).
A produção de ATP ocorre via fosforilação oxidativa, através do transporte de elétrons na membrana interna mitocondrial (Ramalho-Santos & Amaral, 2013). O número de mitocôndrias pode ser predito com base no DNAmt, pois cada mitocôndria apresenta apenas 1 cópia do genoma (Chiaratti et al., 2010). Durante a oogênese, o número de mitocôndrias aumenta largamente, sendo que o número de cópias do DNAmt aumenta de 100, nos oócitos dos folículos primordiais, para 300.000-400.000, nos oócitos maturos (Jansen & de Boer, 1998).
No período de crescimento do oócito, as mitocôndrias se agrupam em torno da VG e, durante a maturação, migram para a região próxima a placa metafásica, devido ao alto requerimento energético necessário durante a MIV (Spikings et al., 2007). Durante a MIV, os níveis de ATP aumentam consideravelmente e o oócito apresenta uma enorme quantidade de DNAmt. Entretanto, não ocorre replicação deste material genético durante os estágios iniciais da clivagem e do desenvolvimento embrionário pré-implantação (Spikings et al., 2007). Como resultado, há um decréscimo progressivo do conteúdo de DNAmt, o que sugere que o número de cópias do DNAmt precisa ser amplificado em níveis suficientes até o momento da fecundação (El Shoubagy et al., 2006). Portanto, o número de cópias do DNAmt seria um indicador de competência oocitária (Wang & Sun, 2007). Os oócitos BCB+ apresentam mais cópias de DNAmt e tendem a serem fecundados mais facilmente que os BCB-, nos quais, a replicação do DNAmt se encontra atrasada (Spikings et al., 2007).
A disfunção mitocondrial causada pelo estresse oxidativo também tem sido bastante estudada. Quando ocorre estresse oxidativo, há aumento nas ROS, reduzindo o conteúdo de ATP e o potencial de membrana mitocondrial, o que prejudica a MIV e o desenvolvimento embrionário (Zhang et al., 2006). Por ser um indicador de danos funcionais e da qualidade oocitária, as mitocôndrias vêm sendo
3. HIPÓTESES
Hipotetizou-se nesta pesquisa:
1. Que o BCB pode gerar toxicidade ao oócito imaturo, afetando o desenvolvimento embrionário posterior.
2. Que um meio com maior complexidade de componentes pode manter o oócito suíno em condições mais apropriadas durante a seleção oocitária através do BCB.
4. OBJETIVOS
Com base no exposto acima, o presente trabalho teve como objetivos:
1. Averiguar se o BCB é responsável por toxicidade em oócitos suínos imaturos. 2. O desenvolvimento de um meio mais elaborado que substitua o D-PBS, para
a seleção de oócitos através do corante de viabilidade BCB.
5. ARTIGO 1
Brilliant Cresyl Blue staining negatively affects mitochondrial functions in
porcine oocytes
Brilliant Cresyl Blue staining negatively affects mitochondrial functions in porcine oocytes
E.C.S. Santos1)*, D Sato2)*, Lucia Jr. T1), H Iwata2)※
1) Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Campus
Capão do Leão s/n, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil.
2) Tokyo University of Agriculture, Funako 1737 Atsugi City, 243-0037 Japan.
*Both author equally contributed to this study
Summary
The aim of the present study was to examine the effects of Brilliant Cresyl Blue (BCB)
staining on mitochondrial functions in porcine oocytes. Cumulus-oocytes complexes (COCs)
collected from slaughterhouse-derived porcine ovaries were cultured with (13 µM) or without
(0 µM, control) BCB for 60min. Mitochondrial functions in oocytes were examined
immediately after staining or after in vitro maturation. BCB stained oocytes produced
reactive oxygen species (ROS) at higher level than control oocytes immediately after staining
(2.2 fold, P < 0.001) and after maturation (1.7 fold, P < 0.001). The ATP content and
mitochondrial membrane potential (MMP) in oocytes were similar for the two groups
immediately after staining. However, ATP and relative MMP levels were significantly (P <
0.05) lower in BCB-treated oocytes than in control (2.18 vs. 2.83pM, and 0.82 vs. 1.0,
respectively). There was no difference in mitochondrial DNA copy number between the two
groups after maturation. The ATP content in early developmental stage embryos (3 days after
parthenogenetic activation) was lower in BCB-staining group than that in the control group
but the difference was not significant. In conclusion, BCB staining of oocytes at the immature
stage compromises mitochondrial functions throughout oocyte maturation, but the function
restores during early embryo development.
