Mestrado em Biologia Molecular em Saúde
Casuística da infeção por Chlamydia trachomatis, Ureaplasma
urealyticum/ Ureaplasma parvum e Mycoplasma hominis em amostras
genitourinárias de utentes de um Laboratório de Análises Clínicas
Trabalho submetido por
Tânia Vanessa Bernardo Gonçalves
para obtenção do grau de Mestre em Biologia Molecular
Trabalho orientado por
Doutora Ana Paula Ferreira Dr. Carlos Cardoso
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
À Doutora Ana Paula Ferreira pela orientação contínua do longo percurso de construção da tese, pela celeridade e prontidão na resposta a todas as minhas dúvidas, pela insistência no rigor e pela motivação.
Ao Dr. Carlos Cardoso pela disponibilidade para orientação e por me permitir a oportunidade de realizar este estudo numa área que me apaixona e para a qual pretendo continuar a contribuir: Análises Clínicas.
Aos meus pais e avós, pelo carinho e compreensão, e pelas “injeções” de otimismo e motivação.
Ao Sérgio pelo apoio, companheirismo e amor.
RESUMO
Neste estudo foram analisados os dados referentes às bactérias Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum,
duma amostra constituída por 16 020 utentes de um laboratório de análises clínicas.
Constatou-se que o maior número de pedidos de análises recaía sobre a Chlamydia trachomatis, dado esta ser uma das doenças sexualmente transmissíveis com maior
prevalência atualmente, e que a faixa etária com maior pedido de análises se situa entre os 27 e os 34 anos, correspondendo a adultos sexualmente ativos e em idade reprodutiva. De salientar também a elevada incidência de infertilidade em Portugal e a ligação entre este facto e as doenças sexualmente transmissíveis.
Verificou-se que do total das análises requeridas apenas 4,6% foram amostras do género masculino. No entanto, são os homens que apresentam globalmente uma maior taxa de positivos, estando este facto associado à existência de sintomatologia aquando do diagnóstico.
Da análise da amostra em estudo conclui-se que as colheitas de urina e exsudado uretral são os produtos que apresentam maior positividade para ambos os sexos, no entanto, a colheita com maior número de pedidos é a de exsudado vaginal.
Foi possível ainda verificar que os métodos moleculares que permitem a distinção entre ureaplasmas contribuem para o uso racional de antibióticos.
ABSTRACT
In this study data regarding bacteria Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum, a sample consisting of 16 020
users in a clinical laboratory were analyzed.
It was found that the largest number of requests for analyzes fell on Chlamydia
trachomatis, as this is one of the sexually transmitted diseases most prevalent today,
and that the age group with the largest order of analysis is between 27 and 34 years, corresponding to sexually active adults of reproductive age. Also worth mentioning is the high incidence of infertility in Portugal and the connection between this fact and sexually transmitted diseases.
It was found that the total number of analyzes required only 4,6 % of the samples were males. However, they are generally men have a higher positivity rate, this fact being linked to the existence of symptoms at the time of diagnosis.
Sample analysis in study concluded that the taking of urine and urethral exudate are products that have higher rates of both sexes, however, the harvest with more applications is the vaginal exudate.
It was also possible to verify that molecular methods which allow the distinction between ureaplasmas contributes to the rational use of antibiotics.
ÍNDICE GERAL
Dedicatória ... 1
Agradecimentos ... 2
Resumo... 3
Abstract ... 4
Índice de Figuras... 7
Índice de Tabelas ... 8
Lista de Siglas... 9
1. Introdução ... 10
1.1 Chlamydia ... 12
1.1.1 Morfologia e Fisiologia ... 13
1.1.2 Patogénese e Imunidade ... 16
1.1.3 Manifestações Clínicas ... 18
1.1.4 Diagnóstico Laboratorial ... 21
1.1.5 Tratamento e Prevenção ... 25
1.2 Mycoplasma e Ureaplasma ... 26
1.2.1 Patogenicidade ... 27
1.2.2 Mecanismos de infeção ... 29
1.2.3 Suscetibilidade aos Antibióticos ... 30
1.2.4 Diagnóstico Laboratorial ... 31
1.2.5 Tratamento e Prevenção ... 32
2. Materiais e Métodos ... 33
2.1 Técnica usada para a deteção de Chlamydia trachomatis ... 33
2.2 Técnica usada para a deteção de Mycoplasma hominis ... 35
2.3 Técnica usada para a deteção de Ureaplasma urealyticum/ Ureaplasma parvum ... 35
3. Resultados e Análise ... 37
3.1 Análise Exploratória e Descritiva ... 37
3.1.2 Avaliação do número de análises realizadas ... 38
3.1.3 Chlamydia trachomatis ... 39
3.1.4 Mycoplasma hominis ... 41
3.1.5 Ureaplasma urealyticum ... 42
3.1.6 Ureaplasma parvum ... 44
3.2 Avaliação do Pedido de Análises em Função da faixa etária ... 45
3.3 Presença Simultânea das Diversas Bactérias ... 48
3.4 Avaliação da Necessidade de Aplicação de Terapêutica ... 48
4. Discussão ... 50
5. Conclusões ... 54
6. Bibliografia ... 55
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo de crescimento da Chlamydia………..14
Figura 2 - Microfotografia eletrónica de um fino corte de inclusão de Chlamydia...15
Figura 3 - Evolução da infeção (uretrite) não tratada………..…………...20
Figura 4 - Histograma de frequências da variável idade…...37
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – Pedidos de análise distribuídos em função do género……….…….…39
Tabela 2 – Pedidos de análise para Chlamydia trachomatis………..…40
Tabela 3 – Análises para Chlamydia trachomatis em função do género………...40
Tabela 4 – Pedidos de análise para Mycoplasma hominis………..41
Tabela 5 – Análises para Mycoplasma hominis em função do género………...42
Tabela 6 – Pedidos de análise para Ureaplasma urealyticum………43
Tabela 7 – Análises para Ureaplasma urealyticum em função do género……….43
Tabela 8 – Pedidos de análise para Ureaplasma parvum………...……44
Tabela 9 – Análises para Ureaplasma parvum em função do género………44
Tabela 10 – Análises requisitadas em função da faixa etária……….45
Tabela 11 - Percentagem de resultados positivos e negativos obtidos para cada análise requisitada em função da faixa etária………...46
Tabela 12 – Cruzamento de CT com as restantes bactérias ………..………48
Tabela 13 – Ureaplasma parvum vs Ureaplasma urealyticum ……….…49
Tabela 14 – Resultados de Chlamydia trachomatis em função da faixa etária……….67
Tabela 15 – Resultados de Ureaplasma urealyticum em função da faixa etária………….67
Tabela 16 – Resultados de Ureaplasma parvum relativos à Faixa Etária………68
LISTA DE SIGLAS
CT - Chlamydia trachomatis
UU - Ureaplasma urealyticum
UP - Ureaplasma parvum
MH - Mycoplasma hominis
DIP - Doença Inflamatória Pélvica
EB – Elementary Body (Corpo Elementar)
RB – Reticulate Body (Corpo Reticular)
LGV - Linfo Granuloma Venéreo
DST - Doença Sexualmente Transmissível
NAAT - Testes de Amplificação de Ácidos Nucleicos
PCR - Polymerase ChainReaction
LCR - Ligase Chain Reaction
TMA - Transcription-Mediated AmplificationAssay
IST - Infeção Sexualmente Transmissível
UNG - Uretrite Não Gonocócica
NG – Neisseria gonorrhoeae
URI – 1º jato Urina
URT – Exsudado Uretral
VAG – Exsudado Vaginal
CEE – Exsudado Endocolo/Endocervical
RET – Exsudado Retal
ESP – Esperma
1. INTRODUÇÃO
Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que as doenças sexualmente transmissíveis são a segunda doença que mais afeta as mulheres entre os 15 e os 44 anos nos países em desenvolvimento e estão referenciados cerca de 50 milhões de novos casos por ano no mundo para a infeção por Chlamydia trachomatis (CT).
