INTRODUÇÃO À GENÉTICA FORENSE
Professores:
Dario Grattapaglia Luciano Chaves Arantes
Período:
03/02/2003 a 15/02/2003
Patrocínio:
UNIVERSIDADE CATÓLICA DE BRASÍLIA – UCB Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia
ÍNDICE
Plano de ensino 3
Identificação 3
Pré-requisitos 3
Estrutura geral da disciplina 3
Ementa básica 4
Objetivos 5
Número e duração das aulas 5
Dinâmica das aulas 6
Bibliografia e apoio didático 6
Avaliação 9
Seminário – roteiro e instruções 10
Orientações gerais 11
Patrocínio 12
Cronograma do curso 13
PLANO DE ENSINO
Introdução à Genética Forense – 1º Semestre de 2003
Identificação
Curso: Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia Disciplina: optativa
Créditos: 4 Vagas: 10
Professores: Dario Grattapaglia e Luciano Chaves Arantes Período: 03/02/2003 a 15/03/2003
Horário: 8:00 às 18:00 (segunda-feira à sexta-feira), 8:00 às 12:30 (sábado)
Local: Laboratório de Biotecnologia Genômica Universidade Católica de Brasília
SGAN 916 Módulo B - fone 61 340 5550
Pré-requisitos
Genética básica em nível de graduação, estatística básica em nível de graduação, experiência comprovada de trabalho em laboratório e disponibilidade total no período do curso.
Estrutura geral da disciplina
Aulas teóricas abordando os principais assuntos técnicos e científicos sobre a utilização da análise genética do DNA em estudos forenses, acompanhadas de aulas práticas nas quais o estudante terá a oportunidade de desenvolver procedimentos laboratoriais de extração de DNA e análise de polimorfismos genéticos de marcadores moleculares e de acompanhar demonstração de seqüenciamento de DNA. Seminários técnicos científicos serão ainda preparados e ministrados pelos alunos no final do curso abordando aspectos técnicos ou históricos da genética forense, artigos científicos específicos ou ainda a apresentação de casos famosos da história recente da genética forense. Para as aulas práticas a turma será dividida em 3 grupos de 3 ou 4 pessoas e para cada grupo serão fornecidos um ou mais casos
forenses simulados para resolução. Em cada um dos casos será necessário utilizar diferentes tecnologias de análise de polimorfismos.
Ementa básica
Aulas teóricas Conceitos básicos de genética Mendeliana e de biologia molecular aplicáveis à análise de DNA; História do desenvolvimento da genética forense; Coleta e preparo de amostras forenses, cadeia de custódia; amostras forenses: DNA degradado, inibidores de PCR, contaminação, misturas; base genética de marcadores moleculares, PCR, RFLP´s, STR´s; propriedades especiais dos marcadores microssatélites (stutters, ± A, microvariantes etc.); base genética e aplicações de marcadores microssatélites no cromossomo Y; base genética e aplicações de polimorfismos no DNA mitocondrial e Alu repeats métodos de separação e detecção de polimorfismos de DNA; revisão dos conceitos básicos de genética de populações aplicáveis à análise de DNA; princípios básicos de cálculos forenses de individualidade e paternidade; estudo de casos de paternidade: riscos de falsas inclusões e mutações múltiplas; DNA forense em não-humanos: aplicações e estudo de caso de investigação de incêndio florestal; validação laboratorial, considerações sobre montagem de laboratório forense; bancos de dados de freqüências alélicas: considerações estatísticas e populacionais; novas tecnologias de análise genética forense: SNPs, microarrays, espectrometria de massa; organizações internacionais de genética forense, controle de qualidade, bancos de dados, treinamento; aspectos legais do uso de análise de DNA
Aulas práticas. Extração e quantificação de DNA de amostras biológicas referência e de amostras de casos forenses simulados; montagem de reações de PCR de STR; preparo de géis de poliacrilamida para detecção com nitrato de prata; carregamento, revelação e interpretação de géis de poliacrilamida; análise e interpretação de polimorfismos de DNA em seqüenciador automático; demonstração de seqüenciamento de mt-DNA; genotipagem de STR; estudo de casos: investigação de paternidade, identificação individual em caso de estupro; cálculos forenses; construção de bancos de dados de freqüências alélicas.
