UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
BRENO SOUZA BENEVIDES
ALTERAÇÃO DO PERFIL DE COLÁGENO DE DENTES EXTRAÍDOS DE PACIENTES SUBMETIDOS A RADIOTERAPIA DE CABEÇA E PESCOÇO
BRENO SOUZA BENEVIDES
AVALIAÇÃO DA ALTERAÇÃO DO PERFIL DE COLÁGENO DE DENTES EXTRAÍDOS DE PACIENTES SUBMETIDOS A RADIOTERAPIA DE CABEÇA E
PESCOÇO
FORTALEZA 2016
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Odontologia. Área de concentração: Clínica Odontológica.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
B413a Benevides, Breno Souza.
Avaliação da alteração do perfil de colágeno de dentes extraídos de pacientes submetidos a radioterapia de cabeça e pescoço / Breno Souza Benevides. – 2016.
69 f.: il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará; Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem; Departamento de Odontologia; Programa de
Pós-Graduação em Odontologia; Mestrado em Odontologia, Fortaleza, 2016. Área de Concentração: Clínica Odontológica.
Orientação: Prof. Dr. Fabrício Bitu Sousa.
1. Radioterapia. 2. Neoplasias de cabeça e pescoço. 3. Colágeno tipo I. 4. Colágeno tipo III. 5. Dentina. 6. Ligamento Periodontal. 7. Cárie Dentária. I. Título.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, Nosso Senhor todo poderoso, por todas as coisas boas e más que me aconteceram. Cada uma delas, ao seu modo, me fez chegar aonde cheguei e ser quem eu sou. Foi minha trajetória cheia de tropeços, vitórias e derrotas que permitiu que adquirisse maturidade suficiente para realizar este sonho.
Minha eterna gratidão aos meus pais, CLOVIS e MARIA JOSÉ, que, mesmo com os afazeres do cotidiano e as atribulações de trabalho, sempre priorizaram a educação dos filhos à base das atitudes e do exemplo, orientando e apoiando o meu engrandecimento pessoal e profissional.
À minha esposa, amiga e companheira, MARIANA CANUTO, pela sua lealdade, paciência e amor. Você é um presente que a vida me deu.
À minha avó/mãe, JULIETA GOMES DE BARROS, pelo dom da vida e pelo amor sempre dispensado a mim, ao meu irmão, BRUNO BENEVIDES, por estar sempre ao meu lado e ser um grande referencial na minha trajetória científica. À minha irmã, JULIANA BENEVIDES, por me dar o ânimo infantil do qual todo adulto necessita.
Ao Prof. Dr. FABRÍCIO BITU SOUSA, que teve a bondade de me aceitar como orientando, agradeço pela colaboração, paciência e pelos conhecimentos repassados durante todo o desenvolvimento do trabalho.
Aos queridos amigos que conheci durante o mestrado e que me ajudaram como se fossem meus irmãos nesta jornada, especialmente PAULO GOBERLÂNIO, ELISA LIMA VERDE e ALCEU MACHADO.
Agradeço também aos amigos: JOSÉ MARIA MENESES, LINCOLN PARENTE, ASSIS DA SILVA LIMA, pelo suporte e oportunidades que sempre me deram desde o início desta caminhada, em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Universidade Federal do Ceará, na pessoa do reitor JESUALDO PEREIRA FARIAS.
À Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem (FFOE/UFC), na pessoa de sua diretora Profa. Dra. LIDIANY KARLA AZEVEDO RODRIGUES.
Ao Curso de Odontologia, na pessoa do seu coordenador Prof. Dr. JULIANO SARTORI MENDONÇA.
Ao coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem (FFOE/UFC) Prof. Dr. VICENTE DE PAULO ARAGÃO SABÓIA.
Ao Pró-Ensino na Saúde, através da Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado.
RESUMO
Palavras-chave: Radioterapia. Neoplasias de cabeça e pescoço. Colágeno tipo I. Colágeno tipo III. Dentina. Ligamento periodontal. Cárie dental.
ABSTRACT
Compromised dental health by incidence of radiation is taken as a result of the reduction in salivary flow as well as possible direct radiogenic damage to tooth structure. The exact nature of the latter remains to be elucidated. The aim of this paper is to investigate the anatomical predominance of collagen type I and type III in the dentin and periodontal ligament and the amount of these collagens in the periodontal ligament of extracted teeth within the radiation fields of patients who have underwent radiotherapy (RT) for treatment of malignant head and neck tumors. The sample consisted of 20 teeth, 8 carious teeth of patients who underwent total dose of less radiation than 60 Gy (experimental group I - EG I), 6 carious teeth of patients who underwent total radiation dose equal to or greater than 60 Gy (experimental group II - EG II) and 6 healthy erupted teeth not subjected to radiation (control group - CG). A histomorphometrical study was conducted using the staining technique Picrosirius Red with polarized light. Qualitative analysis of dentin noticed the predominance of type III collagen in the surrounding regions to carious lesions in EG I, general predominance of type III collagen throughout the dentin of EG II and general predominance of type I collagen in the dentin of the CG. Qualitative analysis of the periodontal ligament noticed that the CG and EG I there was a predominance of type I collagen in the cervical third and type III in the apical third. In the EG II, the fibers were more disorganized and there was no more the previous dominance pattern. Quantitative analysis of the periodontal ligament noticed that the total of collagen type I showed significantly reduced in EG I (48.8 ± 6.1%) or EG II (49.1 ± 5.0%) in relation to the periodontal ligament of the CG (69.7 ± 6.3%) (p = 0.047). Total collagen type III showed significantly higher in EG I (51.2 ± 6.1%) or in EG II (50.9 ± 5.0%) in relation to the periodontal ligament of the CG (24.8 ± 5.1%) (p = 0.006). Conclusion: ionizing radiation promotes collagen changes in the dentin and periodontal ligament of teeth within the radiation fields of patients who have underwent head and neck RT.
