Universidade Federal do Ceará Instituto de Ciências do Mar Pós-graduação em Ciências Marinhas Tropicais

SANDRA PIEDAD VELASQUEZ MEDINA

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE PIRAPITINGA Piaractus brachypomus (PISCES, CHARACIDAE)

Fortaleza, Ceará

2008

Universidade Federal do Ceará Instituto de Ciências do Mar

Sandra Piedad Velásquez Medina

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE PIRAPITINGA Piaractus brachypomus (PISCES, CHARACIDAE)

Dissertação apresentada à Coordenação do Curso de Ciências Marinhas Tropicais do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Marinhas.

Área de concentração: Utilização e Manejo de Ecossistemas Marinhos e Estuarinos

Orientador: Prof. Dr. Luiz Drude de Lacerda.

Co-orientadora: Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro.

Fortaleza, Ceará

2008

Velásquez-Medina, Sandra P.

Criopreservação do sêmen de pirapitinga, Piaratus brachypomus (Pisces, Characidae)/ Sandra Velásquez Medina – Fortaleza, 2008.

96 f.

Dissertação (Mestrado em Ciências Marinhas Tropicais) - Universidade Federal do Ceará, Instituto de Ciências do Mar.

1. Sêmen. 2. Criopreservação. 3. Pirapitinga.

Dedico este trabajo a mi papá Luis

Francisco, a mi hermana Vicky y a

Gustavo que son para mi las

personas mas importantes en mi

vida.

“ En el fondo, los científicos somos gente con suerte:

podemos jugar a lo que queramos durante toda la vida”.

Lee Smolin

“Si no conozco una cosa, la investigaré”.

Louis Pasteur

Meus agradecimentos a continuação são de todo coração, já que estas pessoas colocaram seu grãozinho de areia tanto de forma emocional, educativa ou laboral para a realização desta dissertação:

Ao professor Luiz Drude agradeço imensamente por ter-me apoiado neste projeto no ultimo momento e ter-me brindado sua orientação sabendo do pouco tempo que ele dispõe.

A minha família por estar sempre me ajudando e me animando em tudo o que eu preciso.

A Cristiane Mello por seu tempo e sugestões em cada uma das páginas deste trabalho.

Ao meu querido Gustavo, namorado, noivo, amigo, cúmplice, confidente e demais, que está todos os dias lutando do meu lado para conseguir as coisas “tavo, sin ti no se a donde mi mente hubiera vagado”.

À Pós-Graduação em Ciências Marinhas Tropicais da Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade concedida.

À CAPES pela ajuda financeira para me manter no Brasil nestes anos.

Ao pessoal do Laboratório de Tecnologia de Sêmen Caprino e Ovino da UECE, em especial ao Marcelo e à Audália, sendo pessoas maravilhosas, ensinando-me os primeiros passos da criopreservação e ajudando-me nas minhas coletas.

Ao pessoal do DNOCS por permitir-me realizar minhas coletas nas suas instalações e em especial ao Pedro e ao Alexandre pela grande disposição em colaborar.

A meus amigos brasileiros Fredy, Luciano, Eduardo e Fabiano, que sempre me escutaram e me alegraram.

Ao pessoal dos Laboratórios de Ecologia Marina e Ecotoxicologia do LABOMAR, pessoas tão amáveis que sempre me abriram as portas para compartir com eles.

Ao professores e funcionários do LABOMAR nos momentos de gentileza para comigo, em especial à Maria Gomes por ser um tipo de pessoa de quem mais precisa o mundo, com seu bom dia e sorriso a cada dia.

Ao Frank pelas conversas e ajuda nas minhas dúvidas na língua inglesa.

Ao Ricardo e Lula, por tentar ajudar-me no meu anterior projeto com os ariacós L.

synagris.

A pirapitinga (Piaractus brachypomus) é uma espécie de peixe exótico introduzido no nordeste brasileiro, o qual tem grande importância comercial devido a seu hábito alimentar, excelente crescimento, resistência ao manejo em cativeiro e às enfermidades. A criopreservação de seu sêmen pode contribuir nos aspectos econômico, genético e meio ambiental da região e da espécie. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo adequado de congelação seminal para poder obter motilidades próximas ao sêmen a fresco. Trabalhou-se com o sêmen de 19 machos maduros de dezembro de 2007 a março de 2008, determinando as características seminais; a toxicidade dos crioprotetores DMSO 10% e metilglicol 10%, diluídos em glicose 5%, ACP-104 e solução Ringer nas diluições de 1:3, 1:5 e 1:7, durante 15 minutos a 4°C; a criopreservação a -196°C com as mesmas criodiluições usando palhetas de 0,25 e 0,5 mL, congeladas em vapores de nitrogênio líquido em caixas de isopor ou em “dry shipper”, sendo depois transferidas para botijões criogênicos durante 15 dias. Foram avaliadas as motilidades e velocidades através da análise seminal auxiliado por computador (CASA) pós- descongelação; e a morfologia seminal a fresco e pós-descongelação. Os parâmetros seminais a fresco observados foram: motilidade objetiva média de 94%, concentração de 44 x 10

spzt/mL, volume de 7 mL, osmolaridade de 317 mOsm/Kg e pH de 8,4. Nos testes de toxicidade não foram encontradas diferenças significativas entre o T3 (Ringer+Metilglicol 10%) na diluição 1:3 comparado com o grupo controle (P=0.06), apresentando motilidade de 80% e VCL de 95 µm/s. O melhor método de congelamento foi o “dry shipper” utilizando palhetas de 0,5 mL, registrando motilidade de 62% para o T6 (Glicose+DMSO 10%) na diluição 1:7, entretanto, apresentaram baixas velocidades para todos os tratamentos, com melhores resultados de VCL, VSL e VAP para o T6. No sêmen fresco, a morfoanomalia mais encontrada foi a cauda dobrada (20%) e no sêmen pós- descongelação, a cauda enrolada (23%). Comparando-se os resultados de morfoanomalias antes e pós-descongelamento foram observadas diferenças significativas entre as amostras (P<0,05). Conclui-se que o sêmen de pirapitinga pode ser preservado em Ringer+Metilglicol 10% em 1:3, sem apresentar altas toxicidades, e criopreservado em Glicose+DMSO 10% utilizando o “dry shipper”.

Palavras-chave: sêmen, criopreservação, pirapitinga.