Introduction
Glucose metabolism changes as oocytes grow in follicle, and the activity of
glucose-6-phospatate dehydrogenase (G6PDH) decreased as oocyte attain to their maximum size. The
activity of G6PDH in oocytes can be visualized by staining with Brilliant Cresyl Blue (BCB),
and this simple method has been used in cows (Alm et al., 2005; Janowski et al., 2012;
Castaneda et al., 2013; Silva et al., 2013), in ovine (Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2011;
Wang et al., 2012), and in pigs (Ishizaki et al., 2009) to select for oocytes that have greater
developmental competence. In addition, oocytes determined as competent by BCB staining
have a higher ATP (Catála et al., 2012) level and mitochondrial content (Catála et al., 2011)
compared to oocytes deemed incompetent. However, some studies have reported that BCB
staining itself can exert adverse effects on oocytes. Exposure of porcine oocytes to a BCB
solution changed the levels of mRNA and proteins that are responsible for successful
fertilization (Kempisty et al., 2011) and induced chromosomal aberrations (Pawlak et al.,
2011). In addition, although BCB positive oocytes have higher ability to develop to the
blastocyst-stage embryos than BCB-negative oocytes, this ratio for BCB-positive oocytes
was similar to that for oocytes that had not been subjected to BCB staining (Wongsrikeao et
al., 2006). Moreover, other studies observed no significant differences in developmental
competence between BCB-positive and control oocytes (Ishizaki et al., 2009;
Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2011). These results raise the possibility that BCB staining is toxic to
oocyte. BCB is reduced to a colorless state by NADPH in oocytes. Thus, the reductive ability
of oocytes, which is essential for scavenging potentially harmful free radicals, may be
diminished by BCB staining.
It is well known that reactive oxygen species (ROS) can cause mitochondrial damage in
BCB staining on mitochondrial function in oocytes. To address this question, the effects of
BCB staining on porcine oocyte development and mitochondrial function were examined.
The ROS levels, ATP content, mitochondrial membrane potential (MMP), and mitochondrial
DNA (mtDNA) copy number were determined in oocytes immediately following BCB
treatment and after a maturation period and compared with values obtained from untreated
control oocytes. In addition we compared the ATP content in early developmental stage
embryos derived from oocytes stained with BCB with embryos derived from oocytes not
subjected to BCB staining.
Materials and methods
Chemicals and media
All chemicals were purchased from Nacalai Tesque (Kyoto, Japan) unless otherwise
indicated. The medium used for in vitro maturation (IVM) was North Carolina State
University 37 (NCSU37) solution (Petters and Wells 1993) supplemented with L-cysteine
(0.6 mM) and follicular fluid (10% v/v). The medium used for oocyte washing and ROS and
membrane potential measurement was NCSU37 without follicular fluid but containing 0.1%
BSA. Media used for parthenogetic activation, and IVC were based on PZM4 (Yoshioka et
al, 2002).
Oocyte collection and maturation
Ovaries of pre-pubertal gilts (LWD-pig, six months of age) were collected at a local
slaughterhouse and transported within 1h to the laboratory at 37°C in phosphate-buffered
saline (PBS) that contained 10 IU/mL penicillin G and 0.1 g/mL streptomycin sulfate.
diameter) on the surface of ovaries using a 10mL syringe connected to 18G needle. For the
first 20 h of the maturation period, the oocytes were cultured in IVM medium containing 1
mM dibutyryl cAMP (dbcAMP; Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), 10 IU/mL equine
chorionic gonadotropin (eCG, ASKA Pharma Co. Ltd., Tokyo, Japan), and 10 IU/mL human
chorionic gonadotropin (hCG, Fuji Pharma Co. Ltd., Tokyo, Japan). The oocytes were then
transferred to a maturation medium covered by paraffin oil (10 oocytes/100µl drop, NUNC
A･ S, Roskilde, Denmark) that lacked both dbcAMP and the hormones, and cultured for 24 h
at 38.5ºC in an atmosphere of 5% CO2 and 95% air.
Brilliant Cresyl Blue staining and chromatin configuration
COCs were cultured in an amino acids and glucose-free IVM medium containing 1 mM of
pyruvic acid, 0.1% BSA, and 13 µM BCB (B5388, Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) for
1 h. The oocytes were washed before use in subsequent experiments. The first experiment
was conducted to validate whether our BCB staining methods separate more developed
oocytes. Based on coloration from BCB staining, oocytes were sorted into two groups:
BCB-positive, having a strong blue color; and BCB-negative, having faint or no color. The oocytes
were denuded, fixed in 4% paraformaldehyde and permeabilized in PBS containing triton
X-100 for 30min. The oocytes were mounted with an antifade reagent containing DAPI
(Pro-long gold antifade reagent with DAPI; Invitrogen, OR, USA) on glass slides. The chromatin
configuration of the oocytes was then examined under microscope (Olympus, Tokyo, Japan).
As previously described, chromatin condensation is correlated with oocyte growth, and
highly competent oocytes have a more condensed chromatin configuration (Sun et al., 2004).
Oocytes were thus assigned to one of three categories according to the previous descriptions
germinal vesicles, with the condensed chromatin forming a ring or horseshoe around the
nucleolus. Category II oocytes had a few chromatin clusters at the nuclear membrane.