A relação entre a infeção genital subclínica e o comprometimento da fertilidade feminina tem recebido enfoque científico desde que foi estabelecida uma linha causal entre sequelas irreversíveis de infeções genitais e infertilidade.1 As infeções genitais diagnosticadas em mulheres inférteis resultam de agentes inoculados sexualmente ou de microrganismos originalmente comensais que adquirem patogenicidade. O maior foco de interesse incide sobre um dos principais agentes de Infeções Sexualmente Transmissíveis (IST), a bactéria Chlamydia trachomatis, que tem efeitos
comprovados na fertilidade em ambos os sexos2,3 e cuja infeção tem sido reconhecida como um dos maiores problemas de saúde pública pois é considerada como uma das Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST) mais frequentes em todo o mundo. Na maioria das mulheres, 70 a 75%, e em mais de 50% dos homens essas infeções cursam de forma assintomática. Assim, a CT pode ser considerada bem adaptada ao ser humano, uma vez que consegue multiplicar-se sem causar respostas exacerbadas do organismo, criando assim dificuldades na obtenção do diagnóstico. Esta particularidade retarda ou inviabiliza totalmente o tratamento, permitindo que os casos de infeção genital se propaguem ao trato genital superior. Na ausência de tratamentos, 10 a 40% dos casos evoluem para uma doença inflamatória pélvica (DIP)4, documentada como a principal causa de infertilidade por fator tubário5 e a
mais importante causa de infertilidade que pode efetivamente ser prevenida.2 Acresce ainda o problema das reinfeções que são muito frequentes se os parceiros sexuais não forem tratados.
A homeostasia do ambiente vaginal depende da sua flora comensal que é dominada por espécies Lactobacillus spp.6,7 designados também Bacilos Döderlein.7 O papel
com menor risco de infeção por Chlamydia trachomatis e Mycoplasmas genitais.8 A
diminuição da concentração ou da função das bactérias acidófilas diminui a acidificação do microambiente alterando o estado de equilíbrio dinâmico. Espécies patogénicas e oportunistas têm assim maior probabilidade de sobrevivência neste microambiente, com implicações diretas na suscetibilidade a doenças infeciosas genitais.
O papel do Mycoplasma hominis (MH) e do Ureaplasma urealyticum (UU) tem
ganho relevo e vários estudos demonstraram percentagens significativas de MH (6%) e UU (20 a 30%) em culturas cervicais de mulheres inférteis.10-12 Estas espécies são comensais do trato genital humano mas podem contribuir para a infertilidade feminina no cenário de uma vaginose bacteriana ou por ascensão ao trato genital superior estéril, ao potenciar alterações tubárias e cervicais que impedem o trajeto espermático e a fecundação.13 O Ureaplasma urealyticum, dividido mais
recentemente em Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum (UP), é um
microrganismo que pode colonizar o trato genital feminino até cerca de 67% das mulheres sexualmente ativas na idade reprodutiva. Há evidências de que o tempo, a duração e a intensidade da resposta inflamatória à infeção por Ureaplasma sejam os
principais determinantes dos resultados gestacionais e neonatais.
No entanto, não está ainda esclarecido se o tratamento destas infeções tem impacto na fertilidade.14 Contudo, o seu rastreio e tratamento são importantes dada a
potencial interferência na eficácia de técnicas invasivas de diagnóstico de infertilidade e de procriação medicamente assistida, por contaminação dos meios de cultura, impedindo a fertilização in útero, nidação, e o desenvolvimento embrionário (induzindo aborto espontâneo), e ainda pelo risco de DIP por inoculação de microrganismos na cavidade uterina no momento da transferência embrionária.15
Foi realizado um estudo da prevalência de organismos não-virais em 1 718 pacientes de uma clínica de medicina geniturinária de Inglaterra, em que a prevalência de
Chlamydia trachomatis foi de 7,1%, Ureaplasma urealyticum de 16,1% e Ureaplasma parvum de 35,6%.16 Um outro estudo foi realizado para avaliar a
prevalência de Ureaplasma urealyticum, sendo esta de 14,66%, e de Mycoplasma hominis, que se situa nos 3,16%.17 Utilizando técnicas de deteção por PCR, foram
urealyticum em 17,2% das mulheres, enquanto o Mycoplasma hominis estava
presente apenas em 2,1% das mulheres.18 Outro estudo aplicando o método de PCR para o diagnóstico verificou uma prevalência de CT em 8 %, UU em 16 % e UP em 37% dos pacientes.19 Um estudo recente realizado em Espanha apresenta uma prevalência de CT de 4,1% em mulheres e 4,3% em homens.20
1.1 CHLAMYDIA
Inicialmente identificadas como protozoários e posteriormente consideradas vírus de grandes dimensões, ou ainda numa outra abordagem intermediários entre vírus e bactérias, a sua natureza bacteriana só ficou definitivamente esclarecida na década de 60 com os progressos da biologia celular, sobretudo com a microscopia eletrónica de transmissão.21
Estas pequenas bactérias gram-negativas, são parasitas intracelulares obrigatórios tal como os vírus, mas em oposição aos vírus, contêm simultaneamente RNA e DNA, parede celular e ribossomas procarióticos. Sintetizam as suas próprias proteínas, ácidos nucleicos e lípidos e têm a designação de “parasitas de energia” porque aproveitam o ATP que a célula que parasitam produz. A divisão destas bactérias é feita por fissão binária, e são sensíveis a vários antibióticos.
A sequenciação do código do DNA contrariou fundamentos até aí em vigor, pois revelou a presença de genes capazes de levar à produção de ATP e à biossíntese do peptidoglicano. Um dos genes desta bactéria assegura a produção de uma citolisina e os outros genes comparam-se aos de organismos superiores, o que de alguma forma ilustra a evolução dos eucariotas. Foram identificados genes de uma molécula semelhante à fosfolipase D que opera sobre os lípidos das células parasitadas.
A Chlamydia fabrica um lipopolissacarídeo (LPS) do tipo gram-negativo e pelo
menos 2 proteínas de choque térmico, semelhantes a outras bactérias, o que explica as reações autoimunes na patogénese da infeção por Chlamydia.22
Até 1999 o género Chlamydia era o único na família Chlamydiaceae e na ordem Chlamydiales e eram reconhecidas 4 espécies: C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae e C. pecorum. Análises mais recentes de sequências de rRNA 16S e 23S
classificação taxonómica propôs que a ordem Chlamydiales fosse subdividida em
quatro famílias: (1) Chlamydiaceae, contendo dois géneros, Chlamydia (C. trachomatis, C. muridarum e C. suis) e Chlamydophila (Cph. pneumoniae, Cph. pecorum, Cph. abortus, Cph caviae e Cph. felis); (2) Simkaniaceae, para incluir Simkania negevensis; (3) Parachlamydiaceae, para incluir Parachlamydia acanthamoeba e (4) Waddliaceae para incluir Waddlia chondrophila.23,24
No género Chlamydia a espécie com maior destaque para os humanos é a Chlamydia trachomatis onde se distinguem 2 biovares, segundo a sua ação patogénica e a
capacidade de invasão das células em cultura:
→ Os agentes do tracoma, da conjuntivite de inclusão, da infeção óculo-genital e da artrite reativa.
→ Os agentes de infeção invasiva do trato genital associados a uma patologia linfoide: o Linfo Granuloma Venéreo (LVG).
Os 2 biovares dividem-se com base nos epítopos da proteína principal da membrana externa em 18 serovares25, designados por letras de A a K mais Ba, Da, Ia, Ja no 1.º biovar e de L1, L2, L3 no 2.º biovar.
O genoma da Chlamydia é bastante pequeno, contém aproximadamente 600 kb.26 A
análise dos genomas das Chlamydias, mostra que codificam para aproximadamente
875 proteínas, e 70 destas são exclusivas de CT. Verificou-se que a região próxima à origem de replicação é onde existe a maior diversidade, esta região inclui genes que controlam a síntese de triptofano, e a sua utilização foi relacionada com a mediação do interferão gama (IFNγ) no desenvolvimento da infeção persistente.27
1.1.1 Morfologia e Fisiologia
Foi observado por microscopia eletrónica na membrana externa da Chlamydia,
reticular (RB) - é a forma de resistência e de propagação, não infecioso, metabolicamente ativo, com um diâmetro entre 800 e 1000 nm (Figs. 1 e 2).