Objetivos
Formação básica e desenvolvimento de uma visão crítica sobre os conceitos fundamentais da genética forense envolvendo: (1) a base genética e propriedades moleculares das principais
classes de marcadores moleculares utilizados em análise genética forense; (2) os procedimentos básicos de coleta, processamento e análise genética de amostras forenses; (3) os conceitos básicos utilizados na análise estatística de parentesco, individualidade e construção de bancos de dados para fins forenses; (4) aspectos legais da utilização de análise genética, organizações internacionais de genética forense, novas tecnologias.
Capacitação básica em procedimentos laboratoriais utilizados em genética forense envolvendo: (1) Extração e quantificação de DNA de amostras forenses; (2) PCR de STR em sistemas multiplexes de análise; (3) Detecção de polimorfismos de STR em géis de poliacrilamida com detecção via coloração com nitrato de prata e detecção semiautomatizada por fluorescência em seqüenciador automático; (4) Seqüenciamento e análise de polimorfismos em DNA mitocondrial; (5) Interpretação de polimorfismos e genotipagem; (6) Cálculos de genética forense e construção de bancos de dados.
Número e duração das aulas
Aulas teóricas: 11 encontros de 4 horas das 8:00 às 12:00 Aulas práticas: 9 encontros de 4 horas das 14:00 às 18:00.
Dinâmica das aulas
A disciplina se baseia em uma intensa participação dos alunos e forte interação entre estes e o professor na condução dos encontros. Uma programação detalhada do curso é apresentada a seguir. O sucesso do aluno vai depender em grande parte do tempo que este dedicar ao estudo fora da sala de aula seja individualmente ou em grupo. O papel do professor será o de orientar as atividades de estudo independente dos alunos, dirimir dúvidas e aprofundar as discussões nos temas delineados no roteiro.
As aulas serão conduzidas seguindo um roteiro disponibilizado aos alunos no dia da aula. Para as aulas práticas, um roteiro detalhando todas atividades diárias e protocolos laboratoriais será disponibilizado a uma semana do início do curso. As aulas expositivas serão complementadas pela apresentação de seminários por parte dos alunos sobre temas previamente determinados na área de genética forense.
Bibliografia e apoio didático
A referência básica do curso é um livro muito atual e em inglês sobre tipagem de DNA forense. Leituras específicas deste livro serão determinadas ao longo das aulas para fixação do conteúdo ministrado.
Butler, J.M. 2001. Forensic DNA typing. Biology and technology behind STR markers. Academic Press. 322 p.
Inman, K., Rudin, N. 1997. Introduction to Forensic DNA Analysis. CRC Press, New York. 256 pp.
Tendo em vista a dificuldade para a aquisição destes livros, serão disponibilizadas uma cópia de cada para consulta dos alunos matriculados.
A biblioteca da pós-graduação da Universidade Católica de Brasília conta com dois livros em português que foram doados pela Editora da Fundação de Pesquisas Científicas de Ribeirão Preto (Funpec-RP Editora):
Conselho Nacional de Pesquisa. 1999. A Tecnologia do DNA na Ciência Forense.
FUNPEC-RP Editora. 202 p.
Conselho Nacional de Pesquisa. 2001. A Avaliação do DNA como Prova Forense.
FUNPEC-RP Editora. 283 p.
Além desses livros são indicados alguns outros livros básicos em português e uma série de artigos científicos para apoio didático das aulas. Finalmente estará disponível uma sala de computadores ligados à Internet para consulta das várias web pages existentes sobre o assunto para o estudo, análises estatísticas, preparação do seminário e relatório de aulas práticas.
1. Alford, RL; Hammond, HA; Coto, I; Caskey, CT. Rapid and efficient resolution of parentage by amplification of short tandem repeats. Am J Hum Genet 55:190-195, 1994.