Category III oocytes had non-condensed chromatin distributed throughout the nucleoplasm.
Thirty oocytes were categolised using BCB staining and repeated using oocytes from
differential ovaries series.
Measurement of ROS levels
Levels of ROS in oocytes immediately after BCB staining or after in vitro maturation were
measured using ROS Detection Reagents (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA,
USA) according to manufacturer’s instructions. In this assay, dihydrocalcein, AM permeates the oocyte cell membrane and is oxidized to emit green fluorescence. Fluorescence was
observed under a fluorescent digital microscope (Keyence, BZ-8000, Tokyo, Japan), and the
fluorescence intensity of each pixel was transformed to obtain a quantitative measure using
Image-J software (NIH, Bethesda, MD, USA). Experiments were conducted 2 times using
20-25 oocytes derived from differential ovaries series. And fluorescence intensities of total
40–50 oocytes per group were used for comparison.
Measurement of ATP content in oocytes and early developmental stage embryos.
The effect of BCB staining on ATP content in individual oocytes was examined
immediately after staining, after in vitro maturation and 3 days after activation. ATP content
was measured as the luminescence generated in an ATP-dependent luciferin–luciferase
bioluminescence assay (ATP assay kit; Toyo Ink, Tokyo, Japan) as previously described
(Iwata et al., 2011). For each sample, individual oocytes were added to 50-μL distilled water.
Microtech, Chiba, Japan). The experiment was performed at least 2 times with 30 oocytes or
embryos in each group for each experiment, and ATP content was compared between the two
oocyte groups.
Oocyte activation
The oocytes were activated in the culture medium containing ionomycin (10µg/ml) and then
incubated for 6h in culture medium containing cytochalasin B (10µg/ml) and cycloheximide
(10µg/ml). After the incubation, oocytes were washed and transferred into culture drop (10
oocytes/50µl) and incubated for 3 days. In vitro culture were performed at 38.5 °C in
atmosphere of 5% CO2 and 5% O2 and 90% N2.
Measurement of MMP
MMP was measured immediately following BCB staining and after in vitro
maturation. Oocytes were cultured for 30 min in NCSU37 medium containing 0.5 µM
MitoTracker Orange (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) a fluorescent
indicator of mitochondrial activity. After staining, oocytes were washed and mounted on a
slide, and fluorescence intensity was measured using a fluorescent digital microscope
(Keyence, BZ-8000, Tokyo, Japan). The measurement was converted to pixel counts using
ImageJ software (NIH, Bethesda, U.S.A.). Experiments were performed in duplicate using 50
oocytes in each group for each experiment, and total fluorescence intensity was compared
between the two oocyte groups.
Measurement of mtDNA copy number
Preliminary observations suggested that the mtDNA copy number varied considerably
among oocytes and donor gilts. However, the mean mtDNA copy number determined for a
the same donor (r = 0.746, P < 0.01), as similar trend has been observed in cows (Iwata et al,
2011). Therefore, 20 oocytes were collected from a single donor and divided into two groups,
with one group of 10 oocytes cultured without BCB and the other with 13 µg/mL BCB for 60
min. After in vitro maturation, mtDNA copy number was compared between BCB-stained
and control oocytes (not subjected to BCB staining). In the comparison, total of 15 gilts were
used. DNA extraction and PCR amplification were conducted according to previously
described methods (Iwata et al., 2011). To obtain the mtDNA copy number, mtDNA was
amplified by real-time PCR using a Rotor-Gene 6500 real-time rotary analyzer (Corbett
Research, Sydney, Australia) with the primer set 5ʹ-CGAGAAAGCACTTTCCAAGG -3ʹ and 5ʹ- CTAATTCGGGTGTTGGTGCT -3ʹ and MESA Blue qPCR MasterMix Plus for SYBR Assay (Eurogentec, Liège, Belgium). The primers were designed using Primer3Plus
(http://sourceforge.net/projects/primer3/) and a porcine mtDNA sequence (ACCESSION
AF304202; from base 8744 to 8914, 151bp). The PCR was performed with initial
denaturation at 95ºC for 5 min, followed by 40 cycles of 95ºC, 58ºC and 72ºC for 20 s at each
temperature. A standard curve was generated for each run using 10-fold serial dilutions
representing copies of the external standard, which was the PCR product of the corresponding
gene cloned into a vector using the Zero Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen, Carlsbad,
USA). Data from the two trials in which the amplification efficiency was < 1.9 were
discarded.
Statistical Analysis
The distribution of chromatin configuration and cleavage ratio of embryos was
analyzed by chi square test, and comparison of mean difference between BCB-treated
oocytes and un-treated oocytes (not subjected to BCB staining) were conducted using
Package for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL). P value less than 0.05 was
considered significantly difference.
Results
BCB positive oocytes had advanced chromatin configuration
A higher fraction of BCB-positive oocytes was assigned to Category I as compared to that of
BCB-negative oocytes (Table 1). Based on the results, we concluded current BCB staining
properly separated oocytes.