The pirapitinga (Piaractus brachypomus) is a species of exotic fish introduced in the Brazilian north-eastern, with great commercial importance for its alimentary habit, excellent growth, handling resistance in captivity and against diseases. The cryopreservation of its semen can contribute in the economic, genetic and environment aspects of the region and the species. The objective of this work was to develop an adequate protocol of seminal frozen to be able to obtain motility closer to the fresh semen. It was worked with the semen of 19 mature males between December of 2007 and March of 2008, determining its seminal characteristics; the cryoprotectants toxicity DMSO 10% and methylglicol 10%, diluted in glucose 5%, ACP-104 and Ringer solution at 1:3, 1:5 and 1:7 dilutions, during 15 minutes at 4°C;

the cryopreservation at -196°C with the same cryoextenders using 0,25 and 0,5 mL straws, frozen in nitrogen vapor inside styrofoam boxes or in dry shipper, being later transferred to cryogenic containers for 15 days. It was evaluated the motilities and speeds through the computer-assisted sperm analysis (CASA) post-thawed; and the morphology in fresh and post-thawed semen. The seminal parameters observed in fresh semen were: objective mean motility of 94%, concentration of 44 x 10

spzt/mL, semen volume of 7 mL, osmolarity of 317 mOsm/kg and pH of 8,4. In the toxicity tests weren’t find significant differences between T3 (Ringer+Methylglicol 10%) at 1:3 dilution compared with the control group (P=0.06), showing motility of 80% and VCL of 95 µm/s. The best frozen method was in dry shipper using 0.5 mL straws, registering motility of 62% for T6 (Glucose+DMSO 10%) at 1:7 dilution, however, showing low speeds for all treatments, with better results of VCL, VSL and VAP to T6. In fresh semen, the morpho anomalies most found was the tail doubled (20%) and in the post-thawed semen, the tail coiled (23%). Comparing the morpho anomalies results before and after frozen it was observed significant differences between samples (P<0.05). It was concluded that the pirapitinga semen can be preserved in Ringer+Methylglicol 10% in 1:3, without presenting high toxicities, and cryopreservated in Glucose+DMSO 10% using dry shipper.

Key words: semen, cryopreservation, pirapitinga.

Pág.

RESUMO... vii

ABSTRACT... viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS... xi

LISTA DE FIGURAS... xii

LISTA DE TABELAS E QUADROS ... xvi

1. INTRODUÇÃO... 01

2. REVISÃO DE LITERATURA... 03

2.1. Descrição da espécie... 03

2.2. Características gerais do espermatozóide de teleósteos... 05

2.2.1. Motilidade... 06

2.2.2. Morfoanomalias... 08

2.3. Processo de Congelamento... 10

2.3.1. Agentes crioprotetores... 12

2.3.2. Meios diluentes... 13

2.4. Avaliação da cinética espermática através de análise seminal auxiliada por computador (CASA)... 14

3. JUSTIFICATIVA... 16

4. OBJETIVOS... 18

4.1. Objetivo Geral... 18

4.2. Objetivos Específicos... 18

5. MATERIAL E MÉTODOS... 19

5.1. Local do experimento e animais experimentais... 19

5.2. Hipofisação dos reprodutores... 20

5.3. Coleta de sêmen... 20

5.4. Teste de contaminação do sêmen... 21

5.5. Avaliação da motilidade... 21

5.6. Características seminais... 22

5.7. Estudo da toxicidade do crioprotetor... 23

5.8. Congelamento e descongelamento seminal... 24

Experimento 1: Congelamento em rampa em palheta de 0,25 mL... 24

Experimento 3: Congelamento em “dry shipper” em palhetas de 0,5 mL.. 27

5.9. Análise morfológica do sêmen... 28

5.10. Análises estatísticas... 29

6. RESULTADOS... 30

6.1. Características do sêmen... 30

6.2. Estudo da toxicidade dos crioprotetores... 31

6.2.1. Motilidade... 31

6.2.2. Velocidades... 32

6.3. Congelamento e descongelamento seminal... 37

Experimento 1: Congelamento em rampa em palheta de 0,25 mL... 37

Experimento 2: Congelamento em rampa em palheta de 0,5 mL... 40

Experimento 3: Congelamento em “dry shipper” em palhetas de 0,5 mL.. 43

6.4. Análise morfológica do sêmen... 50

7. DISCUSSÃO... 53

7.1. Características do sêmen... 53

7.2. Estudo da toxicidade de crioprotetores... 54

7.3. Testes de Criopreservação... 57

7.4. Análise morfológica do sêmen... 61

8. CONCLUSÕES... 64

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 65

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% Porcentagem

ACP-104 Meio diluente à base de água de coco em pó para sêmen de peixes ATP Adenosina trifosfato

AMPc Adenosina monofosfato ciclico

°C Graus Celsius

CASA Computer Assisted Semen Analysis DMSO Dimetil sulfóxido

EP Erro padrão

LTSCO Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino

M Mol

mL Mililitro mOsm Miliosmoles N

L Nitrogênio líquido

pH Potencial hidrogeniônico

s Segundo

SCA Sperm Class Analyzer

T1 Tratamento 1 (Ringer + DMSO 10%) T2 Tratamento 2 (ACP-104 + DMSO 10%) T3 Tratamento 3 (Ringer + Metilglicol 10%) T4 Tratamento 4 (ACP-104 + Metilglicol 10%) T5 Tratamento 5 (Glicose 5% + Metilglicol 10%) T6 Tratamento 6 (Glicose 5% + DMSO 10%)

µL Microlitros

µm Micrômetro

VAP Velocidade média

VCL Velocidade curvilinear da trajetória

VSL Velocidade linear

Pág.

Figura 1. Adulto de pirapitinga (Piaractus brachypomus)... 05

Figura 2. Espermatozóides de Piaractus brachypomus a 400X, corados com azul de bromofenol... 06

Figura 3. Dinâmica dos mecanismos de inibição e ativação espermática em peixes de água doce (Adaptado de Tabares et al., 2005)... 08

Figura 4. Equipamentos para congelamento de sêmen: (A) geladeira de poliestireno com rampa metálica, (B) “dry shipper”... 12

Figura 5. Representação esquemática das diferentes velocidades medidas pelo sistema de análise seminal (CASA). VCL= velocidade curvilinear; VSL= velocidade em linha reta; VAP = velocidade média... 15

Figura 6. Leitura da marcação eletrônica com chip das pirapitingas... 19

Figura 7. Coleta do sêmen de pirapitinga em Epperdorf... 20

Figura 8. Teste de toxicidade, criodiluições resfriadas a 4°C... 23

Figura 9. Preenchimento de palhetas com as criodiluções... 25

Figura 10. Raques com globetes para o armazenamento das palhetas... 25

Figura 11. Descongelamento das palhetas em banho-maria... 26

Figura 12. Página principal do resultado da avaliação de motilidade com o sistema CASA... 26

Figura 13. Representação dos movimentos dos espermatozóides de pirapitinga avaliados com o método CASA... 27

Figura 14. Congelamento em “dry shipper” a -170°C... 28

Figura 15. Média ± erro padrão da motilidade de espermatozóides

progressivos, rápidos, médios e lentos nas criodiluições

avaliadas no teste da toxicidade. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 =

ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-

104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 =

Glicose 5%+DMSO 10%. Letras diferentes são

significativamente diferentes (P<0.05)... 34

Figura 16. Média ± erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s, nas diferentes criodiluições avaliadas no teste da toxicidade.