LISTA DE GRÁFICOS
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Painel de fotomicrografias da dentina a ligamento periodontal de dentes irradiados...39 Figura 2 - Painel de fotomicrografias da dentina perilesional de dentes cariados irradiados (GE I e GE II)...39 Figura 3 - Painel de fotomicrografias da dentina e ligamento periodontal de dentes hígidos não irradiados (GC) ...40
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RT Radioterapia QT Quimioterapia ORN Osteorradionecrose
IMRT Radioterapia de intensidade modulada HP Hidroxilisilpiridinolina
LP Lisilpiridinolina
TGF-β Fator de crescimento tumoral Beta EPM Erro padrão da média
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL... 14
2 PROPOSIÇÃO... 18
2.1Objetivo Geral... 18
2.2Objetivos Específicos... 18
3 CAPÍTULOS... 19
3.1 Capítulo 1: Avaliação da alteração do perfil de colágeno de dentes extraídos de pacientes submetidos a radioterapia de cabeça e pescoço... 20
4 CONCLUSÃO GERAL... 41
REFERÊNCIAS... 42
1 INTRODUÇÃO GERAL
Cirurgia ablativa, radioterapia (RT), quimioterapia (QT) e cirurgia reconstrutiva são componentes do tratamento curativo ou paliativo das neoplasias malignas de cabeça e pescoço, os quais se destinam a aumentar a sobrevida e a qualidade de vida (BAKER et al., 2001; HONG et al., 2001;
SCHIMMELE et al., 2001; WARNKE et al., 2007). A RT é uma técnica que
utiliza a radiação ionizante e exerce efeito terapêutico por semisseletividade, visando a danificar o material genético de células malignas vulneráveis, seja de forma direta ou por meio da produção de radicais livres, resultando em morte celular (BLOOMER et al., 1975). Em adição aos efeitos anticancerígenos
desejáveis, a radiação ionizante provoca danos aos tecidos normais localizados dentro dos campos de radiação (BARCELLOS-HOFF et al., 2000). Os sinais e sintomas incluem mucosite, hipossalivação irreversível devido à função da glândula salivar prejudicada, osteorradionecrose (ORN), cáries de radiação e perda de inserção periodontal (VISSINK et al., 2003;
BARTEL-FRIEDRICH et al., 1999).
A dose de radiação necessária para o tratamento das neoplasias malignas de cabeça e pescoço é baseada na localização do tumor, tipo do tumor maligno e se utilizada exclusivamente ou em combinação com outras modalidades de tratamento. A maioria dos pacientes portadores de carcinomas de cabeça e pescoço tratados com intenção curativa recebem uma dosagem total entre 50 Gy e 70 Gy. Essa dosagem é normalmente administrada no período de cinco a sete semanas, uma vez ao dia, cinco dias da semana, 2 Gy
per fraction (BARRETT et al., 2009). O fracionamento da radiação é utilizado
devido à diferença da resposta reparadora tecidual: de forma geral, os tecidos normais têm a capacidade de reparar danos subletais ao seu DNA, em especial, quando expostos a baixas doses, de maneira mais eficaz do que os tecidos tumorais (JOINER et al., 2016). Outra vantagem é que a radiação
O fator limitante mais importante da dosagem de radiação é a tolerância dos tecidos normais adjacentes. A depender do estágio e da localização do tumor primário e linfonodos afetados, a boca, glândulas salivares e maxilares da maioria dos pacientes portadores de câncer de cabeça e pescoço poderão estar localizados nos campos de radiação. Mesmo com o cronograma radioterapêutico mais otimizado, alterações radioinduzidas não desejadas vão ocorrer nessas estruturas. Os tecidos com altas taxas de turnover exibem
reações agudas à RT (efeitos precoces), enquanto nos tecidos com baixas taxas de turnover os danos podem não se tornar evidentes por meses ou anos
após a RT (efeitos tardios ou crônicos) (JOINER et al., 2016; HALL et al.,
2000).