Mitochondrial function in oocytes is altered by BCB staining
Immediately after BCB staining and after in vitro maturation (44 h after BCB
staining), levels of ROS were higher for BCB-stained oocytes than for untreated controls
(Figure 1-A, B). The proportion of mitochondria with active membrane potentials was also
affected by BCB staining, such that the relative MMP in in vitro-matured BCB-stained
oocytes was low by 18% compared with that of control matured oocytes (Figure 2-B),
although there was no difference between the two groups immediately after BCB treatment
(Figure 2-A). Similarly, there was no difference in ATP content between BCB-treated and
control oocytes immediately after staining (1.52 vs. 1.62 pM, Figure 3-A), whereas ATP
content in in vitro-matured BCB-treated oocytes was significantly lower than that in control
oocytes (2.18 pM vs. 2.83 pM, P > 0.05; Figure 3-B). When the oocytes were activated and
cultured for 3 days, there was no difference between the cleaved ratio (>=2cell stage) between the BCB treated groups and control group (embryos derived from oocytes not subjected to
BCB staining). ATP content in early developmental stage embryos was still lower for BCB
treated group than that for control group but the difference was not significant (P = 0.24,
MtDNA copy number in BCB stained-oocytes
A comparison of mtDNA copy number of BCB-stained and untreated cohort oocytes is
shown in Figure 4-A.The mtDNA copy number was highly variable among gilt donors,
ranging from 82,383 to 299,817 copies. When the mean mtDNA copy number of total
oocytes was compared between BCB-stained and untreated oocytes, the difference was not
statistically significant (161,787 vs. 145,368, P > 0.05; Figure 4-B). There was a strong
correlation between mtDNA copy numbers of BCB-treated and untreated cohort oocytes
derived from the same donor (r = 0.74, P < 0.001, Figure 4-C). However, when the ratio of
mtDNA copy number of BCB-stained oocytes to mtDNA copy number of control oocytes
was calculated, the mean ratio ± SEM was 1.18 ± 0.07, which was significantly greater than
1.0, indicating that BCB staining increased the mtDNA copy number.
Discussion
This study is the first detailed investigation of the effects of BCB staining on
mitochondrial function in oocytes. The results demonstrate that mitochondrial functions in
oocytes are affected by BCB treatment and the effect continues during oocyte maturation but
the effect diminished until early developmental stage embryos.
BCB staining has been used to select for oocytes with high developmental
competence based on the activity of G6PDH (Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2011;
Mirshamsi et al., 2012). However, it has been suggested that BCB staining is ineffective for
equine oocyte selection (Pereira et al., 2013) and that it may adversely affect the intrinsic
character of porcine oocytes by altering the levels of proteins responsible for fertilization
(Kempisty et al., 2011). BCB is oxidized in oocytes, producing a strong blue color;
study showed for the first time that oocytes cultured with BCB generated high levels of ROS,
immediately after staining and even after 44 h of culture, indicating that BCB staining
negatively affects the redox state in oocytes and that this effect is persistent. Mitochondria are
responsible for the regulation of redox homeostasis (Kang et al., 2012); it was therefore
important to determine whether BCB staining affects mitochondrial function in oocytes.
It was observed in this study that following a period of in vitro maturation, the ATP
content in oocytes increased with respect to the initial level at the germinal vesicle stage,
supporting previous findings in bovines (Stojkovic et al., 2001). Interestingly, MMP and the
ATP content were lower in in vitro-matured oocytes stained with BCB than in untreated
oocytes. MMP increases with oocyte maturation and is thus higher in in vitro-matured
oocytes, reflecting a greater degree of competence (Fujii et al., 2009). A high MMP is also
required for proper cortical granule exocytosis (Van et al., 2007). ATP is a determining factor
for successful fertilization of bovine oocytes, and oocytes cultured in an optimal maturation
medium contained higher levels of ATP than those cultured in a suboptimal medium;
furthermore, disruption of the mitochondrial electron transfer by rotenone reduced the ATP
content and positive fertilization outcomes (Somfai et al., 2012). Therefore, the lower MMP
and ATP levels observed in the present experiments as a result of BCB treatment are
indicative of compromised mitochondrial function, which could ultimately affect following
developmental ability of the oocytes.
In contrast, there was a strong correlation between mean mtDNA copy numbers of
BCB-treated and control oocytes, indicating that oocytes character resemble within individual
donor even after BCB staining. Interestingly, the ratio of mtDNA copy number in
BCB-stained oocytes to the copy number of controls was significantly greater than 1.0. In light of
copy number increased, it can be inferred that BCB staining reduces the overall quality of
mitochondria and the impaired mitochondrial quality stimulates de novo synthesis of
mitochondria. Mitochondrial homeostasis involves a balance between synthesis and
degradation (Weber et al., 2010). Together with it is suggested that in oocytes subjected to
BCB treatment, mitochondrial damage or a low ATP content may enhance mitochondrial
biogenesis, resulting in the accumulation of low-quality mitochondria. In addition, the fact
that early-stage embryos derived from BCB-stained oocytes had still low ATP content
compared with embryos derived from control oocytes but the difference was not significant
suggesting that the damaged mitochondria were partly restored during early embryonic
development.