VCL = velocidade curvilinear; VSL = velocidade linear; VAP = velocidade média. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP- 104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP- 104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%. Letras diferentes são significativamente diferentes (P<0.05)... 34 Figura 17. Médias e intervalo de confiança da motilidade de

espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos nas criodiluições avaliadas no teste de toxicidade. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%... 35 Figura 18. Médias e intervalo de confiança das velocidades espermáticas,

em µm/s, nas diferentes criodiluições avaliadas no teste da toxicidade. VCL = velocidade curvilinear; VSL = velocidade linear; VAP = velocidade média. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP- 104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 =

Glicose 5%+DMSO 10% 36

Figura 19. Curva de congelamento dos experimentos 1 e 2 utilizando o equipamento de geladeira de isopor com rampa durante 5 minutos... 37 Figura 20. Média e erro padrão da motilidade de espermatozóides

progressivos, rápidos, médios e lentos pós-descongelamento

utilizando palheta de 0,25 mL e rampa de congelamento. T1 =

Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 =

Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 =

Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%... 38

Figura 21. Média e erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s, pós-descongelamento, em palheta de 0,25 mL e rampa de congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%... 40 Figura 22. Média e erro padrão da motilidade de espermatozóides

progressivos, rápidos, médios e lentos pós-descongelamento utilizando palheta de 0,50 mL e rampa de congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%... 41 Figura 23. Média e erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s,

pós-descongelamento, em palheta de 0,50 mL e rampa de congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%... 43 Figura 24. Média e erro padrão da motilidade de espermatozóides

progressivos, rápidos, médios e lentos pós-descongelamento utilizando palheta de 0,50 mL e “dry shipper”. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%... 46 Figura 25. Média e erro padrão das velocidades espermáticas (curvilinear,

linear e média) pós-descongelamento utilizando palheta de 0,50 mL e “dry shipper”. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP- 104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP- 104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%... 46 Figura 26. Análise geral das criosoluções e criodiluições em palhetas de

0,25 e 0,5 mL e pelos métodos de congelamento em rampa

dentro de geladeira de isopor e “dry shipper” (média ± ep)... 48/49

de Piaractus brachypomus a fresco... 51 Figura 28. Porcentagem média das características morfológicas do sêmen

de Piaractus brachypomus pós-descongelamento nos meios

diluentes Ringer, ACP-104 e Glicose e nos crioprotetores

DMSO e Metilglicol... 51

Tabela 1. Diluentes e crioprotetores utilizados no teste de toxicidade e na criopreservação de sêmen de pirapitinga (Piaractus brachypomus) 24 Tabela 2. Morfoanomalias em espermatozóides de pirapitinga (Piaractus

brachypomus)... 29 Tabela 3. Características seminais das pirapitingas, avaliadas durante o

período de dezembro de 2007 a março de 2008... 30 Tabela 4. Características dos “pools” de sêmen de pirapitinga... 31 Tabela 5. Valores médios das porcentagens de motilidade total (MT),

espermatozóides rápidos, médios e lentos, e velocidades curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP) (µm/s) nos testes de toxicidade... 33 Tabela 6. Média e erro padrão da motilidade, em porcentagem, de

espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos, e velocidades curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP), em µm/s, no teste de congelamento na geladeira de isopor, em palheta de 0,25 mL... 39 Tabela 7. Média e erro padrão da motilidade, em porcentagem, de

espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos, e velocidades curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP), em µm/s, no teste de congelamento na geladeira de isopor, em palheta de 0,50 mL... 42 Tabela 8. Média e erro padrão da motilidade, em porcentagem, de

espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos, e velocidades curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP), em µm/s, no teste de congelamento no “dry shipper”, em palheta de 0.50 mL... 45 Quadro 1. Análise subjetiva da motilidade (adaptado de Strussman et

al.,1994)... 21 Quadro 2. Parâmetros estabelecidos para a análise pelo sistema CASA do

sêmen de pirapitinga (Piaractus brachypomus)... 22

Quadro 3. Alterações morfologicas do sêmen de Piaractus brachypomus,

lâminas coradas com azul de bromofenol: (A) normal; (B) cabeça

deformada; (C) peça intermediária degenerada; (D, F, G, H) cauda

enrolada; (E) cauda dobrada na ponta; (I) cauda dobrada; (J) gota

citoplasmática proximal; (K) gota citoplasmática distal; (L) cauda

quebrada... 52

As populações naturais de peixes têm diminuído nas ultimas décadas devido à degradação ambiental e à pesca excessiva, fatores que aceleram a descaracterização e o desaparecimento do habitat aquático natural e dos organismos que nele vivem (Miliorini, 2006). Com o passar dos anos a demanda de pescado vem aumentando impulsionada principalmente pelo crescimento da população e a tendência mundial da procura de alimentos saudáveis indicados para a saúde humana, como o pescado, sendo este uma alternativa alimentar de alto valor nutritivo, baixo teor de gordura e alta digestabilidade (Andrade e Yusi, 2003).

Visando suprir este desequilíbrio ecológico e aumentar os benefícios econômicos, a piscicultura que produz 43 milhões de toneladas por ano (FAO, 2007) gera constantemente inúmeros trabalhos no âmbito de técnicas de cultivo, controle de doenças, avaliação dos gametas produzidos em cativeiro e técnicas para congelamento seminal, entre outras (Yao et al., 2000; Williot et al., 2000; Tvedt et al., 2001; Taddei et al., 2001; Tanaka et al., 2002).

O conhecimento e desenvolvimento de novos protocolos para o armazenamento de sêmen de peixes vêm avançando desde a última década, mostrando sempre a sua importância como ferramenta em programas de melhoramento genético de espécies de interesse econômico, em iniciativas de re- estabelecimento das populações de ambientes em recuperação, na criação de importantes bancos de sêmen de peixes nativos e no aumento das produções em cativeiro (Carneiro, 2007).

A técnica de criopreservação fundamenta-se no congelamento de gametas

em nitrogênio líquido, podendo ser preservadas por um período de vários anos

(Suquet et al., 2000). O primeiro trabalho de congelamento foi realizado por Blaxter,

em 1953 (citado por Suquet et al., 2000), que viabilizou o cruzamento de duas

espécies de arenque que desovam em épocas diferentes do ano. Desde então, tem-

se gerado um grande número de protocolos tanto para espécies de água doce

(salmão e carpa) como marinhas (linguados e tainhas), entre outras (Suquet et al.,

2000). Na atualidade existem no mundo bancos genéticos de peixes na Rússia,

Ucrânia, Finlândia, Noruega, Reino Unido, Filipinas, Estados Unidos, Canadá, índia,

Brasil e Colômbia (Harvey et al., 1998).

No Brasil, mais especificamente no Sudeste, várias espécies de peixes encontradas nos Estados de Santa Catarina, São Paulo e Minas Gerais, têm sido objetos de diversos estudos relacionados à criopreservação, destacando-se trabalhos com as espécies Pseudoplatystoma corruscans (pintado), os characideos curimba (Prochilodus lineatus), pacu (Piaractus mesopotamicus), piapara (Leporinus elongatus), dourado (Salminus maxillosus) (Carolsfeld et al., 2003), a falsa pirapitinga (Brycon nattereri) (Oliveira et al., 2006) e a piracanjuba (Brycon orbignyanus) (Bedore, 1999; Murgas et al., 2001, 2004, 2007; Carolsfeld et al., 2003;

Maria et al., 2006). Nestes trabalhos vários tipos de crioprotetores e diluentes foram testados, dos quais o dimetilsulfóxido a 10%, combinado com a glicose a 5% e a gema de ovo mostraram motilidades espermáticas acima de 50%.