2. Álvarez, JC; Entrala, C; Lorente, JA; Lorente, M; Fernández-Rosado, FJ; Martínez-Espín, E;
Rodríguez, E; Villanueva, E. Análisis de ADN mitocondrial. Forénsica 1(1):40-59, 2001.
3. Anderson, S; Bankier, AT; Barrell, BG; de Bruijn, MHL; Coulson, AR; Drouin, J; Eperon, IC;
Nierlich, DP; Roe, BA; Sanger, F; Schreier, PH; Smith, AJH; Staden, R; Young, IG. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290(9):457-465, 1981.
4. Arantes, LC. Análise da Variação Genética em Treze Locos STR na População do Distrito Federal. Universidade de Brasília. Dissertação de Mestrado. 120 p., 1999.
5. Beamonte, D; Guerra, A; Ruíz, B; Alemy, J. Microsatellite DNA polymorphism analysis in case of na illegal cattle purchase. Journal of Forensic Sciences 40(4):692-694, 1995.
6. Bio-Rad. Acrylamide polymerization – a pratical approach. US/EG Bulletin 1156:1-8, 1997.
7. Bowers, JE; Meredith, CP. The parentage of a classic wine grape, Carbenet Sauvignon.
Nature Genetics 16:84-87, 1997.
8. Brondani, RPV; Brondani, C; Tarchini, R; Grattapaglia, D. Development, characterization and mapping of microsatellite markers in Eucaliptus grandis and E. urophylla. Theor Appl Genet 97:816-827, 1998.
9. Budowle, B; Brown BL. El uso del análisis de ADN en la identificación forense. Forénsica 1(1):9-22, 2001.
10. Busque, MDL; Desmarais, D; Provost, S; Schumm, JW; Zhong, Y; Chakraborty, R. Analysis of allele distribuition for six short tandem repeat loci in the french Canadian population of Québec. Journal of Forensic Science 42:1147-1153, 1997.
11. Butler, JM. STR analysis by time-of-flight mass spectrometry. Profiles in DNA 2(3):3-6.
12. Coyle, HM; Ladd, C; Palmbeach, T; Lee, HC. The green revolution: botanical contributions to forensics and drug enforcement. Croatian Medical Journal 42(3):340-345, 2001.
13. Crouse, CA; Rogers, S; Amiott, E; Gibson, S; Masibay, A. Analysis and interpretation of short tandem repeat microvariants and three-banded allele patterns using multiple allele detection systems. Journal of Forensic Sciences 44(1):87-94.
14. Edwards, A; Civitello, A, Hammond, HA; Caskey, CT. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. Am J Hum Genet 49:746-756, 1991.
15. Ferreira, ME, Grattapaglia, D. Introdução Ao Uso de Marcadores Moleculares Em Análise Genética. 3. ed. Brasília: Embrapa, 1998. 222p.
16. Grattapaglia, D; Bolzon, A; Ferreira, ME. Número adequado de locos analizados via PCR em exames de paternidade: vantagens em se utilizar baterias de 16 ou mais locos STR para proteção contra falsas inclusões e mutações. Laes & Haes 21(126):122-139, 2000.
17. Grattapaglia, D; Schimidt, AB; Silva, CC; Stringher, C; Fernandes, AP; Fereira, ME. Brazilian population database for the 13 STR loci of the AmpFlSTR Profiler Plus and Cofiler multiplex kits. Forensic Science International 118:91-94, 2001.
19. Gusmão, L; Brion, M; González-Neira, A; Lareu, M; Carracedo, A. Y Chromossomo specifc polymorphism in forensic analysis. Legal Medicine 1:55-60, 1999.
20. Lins, AM; Sprecher, CJ, Puers, C; Schumm, JW. Multiplex sets for the amplifications of Polymorphic short tardem repeat loci - silver stain and fluorescence detection. BioTechniques 20:882-889, 1996.
21. Martin, PD; Schmitter, H; Schneider, PM. A brief history of the formation of DNA databases in forensic science within Europe. Forensic Science International 119:225-231, 2001.