In conclusion, BCB staining can have potentially damaging effects on oocytes as a
result of the increased production of ROS, a lowering of the MMP, and compromised ATP
production; however, further studies beyond the early developmental stages are required in
order to determine whether these effects can ultimately undermine embryonic development.
Acknowledgement
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25450400 and CNPq-Brazil.
References
Alm, H., Torner, H., Löhrke, B., Viergutz, T., Ghoneim, I.M. & Kanitz, W. (2005). Bovine blastocyst development rate in vitro is influenced by selection of oocytes by brilliant cresyl blue staining before IVM as indicator for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity.
Castaneda, C.A., Kaye, P., Pantaleon, M., Phillips, N., Norman, S., Fry, R. & D'Occhio M.J. (2013). Lipid content, active mitochondria and brilliant cresyl blue staining in bovine oocytes. Theriogenology 79, 417-22.
Catalá, M.G., Izquierdo, D., Uzbekova, S., Morató, R., Roura, M., Romaguera R., Papillier, P. & Paramio, M.T. (2011). Brilliant Cresyl Blue stain selects largest oocytes with highest mitochondrial activity, maturation-promoting factor activity and embryo developmental competence in prepubertal sheep. Reproduction 142, 517-27.
Catalá, M.G., Izquierdo, D., Rodríguez-Prado, M., Hammami, S. & Paramio, M.T. (2012). Effect of oocyte quality on blastocyst development after in vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in a sheep model. Fertility and Sterility 97, 1004-8.
El Shourbagy, S.H., Spikings, E.C., Freitas, M. & St John, J.C. (2006). Mitochondria directly influence fertilisation outcome in the pig. Reproduction 131, 233-45.
Fujii, W. & Funahashi, H. (2009). Exogenous adenosine reduces the mitochondrial membrane potential of murine oocytes during the latter half of in vitro maturation and pronuclear formation following chemical activation. Journal of Reproduction and
Development 55, 187-93.
Ge, H., Tollner, T.L., Hu, Z., Da, M., Li, X., Guan, H., Shan, D., Lu, J., Huang, C. & Dong Q. (2012). Impaired mitochondrial function in murine oocytes is associated with controlled ovarian hyperstimulation and in vitro maturation. Reproduction, Fertility and Development 24, 945-52.
Ishizaki, C., Watanabe, H., Bhuiyan, M.M. & Fukui, Y. (2009). Developmental competence of porcine oocytes selected by brilliant cresyl blue and matured individually in a chemically defined culture medium. Theriogenology 72, 72-80.
Iwata, H., Goto, H., Tanaka, H., Sakaguchi, Y., Kimura, K., Kuwayama, T., Monji, Y. (2011). Effect of maternal age on mitochondrial DNA copy number, ATP content and IVF outcome of bovine oocytes. Reproduction, Fertilily and Development 23, 424-32.
Janowski, D., Salilew-Wondim, D., Torner, H., Tesfaye, D., Ghanem, N., Tomek, W., El-Sayed, A., Schellander, K. & Hölker, M. (2012). Incidence of apoptosis and transcript abundance in bovine follicular cells is associated with the quality of the enclosed oocyte.
Theriogenology 78, 656-69.
Kang, J. & Pervaiz, S. (2012). Mitochondria: redox metabolism and dysfunction.
Biochemistry Research International 2012, 896751.
Kempisty, B., Jackowska, M., Piotrowska, H., Antosik, P., Woźna, M., Bukowska, D., Brüssow, K. P. & Jaśkowski, J. M. (2011). Zona pellucida glycoprotein 3 (pZP3) and integrin β2 (ITGB2) mRNA and protein expression in porcine oocytes after single and double exposure to brilliant cresyl blue test. Theriogenology 75, 1525-35.
Mirshamsi, S.M., Karamishabankareh, H., Ahmadi-Hamedani, M., Soltani, L., Hajarian, H., Abdolmohammadi, A.R. (2013). Combination of oocyte and zygote selection by brilliant cresyl blue (BCB) test enhanced prediction of developmental potential to the blastocyst in cattle. Animal Reproduction Science 136, 245-51.
Mohammadi-Sangcheshmeh, A., Held E., Ghanem, N., Rings, F., Salilew-Wondim, D., Tesfaye, D., Sieme, H., Schellander, K. & Hoelker, M. (2011). G6PDH-activity in equine oocytes correlates with morphology, expression of candidate genes for viability, and preimplantative in vitro development. Theriogenology 76, 1215-26.