No Nordeste do Brasil, este tipo de pesquisa tem sido pouco abordada. No caso do Estado do Ceará só foram realizados dois trabalhos, um deles com a espécie Colossoma macropomum (tambaqui), realizado por Farias (1998) que utilizou a água de coco como ativador e como diluente do sêmen, em várias osmolaridades, conseguindo resultados promissórios. O outro trabalho realizado por Carvalho (1999), mostrou motilidades baixas dos espermatozóides ao criopreservar sêmen da espécie Ciprinus carpio (carpa) em água de coco acrescida de glicerol ou etileno-glicol como crioprotetores.

Embora seja endêmica do Amazonas, a espécie Piaractus brachypomus

(pirapintiga ou pacu branco), pertencente aos characideos, é uma espécie altamente

comercial na região Nordeste brasileira pela qualidade de sua carne. Recentemente,

a diminuição na diversidade genética observada nos plantéis de reprodutores das

fazendas dedicadas à produção de alevinos e os freqüentes fenômenos cíclicos de

secas, os quais exercem acentuada ação sobre seus processos reprodutivos, obriga

a regularizar ou desenvolver tecnologias que permitam o intercâmbio de material

seminal entre os produtores, aproveitar as gametas que possam obter-se de

indivíduos silvestres e conservar amostras seminais nos períodos menos favoráveis

(Farias, 1998; Fresneda et al., 2004).

2.1. Descrição da espécie

A pirapitinga (Piaractus brachypomus) é uma espécie nativa dos rios Amazonas, Orinoco e seus afluentes. Foi introduzida no Ceará em 1972 pelo Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS). Os primeiros exemplares trazidos de Iquitos (Peru) foram com o objetivo de povoamento dos açudes e estocagem em viveiros para seu cultivo intensivo (Sobrinho et al., 1984).

Hoje em dia o Centro de Pesquisas em Aqüicultura do DNOCS produz grandes quantidades de alevinos provenientes do cruzamento dos estoques originais.

A espécie apresenta de 33 a 37 rastros no primeiro arco branquial, 88 a 98 escamas na linha lateral e 1 a 3 dentes no maxilar. Atinge 79 cm de comprimento total e 11 kg de peso corporal. Sua cor é branco prateada, com nadadeiras peitorais de cor amarela, abdominais e anal vermelhas. A coloração vermelha vivo no peito aparece na época de desova e é muito acentuada (Fig. 1). A espécie é conhecida no mundo como cachama, cachama blanca, freshwater pompano, pacu, red pacu, redbellied pacu, morocoto, paco e caranha.

Classificação taxonômica (FISHBASE, 2008):

Reino Animália Filo Chordata Classe Teleostei Ordem Cypriniforme Família Characidae

Gênero Piaractus (Holmberg, 1887)

Espécie Piaractus brachypomus (Cuvier, 1818)

Sinônimos ambíguos (FISHBASE, 2008):

Colossoma mitrei (non Berg, 1895)

Myletes edulis (non Castelnau, 1855)

Myletes mitrei (non Berg, 1895)

Piaractus mitrei (non Berg, 1895)

Sinônimos Unambíguos (FISHBASE, 2008):

Colossoma bidens (Spix e Agassiz, 1829) Colossoma brachypomum (Cuvier, 1818) Colossoma branchypomus (Cuvier, 1818) Colossoma paco (Humboldt, 1821)

Myletes bidens (Spix e Agassiz, 1829) Myletes brachypomus (Cuvier, 1818) Piaractus mesopotamicus (Cuvier, 1818) Piaractus brachipomus (Cuvier, 1818) Piaractus briachypumus (Cuvier, 1818)

Os indivíduos em cativeiro não conseguem desovar naturalmente porque nessas condições não encontram estímulos físico-químicos para completar seu ciclo de reprodução, sendo necessária a indução hormonal com hipófise de carpa e a fertilização artificial. Nas condições naturais, estes peixes migram rio acima no período entre junho/julho até outubro, quando os ovários das fêmeas ainda não estão desenvolvidos, por isso são chamadas de espécie de piracema. A desova ocorre no período de novembro a fevereiro quando as condições ambientais se tornam ideais, com temperatura media da água de 27°C após as primeiras chuvas.

As fêmeas de pirapitinga alcançam sua maturidade sexual ao cabo de três anos, enquanto que a dos machos ocorre ao final de dois anos. São espécies de fecundação externa as quais liberam seus gametas no meio ambiente (Almeida, 1997).

Segundo Mesa e Botero (2007) as pirapitingas são espécies de grande

importância comercial devido a seu hábito alimentar (frutas, restos de cultivos

agrícolas, farelo de trigo, cuim, etc.), excelente crescimento, resistência ao manejo

em cativeiro, apresenta alta docilidade, resistente às enfermidades, é de fácil

adaptação às condições limnológicas desfavoráveis por períodos não prolongados e

porque podem ser criadas com outras espécies, tais como as tilápias e as carpas.

Figura 1. Adulto de pirapitinga (Piaractus brachypomus)

2.2. Características gerais do espermatozóide de teleósteos

O espermatozóide dos peixes com fecundação externa tem uma estrutura do tipo simples (Fig. 2), apresenta uma cabeça que mede entre 2-4 micrometros, sendo quase esférica e conformada por um núcleo no qual se encontra o DNA, um colar que forma a peça intermediária onde se encontram os centríolos e de 2 a 9 mitocôndrias, um flagelo que pode medir entre 20 e 100 mm constituído por um axonema com nove pares de microtubulos periféricos e um par central. A membrana que recobre o espermatozóide está composta de fosfolipídios, lipídios neutros e glicolipídios, sua função é fundamental para a regulação de diferentes atividades celulares e vias de sinalização que podem conduzir à motilidade espermática.

Os espermatozóides da maioria dos peixes não possui acrossoma,

característica que os diferença do sêmen de mamíferos, não precisam desta

estrutura porque as gametas, ao serem liberados no meio, entram diretamente na

micrópila dos ovócitos, finalizando a fecundação. Esta cavidade permanece pouco

tempo aberta, se fechando em poucos minutos ao hidratar-se o ovócito no momento

de ser liberado na água (Morales, 1986).

Figura 2. Espermatozóides de Piaractus brachypomus a 400X, corados com azul de bromofenol.

2.2.1. Motilidade

O sêmen de peixes se encontra inativo dentro dos testículos, ao entrar em contato com a água, contam com um breve período de ativação, que se expressa no movimento e velocidade para lograr a fertilização. Esta motilidade se deve a mudanças na pressão osmótica, balanço iônico e pH (Fig. 3).