22. Powell, W; Machray, GC; Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats.
Elsevier Trends Journals 1:215-222, 1996.
23. Ruitberg, CM; Reeder, DJ; Butler, JM. STRBase: a short tandem repeat DNA database for the human identity testing community. Nucleic Acids Research 29:302-322, 2001.
24. Savolainen, P; Lundeberg J. Forensic evidence based on mt-DNA from dog and wolf hairs.
Journal of Forensic Sciences 44(1):77-81.
25. Sensabaugh, G; Kaye, DH. Non-human DNA evidence. Jurimetrics J. 38:1-16, 1998.
26. Tereba, A. Tools for analysis of population statistics. Profiles in DNA 2(3): 14-16.
Avaliação
A avaliação do desempenho dos estudantes será contínua e realizada de várias formas de maneira a dar diversas oportunidades do estudante manifestar e concretizar o seu interesse pela disciplina. Cada elemento da avaliação tem seu peso específico conforme descrito a seguir. A nota mínima para aproveitamento da disciplina é 7,0 (numa escala de 0 a 10) conforme regimento interno da UCB.
Relatório de aula prática (30%): cada grupo deverá entregar um relatório completo dos resultados e discussão dos experimentos desenvolvidos durante as aulas práticas. Este relatório deverá conter duas seções:
1) Resultados: nesta seção, deverão ser apresentados todos os resultados, positivos e negativos, dos experimentos realizados incluindo imagens dos géis, tabelas de genótipos, seqüências de DNA, análises estatísticas realizadas, tabelas de bancos de dados;
2) Discussão: nesta seção os resultados deverão ser discutidos no contexto do que foi estudado ao longo do curso e, além disso, deverão ser apresentadas as conclusões dos casos forenses realizados.
Seminário (30%): no primeiro dia de aula serão determinados grupos de trabalho para as aulas práticas e a preparação do seminário. Os temas de seminário previamente determinados serão sorteados entre os grupos para a apresentação no penúltimo dia de curso. O trabalho consiste em uma apresentação oral de 30 minutos sobre o tema utilizando recursos audiovisuais (powerpoint) e a entrega para os demais alunos de um roteiro do seminário contendo a impressão dos slides apresentados.
Prova (40%): será realizada uma prova final sobre toda a matéria discutida na disciplina incluindo as aulas práticas. O objetivo desta prova é avaliar o empenho e interesse de cada estudante no curso e o entendimento crítico dos conceitos discutidos ao longo das aulas. Na prova será buscada a capacidade de integrar conceitos discutidos e propor formas de resolver problemas e não de simplesmente repetir definições ou descrever experimentos discutidos durante as aulas.
Seminário – Roteiro e instruções
No primeiro dia de aula serão compostos 3 grupos de trabalho, cada um com 3 ou 4 pessoas selecionadas de forma planejada. Os temas do seminário serão sorteados dentre os seguintes:
1. O caso O.J. Simpson;
2. O projeto Inocência – “ Innocence Project”;
3. Utilização de DNA não-humano na investigação forense;
4. DNA forense na justiça brasileira;
5. Bancos de dados de perfis de DNA de civis: projeto Phoenix na Espanha;
6. Bancos de dados de perfis de DNA de criminosos: NDNAD na Inglaterra e CODIS nos EUA;
7. A investigação forense em grandes desastres e acidentes aéreos.
O seminário resumindo os principais pontos do projeto desenvolvido deverá ter uma duração máxima de 30 minutos, com mais 10 minutos para perguntas e discussão. A apresentação deverá necessariamente ser realizada utilizando recursos audiovisuais (apresentação em powerpoint usando datashow) e poderá incluir a utilização de vídeos obtidos na internet.
Orientações gerais
Por se tratar de um curso intensivo em nível de pós-graduação, envolvendo aulas teóricas e práticas, no qual pretendemos abordar uma série de assuntos, torna-se absolutamente fundamental a assiduidade de todos para o bom desenvolvimento dos experimentos e das discussões teóricas. Queremos, portanto, salientar que o horário estabelecido para as aulas não terá, em princípio flexibilização da nossa parte. Tentaremos ao máximo cumprir o cronograma e horários estabelecidos, porém, por se tratar de experimentos de laboratório, poderá ser necessária a permanência de vocês além do horário em diversas ocasiões.