Mohammadi-Sangcheshmeh, A., Soleimani, M., Deldar, H., Salehi, M., Soudi, S., Hashemi, S.M., Schellander, K., Hoelker, M. (2012). Prediction of oocyte developmental competence in ovine using glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) activity determined at retrieval time. J. Assist. Reprod. Genet. 29, 153-8.
Pawlak, P., Pers-Kamczyc, E., Renska, N., Kubickova, S. & Lechniak, D. (2011). Disturbances of nuclear maturation in BCB positive oocytes collected from peri-pubertal gilts. Theriogenology 75, 832-40.
Petters, R.M., & Wells, K.D. (1993). Culture of pig embryos. J. Reprod. Fertil. Suppl. 48, 61-73.
Pereira, G.R., Lorenzo, P.L., Carneiro, G.F., Bilodeau-Goeseels, S., Kastelic, J.P., Esteller-Vico, A., Lopez-Bejar, M. & Liu, I.K. (2013). Selection of developmentally competent immature equine oocytes with brilliant cresyl blue stain prior to in vitro maturation with equine growth hormone. Zygote 1, 1-5.
Silva, D.S., Rodriguez, P., Galuppo, A., Arruda, N.S., Rodrigues, J.L. (2013). Selection of bovine oocytes by brilliant cresyl blue staining: effect on meiosis progression,organelle distribution and embryo development. Zygote 21, 250-5.
Somfai, T., Inaba, Y., Watanabe, S., Geshi, M. & Nagai, T. (2012). Follicular fluid supplementation during in vitro maturation promotes sperm penetration in bovine oocytes by enhancing cumulus expansion and increasing mitochondrial activity in oocytes. Reprod.
Fertil. Dev. 24, 743- 52.
Stojkovic, M., Machado, S.A., Stojkovic, P., Zakhartchenko, V., Hutzler, P., Gonçalves, P.B. & Wolf, E. (2001). Mitochondrial distribution and adenosine triphosphate content of bovine oocytes before and after in vitro maturation: correlation with morphological criteria and developmental capacity after in vitro fertilization and culture. Biol. Reprod. 64, 904- 9.
Sun, X. S., Liu, Y., Yue, K.Z., Ma, S.F. & Tan, J.H. (2004). Changes in germinal vesicle (GV) chromatin configurations during growth and maturation of porcine oocytes. Mol.
Reprod. Dev. 69, 228-34.
Van Blerkom, J., Davis, P. (2007). Mitochondrial signaling and fertilization. Mol. Hum.
Yoshioka, K., Suzuki, C., Tanaka, A., Anas, I.M. & Iwamura, S. 2002. Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium. Biol. Reprod. 66, 112-119.
Wang, L., Lin, J., Huang, J., Wang, J., Zhao, Y. & Chen, T. (2012). Selection of ovine oocytes by brilliant cresyl blue staining. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012, 161372.
Weber, T.A. & Reichert, A.S. (2010). Impaired quality control of mitochondria: aging from a new perspective. Exp. Gerontol. 45, 503-11.
Wongsrikeao, P., Otoi, T., Yamasaki, H., Agung, B., Taniguchi, M., Naoi, H., Shimizu, R. & Nagai, T. (2006). Effects of single and double exposure to brilliant cresyl blue on theselection of porcine oocytes for in vitro production of embryos. Theriogenology 66, 366-72.
Zhang, W., Liu, Y., An, Z., Huang, D., Qi, Y., Zhang, Y. (2011). Mediating effect of ROS on mtDNA damage and low ATP content induced by arsenic trioxide in mouse oocytes.
Figures
1 2 3
Positive 40 20 (50.0)a 13 (32.5) 7 (17.5)a
Negative 22 5 (22.7)b 4 (18.2) 13 (59.1)b
Table1. Chromatin configuration of oocytes categorized based on the BCB staining.
Chromatin Configuration (%)
a-b, P<0.05. Oocytes were divided into 3 categories based on chromatin configurations. About 30 oocytes were subjected to BCB staining and the experiment was repeated 2 times.
BCB No. of oocytes
Groups No. of oocytes No.of cleaved embryos ATP content in embryo (pM) Control 128 66 1.33±0.16 BCB 157 65 1.14±0.12 Total 285 131
Table 2. ATP content in early developmental embryos derived from oocytes stained with BCB.
6. MANUSCRITO 2
Efeito do meio para a seleção de oócitos suínos através do Brilliant Cresyl
Blue na Maturação in vitro, Produção Embrionária e Genotoxicidade
Efeito do meio para a seleção de oócitos suínos através do Brilliant Cresyl Blue na Maturação in vitro, Produção Embrionária e Genotoxicidade
Santos, E.C.S.1; Pradieé, J.2; Mirapalheta, E.M.2; Mion, B.2; Pereira, M.M.4; Lazari, J.C.4; Mondadori, R.G.3; Vieira, A.D. 2; Pegoraro, L.M.C.4; Lucia,T. Jr.*1,2
1Centro de Desenvolvimento Tecnológico, 2Faculdade de Veterinária, 3 Instituto de Biologia,
Universidade Federal de Pelotas (UFPel) Pelotas
4Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS, Brasil.