Uma vez que as taxas globais de sobrevida para neoplasias malignas de câncer de boca são de 80% para as lesões em estágio inicial e 35% para as lesões em estágios avançados, o objetivo da terapêutica efetiva inclui a preservação da função dos tecidos normais e redução das injúrias ao máximo. Estratégias para aumento da probabilidade de controle dos tumores sem aumentar, ou até mesmo diminuir, a probabilidade de complicação dos tecidos normais vêm sendo desenvolvidas e têm sido tema de ensaios clínicos. Com base nas propriedades radiobiológicas descritas, esquemas alternativos de fracionamento de radiação (hiperfracionamento e fracionamento acelerado), técnicas que reduzem o volume de radiação (radioterapia de intensidade modulada - IMRT e radioterapia conformada 3D) e esquemas que aumentam a oxigenação dos tecidos tumorais foram desenvolvidos (RUSSEL, 2000; KAANDERS et al., 2002).
produção de matriz orgânica da dentina e sua mineralização, nutritiva e imunológica, capaz de reagir a estímulos agressores, levando à formação de diferentes tipos de dentina no intuito de barrar o curso da cárie e restringi-la a níveis mais superficiais do dente. Em sua superfície externa, a polpa dentária tem células que a revestem (odontoblastos), com processos que se estendem ao interior dos túbulos dentinários (SCHROEDER, 1991). A necrose do tecido dentário pulpar e sua subsequente remoção no curso de tratamento de lesões cariosas profundas resultam em perda de elasticidade da estrutura dentária e risco aumentado de fraturas dentinárias (al-NAWAS et al., 2000).
O periodonto é constituído por cementoblastos, células do ligamento periodontal e osteoblastos. Os fibroblastos do ligamento periodontal representam o tipo celular mais encontrado nesse tecido. São células mesenquimais que expressam marcadores específicos, como periostina, esclerotina, proteína de ligação de cemento, além de fatores de transcrição para a diferenciação osteoblástica, colágeno, fosfatase alcalina, osteonectina, osteocalcina e osteopontina (LOSSDORFER et al., 2010; MARCHESAN et al.,
2011). Consequentemente, apresentam a capacidade de se diferenciar em osteoblastos, o que fica reforçado pela propriedade de formação de nódulos minerais imaturos, quando cultivados in vitro (MURAKAMI et al., 2003). Desta
maneira, contribuem significativamente para a integridade e capacidade de reparo do periodonto e desenvolvimento da doença periodontal (LEKIC et al.,
1997). Os efeitos da RT sobre o periodonto têm sido atribuídos à hipovascularidade e hipocelularidade, comprometimento da capacidade de reparo e regeneração e risco aumentado de perda de inserção periodontal (VISSINK et al., 2003).
Por um lado, a radiação aparenta ter um efeito destrutivo direto sobre os tecidos dentais duros, especialmente à junção amelo-dentinária. Por outro lado, a hipossalivação radioinduzida é considerada causadora de deficiência de mecanismos de auto-limpeza orais e imunocompetência local, facilitando a atividade de microrganismos envolvidos na etiopatogênese da cárie dentária (CHAMBERS et al., 2004; GROTZ et al., 1997). Quando os dentes estão
localizados nos campos de radiação, a hipovascularização pulpar e periodontal resulta no déficit da sua microcirculação. Os efeitos indiretos da radiação sobre o fluxo vascular da dentição também exercem um papel fundamental nesse ciclo multifacetado de promoção de cáries e doença periodontal (SQUIER, 1990).
A partir da análise dos trabalhos que investigam os efeitos da radiação sobre os tecidos componentes do sistema estomatognático, com ênfase para o desenvolvimento de cáries e alterações periodontais, este estudo objetivou analisar qualitativamente a predominância e a organização das fibras de colágeno tipo I e colágeno tipo III da dentina e ligamento periodontal de dentes irradiados bem como a quantidade de colágeno tipo I e colágeno tipo III do ligamento periodontal de dentes irradiados, extraídos de pacientes submetidos a RT para tratamento de neoplasias malignas de cabeça e pescoço.
2 PROPOSIÇÂO
2.1 Objetivo geral
Analisar o perfil de colágeno tipo I e colágeno tipo III da dentina e do ligamento periodontal de dentes contidos nos campos de radiação de pacientes submetidos a RT de cabeça e pescoço.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar o perfil em dentina e ligamento periodontal dos colágenos
tipo I e III bem como quantificar estes tipos de colágeno no
ligamento periodontal de dentes submetidos a menos de 60 Gy de
radiação, 60 Gy ou mais de radiação e dentes hígidos não
irradiados.
Comparar a quantidade de colágeno tipo I e colágeno tipo III do
ligamento periodontal de dentes de pacientes submetidos a
menos de 60 Gy de radiação, 60 Gy ou mais de radiação e dentes
hígidos não irradiados;
Determinar a proporção de colágeno tipo I:colágeno tipo III do
ligamento periodontal de dentes submetidos a menos de 60 Gy de
radiação, 60 Gy ou mais de radiação e dentes hígidos não
3 CAPÍTULOS
Esta dissertação está baseada no Artigo 46 do Regimento Interno do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará (Anexo A), que regulamenta o formato alternativo para dissertações de Mestrado e teses de Doutorado e permite a inserção de artigos científicos de autoria ou coautoria do candidato.