O sistema de avaliação que adotaremos ao longo do curso envolve uma prova final individual com peso de 40%, a apresentação do seminário do grupo com peso 30% e a entrega de um relatório por grupo das aulas práticas (peso de 30%). Com isso pretendemos maximizar a participação e interesse de todos e, ao mesmo tempo, dar várias oportunidades de avaliarmos o desempenho dos estudantes. Desta forma, a participação de todos em todas as aulas é imprescindível e não será permitida a ausência sistemática ao longo do curso.
Lembramos ainda que, de acordo com o regimento interno da UCB, o máximo de faltas permitidas é de 20% para que o aluno tenha aproveitamento da disciplina.
Teremos um total de 10 alunos distribuídos em 3 grupos de 3 ou 4 pessoas, montados de acordo com a experiência anterior de cada um buscando homogeneizar os grupos. No primeiro dia de aula, cada grupo receberá um kit com pequenos equipamentos, reagentes e suprimentos, além do roteiro das aulas práticas. Cada aluno deverá trazer seu próprio avental de laboratório e sempre utilizar calçados fechados compatíveis com atividades de laboratório.
É muito importante que cada grupo seja responsável pela manutenção da ordem em sua bancada e contribua sempre para a organização geral das áreas e equipamentos comuns a todos. Não será tolerada a desordem no laboratório.
Planejamos um curso muito intensivo, dinâmico, atual e interessante com experimentos variados onde todos terão a oportunidade de ter contato direto com as mais modernas tecnologias de análise de DNA forense. Reiteramos, portanto, a importância da participação
intensiva de todos para o bom desenvolvimento do curso. Lembramos ainda que durante o curso será necessária a leitura de um livro e artigos em inglês. Para facilitar a compreensão destes textos, uma semana antes do início das aulas o livro bem como os principais artigos estarão disponíveis na secretaria da pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia.
Patrocínio
Durante este curso, os estudantes terão a oportunidade de ter contato direto com as tecnologias, reagentes e equipamentos mais avançados utilizados nos melhores laboratórios de genética forense do mundo. Para a viabilização deste curso neste nível nós contamos com o apoio de três dos maiores fornecedores de reagentes e/ou equipamentos para genética forense: Biobrás e Applied Biosystems. Estas empresas forneceram gratuitamente ao curso kits de tipagem de STR, kits de seqüenciamento ou kits de extração de DNA. Especialistas destas empresas estarão ainda enriquecendo o nosso curso ao fazer apresentações técnicas ao longo do curso para demonstrar as características destes produtos e equipamentos especificamente para aplicações forenses. Além dessas empresas contamos com o apoio do Laboratório Heréditas que gentilmente emprestou equipamentos necessários para o desenvolvimento das aulas práticas.
CRONOGRAMA DO CURSO
Segunda 03/02/03 Terça 04/02/03 Quarta 05/02/03 Quinta 06/02/03 Sexta 07/02/03 Sábado 08/02/03
AT: 9:00-10:00 (DG) Teste introdutório
AT: 8:00-10:00 (LA) História do desenvolvi- mento da genética forense.
Coleta, identificação, armazenamento e transporte de amostras forenses
Cadeia de custódia
AT: 8:00-10:00 (LA)
Base genética de mar-cadores microssatélites STR), RFLP- VNTRs; PCR-AmpFLPs e SSOP
AT: 8:00-9:30 (DG) Biologia dos marcadores microssatélites (stutters, ± A, microvariantes etc.)