*Autor para correspondência: Faculdade de Veterinária, Campus Capão do Leão, Universidade Federal de Pelotas, CEP 96010-900, Pelotas, RS, Brasil, Fone: +55 53 3275 7644, E-mail: tluciajr@gmail.com
Resumo
A PIV de embriões suínos ainda apresenta resultados pouco satisfatórios, quando comparada com outras espécies domésticas, o que pode ser atribuído à seleção de oócitos de baixa qualidade. A coloração com Brilliant Cresyl Blue (BCB) permite a avaliação da atividade intracelular da enzima G6PDH, presente em altas concentrações nos oócitos em crescimento, nos quais o BCB é degradado com mais facilidade do que nos oócitos com crescimento finalizado. Assim, os oócitos mais viáveis permanecem corados em azul. Entretanto, o único meio usado para a seleção de oócitos com BCB é o D-PBS. Esta pesquisa objetivou avaliar um novo meio, chamado de ReproPEL, para a seleção de oócitos suínos com BCB. Oócitos obtidos de ovários de fêmeas suínas pré-púberes abatidas em um frigorífico foram corados com BCB (13 µM) durante 60 min, nos meios D-PBS e ReProPEL, posteriormente separados em corados (+) e sem coloração (-), compondo 6 grupos: DPBS+; DPBS-; ReproPEL+; ReproPEL-; DPBSc; e ReproPELc (os dois últimos sendo grupos controle, sem contato com o corante). Os oócitos foram maturados in vitro em NCSU-23, durante 48 h e avaliados quanto a MIV nuclear, densidade dos grânulos corticais (GC), ativação partenogenética e teste cometa. Na MIV nuclear, as maiores taxas de MII (P < 0,05) foram obtidas no DPBS+ (63,1%), ReproPELc (55,1%) e ReproPEL+ (50,2%). Quanto à densidade dos GC, os grupos com menor área (P < 0,05), evidenciando melhor migração, foram ReproPELc, PBS+, D-PBS- e ReproPEL+. A ativação partenogenética demonstrou que o meio ReproPEL possui boa capacidade de manutenção oocitária, possibilitando taxas aceitáveis de desenvolvimento até o estágio de blastocisto: ReproPEL+ (13,0%); e ReproPELc (12,7%). Conclui-se que o meio ReProPEL pode ser usado para a manutenção de oócitos suínos, porém não é o mais indicado para a seleção de oócitos através do BCB.
Abstract
The results of IVP of swine embryos are still unsatisfactory, when compared to other domestic species, which may be due to the selection of oocytes of poor quality. Staining with
Brilliant Cresyl Blue (BCB) allows the evaluation of the intracellular activity of the G6PDH,
an enzyme present in high concentrations in growing oocytes, in which BCB is degraded more intensively than in grown oocytes. Thus, oocytes with greater viability are stained in blue. However, the D-PBS is the only medium used for oocyte selection through BCB. The objective of this study was to test a new medium called ReproPEL for selection of oocytes using BCB. Oocyes obtained from ovaries of prepubertal gilts slaughtered in an abattoir were stained with 13 µM BCB during 60 min in the D-PBS and ReProPEL media, subsequently classified in stained (+) or unstained (-), composing 6 groups: DPBS+; DPBS-; ReproPEL+; ReproPEL-; DPBSc; and ReproPELc (the last two considered as controls, with no contact with BCB). Oocytes were matured in vitro in NCSU-23 during 48 h and evaluated for nuclear IVM, density of cortical granules (CG), parthenogenetic activation and comet assay. The greater rates of nuclear IVM (P < 0.05) were obtained for DPBS+ (63.1%), ReproPELc (55.1%) and ReproPEL+ (50.2%). The groups with smaller area of CG (P < 0.05), showing better migration, were ReproPELc, D-PBS+, D-PBS- and ReproPEL+. The parthenogenetic activation indicated that the ReproPEL medium presented satisfactory capacity of oocyte maintenance, resulting in acceptable rates of development to the blastocyst stage: 13.0% for ReproPEL+; and (12.7%) for ReproPELc. In conclusion, the ReproPEL medium can be used for maintenance of swine oocytes, but not for oocyte selection through BCB.