Por se tratar de pesquisas envolvendo seres humanos, o presente trabalho foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará/PROPESQ, com o parecer Nº 1.350.280, sendo aprovado em 03/12/15, sob o CAAE: 51260715.7.0000.5054 (Anexo B).
Foram utilizados espécimes teciduais emblocados em parafina, armazenados nos arquivos do Laboratório de Patologia Bucal da UFC, através da assinatura do Termo de Fiel Depositário (Anexo C).
Diante disso, tal dissertação de mestrado é composta por um capítulo que contém um artigo científico, que será submetido à publicação no periódico “Medicine”, conforme descrito abaixo: (ANEXO D).
Avaliação da alteração do perfil de colágeno de dentes
extraídos de pacientes submetidos a radioterapia de cabeça e pescoço.
3.1 CAPÍTULO 1: Avaliação da alteração do perfil de colágeno de dentes extraídos de pacientes submetidos a radioterapia de cabeça e pescoço. Este artigo seguiu as normas de publicação do Periódico Medicine (ISSN: 0025-7974).
Autores:
Breno Souza Benevides
Grau acadêmico: Bacharel em Odontologia, Especialista em Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial
Posição: Estudante de Mestrado em Odontologia
Afiliação institucional: Departamento de Clínica Odontológica, Setor de Diagnóstico Oral, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil.
Fabricio Bitu Sousa
Grau acadêmico: Bacharel em Odontologia, Doutor em Patologia Oral, Bacharel em Patologia Oral.
Posição: Professor Titular da Universidade Federal do Ceará -
campus Fortaleza.
Afiliação institucional: Departamento de Clínica Odontológica, Setor de Patologia Oral, Universidade Federal do Ceará, campus Fortaleza,
Fortaleza, Brasil.
Autor de Correspondência: Breno Souza Benevides
Endereço: Rua Frei Mansueto, 505, AP 1401. Meireles – Fortaleza, Ceará, Brasil, CEP: 60175-070.
RESUMO
Keywords: Radiotherapy. Head and neck cancer. Collagen Type I. Collagen type III. Dentin. Periodontal ligament.
INTRODUÇÃO
Radioterapia (RT), quimioterapia (QT), cirurgia ressectiva e cirurgia reconstrutiva são componentes do tratamento curativo ou paliativo das neoplasias malignas de cabeça e pescoço, destinados a aumentar a sobrevida e a qualidade de vida1-4. Em adição aos efeitos anticancerígenos desejáveis, a radiação ionizante provoca danos aos tecidos normais localizados dentro dos campos de radiação5. Os efeitos indiretos da radiação sobre o fluxo vascular da
dentição, levando a um déficit da microcirculação tecidual, também exercem um papel fundamental no contexto clínico oral multifacetado desses pacientes6. Os sinais e sintomas incluem mucosite, hipossalivação, osteorradionecrose (ORN), cáries de radiação e perda de inserção periodontal7,8.
O principal componente dos dentes humanos é a dentina, a qual é composta de minerais (70%), matriz orgânica (20%) e água (10%). Acredita-se que 90% da matriz orgânica seja constituída de colágeno9. O esmalte dentário,
que recobre a coroa, é considerado o tecido mais mineralizado dos mamíferos, sendo 95% tecido calcificado, 4% água e 1% matriz orgânica, apresentando porcentagem de colágeno irrisória em sua composição. A polpa dentária está localizada no interior de uma cavidade central e no sistema de canais radiculares e representa a parte vital do dente. Apresenta função sensorial, formadora, uma vez que durante toda a vida do dente há a produção de matriz orgânica da dentina e sua mineralização, nutritiva e imunológica, capaz de reagir a estímulos agressores, levando à formação de diferentes tipos de dentina no intuito de barrar o curso da cárie e restringi-la a níveis mais superficiais do dente. Em sua superfície externa, a polpa dentária tem células que a revestem (odontoblastos), com processos que se estendem ao interior dos túbulos dentinários10. A necrose do tecido dentário pulpar e sua
resultam em perda de elasticidade da estrutura dentária e risco aumentado de fraturas dentinárias11.
O periodonto de inserção é constituído por cementoblastos, células do ligamento periodontal e osteoblastos. Os fibroblastos do ligamento periodontal representam o tipo celular mais encontrado nesse tecido. São células mesenquimais que expressam marcadores específicos, como periostina, esclerotina, proteína de ligação de cemento, além de fatores de transcrição para a diferenciação osteoblástica, colágeno, fosfatase alcalina, osteonectina, osteocalcina e osteopontina12,13. Consequentemente, apresentam a capacidade
de se diferenciar em osteoblastos, o que fica reforçado pela propriedade de formação de nódulos minerais imaturos, quando cultivados in vitro14. Desta maneira, contribuem significativamente para a integridade e capacidade de reparo do periodonto e desenvolvimento da doença periodontal15. Os efeitos da
RT sobre o periodonto têm sido atribuídos à hipovascularidade e hipocelularidade, comprometimento da capacidade de reparo e regeneração e risco aumentado de perda de inserção periodontal7.