AT: 8:00-10:00 (LA) Genotipagem de STR: perfis parciais, misturas
Validação laboratorial Considerações sobre montagem de laboratório forense
AT: 10:00-12:00 (DG) Revisão dos conceitos genéticos Mendelianos básicos aplicados na análise de DNA
AT: 10:30-12:30 (DG) Revisão dos concei-tos básicos de biologia molecular aplicáveis à análise de DNA
AP-LB: 10:30-12:30 Preparo das placas de eletroforese vertical com gel de poliacrilamida
Eletroforese em gel de agarose para verificação da PCR
AT: 9:30-11:00 (LA) Amostras forenses: DNA degradado, inibidores de PCR, contaminação, misturas
AT: 11:00-12:30 (RG BIOBRAS)
Validação de multiplexes comerciais de STR
AT: 10:30-12:30 (DG) Revisão dos conceitos básicos de genética de populações aplicáveis à análise de DNA
Tempo para consulta de artigos, livros e internet visando a preparação de seminário sobre tópico selecionado
Aula prática 1 Aula prática 2 Aula prática 3 Aula prática 4 Aula prática 5
AT: 14:00- 15:00 (LA) Orientações e
apresentação do roteiro de aulas práticas AP-LB: 15:00-18:00 Coleta de amostras Extração de DNA
AP-LB: 14:00-18:00 Quantificação e diluição de DNA
Montagem de PCR para STR
AP-LB: 14:00-16:00 Carregamento do gel de poliacrilamida
Eletroforese
AT: 16:00-18:00 (LA) Métodos de separação e detecção de polimorfismos de DNA AP-LB:
Fixação dos géis em ácido acético
AP-LB: 14:00-18:00 Coloração com prata Leitura dos resultados
AP-LI: 14:00-18:00 Análise e interpretação dos dados de STR gerados Construção do banco de dados de freqüências alélicas
Segunda 10/02/03 Terça 11/02/03 Quarta 12/02/03 Quinta 13/02/03 Sexta 14/02/03 Sábado 15/02/03
AT: 8:00-10:00 (DG) Biologia e aplicações de marcadores microssatélites no cromossomo Y
AT: 8:00-10:00 (LA) Estudo de caso forense:
reconstrução familial
AT: 9:00-10:30 (DG) Estudo de casos de
paternidade: riscos de falsas inclusões e mutações múltiplas
AT: 8:00-10:00 (LA)
Aspectos legais do uso de análise de DNA: exemplos da Polícia Civil do DF
Bancos de dados de freqüências alélicas: considerações
estatísticas e populacionais
AT: 8:00-10:00 (DG) DNA forense: novas tecnologias, SNPs, microarrays,
espectrometria de massa
AT: 10:30-12:30 (LA) Biologia e aplicações de polimorfismos no DNA mitocondrial
AT: 10:30-12:30 (DG) Princípios básicos de cálculos forenses de individualidade e paternidade
AP-LB: 10:30-12:30 Carregamento do gel de poliacrilamida
Eletroforese
AT: 10:30-12:30 (DG)
DNA forense em não-humanos:
aplicações e estudo de caso de investigação de incêndio florestal
AT:10:30-12:30 (LA) Organizações internacionais de genética forense
Controle de qualidade Bancos de dados Treinamento
AT: 8:00-12:30 (DG) Avaliação da disciplina e dos instrutores
Prova final de
conhecimentos adquiridos
Aula prática 6 Aula prática 7 Aula prática 8 Aula prática 9
AP-LB: 14:00-18:00 Extração de DNA de amostras biológicas de casos forenses simulados Quantificação e diluição de DNA
AP-LB: 14:00-18:00 Montagem de PCR para STR
Preparo das placas de eletroforese vertical com gel de poliacrilamida Eletroforese em gel de agarose para verificação da PCR
AP-LB: 13:30-15:00 Coloração com prata AT:15:00-17:00 (LA) Estudo de caso forense:
estupro
AP-LB: 17:00-18:00 Leitura dos resultados
AP-LI: 14:00-18:00
Análise e interpretação de dados de STR
Cálculos forenses (paternidade e individualidade)
AP: 14:00-18:00
Apresentação de seminários técnicos e discussão e entrega de relatórios
DG - Dario Grattapaglia AT - aula teórica
LA - Luciano Arantes AP - aula prática
RG - Roberto Gil (Biobrás) LB - laboratório de biotecnologia LI - laboratório de informática
