El empleo de la cepa E de R. prowazeki en la inmunizacion contra el tifo endemico

CONTRA EL TIFO EPIDEMICO*

JOHN P. FOX, M.D. Y MARTHA E. JORDAN, M.D.

Del Departamento de Medicina Tropical g Salud Pziblica, División de Epidemiolog%a, Escuela de kfedicina,

Universidad de Tulane, Nueva Orleans, Luisiana, E. U. A.

Clavero y Pérez Gallardo (1) aislaron la cepa E, en el curso de un pase ordinario por embrión de pollo de cepas de R. prowaxeki obtenidas en Madrid, en 1941, durante una epidemia de tifo. Después de cierto número de pases en serie, efectuados en huevos, se comprobó que la cepa no era ya patogénica para los animales de laboratorio. Después de una tentativa, que no permitió llegar a conclusiones definitivas, de inmunizar al hombre con dicha cepa (2), Pérez Gallardo y Fox hicieron nuevos estudios en animales (3), hallando así que la cepa E era, en efecto, menos virulenta que otras cepas epidémicas madres, que no se podía recuperar de los tejidos de los cobayos inoculados, pero que conservaba una identidad y una capacidad antigénicas que no se distinguían de las correspondientes a las cepas no modificadas. Ni el pase en animales ni más de 300 pases en huevo han producido ninguna alt,eración de las propiedades de la cepa E.

CINCO AÑOS Y MEDIO DE ESTUDIOS EN LOS

ESTADOS UNIDOS

En 1951 se inició un amplio estudio sobre la posible utilización de la cepa E para vacunar al hombre. Durante dicho año y el siguiente, fueron inoculados 150 voluntarios aproximadamente (en su mayoría reclusos de la prisión del Estado de Misisipi, Parch- man), empleando distintas dosis y vías de inoculación. También se hicieron ino- culaciones, para estudios de control, con membrana de yema normal y vacuna co- mercial del tipo Cox, de virus inactivado con formalina. Con el íin de evaluar las

*Este trabajo se hizo con la cooperación del Gobierno del Perú y con una subvención otorgada por la OSP/OMS a la Universidad de Tulane. Manuscrito recibido en julio, 1957.

reacciones a la vacuna, se efectuaron obser- vaciones clínicas durante los 14 dias siguien- tes a su inoculación. Se tomaron muestras de sangre antes de la inoculación, en diversas ocasiones durante un breve período después de ella, y luego a intervalos anuales. El desarrollo y la persistencia de anticuerpos se determinó por medio de la fijación del complemento (FC) y de pruebas de neutra- lización en ratas, empleando estos sueros. Se estudió la duración de la inmunidad por medio de inoculaciones reinfectantes con rickettsia de virulencia normal (cepas Nápoles y Breinl), administradas a volun- tarios inmunizados con la cepa E, a diversos intervalos durante un período de 5 años y medio. En cada grupo reinfectado había dos o tres personas no inmunizadas, para el control de la actividad del inóculo, y en dos de los ocho grupos de prueba había indivi- duos inmunizados con la vacuna comercial del tipo Cox.

Las reacciones clínicas fueron de tres tipos: locales, sistemáticas tempranas (de 1 a 4 días después de la inoculación) y sistemáticas tardías (9 días o más después de la inoculación). Las reacciones locales con- sistieron en la formación de nódulos, erite- mas e hinchazones, linfadenitis regional y, rara vez, ulceraciones del punto de la inoculación intradérmica. Las reacciones sistemáticas tempranas fueron malestar, cefalalgia y fiebre ligera de corta duración. Las reacciones sistemáticas tardías consti- tufan, indudablemente, manifestaciones de una verdadera infección por rickettsia, aunque nunca se descubrieron estos microor- ganismos en la sangre extraída directamente ni en la obtenida por picadura de piojo (4). La frecuencia y gravedad de las reacciones tempranas, aunque no de las tardías, se