Todo o processo começa quando os espermatozóides passam pelo conduto espermático, onde são banhados pelo fluido testicular ou plasma seminal, o qual tem pH básico e é rico em bicarbonato (HCO

), fazendo com que permaneçam imóveis e com metabolismo reduzido, onde as mitocôndrias se encontram com baixo potencial de membrana a fim de preservar as poucas reservas energéticas e diminuir a formação de compostos de oxidação.

Quando ocorre a espermiação no meio aquoso, os fatores que suprimem a motilidade são neutralizados no momento pelas condições do meio ambiente e a motilidade espermática é parcialmente controlada pela pressão osmótica. Em peixes continentais, a água tem uma baixa osmolaridade em comparação com o plasma seminal, ocorrendo assim um choque hiposmótico que gera o sinal inicial para os eventos que conduzem à ativação e que, na maioria dos peixes de água doce, tem uma duração de 30 a 40 segundos. Com uma solução ativadora de qualquer composição iônica, entre a faixa de 100 a 200 miliosmoles (mOsm/kg), já é possível desencadear a ativação por abertura de canais iônicos ao provocar um estiramento das células por hiperpolarizando a membrana.

O principal efeito do choque hiposmótico na cascada da iniciação da ativação

da motilidade do espermatozóide é induzir uma imediata hiperpolarização da

membrana, o qual leva a um desenvolvimento progressivo da ativação da motilidade flagelar e também a um incremento do pH intracelular, alterado pelo incremento ou diminuição da concentração iônica interna (Tabares et al., 2005).

Na carpa, os espermatozóides imóveis têm um potencial de membrana baixo, devido ao fato de que a carga é maior no plasma seminal (82.4 mM de K

) que em nível intracelular (60.5 mM de K

). Na iniciação da motilidade induzida por osmolaridade, diminui a pressão osmótica extracelular e a concentração de K

, resultando em uma hiperpolarização transitória da membrana (Krasznai et al., 1995).

O balanço iônico também tem papel na aquisição da capacidade para a ativação da motilidade e está relacionado com as mudanças nas concentrações extracelulares de K

, Na

, HCO

e íons hidrogênio. A tensão de membrana modifica a conformação de algumas proteínas membranais, permitindo o intercâmbio de íons com o meio extracelular, o Ca

ingressa no espermatozóide, e participa na regulação do início da ativação; desencadeando a transdução de sinais e atuando como enzima efetora através da adenilato ciclase, a qual regula o metabolismo do AMPc. Os íons K

inibem a ativação dos espermatozóides a baixas concentrações.

Devido a isso, se há reportado que a inibição da ação do K

é regulada principalmente pelos íons Ca

, possivelmente devido ao fluxo simultâneo de Ca

e K

. A saída de K

favorece a abertura de canais de Ca

e o ingresso do mesmo até o interior. O Ca

que ingressa, favorece a liberação de Ca

intracelular armazenado e modifica o pHi (pH intracelular) produzindo-se o primeiro sinal Ca

dependente e AMPc independente para o início da motilidade. No caso da truta, os íons Na

e Mg

também participam no processo de ativação, reduzindo a ação inibitória dos íons K

(Cosson et al., 1999).

O pH extracelular é outro dos fatores que controla os parâmetros da motilidade,

e seus valores ótimos são necessários mas não suficientes para as condições de

ativação espermática, alterações do pH interno (um possível segundo mensageiro

celular) interferem com a motilidade em diferentes espécies. Portanto, a modificação

do pH intracelular por ação do Ca

e outros componentes parecem ser necessárias

no processo de ativação. A motilidade flagelar depende do pH intracelular numa

faixa de 6.5 - 8.5, acima ou abaixo desses valores, se reduz significativamente

(Tabares et al., 2005).

Figura 3. Dinâmica dos mecanismos de inibição e ativação espermática em peixes de água doce (Adaptado de Tabares et al., 2005).

2.2.2. Morfoanomalias:

A avaliação morfológica dos espermatozóides é importante, já que poderá

definir o estado das células e a taxa de fecundidade. Suas características foram

classificadas em dois grupos:

a) Anormalidades secundárias ou menores: espermatozóides que podem apresentar cabeça isolada, flagelo dobrado ou gotas citoplasmáticas no flagelo próximas à cabeça. Estas morfoanomalias não afetam significativamente a fertilidade.

b) Anormalidades primárias ou maiores: são todas as anormalidades de cabeça (macrocefalia, microcefalia, degenerada), gotas livres ou distais no flagelo, flagelos curvados, dobrados ou quebrados. Estas morfoanomalias podem afetar significativamente a fertilidade (Sierra, 2005).

Cada uma destas alterações se define da seguinte forma:

Anormalidades maiores:

a) Macrocefalia: se observa naqueles espermatozóides que apresentam cabeça gigante, com contorno e forma anormais, sem aparente degeneração cromatínica ou vacuolar.

b) Microcefalia: espermatozóides com cabeça de tamanho reduzido, com contorno e forma anormais, sem degeneração cromatínica ou vacuolar aparentes.

c) Cabeça degenerada: espermatozóides com cabeça de tamanho e forma normais, mas que apresentam contorno irregular e ou degenerações cromatínica ou vacuolar aparentes.

d) Peça intermediária degenerada (PID): alterações na espessura (terço médio da peça intermediária), densidade, difração e comprimento da peça intermediária, envolvendo seu contorno e sua inserção à cabeça (colo).

e) Cauda fraturada: células espermáticas com fratura e retenção da cauda.

f) Cauda fortemente enrolada: consisti da dobradura e enovelamento da cauda sobre si mesma ou sobre a cabeça.

g) Cauda degenerada: espermatozóides que apresentam descontinuidade da cauda a partir da peça intermediária.

Anormalidades menores:

a) Cabeça isolada normal: cabeças observadas sem cauda, porém sem

qualquer alteração de cabeça.

mesma ou a cabeça.

c) Gotas citoplasmáticas: gotas posicionadas ao longo do flagelo.

Quando os espermatozóides apresentam morfoanomalias maiores e menores simultaneamente, são consideradas as alterações maiores e, quando dois tipos de anormalidade da mesma categoria ocorreram simultaneamente, aquela de maior implicação sobre a fertilização é considerada.

2.3. Processo de congelamento

A técnica de congelamento celular basicamente resulta na transferência de temperatura e no transporte de água. Pode ser dividida em três etapas: (1) As células são submetidas a uma solução crioprotetora (metanol, etileno-glicol, glicerol, etc.), a qual penetra na célula e substitui a maior quantidade de água intracelular; (2) Posteriormente, a célula deve regular a osmolaridade, ficando isotônica com o meio extracelular, o que pode causar efeitos tóxicos e impactos osmóticos nas mesmas;

(3) Na última etapa, se faz diminuir a temperatura passando pelo ponto de congelamento da água e da solução crioprotetora onde, segundo a curva de congelamento empregada, se realizará de maneira diferente a formação de cristais, os quais podem chegar a danificar a célula (Lezcano, 2001).