O EB comporta-se como um esporo que garante a sobrevivência fora da célula do hospedeiro e é nele que se encontram os ácidos nucleicos (DNA e RNA).29 A membrana externa do EB segrega proteínas extracelulares ricas em cisteína, unidas de forma cruzada a pontes dissulfito, proporcionando-lhe proteção e forma.30 As proteínas ricas em cisteína incluem a proteína OMP presente na membrana externa, esta tem um peso molecular de 40 kDa, constitui 60% do total das proteínas da membrana externa, está codificada pelo gene omp1, e contém antigénios de superfície.31
Fig. 2. Microfotografia eletrónica de um fino corte de inclusão de Chlamydia (→ Corpo elementar;
→Corpo reticular) 33
A proteína que se encontra no espaço periplásmico com um peso molecular de 69kDa, codificada pelo gene omp2, proporciona à Chlamydia, integridade
semelhante à do peptidoglicano, o RB no entanto não contém esta proteína.34,35 A proteína codificada pelo gene omp3 com um peso molecular entre 12-15 kDa é uma proteína hidrofílica que ajuda na adesão às células do hospedeiro.35,36
A Chlamydia trachomatis tem proteínas antigénicas na membrana que induzem a
ativação dos mecanismos imunológicos humorais e celulares, inclusive a produção de imunoglobulinas específicas das classes IgA, IgM e IgG bem como cromocitocinas, interleucinas, interferons e o fator de necrose tumoral.37
As proteínas de choque térmico designadas por HSP70 bem como as HSP60, foram encontradas em mulheres com doença pélvica associada a CT.35,36 As HSP60 têm ainda um papel facilitador na carcinogénese cervical em doentes com infeção persistente por Chlamydia trachomatis. As proteínas HSP60 sintetizadas pela CT têm
ação anti-apoptótica durante a infeção persistente, facilitando a atuação das oncoproteínas em células simultaneamente infetadas por alguns HPV de alto risco (nomeadamente o HPV tipo 16, 18).38
A Chlamydia precisa de aminoácidos para se desenvolver, como a cisteína e o
triptofano, o que significa que, se não os recebe, por ação, p. ex., do interferão γ, irá manter-se em estado de vida latente. Se porém dispuser dos meios necessários, a unidade metabólica (RB), sintetizará o seu próprio DNA, RNA e as suas proteínas.
O EB penetra nas células, aproveitando pequenas efrações na base das microvilosidades, e fica fechado no interior de uma vesícula. A fusão dessa vesícula
de endocitose com as vesículas dos lisossomas é inibida se a membrana externa da bactéria estiver intacta. Caso contrário a fagocitose continua o seu curso e a
Chlamydia é destruída.
A Chlamydia permanecendo, consegue modificar o vacúolo e também a sua própria
composição de maneira a aproximar-se da célula hospedeira. O EB vai tornar-se menos rígido por perda de ligações S-S, aumenta de volume e transforma-se ao fim de 6 a 8h na partícula RB.
O RB divide-se dentro da vesícula, por fissão binária, originando organismos-filhos muito pleomórficos. Entretanto o DNA condensa-se, estabelecem-se ligações S-S entre as proteínas da membrana externa, e formam-se em 18 a 24h novos EB. Às 48-72h a célula repleta de EB rompe-se e liberta os EB que vão contaminar outras células. Como o processo de crescimento é assíncrono observam-se RB, EB e microrganismos intermédios, de formas variadas, na mesma inclusão, a qual resulta do aglomerado de Chlamydia dentro do fagossoma.
A redução do número de ligações S-S entre as proteínas da membrana exterior, imediatamente após a penetração na célula hospedeira, justifica a perda da forma esférica rígida do RB.21
1.1.2 Patogénese e Imunidade
A Chlamydia trachomatis é considerada um dos patogenes de transmissão sexual
mais prevalentes em todo o mundo. As infeções urogenitais causadas por CT resultam em múltiplas manifestações clínicas, incluindo cervicites, uretrites, e DIP, que podem conduzir a aborto e infertilidade. Dado que a infeção pode ser assintomática e que a infeção vaginal é predominantemente silenciosa pode ocorrer evolução para DIP num número significativo de casos (até 40%). Alertando para as sequelas de DIP, um estudo retrospetivo demonstrou maior predisposição para infertilidade em mulheres com DIP e cultura positiva para CT.39
A CT contamina apenas algumas células, onde esta encontra recetores para o EB. Contamina células epiteliais não ciliadas, colunares, das mucosas da uretra, do endométrio, endocolo, trompas de Falópio, ânus e reto, do trato respiratório e das conjuntivas. O biovar responsável pelo LGV replica-se nos fagócitos mononucleares do sistema linfático e portanto gera granulomas.
O local mais comum da infeção por Chlamydia trachomatis no trato genital feminino
é no endocolo, devido à sua preferência pelas células do epitélio cilíndrico. A sintomatologia é escassa e em cerca de 70% dos casos é assintomática.41
A infeção uterina durante a gravidez resulta na rutura prematura de membranas e em corioamnionite.2 Abortos precoces e recorrentes podem ser induzidos por infeção assintomática por CT através da ação de mediadores imunitários: mulheres com historial de abortos recorrentes e insucesso de técnicas de fertilização in vitro (FIV)
têm maiores titulações serológicas de IgG específicas para CT, e cerca de 41% sofre pelo menos um aborto espontâneo.42 Durante a gestação a anatomia do trato genital modifica-se, sendo que as paredes vaginais hipertrofiam-se e são mais vascularizadas, há um aumento no glicogénio do epitélio vaginal com uma diminuição significativa do pH. O colo uterino hipertrofia-se, podendo levar à exposição de uma área maior do epitélio colunar. Todas essas mudanças têm grande influência na flora microbiana vaginal da mulher grávida e algumas delas podem favorecer a penetração de certos agentes infeciosos, incluindo a CT.43
Um estudo considerou a mulher uma fonte importante de retransmissão da bactéria para os seus parceiros e também para o feto. A transmissão materno-fetal ocorre por contato direto, após a rutura das membranas.44 Nos homens diagnosticados com prostatite e CT positiva, existe uma associação com diminuição da fertilidade, considerando a baixa concentração de espermatozoides, motilidade espermática, alta fragmentação do DNA, o aumento de reação acrossómica, e morfologia anormal dos espermatozoides, nestes doentes.45
Vários fatores de risco para a infeção por Chlamydia trachomatis têm sido descritos
e uso de terapêutica anticoncecional. Em homens o fator de risco mais citado é idade inferior a 25 anos.46
Dados disponíveis demostram que DST, como a CT, facilitam a transmissão do HIV através de mecanismos biológicos, e que o tratamento precoce de DST como a CT deve fazer parte da estratégia global de prevenção do HIV.47
1.1.3 Manifestações Clínicas
A Chlamydia trachomatis apresenta-se sob diversas manifestações clínicas. São a
seguir apresentadas algumas das que têm maior expressão e cujas consequências têm mais impacto na sociedade.