192 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA

CUADRO No. l.-Examen, por la prueba de jijación del complemento, de sueros recogidos en voluntarios

infectados con cepas E. Distribución de los resultados por titulo, dosis, via de inoculación y tiempo trans-

currido desde la inoculación,

Números de sueros con títulos de FC de 1 en x Dilucibn

inoculada de membrana de yema con cepa E

Intervala desde la inoculación (meses) 12 _-

Inoculación intradérmica Inoculación subcutánea

32 - 4 7 7 3 -. 3 2 25 25 23 24 16 -- 24 24 26 22 18 8 - 21 7 8 6 14

28,y Total

nlas

4l8

1 1 1 5 6 2 2 6 5 4 4 6

3 1

64 m8,$y 3 4 2 1 5 2 3 2 1 ----

1 2

2 4 8 lú 32 64

0,5 4 2 4 4 3 4

1 2 6 5 7 2

2 2 5 7 5

6

12 9

--- --

0,5 13

1 2

2 7

6 4

12 18

2 4 7 2 1 1 1

/ ₄₆₆₄₁₁ 2 1 2 3 1

133341

4 8 4 2

1 1:lO

1:lM

l:l.OOO 1:103000

2 24 24 22 22 19

-

Inoculación intramuscular Inoculación subcutánea

4 6 2 13 13 12 12 9 -

1 1 3 4 2 2 2 3 1 2

1:lO 0,5 3

1

2 1

6

12 5

4 3 2 3 1 -

8 1 1 2

1 2 4 3 2

1 1 3 1 5

1 3 1 4 2

7 3 2

12 12 12 ll 9 1 1

relacionó con el volumen de la dosis inocu- lada, es decir, que cuanto más rickettsias se inoculan, tanto mayor es la probabilidad de que se presente una reacción visible. Sin embargo, ~610 4 individuos, entre 157 inoculados, tuvieron reacciones de gravedad suficiente para impedir sus actividades normales. En la sección siguiente se darán más detalles respecto a las reacciones.

Durante el mes siguiente a la inoculación, los estudios serológicos mostraron un au- mento de anticuerpos FC y neutralizantes, que se mantuvieron durante 6 meses a un nivel satisfactorio. No obstante, un año después de la inoculación, los anticuerpos FC habfan descendido en la mayorfa de los casos (70 %) por debajo de los niveles per- ceptibles. Aunque los anticuerpos neutrali- zantes también disminuyeron, llegaron con el tiempo a un nivel relativamente estable, que ha persistido en la mayoría de los sueros disponibles para prueba durante el período de 5 años y medio. Asimismo, se estableció

la relación de la dosificación con la reacción serológica, en el grado inicial, y, en cierta medida, con la persistencia de anticuerpos FC. El cuadro No. 1 muestra los anticuerpos FC durante el año que sigue a la inoculación, según las dosis y la vía de aplicación. El cuadro No. 2 resume los estudios serológicos, tanto respecto a la FC como a la neutraliza- ción, en términos de persistencia del anti- cuerpo a lo largo del período de estudio.

En contraste con el grupo inoculado con cepa E, en el cual el 96% desarrollaron anticuerpos neutralizantes o FC, indepen- dientemente del inóculo utilizado, ~610 en 13 de los 27 voluntarios (48%) inmunizados con la vacuna inactivada de tipo Cox se presentaron anticuerpos, según uno u otro de los dos métodos de prueba usados. La titulación de FC fue en general baja y estaba en descenso antes de transcurridos dos meses de la inoculación.

CUADRO NO. 2.-Persistencia de los anticuerpos de $jación del complemento y neutralizantes, después de la inmunización con cepa E.

Número de sueros con anticuerpos de titulación de 1:x Intervalo

después de la

inoculación _{(meses) -} Anticuerpos de FC? Anticuerpos neutralizantes

Totalb

probado <’ 2-4 8-16 32 G4+ probado Total ’ l-2 3-5 6-l 1 12-23 24+

--- ----~--- --

2 114 21 8 36 28 21 28 6 7 15

6 108 11 13 53 16 15 27 1 3 12 6 5

12 83 64 4 13 1 1 44 1 1 8 17 10 7

24 44 26 13 2 3 40 1 6 13 6 7 7

36 25 18 6 1 24 1 3 12 5 3

48 22 18 4 22 2 2 8 9 1

60-66 13 8 2 3 13 1 1 3 8

s Los titulos se miden con 2 unidades de antígeno.

b Debido a que algunos voluntarios se prestaron intermitentemente a las tomas de sangre, a que otros fueron puestos en libertad y luego regresaron, y a que se incluyen en el grupo de 60-66 meses tres volun- tarios de Xueva Orleans, los voluntarios observados difieren ligeramente de intervalo a intervalo, aparte de las diferencias debidas a la simple substracción.