Se a taxa de resfriamento é baixa, há suficiente tempo para que as células percam a água necessária para permanecer em equilíbrio osmótico com a solução extracelular concentrada; embora uma exposição prolongada à solução concentrada seja geralmente letal. Por outra parte, se a taxa de resfriamento é alta, não há tempo suficiente para que a água se difunda fora das células formando cristal de gelo. As células se equilibrarão por congelamento intracelular iniciado por nucleação homogênea ou heterogênea, sendo o congelamento intracelular fatal.

Uma situação balanceada que permita a sobrevivência pode dar-se quando a

taxa de resfriamento seja o suficientemente alta para minimizar o tempo de

exposição à solução concentrada e, ao mesmo tempo, suficientemente baixa para

minimizar a quantidade de gelo intracelular por abaixo do nível crítico ao criodano

(Sierra, 2005).

Existem vários utensílios e equipamentos para congelar as amostras de sêmen, sendo os mais utilizados as geladeiras de isopor, “dry shippers”, freezers reguláveis e botijões criogênicos, dentro dos quais são introduzidas palhetas francesas plásticas, cujo volume pode ser de 0,25 , 0,5 e 5 mL (Maisse et al., 1998).

A geladeira de isopor consiste em uma caixa de polietileno de 50x30x30 cm, dentro da qual é adaptada uma rampa metálica separada do fundo 10 cm, onde a temperatura desejada se consegue colocando o nitrogênio líquido a certa altura e as amostras são congeladas só com o vapor do nitrogênio (Fig. 4 A).

O “dry shipper” é um contêiner para transportar com segurança amostras em temperaturas criogênicas. Trata-se de um botijão em alumínio de 50 cm de altura x 30 cm de diâmetro, cujo interior está recoberto por um material de absorção e no meio possui um cilindro onde se suspende uma caneca onde são colocadas as amostras, as quais também são congeladas com os vapores do nitrogênio (Fig. 4 B) (www.taylorwharton.com).

Vários destes equipamentos foram testados em várias ocasiões, Riley et al.

(2004) congelaram em câmaras frias a -140°C, com uma curva de -16°C/min, começando de -60°C, já que ao colocar as amostras a temperatura aumentou.

Cruz et al. (2004), usaram o vapor de nitrogênio líquido dentro de uma geladeira de isopor, colando uma rampa a 3 cm do fundo, estabilizando a temperatura a -76°C durante 15 minutos e Degraaf et al. (2004), colocando as amostras em palhetas de 0,5 mL congelou em um freezer programável a -10°C/min até -150°C, finalmente como a maioria de estudos depois de um tempo determinado as palhetas foram transferidas ao nitrogênio liquido a -196°C.

No Brasil, Maria (2005), congelou sêmen de piracanjuba (Brycon orbignyanus)

dentro de um “dry shipper” a -170°C, a uma taxa de congelamento de -35.6°C/min

durante 24 horas.

Figura 4. Equipamentos para congelamento de sêmen: (A) geladeira de poliestireno com rampa metálica, (B) “dry shipper” (www.taylorwharton.com).

2.3.1. Agentes crioprotetores

Os crioprotetores são empregados no congelamento para diminuir os danos celulares produzidos pelo processo de congelamento-descongelamento. Estas substâncias devem possuir como propriedades uma baixa toxicidade para as células e alta solubilidade em água (Miliorini, 2006). Podem ser classificadas como intracelulares ou permeáveis e extracelulares ou impermeáveis. O crioprotetor intracelular é uma substância química que retira a água da célula e diminui a temperatura em seu interior, interferindo na formação de cristais de gelo. Entre os crioprotetores intracelulares mais utilizados podem ser citados dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, metanol e etilenoglicol usados geralmente a uma concentração de 10% (Maria, 2005). Recentemente foi descrita a excelente ação do metilglicol como crioprotetor de sêmen de piracanjuba (Maria, 2005).

O DMSO tem mostrado bons resultados tanto para espécies de água doce como a truta arco-íris (Oncorrhynchus mykiss) e a piracanjuba (Brycon siebenthale) com taxas de motilidade de 60 a 80 % (Medina et al., 2005), como para espécies marinhas como o linguado e o pargo (Dreanno et al., 1997; Riley et al., 2004).

Carolsfeld et al. (2003), trabalhando com criopreservação de sêmen de peixes

migratórios brasileiros, utilizaram o crioprotetor DMSO com sucesso no

congelamento do sêmen das seguintes espécies: curimbatá (Prochilodus lineatus),

pacu (Piaractus mesopotamicus), piapara (Leporinus elongatos), piracanjuba

(Brycon orbignyanus) e dourado (Salminus maxillosus).

seminal é naturalmente rico em glicerol como no peixe Coregonus muksun. E o metanol, que é altamente inflamável, em peixes tropicais como as tilápias (Oreochromis sp.) e o Zebrafish (Brachydanio rerio) apresentando altas taxas de motilidade (Maisse et al., 1998).

Os crioprotetores extracelulares funcionam de forma diferente; ao invés de entrarem na célula, eles recobrem a superfície celular e estabilizam a membrana, ajudando, portanto, a minimizar e reparar os possíveis danos celulares causados pelo processo de congelamento. Incluem açúcares (sacarose, glicose) sendo estes também considerados como diluentes, polímeros (dextrano, PVP) e proteínas (gema de ovo e leite em pó) (Sierra, 2005), a combinação de um crioprotetor intra e extracelular é muito empregada para os processos de criopreservação. Navarro et al. (2004) criopreservaram sêmen de cachama blanca (Piaractus brachypomus) em criosoluções contendo glicose, gema de ovo e leite em pó.

2.3.2. Meios diluentes

O sêmen puro é praticamente impossível de ser congelado, necessitando tanto da adição de crioprotetores como de meios diluentes. Sendo estes últimos soluções de sais ou de carboidratos, que adicionados ao sêmen, mantém a viabilidade das células espermáticas durante a redução da temperatura. As condições mínimas requeridas para um diluente adequado são: isotonicidade, para que não haja ativação prévia da motilidade espermática; estabilidade, pois suas características físico-químicas não devem ser alteradas durante o contato com o sêmen;

condutividade térmica elevada, permitindo a rápida transferência de temperatura do meio externo para os espermatozóides; esterilidade, ou seja, não devem vincular microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas; e, finalmente, servir de carreador de crioprotetores. É importante que a motilidade dos espermatozóides não seja ativada antes do congelamento e nem durante o descongelamento, pois a mesma pode exaurir a reserva energética necessária à fertilização (Legendre e Billard, 1980).

Na maioria dos trabalhos, a combinação desses dois agentes (crioprotetores e

diluentes) é diferente sendo muito difícil saber qual é o fator ideal para cada espécie,

já que eles atuam de forma distinta (Maisse et al., 1998).

2.4. Avaliação da cinética espermática através do sistema de análise seminal auxiliada por computador (CASA)

O sistema de análise seminal auxiliado por computador é formado por um microscópio ótico binocular com contraste de fase acoplado a uma câmera de vídeo e placa aquecedora, conectados a um computador que utiliza o software SCA. Este programa provê os meios para uma classificação objetiva e rápida, de uma determinada população de espermatozóides. Usando imagens digitais da trajetória de cada célula espermática, o CASA pode analisar, processando algoritmos, as propriedades de movimento dos espermatozóides (Verstegen et al., 2002).