As fibras de colágeno são o principal componente de tração da matriz extracelular e desempenham um papel estrutural fundamental nos tecidos conjuntivos, proporcionando resistência, conferindo forma e permitindo, ao mesmo tempo, flexibilidade. A partir de estudos prévios de exposição de colágeno a radiação, fica evidente que o diâmetro das fibras colágenas é dose- dependente, tornando-se o colágeno, neste contexto, uma espécie de dosímetro biológico16. Os colágenos tipo I e III são fibrilares, apresentando
estrutura semelhante a uma corda. Ao microscópio óptico, esses polímeros lineares de fibrilas apresentam padrões de bandas característicos, refletindo a organização escalonada das moléculas individuais de colágeno. O colágeno tipo I foi o primeiro a ser caracterizado e é o mais comum e abundante de todos os tipos. O colágeno tipo III, mais primitivo, foi encontrado, inicialmente, na derme fetal, estando presente em pequenas quantidades em outros tecidos como trabéculas de órgãos hematopoiéticos, fígado, útero, camadas musculares do intestino e, particularmente, no sistema vascular16.
mobilidade dos dentes. Como um importante componente da matriz intercelular, o colágeno tipo III regula a proliferação e migração celular e expressão de genes específicos, pela integração da sua sequência de aminoácidos com os receptores de integrina sobre a superfície celular17,18. Um
grupo de autores descobriu que o nível de transcrição de mRNA de colágeno tipo III aumenta sensivelmente antes de nódulos mineralizados serem formados, o que demonstra a importância do colagénio do tipo III no curso da remodelação do colágeno do ligamento periodontal19. Outro estudo evidenciou
que, com a reparação do ligamento periodontal, o colágeno tipo III foi gradualmente substituído por colágeno tipo I e a formação de osso maduro aumentou significativamente, em cães da raça beagle20. Esse fato constata que
o colágeno tipo III é uma espécie de precursor do colágeno tipo I, sendo que este último está mais associado à formação de tecidos mineralizados e que a substituição do colágeno tipo I pelo colágeno tipo III pode levar a um prejuízo da regeneração periodontal.
Um estudo imunohistoquímico realizou a caracterização dos fibroblastos do ligamento periodontal de humanos que se tornaram senis após replicação exaustiva ou exposição à radiação ionizante e concluiu que o efeito do processo de envelhecimento leva a uma significante redução sobre sua capacidade de diferenciação osteoblástica e, como essas células são de grande importância para a regeneração periodontal13, a identificação do seu
status de senilidade e capacidade de diferenciação são de extrema importância21.
tratamento de neoplasias malignas de cabeça e pescoço, buscando contribuir para melhor entendimento do surgimento e comportamento das cáries de radiação e doença periodontal nesses pacientes.
MATERIAIS E MÉTODOS
IMPLICAÇÕES ÉTICAS
Esta pesquisa obteve o parecer favorável do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará/PROPESQ do Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará, sob o número do parecer 1.350.280. CAAE: 51260715.7.0000.5054.
DELINEAMENTO DO ESTUDO
Trata-se de uma pesquisa descritiva observacional de corte transversal, constando de análise, quantificação e investigação comparativa de características histológicas em uma série de casos de dentes cariados contidos nos campos de radiação extraídos de pacientes previamente submetidos a RT para tratamento de neoplasias malignas de cabeça e pescoço e dentes terceiros molares erupcionados, hígidos e funcionais, extraídos de pacientes não irradiados.
A amostra da pesquisa foi de conveniência, constituída por 20 blocos de espécimes de dentes do acervo do laboratório de Patologia Bucal do Curso de Odontologia da UFC campus Fortaleza, sendo destes oito dentes cariados
tampados com EDTA 10%. Essa solução foi renovada semanalmente e o ciclo total de descalcificação foi de 45 dias (temperatura de 25 graus Celsius). Os espécimes foram emblocados em parafina e identificados por numeração.
Os espécimes de dentes cariados irradiados foram oriundos de pacientes encaminhados pelo Hospital Haroldo Juaçaba - ICC ao Núcleo de Estudos em Pacientes Especiais (NEPE) da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Ceará / UFC, durante o mês de dezembro de 2015. Todas as exodontias foram executadas pelo mesmo cirurgião-dentista e não houve complicações trans-operatórias. Os dentes foram minimamente manipulados pelas suas coroas, com o cuidado adicional de não se manipularem suas superfícies radiculares. As lesões cariosas acometiam esmalte, dentina e polpa dentais, além dos seus sistemas de canais, mas sem comprometimento radicular. O total de espécimes foi de quatro dentes incisivos, dois caninos, três molares e cinco pré-molares.
Os espécimes de dentes terceiros molares erupcionados, hígidos, não irradiados e funcionais foram oriundos de pacientes atendidos na Disciplina de Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial do Curso de Odontologia da Universidade Federal do Ceará / UFC - Campus Fortaleza, durante o mês de
dezembro de 2015. Todas as exodontias foram executadas pelo mesmo cirurgião-dentista e foram incluídos como viáveis para a amostra apenas os dentes extraídos sob a utilização da Técnica Primeira, mediante utilização de elevadores ou fórceps. Houve cuidado para realização de mínima manipulação dos espécimes, restrita apenas às superfícies coronárias dentais, isentando as superfícies radiculares de traumas. O total de espécimes foi de seis dentes terceiros molares.