E consistió en la prueba directa con rickett- E. Se aceptaron los voluntarios para la sias virulentas de tifo epidémico. Durante prueba con el reinfectante, sin tener en un período de 5 años y medio se aplicaron cuenta las dosis que habían recibido de cepa fuertes dosis de cepas Nápoles o Breinl a un E ni el grado original de inmunidad alcan- total de 36 individuos inoculados con cepas zado. Como se indica en el cuadro No. 3 no

CUADRO No. â.-Resumen de los resultados observados después de la aplicación de reinfectantes con R. prowazeki virulenta, administrados a personas inmunizadas con cepa E o con vacunas de tipo Cox, y a con- troles normales.

-

2-36 Cepa E

cox Control

48 Cepa E

Control

28 (ljb 6

6 3(5)b 6

10 10 10

______~

4 Id 3

2 2 2

60 Cepa E

1

Control 3

66 Cepa E

Control

Número de voluntarios

l

Número con títulosa de FC de 1:x

Antes de la prueba Máximo después de la prueba

Total -

._

.-

.-

._

-

2-4 s-16 39 2-4 8-16 32-64 12gb ---

10 7 5 1 12 10 5

1 5

4 6

---___-___~

1 1 2 Id

1 1

---~--~

Id

2 1

~-__-___--

2 3

1 2

& Títulos de FC medidos con 2 unidades de antígeno.

b Las cifras entre paréntesis incluyen reacciones febriles abortadas, debidas probablemente al rein- fectante, pero que no exigieron tratamiento.

c La cifra entre paréntesis se refiere a una reacción febril abortada, relacionada al quinto día con una infección de las vías respiratorias.

194 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA

hubo más que dos individuos que no resis- tieran la prueba, y ninguno de los dos había tenido nunca anticuerpos FC, ni neutrali- zantes. Respecto a muchos de los que resistieron la prueba, especialmente después del primer año, ya no pudo mostrarse que antes de la prueba hubieran tenido anti- cuerpos FC y varios tenían originalmente ~610 titulación baja, si bien todos presenta- ban anticuerpos neutralizantes en diverso grado. Por otra parte, 3 de los 6 individuos que habían sido inmunizados con la vacuna comercial inactivada, entre 9 y 21 meses antes de la prueba, no resistieron la inocula- ción reinfectante. Como se dijo antes, en cada grupo sometido a prueba se incluyeron controles de los que se presumía que no eran inmunes. Con una excepción (grupo de 5 años), los 18 controles presentaron sfntomas característicos de la fiebre tifoidea de los 6 a los 10 dias siguientes a la inoculación. No se permitió que estos casos de tifo inducido permanecieran en la etapa febril más de 48 horas, transcurridas las cuales se les trató con aureomicina 0 acromicina, que pronto dominaron la enfermedad. Los estudios sobre la FC del grupo inmune, efectuados después de la prueba, mostraron una pronta eleva- ción de título antes que los controles, pero generalmente menor que en ellos.