Introdução
Em suínos, as tecnologias de reprodução assistida não têm acompanhado o desenvolvimento observado em outras espécies de animais domésticos (Du et al., 2008). A qualidade oocitária é fundamental para a realização bem sucedida da PIV (Pawlak et al., 2011; Lee et al., 2013). Porém, ainda que produtos nascidos a partir de embriões suínos fecundados in vitro já tenham sido obtidos (Wongsrikeao et al., 2006) suas taxas insatisfatórias de sucesso (2-36%) tem sido atribuídas à baixa qualidade oocitária e à grande variação no percentual de blastocistos (Pawlak et al., 2012). Esta baixa eficiência na espécie suína também está relacionada com eventos da maturação citoplasmática, tais como: falha na migração e conteúdo imaturo dos grânulos corticais, o que resulta em altas taxas de polispermia (Funahashi, 2003; Dang-Nguyen et al., 2011); baixos níveis de glutationa in vitro 7,98 (pmol/oócito) em comparação com os níveis observados in vivo 36,26 (pmol/oócito) (Brad et al., 2003); e assincronia com a maturação nuclear (Funahashi, 2003; Dang-Nguyen et al., 2011). Portanto, ainda são necessárias melhorias no processo de seleção e nas condições dos meios de manipulação e de MIV, ajustadas ao metabolismo do oócitos suínos (Krisher et al., 2007; Kikuchi et al., 2002).
Metodologias que permitam a seleção dos oócitos mais competentes, bem como a exposição dessas estruturas a meios mais adequados, são alternativas para aprimorar os índices de PIV em suínos. Dentre os métodos não invasivos disponíveis para seleção oocitária, o corante Brilliant Cresyl Blue (BCB) tem sido usado para indicar a competência de oócitos (Roca et al., 1998; Alm et al. 2005; Wongsrikeao et al., 2006). Este corante de viabilidade é degradado através da enzima G6PDH desidrogenase, que apresenta atividade reduzida em oócitos que já completaram seu crescimento, porém tem alta atividade em oócitos que estão em fase de crescimento (Roca et al., 1998; Wongsrikeao et al., 2006). Desta forma, oócitos com maior competência permanecerão corados pelo BCB, sendo classificados como BCB+, e os oócitos com menor competência não serão mantido corados, por serem capazes de metabolizar o corante. Para seleção de oócitos com BCB, o D-PBS tem sido utilizado como meio para incubação, por até 90 min em concentrações de 13 à 26 µM (Romar et al., 1998), pois o BCB torna-se tóxico acima de 52 µM (Rodriguez-Gonzalez et al., 2002). O período de incubação com BCB pode comprometer o desenvolvimento embrionário posterior (Goovaerts et al., 2010; Vandaele, 2008). Como existe a possibilidade deste comprometimento ser decorrente da capacidade de manutenção do meio, é necessário
determinar a efetividade do teste de BCB usando um meio com maior complexidade de nutrientes.
Diversos estudos foram conduzidos visando à formulação de meios com composição semelhante a dos fluídos presentes no oviduto no e útero das fêmeas. Um dos primeiros meios desenvolvidos foi o fluído sintético de oviduto (SOF), desenvolvido para PIV em bovinos (Takahashi & First 1992; Holm et al., 1994). Para a PIV em suínos, o meio NCSU (Petters & Wells, 1993) serviu como base para o desenvolvimento do meio PZM (Porcine
zygote medium), elaborado com base na composição dos fluídos de oviduto de fêmeas suínas
(Yoshioka et al., 2002). Entretanto, a composição destes meios ainda não simula completamente os fluídos naturais. Ainda que vários compostos presentes nestes meios, tais como frutose (Wongsrikeao et al., 2006), glicina (Hong & Lee, 2007), citrato e mio-ynositol adotados no meio SOFaaci (Holm et al., 1999), favoreçam o desenvolvimento oocitário in
vitro, ainda é necessário averiguar se os compostos presentes nos meios SOFaaci e PZM
podem ser utilizados na composição de um novo meio, elaborado para manter a viabilidade oocitária durante a realização do teste com BCB.
Baseado neste contexto, este estudo objetivou comparar dois meios, um mais simples (D-PBS) e um mais elaborado (ReproPEL) durante a seleção de oócitos suínos com o corante BCB, avaliando as taxas de maturação nuclear, citoplasmática, desenvolvimento embrionário e genotoxicidade.
Materiais e Métodos
Seleção oocitária e avaliação da maturação nuclear
Ovários de fêmeas suínas pré-púberes foram coletados em frigorífico local e transportados em NaCl 0,9 % acrescida de gentamicina (50 µg/mL), em temperatura de 30-35 °C. No laboratório, os complexos cumullus oócito (CCOs) foram recuperados a partir de folículos com 3-6 mm de diâmetro, através de aspiração com auxílio de bomba de vácuo (pressão de 14 mmHg). Somente os oócitos com citoplasma homogêneo e com células do cumulus oophurus compactas foram selecionados para MIV. Após a classificação morfológica, os CCOs foram colocados em dois meios (Tabela 1) ReproPel e D-PBS. Os CCOs permaneceram durante 60 min, em placa Nunc 4 poços, em estufa com atmosfera de 5% CO2 e temperatura de 39 °C, em 2 gotas de 400 µL de cada meio, uma contendo 13 µM