Linfogranuloma venéreo (LGV) ou doença de Nicolas Favre
Tracoma
Os serovares A, B, Ba e C da Chlamydia trachomatis, prevalecem em países ou
grupos de baixo nível de higiene, social e individual. A cegueira que resulta da infeção afeta muitos milhões de indivíduos desde o norte de África ao Sudeste Asiático. As crianças contraem frequentemente a doença antes do segundo ano de vida e representam o principal reservatório do microrganismo, no entanto a infeção diminuiu ao longo da adolescência. O tracoma passa de um olho para o outro através das gotículas oculares veiculadas pelas mãos, vestuário, ou exaladas pelo aparelho respiratório ou ainda por contaminação fecal. A doença começa com uma conjuntivite folicular, em que a inflamação alastra pela conjuntiva. As cicatrizes resultantes na conjuntiva levam à retração e ao consequente revirar das pálpebras, o que implica um constante traumatismo da córnea pelas pestanas.32
Conjuntivite do adulto com inclusões – Paratracoma
A conjuntivite folicular aguda proveniente de infeções genitais ocorre no adulto em qualquer região do mundo mais frequentemente entre os 18 e os 30 anos, ou seja, em jovens sexualmente ativos. O corrimento ocular mucopurulento é o primeiro sinal da doença. Observa-se conjuntivite folicular, infiltração e alguma vascularização da córnea. A transmissão é proveniente sobretudo dos órgãos genitais, de onde a bactéria é transferida para o globo ocular. A progressão para cegueira não é comum, devido à cura espontânea e, ao contrário do tracoma, a repetição da infeção é pouco comum. Porém também se observam cicatrizações da córnea nas infeções crónicas. Os serovares D a K da CT são os responsáveis deste quadro clínico.48
Oftalmia neonatal
corrimento ocular purulento na conjuntiva.48 A evolução da doença prolonga-se até
12 meses ou por vezes mais, deixando como sequelas cicatrizes e vascularização anormal da córnea. Existe também risco associado de pneumonia pela CT 6 semanas depois do parto.
Infeções urogenitais (à exceção do LGV)
A CT é responsável por 30% dos casos de uretrite não gonocócica (UNG), no sexo masculino. É uma das doenças sexualmente transmitidas mais frequentes no mundo e as recidivas repetem-se frequentemente. Contudo a infeção é muitas vezes assintomática (fig. 3). No sexo masculino, ocasionalmente, a infeção progride para epidermite ou prostatite especialmente depois dos 35 anos e provavelmente a forma crónica induz esterilidade por obstrução do canal espermático e daí azospermia.32
A proctite pode manifestar-se tanto em homens como em mulheres. Na maioria dos casos os serovares D a K são os responsáveis por estas patologias. Na mulher, uma grande percentagem das infeções mantém-se assintomática, sendo habitualmente os serovares D a K os responsáveis pela infeção.
Fig. 3 – Evolução da infeção (uretrite) não tratada49
as salpingites e as endometrites é, nos países desenvolvidos, amplamente causada por CT e explica muitas vezes as dores pélvicas em mulheres jovens. A salpingite não tratada pode fomentar cicatrizes e oclusões tubárias as quais, se bilaterais, culminam em infertilidade. A gravidez ectópica, as peri-apendicites, e as peri-hepatites (síndrome de Fitz-Hugh-Curtis) podem dever-se a esta etiologia. Os tratamentos de fertilidade, a cirurgia abdominal, e a algia podem ser evitados pela confirmação da infeção por CT em mulheres jovens.
De referir ainda que não são raras as infeções por múltiplos microrganismos associados. Por exemplo em situações em que se manifestam em simultâneo a
Neisseria gonorrhoeae (NG) e a CT, depois de tratada a NG, prosseguem as queixas
porque o tratamento usual contra a NG, frequentemente à base de β-lactâmicos, não afeta a CT.
No sexo masculino a NG e CT em conjunto, representam o grosso das etiologias da epididimite até aos 35 anos. Cerca de 80% dos diagnósticos de síndroma de Reiter em homens (inflamação em várias articulações, conjuntivite e inflamação do sistema urinário) tem origem em infeções genitais por CT. De salientar ainda que 15% das proctites diagnosticadas em homossexuais masculinos estão também associadas a CT. 32
1.1.4 Diagnóstico Laboratorial
A sensibilidade e especificidade dos testes de diagnóstico têm relação direta com a amostra utilizada. Para o exame cultural e pesquisa direta da Chlamydia utiliza-se,
tradicionalmente, o exsudado endocervical ou uretral. Para os testes de amplificação podem ser usadas também amostras de urina e exsudado vaginal. Nos testes indiretos, é recomendada especial atenção para a possibilidade de reações cruzadas interespécies.
As metodologias laboratoriais para o diagnóstico direto e indireto da infeção por
Chamydia trachomatis são: Exame cultural
Pesquisa de antigénios: Imunofluorescência direta (DFA)
Pesquisa de ácidos nucleicos: Sonda de DNA e Amplificação (PCR, LCR, TMA)
Pesquisa de anticorpos: Imunofluorescência indireta (IFI) Microimunofluorescência indireta (MIF) ensaioimunoenzimatico indireto (EIA)
O exame cultural é considerado o teste padrão no diagnóstico. Geralmente utiliza-se zaragatoa endocervical ou uretral para a colheita. O meio de crescimento mais utilizado para a cultura é o de McCoy. A presença de inclusões citoplasmáticas de corpos elementares e reticulares, após o tecido ter sido corado com anticorpo monoclonal fluorescente, indica positividade do teste. Possui sensibilidade de 70-85% e especificidade de 100%. O custo elevado, a demora no resultado (48-72h após a inoculação) e os cuidados para manter os microrganismos viáveis são os aspetos desfavoráveis do método.50,51
A imunofluorescência direta consiste na identificação dos corpúsculos elementares com o uso de anticorpos monoclonais fluorescentes. Possui sensibilidade na ordem dos 85% e especificidade de 98%, quando comparado ao exame cultural. A colheita é efetuada normalmente por zaragatoa endocervical. As estruturas antigénicas são visualizadas através do uso de anticorpos monoclonais contra o LPS ou o MOMP. O MOMP oferece menos resultados falsos positivos, por ser mais específico, já o LPS favorece as reações cruzadas com outras bactérias ou subtipos de Chlamydia. A
técnica e interpretação dos resultados exigem experiência, uma vez que, as ligações inespecíficas dos anticorpos levam a resultados falso-positivos.50,52
O ensaio imunoenzimatico (EIA) deteta o antigénio LPS ou MOMP através de anticorpos mono ou policlonais marcados com enzimas. O resultado final é visualizado por fotometria, fluorescência ou quimiofluorescência. Semelhante à imunofluorescência, quando utilizados anticorpos anti-LPS, o teste fica sujeito a reações cruzadas com o LPS de outros microrganismos, como algumas bactérias gram-negativas (Acinetobacter sp., Gardnerella, Neisserias, Salmonelas e algumas
deteção de CT, observando um aumento de 46% na sensibilidade de identificação a favor da PCR.53
No que diz respeito à pesquisa de anticorpos, apesar da alta resposta imunológica às infeções por Chlamydia, a serologia não é o melhor método para o seu diagnóstico.
Não deve ser utilizado para screening, uma vez que, infeções prévias para CT podem
deixar níveis séricos de anticorpos elevados, tornando difícil a distinção temporal de um processo infecioso. Além disso, podem ocorrer reações cruzadas com outras espécies de Chlamydia. Podem ser usadas técnicas de imunofluorescência indireta,
ensaio imunoenzimático indireto e a micro imunofluorescência indireta. Estas técnicas detetam anticorpos contra o antígeno LPS dos corpos elementares ou reticulares. Quando forem doseados separadamente anticorpos IgG, IgM e IgA, podemos considerar positivo para infeção recente se houver presença de IgA e/ou IgM e IgG com aumento significativo (pelo menos o dobro) entre uma amostra colhida na fase aguda e outra amostra colhida na fase convalescente. A micro imunofluorescência é a mais sensível das técnicas e tem a vantagem de ser espécie e subespécie-específica, porém, é laboriosa e de elevado custo.50-52
A pesquisa de ácidos nucleicos pode ser feita através de sondas de DNA ou da amplificação de ácidos nucleicos. Sondas de DNA com sequência complementar ao RNA ribossomal 16S do genoma da Chlamydia e marcadas com éster de acridina, ao
hibridizar com o DNA da CT são absorvidas por magnetismo, e a reação é quantificada com uso de luminometro. A sua sensibilidade ronda os 75% e a especificidade entre 95-99%. É um teste que ganhou cada vez mais espaço, especialmente pelo facto de ser rápido na obtenção dos resultados (2-3h) e habilidade de produzir resultados fidedignos em amostras colhidas de forma não invasiva, com microrganismos não viáveis.50-52 O Teste de Amplificação de Ácidos Nucleicos (NAAT) consiste na amplificação de sequências de ácidos nucleicos específicos do microrganismo em estudo, pela obtenção de milhares de cópias de um segmento de DNA a partir de primers de uma sequência de DNA alvo. Os primers definem as
enquanto a TMA é dirigida à porção 23s do RNA ribossomal da Chlamydia.56 Os
testes de amplificação têm sensibilidade de 77 a 93%, ou seja, cerca de 20% maior do que a cultura.