PRUEBAS DE CAMPO EN EL PERU

En los estudios precedentes, se encontró que la cepa E podía utilizarse sin peligro en el hombre; además, se obtuvieron ciertas nociones acerca de su dosificación y adminis- tración y se comprobó que la vacuna viva inducía una inmunidad bastante. eficaz y duradera. Quedaba por resolver la impor- tante cuestión de cuán efectiva sería la vacuna en condiciones de campo. Además, se necesitaban definiciones más precisas de la dosificación y las vias de inoculación ópti- mas, y precisaba evaluar la frecuencia y el grado de las reacciones en una población representativa. A fines de 1953, y con el fin de contestar a estas preguntas, se inició en el Perú un estudio, con ayuda de la OSP,

del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de dicho país y del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos. Los grupos de población seleccionados para el estudio comprendfan un sector de la población ur- bana de la ciudad de Arequipa, soldados del ejército peruano de guarnición en dicha ciudad, 10 aldeas del Departamento de Arequipa próximas a la ciudad, 7 aldeas del Departamento de Cuzco, en la parte central y meridional del Perú, y 14 aldeas del De- partamento de Puno, a orillas del Lago Titicaca, en el Perú meridional.

La labor en la ciudad de Arequipa y sus alrededores se orientó hacia el estudio de la serorreacción, en cuanto a las vías de inocu- lación y las dosis de vacuna, así como a la indole de las reacciones. En octubre de 1953 se tomaron muestras de sangre a más de 3.100 personas, a las que luego se les aplicó una vacuna de cepa E en dosis variables, o bien (a 885 personas) un placebo. Durante 21 dfas, se observaron con especial atención estas personas, para anotar todas las reaccio- nes clínicas y, al cabo de 6 semanas de la vacunación, se volvieron a tomar muestras de sangre, con considerable dificultad, a más de 500 personas, para realizar el estudio de la serorreacción. En 1954 y 1955 se vacunaron otros grupos, compuestos prin- cipalmente de militares, y se estudió su serorreacción.

CUADRO No. C.-Resumen de las reacciones inmediatas en grupos vacunados con cepa E, en el Perú.

% de concentra. cih de mm- brana de yema

con cepa E

10,o 1,o 0,25 O,l Placebo

-

1

de personas vacunadas

101 951 252 955 885

-

T

Fiebre” Cefalalgia

______

64 71

30 49

5 23

5 17

2 7

Náusea

17 9 1 2 1

-7

vómitos

7

3 1 1 1

Malestar En canab

61 7

29 2

14 1

8 0

2 0

Reacción

local < +c Linfadenitis

-~

54 42

30 21

29 14

7 7

1 1

6 La fiebre se basa en historiales de “fiebre y escalofrfos”, o en temperaturas comprobadas superiores a 38°C.

b Encamados por lo menos un día.

c Las reacciones locales se graduaron según el diámetro del área de rubor e hinchazón, siendo l+ igual a 1 pulgada aproximadamente.

desarrollaran anticuerpos FC (20% o más de las personas a las que se aplicaron las dosis menores), sólo rara vez dejó de apa- recer el anticuerpo neutralizante. Así pues, el porcentaje general de personas que reaccionaron antes de las seis semanas siguientes a la vacunación, alcanzó a 93 o más de todos los grupos. Tomando en cuenta tanto las reacciones como las sero- rreacciones, se llegó a la conclusión de que la aplicación intramuscular de dosis de una concentración de 0,l a 0,25% era recomen- dable para su empleo general. Aunque todavía han de establecerse los estándares

de actividad y las fechas de caducidad, debe señalarse que los datos del cuadro No. 6 se derivan de un solo lote de vacuna utilizado durante un período de 2 años, y no muestran indicio alguno de disminución de actividad.

Los intentos de conseguir pruebas epide- miológicas de la eficacia de la vacuna con cepa E se limitaron a la población india del altiplano, en las cercanías de Cuzco y Puno. Para ayudar a planear el estudio, era nece- sario conocer algunos antecedentes sobre los casos de tifo que se hubieran presentado en la población y sobre la medida en que ésta se hallara inmune. Los datos disponibles

CUADRO No. á.-Resumen de las reacciones tardias en grupas vacunados con cepa E, en el Perú.