O sistema é simples, envolve uma câmara filmadora que grava o movimento através do videomicroscópio e depois recomeça a seqüência quadro a quadro enquanto marca a posição de cada espermatozóide em um tempo determinado para assim poder calcular as velocidades e a motilidade. Este programa é muito utilizado para avaliação de sêmen humano em clínicas de fertilidade, também sendo muito utilizado para mamíferos, mas que para peixes teve que ser adaptado pelo tempo de movimento, que é de menos de 2 minutos, comparado às varias horas do sêmen de mamíferos (Kime et al., 2001).

Os parâmetros do CASA que são geralmente informados incluem:

MOT (%): percentual de espermatozóides móveis ou progressivos, determinando os que têm movimento rápido, movimento médio e os localmente móveis ou lentos.

VCL (µm/seg): velocidade curvilinear, que é a velocidade do movimento ao longo da trajetória (Fig. 5).

VSL (µm/seg): velocidade em linha reta, velocidade do movimento a partir do ponto inicial até o ponto final ao longo de uma linha reta teórica unindo os dois pontos.

VAP (µm/seg): é a velocidade média do caminho.

LIN (%): linearidade, que é a proporção entre a VSL e a VCL (VSL/VCL) e indica que o maior valor da reta é o caminho mais linear dos espermatozóides.

STR (%) (straightness): índice de espermatozóides na reta.

ALH (µm/seg): deslocamento lateral da cabeça.

BCF (Hz): freqüência de batimentos cruzados.

Figura 5. Representação esquemática das diferentes velocidades medidas pelo sistema de análise seminal (CASA). VCL= velocidade curvilinear; VSL=

velocidade em linha reta; VAP = velocidade média.

Alguns estudos foram realizados em peixes utilizando o sistema CASA para registrar o movimento dos espermatozóides depois do processo de criopreservação, um destes é o de Liu et al. (2007), onde avaliaram a motilidade e a velocidade do sêmen fresco e descongelado do Pagrus major 10 segundos pós-ativação. Os autores encontraram 87% de motilidade no sêmen fresco e 82% no sêmen congelado com DMSO a 10%, não existindo diferença significativa entre a velocidade do sêmen descongelado e o sêmen fresco.

Dreando et al. (1997), analisaram no CASA a motilidade do sêmen pré e pós- descongelamento do peixe plano Scophthalmus maximus, onde os melhores resultados (60 e 80% de motilidade) foram obtidos quando se diluiu Mounib modificado (KHCO

, sacarose e glutationa) em BSA ou DMSO a 10%, enquanto a velocidade permaneceu estável entre o sêmen puro e o descongelado.

Outros estudos se apóiam no programa para observar características do sêmen

“in natura” ou para testar outros fatores que influenciam a velocidade e o movimento do sêmen. Dietrich et al. (2005), investigaram os efeitos seqüenciais do sêmen coletado post mortem e depois da anestesia da truta arco íris (Oncorhynchus mykiss), percebendo uma diminuição nos parâmetros de motilidade, velocidade e trajetória. Wilson e Ingerman (2007) obtiveram no peixe zebra (Danio rerio) motilidades de 83%, VCL de 104 µm/s, VAP de 77 µm/s, VSL de 77 µm/s e LIN de 84 µm/s ativado com água da torneira.

Cada processo de congelamento é espécie-específico, por isso é preciso ter informações sobre as particularidades do sêmen da espécie objetivo e de diversas espécies de peixes (volume coletado, motilidade, concentração de espermatozóides, pH e osmolaridade), o que permite padronizar as técnicas, definir os componentes crioprotetores e os meios diluentes a testar, bem como os procedimentos adequados para o congelamento e posterior descongelamento dos espermatozóides (Carneiro, 2007). Também é importante conhecer as morfoanomalias do sêmen antes e depois de ser congelado, já que estas representam o estado dos gametas no momento do congelamento e os criodanos causados por este processo.

Ainda existem muitas questões básicas a serem respondidas no tocante às técnicas de conservação de sêmen de muitas espécies tropicais de interesse econômico e ambiental. Alguns dos objetivos essenciais da criopreservação são alcançar taxas de fertilização próximas às obtidas com sêmen fresco, avaliar criodiluentes que diminuam os efeitos tóxicos, estresse osmótico e criodanos sobre a célula espermática (alterações na membrana do espermatozóide e em seu DNA) e conseguir curvas de congelamento e descongelamento benéficas para os espermatozóides (Deandro et al., 1997; Suquet et al., 2000; Medina et al., 2005).

Portanto, é importante a continua e progressiva pesquisa com crioprotetores, já que eles são adicionados ao meio para proteger os gametas durante o processo de criopreservação e descongelamento, sendo fundamentais para evitar a formação de cristais de gelo intracelular que causariam o rompimento da célula (Medeiros et al., 2002). Entretanto, altas concentrações de crioprotetores são deletérias aos espermatozóides devido a sua toxicidade, o qual pode resultar na redução da motilidade. Igualmente os meios diluentes devem ser adicionados aos crioprotetores, já que os mesmos prolongam a vida dos espermatozóides in vitro, reduzindo a atividade metabólica, seja por inibidores químicos ou por redução de temperatura (Cloud, 2000).

A geração de um protocolo de criopreservação do sêmen da espécie Piaractus

brachypomus (pirapitinga), contribuirá não só para suprir a demanda da espécie

como também trará vantagens ao aqüicultor e ao meio ambiente, devido a seguintes

itens: i) redução ou eliminação de reprodutores (machos) mantidos na Estação

experimental, com conseqüente redução de custos; ii) eliminação da assincronia da

atividade reprodutiva entre reprodutores, quando estes não estão preparados

simultaneamente para a reprodução; iii) utilização de um volume total de sêmen,

quando são indivíduos que produzem pouco em cativeiro; iv) disponibilidade de

sêmen fora da temporada de desova; e v) diminuição da pressão sobre as

populações silvestres (Godinho, 2000).

4.1. Objetivo Geral

Desenvolver um protocolo adequado de criopreservação para o sêmen da pirapitinga, Piaractus brachypomus, testando diferentes crioprotetores e diluentes na qualidade “in vitro” dos espermatozóides.

4.2. Objetivos Específicos

 Determinar as características seminais da pirapitinga como: volume, pH, concentração espermática e osmolaridade;

 Avaliar a toxicidade dos crioprotetores DMSO e metilglicol a 10%, através do comportamento cinético espermático após 15 minutos resfriados a 4°C;

 Avaliar a cinética espermática em sêmen fresco e diluído em Ringer, ACP- 104 e glicose pós-descongelamento;

 Observar as principais alterações morfologicas do sêmen fresco e pós-

descongelamento.

5.1. Local do experimento e animais experimentais

O estudo foi conduzido entre os meses de dezembro de 2007 e março de 2008.