Quando comparou os resultados entre PCR realizada a partir de secreção cervical e realizada a partir de amostra urinária, George et al, identificou sensibilidade, especificidade e valor preditivo positivo e negativo de 100%, 98%, 96% e 100%, respetivamente, para amostra genital e 82%, 100%, 100% e 92%, respetivamente, para amostra urinária.57 A sensibilidade da PCR cervical é maior quando está presente secreção endocervical mucopurulenta (84%).58 As amostras endocervicais na mulher demostram maior sensibilidade do que as de urina, no entanto nos homens assintomáticos as amostras de urina superam as zaragatoas uretrais.32 Watson e colaboradores concluíram também que os testes de amplificação do ácido nucleico usados em amostras não-invasivas, como urina, são mais efetivos para detetar infeção assintomática que testes convencionais.59 As desvantagens destes testes relacionam-se aos custos elevados e à possibilidade de problemas relacionados com inibição. São mais dispendiosos que outros métodos não-culturais, mas, de menor custo que a cultura. Não existe consenso científico acerca do método mais indicado para o rastreio desta bactéria,40 no entanto a PCR, que pertence à classe das NAAT é
considerado o teste de escolha para diagnóstico de CT.2,40
As amostras usadas para a realização deste estudo foram as seguintes:
Nas mulheres: zaragatoa vaginal, endocolo, vulva e uretra, e o primeiro jato de urina.
Nos homens: zaragatoa uretral e retal, esperma e primeiro jato de urina.
O teste usado neste estudo foi o COBAS® 4800 para
Chlamydia trachomatis e
amplificado e detetado simultaneamente com cada amostra para controlar todo o processo interno.
A preparação de amostras é automatizada com a utilização do equipamento cobas x 480. As amostras são lisadas no próprio dispositivo de colheita ou durante a preparação de amostras pelo agente caotrópico em meio cobas. Os ácidos nucleicos libertados, juntamente com o DNA do controlo interno da CT, são purificados através da absorção das partículas de vidro magnéticas, lavados e finalmente separados destas partículas, tornando-os prontos para amplificação e deteção por PCR.
O reagente de mistura principal contém pares de iniciadores e sondas específicas para o DNA plasmídeo críptico da CT, para o DNA cromossómico do gene ompA da
CT e para o DNA do controlo interno da CT.
1.1.5 Tratamento e Prevenção
O tratamento para estas infeções genitais, recomendado pelo Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC), incluiu a administração de Azitromicina (1g), numa toma oral única, ou de Doxiciclina (100mg) em duas tomas diárias durante 7 dias por via oral.60 O tratamento destas infeções incluem obrigatoriamente o ou os parceiros sexuais.
O tratamento da infeção por Chlamydia trachomatis durante a gravidez tem provado
ser benéfico na prevenção da morbidade neonatal e é recomendado pelo CDC.61 Um dos tratamentos de escolha na gravidez é o estearato de eritromicina, uma vez que a tetraciclina e os seus derivados estão contraindicados nesse período. Outra alternativa seria o uso da amoxicilina, especialmente para mulheres com maior intolerância gástrica. A desvantagem do uso da eritromicina consiste na possível presença de efeitos adversos no trato gastrointestinal, tais como náuseas, vómitos e epigastralgia que contribuem em muitos casos para a interrupção do tratamento.62
múltiplos parceiros e cujo passado sexual se desconhece, e usando sempre preservativo, em particular se não se trata de um parceiro sexual estável.
A identificação e tratamento dos parceiros sexuais das pessoas infetadas, sempre que possível, contribui para reduzir a disseminação da doença. Como as infeções silenciosas são frequentes tanto no homem como na mulher, devem ser propostos testes periódicos de rastreio às pessoas consideradas de maior risco (com parceiros sexuais múltiplos e prática de sexo não protegido), com o objetivo de evitar a propagação da doença.
Não estão previstas ainda vacinas eficazes contra as clamidioses humanas. A dificuldade está em manter as respostas imunológicas à superfície das mucosas, tendo especial relevância a imunidade mediada por linfócitos auxiliares T1.
1.2MYCOPLASMA E UREAPLASMA
O Mycoplasma e o Ureaplasma pertencem à classe Mollicutes, à ordem Mycoplasmatales e à família Mycoplasmataceae. Para o Homem as espécies que têm
sido consideradas como as mais importantes são as seguintes: (i) Mycoplasma pneumoniae, (ii) Mycoplasma hominis, (iii) Ureaplasma urealyticum e (iv) Mycoplasma genitalium.
Os Mycoplasmas e Ureaplasmas são bactérias sem parede celular e de pequenas
crescimento fastidioso e exigentes nutricionalmente. Certas estirpes, requerem no entanto culturas celulares para o seu desenvolvimento, apresentando baixo teor de G+C no DNA, que se situa entre 23 a 40%. Muitas espécies são anaeróbias facultativas e outras são anaeróbias obrigatórias. São parasitas, comensais ou saprófitas, sendo muitas espécies patogénicas para o Homem, para outros animais, bem como para vegetais e insectos.21
Nos seres humanos, a infeção por Ureaplasma urogenital é causada por duas
espécies, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum, com um total de 14
serovares. O UU tem características do biovar T960T (biovar 2 ou A), e inclui 10 grandes serovares genómicos: 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13, enquanto o UP tem características de biovar parvo (biovar 1 ou B) e inclui quatro serovares: 1, 3, 6 e 14.63,64 A divisão das espécies só foi possível através de técnicas moleculares como a PCR, por isso ainda são por vezes consideradas juntas como Ureaplasma spp. A
diferenciação de espécies de Ureaplasma é importante, pois alguns estudos sugerem
que existe de facto uma diferenciação nos efeitos provocados por cada uma destas espécies.