‘% de con- centración de membrana de yema con

cepa E

10,o l,O

0,25 O,l Placebo

Porcentaje de personas vacunadas que sufrieron de:

Número de Reacciones

pXSOll~S

vacunadasa

Gradob Días de duración

De todos los grados

1 2 3 1-3 4-6 7+

___-- ----

83 21 7 10 4 8 2 10

754 29 21 8 1 15 10 4

121 19 12 6 1 12 6 1

724 26 19 6 1 12 ll 3

885 II 9 2 0 7 3 1

7 10

19 1 4

29 3

3 18 1

5 25 3

2 ll 1

= Se excluyeron las personas que eran inmunes antes de la vacunación, excepto en el grupo al que se administró placebo, puesto que de hecho no se presentaron reacciones en estas personas.

196 BOLETIN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA

CUADRO No. 6.-Resumen de reacciones seroinmunes a la vacuna de cepa E, en grupos de población, en

el Perti, medidas por pruebas de anticuerpos de fijación del complemento y neutralizantes, en .sueTos recogidos de 6 a 12 semanas después de la vacunación.a

Grupa vacunado Vía de ino- _culaciónb

Personal civil octubre, 1953

IM SC

Personal militar abril-junio, 1954

IM

Personal civil agosto, 1954

IM

Personal militar julio, 1955

IM

_.

-.

-,.

-

% de con- centración

de man- brana de

yema

l,O 071 170 091 ---

l,O

0,25 091 --__

190 0,25

170

Número de sueros probados

54 50 53 54 --

117 95 111 53 30 190

Porcentaje de sueros con titulos FC de 1 en x

Z-4 8-16 G4+

<2 32

-~

2 30 35 33 100

12 4 30 22 32 94

4 4 26 38 28 96

7 7 37 37 ll 96

-__-__--__---___

3 3 21 18 97

7 4 21 23 96

13 6 32 20 95

9 7 37 24 20 93

7 40 27 27 93

__-- --

4 2 39 33

a 5610 se presentan los resultados referentes a personas de las que se sabe que no eran inmunes en el momento de la vacunación.

b IM-intramuscular; SC-subcutáneo.

c La cifra referente al porcentaje general positivo incluye los sueros sin anticuerpos de fijación del complemento, pero en los que se encontraron anticuerpos neutralizantes.

acerca de la enfermedad eran escasos, pero A fines de 1953 y en 1954 se efectuaron indicaban la existencia de una situación de vacunaciones en las áreas de Cuzco y Puno. endemia, con una tasa anual no mayor de Sin embargo, consideraciones de transporte 70/100.000. En vista de esto, resultó sor- y abastecimiento nos indujeron a concentrar prendente descubrir que de un tercio nuestra labor de descubrimiento de casos en

que los casos que se revelen de infecciones tíficas no sean suficientes para permitir una evaluación satisfactoria de la vacuna.

PREPARACION Y EMPLEO DE LA VACUNA

DE CEPA E

La vacuna de cepa E se prepara inocu- lando material de cultivo en membranas de yemas de embriones de pollo de 7 días. Cuando los embriones comienzan a morir (por lo general, de 7 a 9 días más tarde), se separan las membranas de yema de los embriones vivos y se homogenizan en un mezclador Waring, como una suspensión al 10 %, en un diluente SPG” (6), frío y estéril, y luego se liofilisa en ampollas cerradas a la llama. Lo mejor es almacenar esta vacuna en anhidrido carbónico solidificado pero, como ya se señaló, la experiencia adquirida en el Perú indica que se obtiene una estabili- dad razonable a la temperatura del refrige- rador (4°C.). Después se hace la titulación del material en embriones de pollo, para estimar su actividad. Se estima conveniente un título de 1O-7 por lo menos. Desde luego, es indispensable la esterilidad bacteriana.

La gran cantidad de vacuna empleada en la labor reseñada fue preparada por los Laboratorios Lederle, y tenían una titulación inicial en embriones de pollo de lo-’ a

1O-8,5 (7 a 8,5 log,, dosis infecciosas de huevo).

* Diluente SPG Soluciones madre

KHzP04-2,585 g. en 500 ml. de Hz0 bidestilada (0,038 M.)

KnHP04-ô,27 g. en 500 ml. de Hz0 bidestilada (0,072 M.)

Glutamato de potasio-

4,95 g. ácido glutámico en 100 ml. de Hz0 bidestilada.