ANÁLISE HISTOQUÍMICA
de álcool, as lâminas foram incubadas em solução de picrosirius red (ScyTek®) por 30 minutos e lavadas rapidamente em dois banhos de ácido clorídrico 5%, contracorados com hematoxilina de Harris por 45 segundos e montadas com Enhtellan®. As lâminas foram analisadas em microscópio de luz polarizada (Leica® modelo DM 2000), o que permite visualizar o colágeno tipo I com coloração vermelho-alaranjada e o colágeno tipo III com coloração verde.
Para análise dos diferentes tipos de colágeno na região da dentina e do ligamento periodontal, foi realizada uma análise qualitativa, na qual um avaliador, previamente treinado e de forma cega, observou a predominância de colágenos tipo I e III, em cada uma das amostras.
Para quantificação dos diferentes tipos de colágeno na região do ligamento periodontal, três campos de cada amostra em região cervical (associada ao limite cervical do cemento) e apical (associada ao forame apical), em um aumento de 200x, foram fotografados através de câmera (Sony® modelo DFC 295) acoplada ao Microscópio Leica® DM 2000. As fotomicrografias foram avaliadas pelo software de análise de imagem Image J® (RSB). As regiões que não correspondiam ao ligamento periodontal foram selecionadas através do comando Freehand Selection e eliminadas (Edit>Cut). Posteriormente, foi realizada a calibração dos canais de cores das imagens pelo comando Color Thershold (Image > Adjust > Color Thersold) na função RGB para as cores Vermelho (Mínimo de 71 e Máximo de 255), Verde (Mínimo de zero e Máximo de 69) e Azul (Mínimo de 0 e Máximo de 92). Depois da calibração, as imagens foram convertidas para a escala de cor de 8-bits (Image > Type > 8-bit), binarizadas (Process > Binary > Make Binary) e foi mensurada a porcentagem de área de colágeno marcada em vermelho (Analyse > Analyse Particles) (adaptado de ANDRADE et al., 2011)22.
marcada em vermelho, foi separado o percentual da região ocupada somente pela marcação amarelo-avermelhada. A área verde-esbranquiçada, relativa ao colágeno tipo III, foi obtida pela subtração da região total marcada em vermelho e o percentual marcado unicamente pela cor amarelo-avermelhada (adaptado de ANDRADE et al., 2011)22.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e comparados por meio do teste ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni [nível de significância: 5%, dados paramétricos descritos na forma: média ± erro-padrão da média (EPM)].
RESULTADOS
Análise qualitativa do ligamento periodontal
Nos dentes pertencentes ao GC, as fibras se mostravam longas e embotadas, com distribuição acentuada de colágeno tipo I no terço cervical e tipo III no terço apical. A distribuição dos diferentes tipos de colágeno se mostrou alterada nos dentes irradiados. Em relação ao GE I, o perfil de organização das fibras de colágeno mudava sua conformação. As fibras se dispunham de forma menos difusa, mas organizadas, e, no terço cervical, predominou o colágeno tipo I, ao passo que no terço apical predominou o colágeno tipo III. Em relação ao GE II, as fibras de colágeno, por vezes escassas, dispunham-se de forma difusa, desorganizadamente arranjadas e não havia um padrão de predominância do subtipo de colágeno por regiões da raiz dentária. Havia zonas de predominância ora de colágeno tipo I, ora de colágeno tipo III, independente da região. (Figura 1 e figura 2).
Não houve diferença entre os valores de percentual de área de colágeno dos ligamentos periodontais do GC (18.8±4.1%), GE I (14.7±2.7%) ou GE II (15.5±2.4%) (p=0.619).
O percentual de área representada por colágeno tipo I se mostrou significantemente reduzido nos grupos GE I (48.8±6.1%) ou GE II (49.1±5.0%) em relação ao ligamento periodontal do GC (69.7±6.3%) (p=0.047). O percentual de área representada por colágeno tipo III se mostrou significantemente maior nos grupos GE I (51.2±6.1%) ou GE II (50.9±5.0%) em relação ao ligamento periodontal do GC (24.8±5.1%) (p=0.006). (Gráfico 1).
A relação entre fibras de colágenos tipo I e III se mostrou significantemente reduzida nos grupos irradiados quando comparados ao controle. A proporção média de fibras tipo I no GE I foi de 1.1±0.2 para cada fibra de colágeno tipo III. No GE II, a proporção média de fibras tipo I foi 1.1±0.1 para cada fibra de colágeno tipo III. Por outro lado, a proporção média de fibras tipo I no GC foi na ordem de 2.5±0.3 para cada fibra de colágeno tipo III (p=0.005). (Gráfico 2).
Análise qualitativa da dentina
Em relação à dentina, observou-se, no GC, uma predominância de colágeno tipo I na região peripulpar e mais periférica, adjacente ao cemento. O colágeno tipo III predominava na região central entre essas duas regiões.