Os Mycoplasmas e Ureaplasmas aderem fortemente ao epitélio do trato urogenital e
raramente invadem tecidos ou a corrente sanguínea. Assim podem ser considerados como parasitas superficiais, especialmente das mucosas.21
Estes microrganismos são transmitidos em humanos através de contacto direto entre hospedeiros (venereamente por contacto genital-genital ou genital-oral), verticalmente da mãe para o feto ou recém-nascido ou nosocomialmente através do transplante de tecidos.65
1.2.1 Patogenicidade
Embora alguns Mycoplasmas e Ureaplasmas sejam comensais e pertençam à flora
normal das mucosas humanas, muitas espécies são patogénicas tanto para o Homem como para outras espécies animais, provocando uma grande diversidade de doenças que tendem a tornar-se crónicas.21 O Mycoplasma hominis e o Ureaplasma spp.,
conhecidos coletivamente como Mycoplasmas genitais, são geralmente considerados
Os possíveis comportamentos dos Mycoplasmas genitais em doenças do trato
reprodutor feminino têm sido debatidos desde a década de setenta. A sua presença tem sido congruentemente associada a múltiplas complicações obstétricas incluindo infertilidade, aborto espontâneo, morbilidade neonatal e mortalidade perinatal. Existem indícios de que o tempo, duração, e intensidade da resposta inflamatória à infeção por Mycoplasmas, são os principais determinantes dos resultados
gestacionais e neonatais.63,66,67
Diversos estudos indicam que à presença de UU estão associados UNG, resultados adversos da gravidez relacionados com o peso ao nascer, idade gestacional, rutura prematura de membranas, corioamnionite, parto prematuro, propensão ao aborto, bem como formação de cálculos no aparelho urinário e doença pulmonar em crianças prematuras.68,69,70,71 Porém, a colonização da placenta associa-se frequentemente a corioamnionite histológica (38-66%) e constitui um fator importante para morbilidade da gravidez e aborto espontâneo.42,72 A colonização de UU no endométrio é significativamente maior em casos de abortos recorrentes (28%) e associa-se a infertilidade inexplicada em 26 a 50% dos casos.73,74 Em todos os casos
de endometrite, este agente foi simultaneamente identificado no muco cervical, indicando uma rota ascendente de disseminação para a cavidade uterina.73 Stein et al,
verificou que a prevalência de aborto foi maior em placentas com culturas positivas para Mycoplasmas genitais (45%), do que em placentas infetadas por outras espécies
(33%) ou em placentas estéreis (2,5%).72 Outro estudo refere que espécies de
Mycoplasma têm sido identificadas em amostras endometriais e vaginais de casos de
DIP não associada a CT nem NG75, e a incidência do biovar T960 do UU é superior em casos de DIP (57%) e em mulheres com aborto antecedente (42%).76
Ao UP estão associadas infeções do trato urinário.68,69,70,71 Um outro estudo demostrou que UP sorotipo 6, foi significativamente associado com a presença da flora vaginal normal.77 Motivos pelos quais o UP é a espécie mais comumente isolada em amostras clínicas.78
MH e pode contribuir para a infertilidade ao influenciar a patogenia do MH.79 Por outro lado o UU é considerado como um causador reconhecido de infertilidade em homens ao reduzir a qualidade do sémen e o potencial de fertilização do espermatozoide.80 Para além disso, também os homens infetados por MH apresentam uma redução da motilidade e da concentração de espermatozoides, e ainda alterações na sua morfologia81, em contrapartida a infeção por UU ou infeções mistas evidenciam um aumento na viscosidade e pH do fluido seminal.82 Um outro estudo refere que os Mycoplasmas são capazes de se fixar ao espermatozoide e reduzir a sua
motilidade, demostrando assim mais uma vez a sua associação com a infertilidade masculina.83
Embora os Mycoplasmas tenham sido descritos como produtores de infeções
transmitidas sexualmente, o seu papel patogénico ainda é controverso porque podem fazer parte da flora normal do trato genital de mulheres sexualmente ativas.84 Aquando da determinação do significado clínico da infeção por estas bactérias, a diferenciação de colonização e infeção é importante devido à alta prevalência destas bactérias em populações saudáveis.85
1.2.2 Mecanismos de infeção
Dado que a aderência dos Mycoplasmas às células humanas é extremamente forte,
estes não são eliminados nem por secreções mucosas nem pelo fluxo de urina, tornando-se desta forma bastante difícil a sua eliminação. Nestas bactérias, devido à ausência de parede celular, e de quaisquer apêndices ou fímbrias, associados à aderência de outros procariotas, corrobora-se que adesinas micoplásmicas façam parte da membrana citoplasmática. A ausência de parede celular facilita ainda o contacto entre as membranas do parasita e do hospedeiro. Embora seja questionável a evidência da fusão das duas membranas, há indício de trocas antigénicas entre as mesmas. A íntima associação ente as membranas das células hospedeiras e parasitas cria um ambiente em que as concentrações locais de subprodutos relativamente tóxicos, excretados pela bactéria, tais como peróxido de hidrogénio e amónia, podem causar lesões nos tecidos. Embora, os Mycoplasmas possam ser fagocitados na
partes do corpo onde podem dar início à infeção. Uma vez que anticorpos específicos inibem o crescimento de Mycoplasmas in vitro, o papel destes anticorpos,
aparentemente, é o de controlar o seu crescimento à superfície das mucosas. Por outro lado, os neutrófilos podem também ajudar na dissipação da infecção.21
A indução de resposta inflamatória intrauterina e endometrite será um mecanismo pelo qual microrganismos infeciosos como UU, e agentes de Infeção Sexualmente Transmissível (IST) levam ao insucesso de técnicas de Procriação Medicamente Assistida e impedem a fertilização e manutenção de uma gravidez.86
1.2.3 Suscetibilidade aos Antibióticos
Os Mycoplasmas e Ureaplasmas não são afetados por beta-lactâmicos ou
vancomicina por não possuírem peptidoglicano. Também não são suscetíveis a sulfonamidas e trimetoprim, já que não sintetizam ácido fólico. No entanto, são geralmente sensíveis a alguns antibióticos que interferem com a síntese proteica, como as tetraciclinas.
Os Ureaplasmas são geralmente sensíveis aos macrólidos, e resistentes às
lincosamidas, exceto em altas concentrações.
O MH, em contraste, é naturalmente resistentes à eritromicina, in vitro, mas sensível
a macrólidos de 16 membros (josamicina e miocamicina) e lincomicina. Determinou-se que a base genética para a resistência aos macrólidos em MH é devido a mutações em genes correspondentes ao circuito do peptidil transferase (domínio V) no rRNA 23S.
Apesar de um relatório sobre resistência de alto grau à eritromicina em Ureaplasmas,
na década de 1980, tal resistência aos macrólidos nestes organismos é extremamente incomum, e nenhum mecanismo para resistência aos macrólidos em Ureaplasmas foi
resistência às tetraciclinas descrito nestes organismos. A frequência de resistência às tetraciclinas em Mycoplasmas genitais é, provavelmente, influenciada por fatores
geográficos, uso indiscriminado de antibióticos e promiscuidade sexual.A resistência às tetraciclinas em MH ocorre em até cerca de 40% de isolados clínicos e em Ureaplasmas tem sido referido em cerca de 10%.63
1.2.4 Diagnóstico Laboratorial
O local de colheita da amostra para o diagnóstico laboratorial está relacionado com a clínica (sinais e sintomas) comunicados pelas doentes ao seu médico ou por ele observados quando do exame objetivo em ato de consulta médica, sendo também prescritos em situação de rotina. Seguem-se os seguintes critérios: urina de 1º jacto (método de recolha não invasivo) para rastreio; exsudados vaginais (mulher) e uretrais (homem) quando à suspeita de UNG, e exsudado do endocolo quando a suspeita é de infeção profunda (salpingite), e também na consulta de infertilidade.
No diagnóstico laboratorial das infeções por Mycoplasma e Ureaplasma podem
usar-se métodos culturais e não culturais.
Métodos culturais: Diversos meios de cultura, líquidos e sólidos complexos, podem ser usados para o isolamento e identificação de Mycoplasma e Ureaplasma, como é o
caso do caldo PPLO, e do meio SP4, suplementado com extrato de levedura, soro de cavalo ou soro bovino fetal, a que se adiciona penicilina ou derivados. Primeiro é feita uma inoculação das amostras clínicas em caldos e posterior passagem para meios de cultura sólidos. Os meios de cultura líquida contendo glucose e um indicador de pH, permitem visualizar a fermentação, o que comprova o crescimento bacteriano, ou então usar meios contendo arginina e/ou ureia.21 As colónias de MH e de UU crescem em 1 a 5 dias. As colónias de UU são redondas de contorno negro acastanhado, e as de MH são redondas com centro mais escuro rodeado por larga auréola mais clara. Vários antibióticos incorporados no meio inibem o crescimento da maioria das bactérias gram-positivo e gram-negativo.32 Existem também kits
Os métodos não culturais, ou métodos de diagnóstico direto como a imunofluorescência direta, sondas de ácidos nucleicos, ELISA, têm a vantagem de ser métodos mais rápidos e dotados de maior sensibilidade e especificidade.
Dada a dificuldade de obtenção de crescimento do Mycoplasma e Ureaplasma in vitro, são aconselhadas técnicas de hibridização de ácidos nucleicos e de
amplificação genética para a identificação destas bactérias. Nas técnicas de PCR são utilizados primers de DNA específicos para diversas espécies de Mycoplasma e para
os Ureaplasma, facilitando o diagnóstico clínico microbiológico.21 Estes métodos
permitem também a distinção entre espécies de Ureaplasma (UU/UP).
1.2.5 Tratamento e Prevenção
O tratamento das infeções genitais provocadas por MH e UU, recomendado pelo CDC, é o mesmo que o aplicado no caso da CT já referido no ponto 1.1.5.
O facto de haver distinção através dos métodos moleculares entre UU e UP faz com que a antibioterapia apenas seja administrada no caso de a infeção ser causada por UU, que é a forma patogénica. Antes de existir esta distinção todos os casos eram referenciados para administração de antibioterapia. No caso do UPnão se procede a antibioterapia por este não ser considerado patogénico.