Añadase 2N KOH hasta llegar a pH 7,0. Complétese hasta 200 ml. con Hz0 bidestilada

M$&#Ol Preparaci6n definitiva

Sucrosa-74,62 g. en 500 ml. H?O 0,218 KHzP04-100 ml. de solución madre. 0,0038 KzHP04-100 ml. de solución madre. 0,0072 Glutamato de potasio-30 ml. de

solución madre. 0,0049

Complétese hasta 1.000 ml. con agua bides- tilada.

Para la inoculación, se rehidrata la sus- pensión de membrana de yema 1iofXzada con la conveniente cantidad de agua desti- lada esterilizada, y se efectúan las diluciones apropiadas con el mismo diluente antes citado. Según nuestra experiencia, tanto para la producción de anticuerpos como para reducir al mínimo las molestias que la reacción produce conviene inocular intra- muscularmente 0,25 ml. de una suspensión, del 0,25 al l,OO%, de material vitelar suficientemente activo. Con el fin de evitar la pérdida de actividad durante el proceso de inoculación, se recomienda también que el inóculo se guarde en un baño de agua helada.

RESUMEN

De 5 años y medio de experiencia con el empleo de vacuna de la cepa E viva y no virulenta, resulta lo siguiente:

1. La vacuna se puede usar sin peligro en el hombre, pues cerca de 20.000 inocula- ciones no han provocado ninguna enferme- dad grave, aunque se hayan presentado reacciones. No es probable que las rickettsias de la cepa E puedan transmitirse ulterior- mente por el piojo, puesto que, al parecer, no se produce una invasión de la corriente sanguínea. Si la inmunidad producida por la cepa E no fuera permanente, en un área endémica existiría quizás el peligro de que los individuos inmunizados en la juventud volvieran a ser susceptibles en una edad más avanzada, en que la enfermedad pudiera tener consecuencias más graves.

2. Es preferible la vía de inoculación intramuscular. Una cantidad de 025 ml. de inóculo, de una suspensión vitelar del 0,25 al l%, con un tftulo infectivo inicial por lo menos de 7 log,, , induce reacciones satis- factorias de anticuerpos con un mínimo de molestias.

3. Aunque el anticuerpo FC generalmente desaparece antes del año, en la mayoría de los casos el anticuerpo neutralizante persiste por lo menos durante 5 años y medio.

198

inmunizadas con cepa E para resistir una prueba con rickettsias virulentas de tifo.

5. El empleo bastante amplio de la vacuna de virus vivo en condiciones de campo, en el Perú, demuestra que ésta se puede utilizar en condiciones distintas de las del laboratorio.

REFERENCIAS

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-: Immunization of man against epidemic typhus by infection with avirulent Rickettsia prowazeki (strain E). IV. Persistence of im- munity for as long as five and one-half years and a note as to differing complement-fixation antigen requirements in post-infection and post-vaccination sera. Jour. Immunol. (en prensa).

THE USE OF STRAIN E OF R. PROWAZEKI FOR IMMUNIZATION

AGAINST EPIDEMIC TYPHUS (Summary)

Five and one-half years of experience in the use of living, avirulent strain E as vaccine has given the following information :

1. The vaccine is safe to use in man, since nearly 20,000 inoculations have produced no serious illness, although reactions do occur. It is unlikely that rickettsiae of strain E could be further transmitted by lite, since invasion of the blood stream apparently does not occur. One speculative danger, in an endemic area, would be in preventing disease in the young, but having them eventually become susceptible at an age when more serious illness would result, assuming that strain E-induced immunity is not per-

manent.

2. The intramuscular route of inoculation is preferable, and a .25 ml. quantity of inoculum of

.25yo to 1 yO yolk-sac suspension having an initial egg infective titer of 7 log,, or more induces satisfactory antibody response with minimal re- action.

3. Although CF antibody usually wanes within a year, in most cases ncutralizing antibody per- sists for at least 5 and one-half years.

4. That the duration of immunity is at least 5 and one-half years is also attested by the ability of persons truly immunized with strain E to resist challenge with virulent typhus rickett- siae.