O GE I apresentou predominância de colágeno tipo III na região próxima à polpa, e de colágeno tipo I nas regiões mais periféricas em relação à polpa, com pouco ou quase nenhum colégano tipo I na região peripulpar. Além disso, observou-se que a proporção de colágeno tipo I era maior no terço apical, quando comparado ao terço médio e cervical.
DISCUSSÃO
As cáries de radiação são tidas como resultado da combinação de higiene oral deficiente, aumento da ingestão de alimentos ricos em açúcar e carboidratos, alterações salivares que resultam em deficiência dos mecanismos de auto-limpeza oral e diminuição da imunocompetência local associados aos efeitos destrutivos diretos dos tecidos dentais duros23. Essas cáries são, portanto, o resultado da interrelação de inúmeros fatores intrínsecos e extrínsecos do hospedeiro24.
Em relação aos dentes incluídos no campo de radiação, foi sugerido que a destruição do colágeno contido na polpa dentária contribui para fibrose secundária e diminuição da sua microvascularização e metabolismo, interferindo, portanto, sobre o metabolismo dos odontoblastos: a obliteração dos túbulos dentinários precedida pela degeneração dos processos odontoblásticos mostrou-se ser o principal resultado do dano radiogênico celular direto6,24. Estudiosos sugeriram que um déficit no metabolismo combinado com o dano latente do parênquima pulpar resultaram em cáries de subsuperfície25. Essas lesões seriam o principal fator de contribuição para o rápido e atípico progresso das cáries de radiação que não seriam justificados apenas pela hipossalivação26.
O aumento da quantidade de colágeno tipo III e a diminuição do colágeno tipo I nas regiões peripulpares da dentina dos dentes submetidos a radiação podem, em parte, ser explicados pela alteração do metabolismo e degradação dos odontoblastos associados à formação de uma dentina mais primitiva, dada a rápida progressão das lesões de cárie por radiação.
Estudos in vitro evidenciaram a presença de alterações em esmalte e
dentina de dentes submetidos a radiação11,25,27. Outros estudos demonstraram
que a radiação não apresenta efeitos diretos na estrutura inorgânica de dentes humanos, sendo as alterações dentárias observadas em pacientes com neoplasia maligna de cabeça e pescoço após RT devidas a alterações na matriz orgânica dos seus tecidos28,29. De fato, análises em microscopia
significativas da sua região interprismática (superfície e junção amelo-dentinária), o que corresponde à sua matriz orgânica. É provável que as alterações nessas regiões, que concentram água, resultem de radicais livres e de acúmulo de espécies reativas de oxigênio que podem reagir e danificar os componentes orgânicos. Sugere-se que, por conta das alterações estruturais sofridas, o esmalte seja menos resistente ao ataque ácido após radiação25,27.
Contudo, a aplicação de radiação não promove alterações significativas da microdureza do esmalte dentário como um todo30.
O mesmo estudo de análise em microscopia eletrônica, ao avaliar a dentina de dentes permanentes após as doses de radiação acumuladas de 30 e 60 Gy, revelou degradação de colágeno e alterações micro-morfológicas generalizadas, evidenciadas pela presença de obliteração dos túbulos dentinários e fissuras na estrutura dentinária, além da fragmentação da rede de fibras de colágeno, possivelmente resultante da perda de sua hidratação, o que torna o tecido seco e friável25, achados estes que estão de acordo com os
resultados do presente trabalho. Irradiação de proteínas provoca alterações em suas estruturas secundárias e terciárias, com efeitos nocivos sobre a hidratação das fibras de colágeno pela ação de radicais livres31.
A radiação ionizante apresenta efeitos diferentes sobre a microdureza do esmalte e dentina. Uma possível explicação pode ser o fato de a dentina apresentar teor de água maior do que o esmalte - 10% versus 4% em peso32.
Um fato conhecido é que a radiação atua sobre a água conduzindo à formação de radicais livres e peróxido de hidrogênio. Desta forma, o tecido com maior teor de água pode ser mais vulnerável aos efeitos de radiação do que outro com menor teor. As alterações micro-morfológicas da dentina também podem explicar a diminuição progressiva da sua microdureza com o aumento da dosagem de radiação. Como a dentina promove suporte ao esmalte, uma dentina mais macia se torna menos eficiente, permitindo a ocorrência de fraturas e trincas na estrutura de esmalte30.
(LP), que são ligações trivalentes cruzadas de colágeno maduro (a primeira encontrada virtualmente em todos os tecidos maduros, e a segunda, na dentina e osso)9, implicando que a quantidade de colágeno danificado é equivalente
nos dois grupos e que os danos radiogênicos de colágeno da dentina e esmalte não desempenham um papel crucial no curso do desenvolvimento das cáries de radiação. Essa constatação foi suportada pelo argumento de que a dentina e o esmalte apresentam relativa baixa concentração de colágeno24. Tal
constatação diverge do que evidencia o presente trabalho. Vale salientar que a dose de radiação utilizada no referido estudo foi de 31.5 Gy, bastante abaixo da dosagem utilizada em RT para tratamento de neoplasias malignas de cabeça e pescoço, e que a medição de HP e LP representa apenas a mensuração de fragmentação dessas fibras e, portanto, sua estabilidade.