É importante salientar que esses microrganismos são frequentemente oportunistas e podem estar presentes simultaneamente com outros patogenes e as decisões sobre a terapêutica a aplicar devem refletir sobre essa possibilidade.65
Um estudo demonstrou que numa pequena série de casos de mulheres com invasão microbiana da cavidade amniótica, o uso de Azitromicina parentérica erradicou o
Ureaplasma numa proporção de 3 em cada 4 casos, e os nascimentos ocorreram de
forma normal. A combinação de antibióticos com anti-inflamatórios pode melhorar a eficácia do tratamento.78 No caso das infeções neonatais por Ureaplasmas opta-se
normalmente pelo uso de macrólidos.65
A deteção precoce destas infeções determina a evolução da doença.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização deste estudo recorreu-se a dados de 16 020 utentes que correspondem a 25 685 pedidos de análises relativos a Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum, recolhidos de
exsudados do endocolo, vaginais, uretrais, retal e vulvar, urina e esperma, no período compreendido entre Janeiro de 2009 e Maio de 2011. Os dados usados neste estudo são omissos na identificação dos utentes e foram obtidos através da base de dados do laboratório Dr. Joaquim Chaves.
As colheitas foram realizadas com kits de amostras de urina/amostras ginecológicas COBAS® PCR. Estes kits estão munidos com o meio COBAS® PCR que estabiliza o ácido nucleico permitindo assim a conservação das amostras.
2.1TÉCNICA USADA PARA A DETEÇÃO DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS
Amplificação por PCRSeleção do alvo
Para além do DNA cromossómico, a CT contém um plasmídeo críptico de cerca de 7 500 pares de bases, que é comum a todos os serovares da CT. O teste COBAS® 4800 utiliza os iniciadores da CT CP102 e CP103 para definir uma sequência de aproximadamente 206 nucleótidos dentro do DNA plasmídeo críptico da CT. Para além disso, o teste COBAS® 4800 utiliza os iniciadores de CT CTMP101 e CTMP102 para definir uma sequência de aproximadamente 182 nucleótidos dentro do DNA cromossómico da CT.
Amplificação do alvo
iniciadores ligados ao longo dos modelos alvo para produzir DNA de dupla cadeia. Este procedimento completa o primeiro ciclo da PCR, dando origem a uma cópia de DNA de dupla cadeia das regiões alvo do DNA da CT e do DNA do controlo interno da CT. A repetição deste processo, resulta na amplificação do DNA entre as sequências alvo do iniciador, produzindo uma molécula de DNA de cadeia dupla denominada amplicon. O analisador cobas z 480 repete automaticamente este
processo durante um determinado número de ciclos, cada um com o objetivo de duplicar a quantidade de DNA amplicon. O número de ciclos está pré-programado no
software COBAS® 4800. A amplificação ocorre apenas nos alvos específicos de CT nos respetivos iniciadores. Não são amplificados nem o plasmídeo críptico inteiro da CT nem os genomas de CT.
Amplificação do controlo interno
O controlo interno de CT é uma combinação de dois DNAs plasmídeos recombinantes não infeciosos, cada um com regiões de ligação do iniciador idênticas às das sequências genómicas alvo da CT. Ambos os DNAs plasmídeos recombinantes têm uma sequência alvo interna idêntica aleatória, e uma região de ligação da sonda única, que permite que o controlo interno de CT se distinga do
amplicon alvo. Estas características foram selecionadas para garantir a amplificação
independente do controlo interno da CT e do DNA alvo da CT. O reagente do controlo interno da CT está incluído no teste COBAS® 4800 CT e é introduzido em cada amostra no equipamento cobas x 480 durante o processamento da amostra.
Deteção de produtos da PCR no teste COBAS® 4800
O
teste COBAS® 4800 utiliza tecnologia de PCR em tempo real. A utilização dede energia do tipo Forster. Durante a PCR, as sondas hibridizam-se à respetiva sequência alvo e são clivadas pela atividade da nucleasse 5’ a 3’ da polimerase do DNA Z05 termoestável. Uma vez separados o sinalizador e o supressor, a supressão deixa de ocorrer, e aumenta a emissão fluorescente dos corantes sinalizadores. A amplificação da CT alvo e do controlo interno da CT são medidas independentemente e a comprimentos de onda diferentes. Este processo é repetido durante um determinado número de ciclos, sendo a intensidade da emissão dos corantes sinalizadores individuais aumentada em cada ciclo.
2.2TÉCNICA USADA PARA A DETEÇÃO DE MYCOPLASMA HOMINIS
A deteção por PCR é baseada na amplificação da região específica do genoma do patogene usando primers específicos MH. Na PCR em tempo real, os produtos
amplificados são detetados usando corantes fluorescentes. Estes corantes ligam-se às sondas de oligonucleotidos que se ligam especificamente aos produtos de amplificação. A monitorização na PCR em tempo real da intensidade de fluorescência permite a deteção de produtos acumulados sem reabertura dos tubos de reação depois do início da corrida de PCR. O kit de PCR AmpliSens® Mycoplasma hominis-FRT é um teste qualitativo que contém um controlo interno que é usado no
procedimento de isolamento a fim de controlar o processo de isolamento de cada amostra individualmente e identificar possíveis reações inibitórias. O kit de PCR AmpliSens® Mycoplasma hominis -FRT usa “hot-start”, que reduz substancialmente
a frequência de reações não específicas. “Hot-start” é garantido por separação de nucleótidos e taq polimerase, usando polimerase modificada quimicamente (TaqF). A polimerase modificada quimicamente (TaqF) é ativada por aquecimento a 95º C durante 15 min.
2.3 TÉCNICA USADA PARA A DETEÇÃO DE UREAPLASMA UREALYTICUM/
UREAPLASMA PARVUM
A deteção por PCR é baseada na amplificação da região específica do genoma do patogene usando primers específicos UU/UP. Na PCR em tempo real, os produtos
3. RESULTADOS E ANÁLISE
Os dados usados neste estudo foram analisados com recurso ao software SPSS
Statistics 21. O tipo de análise efetuada será descrito em cada um dos sub pontos deste capítulo.
3.1ANÁLISE EXPLORATÓRIA E DESCRITIVA
Serão avaliadas de forma independente cada uma das variáveis que se considerou relevantes para o estudo.
3.1.1 Caracterização da população em estudo
A amostra é constituída por 16 020 utentes, dos quais 15 235 são mulheres (95.1%) e 785 são homens (4.9%). As idades encontram-se compreendidas entre os 10 e os 94 anos, sendo a média de idades de 34.89 anos e o desvio padrão de 11.24 anos. O intervalo de confiança a 95% para o valor médio da idade é ]34.72; 35.07[. Como se pode observar no histograma de frequências a maioria dos utentes encontra-se na faixa etária reprodutiva.
As medidas de tendência central não estão contidas no intervalo de confiança a 95% indicando assim que a amostra não apresenta uma distribuição normal para a variável em estudo.
Quando a variável é analisada em função do sexo também se observa uma distribuição assimétrica em ambos os casos, sendo no entanto, mais acentuada para o sexo feminino.
3.1.2 Avaliação do número de análises realizadas
A amostra constituída por 16 020 utentes resultou num pedido total de 25 685 análises, com a seguinte distribuição:
Figura 5 – Distribuição dos pedidos de análises.
Como se pode observar na figura 5 o maior número de análises, perfazendo um total de 15 491 pedidos, 60%, é para Chlamydia trachomatis dado ser a DST mais
prevalente na atualidade. Com 22% dos pedidos encontra-se o Ureaplasma urealyticum.
Tabela 1 – Pedidos de análise distribuídos em função do género.
Tipo de análise
Nº análises
Masculino Feminino Total
Chlamydia trachomatis 727 14 764 15 491
Mycoplasma hominis 56 788 844
Ureaplasma urealyticum 225 5 401 5 626
Ureaplasma parvum 168 3 556 3 724
Total 1 176 24 509 25 685
Os pedidos de análises realizadas por utentes do sexo masculino representam apenas 4.6% do pedido total de análises. Aproximadamente 62% destes pedidos é para
Chlamydia trachomatis enquanto que o Ureaplasma urealyticum, é o segundo mais
pedido com 19%. Quando se analisa a distribuição dos pedidos pelo sexo feminino, verifica-se que a ordem se mantem, a Chlamydia trachomatis representa 60% dos
pedidos e o Ureaplasma urealyticum sobe para os 22%. Conclui-se assim que a
distribuição dos pedidos é muito semelhante entre géneros.
3.1.3 Chlamydia trachomatis
Os pedidos de análise para Chlamydia trachomatis representam 60% do total dos
pedidos de análise dos utentes em estudo. A colheita é um dos fatores a ter em conta neste estudo e os dados serão analisados em função desta variável bem como da variável género.
A maioria das amostras em estudo corresponde a colheitas de exsudado vaginal, cerca de 71.2%, não tendo expressão neste conjunto os pedidos de exsudado retal e de esperma, cada um deles com um único pedido.
Tabela 2 – Pedidos de análise para Chlamydia trachomatis.
Produto Nº análises %
Urina 1º jato (URI) 1 098 6.9
Exsudado uretral (URT) 1 014 6.3
Exsudado vaginal (VAG) 11 399 71.2
Exsudado endocolo (CEE) 1 978 12.3
Exsudado retal (RET) 1 0.0
Esperma (ESP) 1 0.0
TOTAL 15 491
• Positivos – 625 (4%)
• Negativos – 14 866 (96%)
Tendo em conta a distribuição da amostra por géneros apresentada no ponto anterior e dado
que se observou a existência de uma diferença significativa entre os positivos vs negativos
em função do género, os dados em estudo serão também explorados e apresentados em função do género.
Tabela 3 – Análises para Chlamydia trachomatis em função do género.
Produto
Masculino Feminino
Negativo Positivo Total Negativo Positivo Total
URI 273
(90.7%)
28
(9.3%) 301
762 (95.6%)
35
(4.4%) 797
URT 380
(89.6%)
44
(10.4%) 424
565 (95.8%)
25
(4.2%) 590
VAG ― ― ― 10 975
(96.3%)
424
(3.7%) 11 399
CEE ― ― ― 1 909
(96.5%)
69
(3.5%) 1 978
RET 1
(100%)
0
(0%) 1 ― ― ―
ESP 1
(100%)
0
Para a maioria das análises realizadas em mulheres foram pedidas amostras de exsudado vaginal, 77.2%, seguido do exsudado do endocolo com 13.4%. Esta observação era de certa forma expectável dado que a maioria destas análises é prescrita nas consultas de ginecologia. Já no caso dos homens as análises distribuem-se sem uma diferença tão significativa entre as amostras de urina e de exsudado uretral. De salientar ainda que são destas últimas amostras as análises que devolvem maior percentagem de positivos independentemente do sexo.
Dos resultados apresentados na tabela 3 destaca-se a diferença entre a percentagem de positivos obtida em função do género, apresentado o sexo masculino maior percentagem de positivos, cerca de 10%, comparado com a percentagem de positivos obtida no sexo feminino, cerca de 4%.
3.1.4 Mycoplasma hominis
Os pedidos de análise para Mycoplasma hominis representam apenas 3.3% do total
dos pedidos de análise dos pacientes em estudo. A maioria das amostras é mais uma vez de exsudado vaginal, 65.2% e não existiu nenhum pedido para exsudado retal. Na tabela 4 encontram-se os pedidos por amostra e a respetiva percentagem no contexto global. A percentagem de resultados negativos foi de 96.1%.
Tabela 4 – Pedidos de análise para Mycoplasma hominis.
Produto Nº análises %
Urina 1º jato (URI) 28 3.3
Exsudado uretral (URT) 65 7.7
Exsudado vaginal (VAG) 550 65.2
Exsudado endocolo (CEE) 200 23.7
Esperma (ESP) 1 0.1
TOTAL 844
• Positivos – 33 (3.9%)
• Negativos – 811 (96.1%)
MH é sobretudo um colonizador na mulher. Das 789 análises de amostras femininas apenas 33 apresentaram resultado positivo (4.2%). O maior número de pedidos foi no exsudado vaginal, seguido do endocolo, no entanto a maior percentagem de positivos regista-se na urina e no endocolo. Os resultados podem ser consultados na tabela 5.
Tabela 5 – Análises para Mycoplasma hominis em função do género
Produto
Masculino Feminino
Negativo Positivo Total Negativo Positivo Total
URI 8
(100%)
0
(0%) 8
19 (95.0%)
1
(5.0%) 20
URT 47
(100%)
0
(0%) 47
18 (100%)
0
(0%) 18
VAG ― ― ― 530
(96.4%)
20
(3.6%) 550
CEE ― ― ― 188
(94.0%)
12
(6.0%) 200
ESP 1
(100%)
0
(0%) 1 ― ― ―
3.1.5 Ureaplasma urealyticum
Foram registados 5 226 pedidos de análise para Ureaplasma urealyticum
representando 21.9% da totalidade em estudo. À semelhança do que já se havia observado com as outras análises também aqui a maioria das amostras é de exsudado vaginal, 82.5%. No entanto e ao contrário do registado até aqui, esta análise devolve globalmente cerca de 11% de positivos. Os resultados globais e diferenciados por género poderão ser consultados nas tabelas 6 e 7 respetivamente.
Tabela 6 – Pedidos de análise para Ureaplasma urealyticum
Produto Nº análises %
Urina 1º jato (URI) 66 1.2
Exsudado uretral (URT) 217 3.8
Exsudado vaginal (VAG) 4 641 82.5
Exsudado endocolo (CEE) 695 12.4
Exsudado retal (RET) 1 0.0
Exsudado vulvar (VUL) 1 0.0
Esperma (ESP) 5 0.1
TOTAL 5 626
• Positivos – 624 (11.1%)
• Negativos – 5 002 (88.9%)
Tabela 7 – Análises para Ureaplasma urealyticum em função do género
Produto
Masculino Feminino
Negativo Positivo Total Negativo Positivo Total
URI 34
(97.1%)
1
(2.9%) 35
31 (100%)
0
(0%) 31
URT 171
(92.4%)
14
(7.6%) 185
30 (93.8%)
2
(6.2%) 32
VAG ― ― ― 4 111
(88.6%)
530
(11.4%) 4 641
CEE ― ― ― 619
(89.1%)
76
(10.9%) 695
RET ― ― ― 1
(100%)
0
(0%) 1
VUL ― ― ― 1
(100%)
0
(0%) 1
ESP 4
(100%)
1
3.1.6 Ureaplasma parvum
Para o Ureaplasma parvum foram registados 3 724 pedidos de análise, resultando
num total de 34.4% de positivos. De referir ainda, que mais uma vez a amostra mais pedida foi a de exsudado vaginal. O exsudado uretral é amostra que apresenta maior percentagem de resultados positivos. Á semelhança do já obtido para o UU, observa-se maior percentagem de positivos no observa-sexo feminino, pois os Ureaplasmas são
colonizadores frequentes do trato vaginal e urinário, estando também de acordo com as estatísticas de incidência da era molecular.
Tabela 8 – Pedidos de análise para Ureaplasma parvum
Produto Nº análises %
Urina 1º jato (URI) 61 1.6
Exsudado uretral (URT) 153 4.1
Exsudado vaginal (VAG) 3 032 81.4
Exsudado endocolo (CEE) 477 12.8
Esperma (ESP) 1 0.1
TOTAL 3 724
Positivos – 1 280 (34.4%)
Negativos – 2 444 (65.6%)
Tabela 9 – Análises para Ureaplasma parvum em função do género
Produto
Masculino Feminino
Negativo Positivo Total Negativo Positivo Total
URI 30
(90.9%)
3
(9.1%) 33
20 (71.4%)
8
(28.6%) 28
URT 108
(80.6%)
26
(19.4%) 134
6 (31.6%)
13
(68.4%) 19
VAG ― ― ― 1 940
(64.0%)
1 092
(36.0%) 3 032
CEE ― ― ― 339
(71.1%)
138
(28.9%) 477
ESP 1
(100%)
0