Outros autores descobriram que as propriedades mecânicas da dentina irrradiada in vitro foram afetadas apenas após doses experimentais
acima de 500 Gy, sugerindo que danos radiogênicos diretos sem cofatores adicionais, como hipossalivação, não afetam significativamente os tecidos dentais duros11.
O ligamento periodontal desempenha um papel importante na dissipação da força mecânica, remodelação óssea alveolar e na manutenção do equilíbrio fisiológico do tecido periodontal33. Como componentes essenciais
da matriz extracelular do ligamento periodontal, colágenos do tipo I e III estão intimamente correlacionados com os danos, reparação e regeneração do tecido periodontal, exercendo importante função no metabolismo dessa matriz34. Todo
colágeno tipo I pode integrar-se com receptores de integrina α1 e β2 na membrana dos osteoblastos e facilitar a diferenciação osteoblástica35,36.
Diminuição da vascularidade e acelularidade do ligamento periodontal com ruptura, diminuição da sua espessura, desorientação das suas fibras e alargamento do espaço periodontal após radiação são achados que já foram relatados37 e são comuns a alguns dos achados do presente trabalho.
relativa baixa prevalência de periodontite crônica avançada está relacionada ao aparecimento das cáries dentais. Uma vez que a cárie de radiação se desenvolve, sua progressão é tão rápida que o dente afetado é perdido antes que a doença periodontal possa ocorrer7. Todos os dentes extraídos dos
pacientes submetidos a RT, no presente trabalho, tiveram como indicação cáries de radiação.
Alguns estudos apontam que os efeitos diretos e indiretos da RT sobre o periodonto resultam em risco aumentado de perda de inserção periodontal, perda dentária e, por consequência, risco aumentado de desenvolvimento de ORN. Portanto, os pacientes portadores de neoplasias malignas de cabeça e pescoço candidatos a RT devem passar por um plano de tratamento periodontal prévio38,39. Esse potencial de perda de inserção pode explicar, em
parte, a diminuição da predominância do colágeno tipo I na porção cervical (região onde se iniciam as alterações periodontais) dos dentes submetidos a mais de 60 Gy de radiação, encontrada neste trabalho.
Um estudo realizado para avaliar as alterações da atividade biológica do cemento após radiação ɣ verificou que as substâncias (dentre elas o TGF-β, que apresenta acentuada importância à produção e maturação de colágeno) que aumentam a secreção de osteoprogerina e fator inibidor de osteoclastogênese dos fibroblastos presentes no cemento irradiado são destruídas pela exposição à radiação. Consequentemente, a proliferação de osteoblastos no cemento não pode ser controlada, havendo uma tendência a anquilose40. Tal fato pode justificar, em parte, a maior predominância de colágeno tipo I nas regiões da dentina mais próximas ao cemento nos dentes não irradiados e nos dentes irradiados submetidos a menos de 60 Gy bem como a maior predominância de colágeno tipo III em todas as regiões da dentina dos dentes submetidos a 60 ou mais Gy de radiação deste presente trabalho.
Conclui-se que a radiação ionizante promove alterações do perfil de colágeno da dentina e do ligamento periodontal de dentes submetidos a RT de cabeça e pescoço, o que foi evidenciado pela significância estatística percebida em da diminuição colágeno tipo I e elevação do colágeno tipo III dos dentes que foram submetidos a radiação em comparação a dentes hígidos não irradiados. Tais alterações podem exercer um papel de destaque na instalação e desenvolvimento de cáries ou eventual doença periodontal dos dentes dos pacientes que são submetidos a RT para tratamento de neoplasias malignas de cabeça e pescoço. Contudo, é coerente destacar a necessidade de mais estudos para elucidar a real participação da alteração do padrão de colágeno dos tecidos dentais irradiados sobre a etiopatologia e desenvolvimento das cáries de radiação e doença periodontal.
COLABORADORES
Drª. Ana Paula Negreiros Nunes Alves, Paulo Goberlânio Barros Silva, Alceu Machado de Sousa e Elisa Lima Verde participaram no suporte técnico nas fases laboratoriais da pesquisa.
AGRADECIMENTOS
Ao Pró-Ensino na Saúde, por meio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado.
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GRÁFICOS
Gráfico 1: Quantificação do colágeno no ligamento periodontal de dentes de pacientes submetidos a diferentes doses de radioterapia de cabeça e pescoço. (*p<0.05 versus grupo controle; média ± erro-padrão).
FIGURAS
Figura 1: Fotomicrografias de dentes irradiados (≥ 60 Gy e < 60 Gy), mostrando alteração no perfil de colágenos tipo I e tipo III em dentina e em ligamento periodontal. (Picrosirius Red sob luz polarizada, 200X)
4 CONCLUSÃO GERAL
A análise dos resultados desta pesquisa permitiu observar que ocorrem alterações dose-dependentes no perfil de colágeno tipo I e colágeno tipo III em dentina e ligamento periodontal de dentes incluídos nos campos de radiação de pacientes submetidos a RT para tratamento de neoplasias malignas de cabeça e pescoço.
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