Foram utilizados 19 machos maduros de pirapitinga, os quais apresentaram a papila urogenital hiperêmica e liberaram sêmen sobre delicada pressão no abdômen. Estes peixes foram pesados e medidos usando uma balança analítica e fita métrica. Logo colocados em viveiros de terra de 350 m

, alimentados com rações balanceadas com 30% de proteína, fornecida diariamente a uma taxa de 3% do peso total dos indivíduos. Os 19 animais foram marcados com chip, sendo colocado na base da nadadeira dorsal para sua posterior identificação (Fig. 6).

Figura 6. Leitura da marcação eletrônica com chip das pirapitingas.

Os animais faziam parte do plantel do Centro de Pesquisas Ictiológicas

"Rodolpho von Ihering" do DNOCS, Pentecoste-Ceará, localizado entre os

03°45’00”S e 39°21’00”W, a 90 Km de Fortaleza.

Os peixes foram divididos em dois grupos, um com 09 e outro com 10 animais.

A indução hormonal se realizou a cada 20 dias, trocando sempre o grupo para que não fossem induzidos os mesmos peixes, ou seja, cada grupo foi induzido a cada 40 dias durante o período de amostragem. Para tanto, se estimou a média do peso de cada grupo de reprodutores e procedeu-se a tratamento hormonal com extrato bruto de hipófise de carpa (EBHC), em uma dosagem para indução à espermiação de 2 mg/kg de peso corporal médio, aplicada próxima à nadadeira dorsal. A coleta de sêmen foi realizada 12 horas após a injeção.

5.3. Coleta de sêmen

Antes de ser coletado o sêmen, foi realizada uma breve pressão celômica sobre os rins para eliminar a maior quantidade de urina possível. Seguidamente, a papila urogenital foi seca com papel toalha para reduzir o risco de possível contaminação com água, fezes ou resquícios de urina. Em seguida, foram realizadas massagens manuais leves sobre a parede celômica na área onde se localizam os testículos, no sentido ântero-posterior. O sêmen foi coletado em tubos Eppendorf de 2 mL e mantido em geladeira de isopor a 4°C (Fig. 7).

Figura 7. Coleta do sêmen de pirapitinga em Epperdorf.

Imediatamente após a coleta, uma alíquota de 2 µL de sêmen fresco de cada peixe foi colocada em uma lâmina histológica, coberta com lamínula e observada ao microscópio ótico, sob aumento de 400x, onde foram avaliados três campos, calculando o porcentual médio de espermatozóides móveis, conforme Strussman et al. (1994) (Quadro 1). Tendo em vista que os espermatozóides no sêmen fresco, sem contaminação são imóveis, se considerou adequado para os experimentos o sêmen que exibiu taxas de motilidade espermática não superior a 5%. Amostras que apresentaram motilidade foram descartadas dos testes de toxicidade e criopreservação.

Quadro 1. Análise subjetiva da motilidade (adaptado de Strussman et al.,1994).

Porcentagem de espermatozóides

móveis

Qualidade dos espermatozóides

0 - 20 Espermatozóides parados ou vibrando.

20 - 40 Espermatozóides vibrando e alguns com movimentos circulares no próprio local.

40 - 60 Espermatozóides com movimentos circulares no próprio local e alguns com movimento retilíneo de baixa freqüência.

60 - 80 A maior parte dos espermatozóides apresenta movimento retilíneo linear de alta freqüência, uns poucos com velocidade retilínea de baixa freqüência e uma pequena parte com movimento circular.

80 - 100 Espermatozóides móveis com movimento retilíneo de alta freqüência (movimentos flechantes).

5.5. Avaliação da motilidade

A motilidade foi mensurada subjetivamente segundo o Quadro 1, para cada

peixe durante a coleta (visando formar os “pools” de sêmen) e objetivamente para

cada “pool” no programa SCA (SCA

2005, Microptics S.L., Espanha) usando o

sistema de analise CASA, no Laboratório de Tecnologia de Sêmen Caprino e Ovino

(LTSCO) da Universidade Estadual do Ceará (UECE). Os parâmetros para a análise

pelo sistema CASA se encontram descritos no Quadro 2.

Foi colocado 1 µL de sêmen em uma lâmina e depois foram adicionados 50 µL de solução ativadora (NaCl 50 mM; Maria et al., 2006) misturando com a ponteira da micropipeta durante 2 segundos. Finalmente a amostra foi observada em microscópio ótico a 400x, sendo analisados três campos. A duração da motilidade espermática foi estimada desde a homogeneização até que somente restassem 10%

de espermatozóides móveis.

Quadro 2. Parâmetros estabelecidos para a análise pelo sistema CASA do sêmen de pirapitinga (Piaractus brachypomus).

Espécie Peixe

Número de quadros consecutivos a analisar 25

Estáticos <10 µm/seg

Motilidade Lenta 10 µm/seg

Motilidade Média 20 µm/seg

Motilidade Rápida >40 µm/seg

5.6. Características seminais

Amostras de sêmen de cada peixe por coleta foram avaliadas para determinar suas características: aspecto (denso, semi-denso, ralo); cor (branco leitoso, branco amarelado, amarelo, transparente); volume (mL; graduação nos Eppendorfs);

osmolaridade (mOsm/Kg; osmômetro), pH (0-14; papel medidor de pH); e concentração espermática (x10

sptz/mL; câmara Neubauer).

Para mensuração da concentração espermática, uma alíquota de 1 µL foi

diluída em 4 mL de solução formol-salina a 1%; desta amostra, foram colocados 20

µL na câmara de Neubauer, contando os 5 quadrados da diagonal em microscópio

óptico a 400x, realizando 3 leituras por amostra.

Amostras de sêmen com motilidades maiores a 85% pós-ativação no teste da motilidade foram selecionadas para os estudos de toxicidade, formando “pools” com aproximadamente 2 mL de cada amostra e mantidas a 4°C.

Foram avaliados como crioprotetores:

 Dimetil sulfóxido (DMSO) a 10%;

 Metilglicol a 10%.

E como meios diluentes:

 Glicose a 5%;

 ACP-104 (meio diluente à base de água de coco em pó para peixes);

 Solução Ringer (NaCl, KCl, NaHCO

e CaCl

).

Nas diluições 1:3, 1:5 e 1:7 (sêmen:criodiluente), conforme Tabela 1.

Cada tratamento foi deixado em repouso por 15 minutos, à temperatura de 4°C (Fig. 8) e depois analisado usando o método CASA, onde foram capturados e registrados os dados de cinética espermática pós-ativação com solução de NaCl a 50 mM, segundo Quadro 2.

Figura 8. Teste de toxicidade, criodiluições resfriadas a 4°C.

Os resultados foram comparados com a motilidade calculada objetivamente dos

“pools” de sêmen fresco no teste da motilidade. Os tratamentos 5 e 6 só foram avaliados a uma diluição de 1:7 por ser um criodiluente comumente usado em peixes da mesma família.

Tabela 1. Diluentes e crioprotetores utilizados no teste de toxicidade e na criopreservação de sêmen de pirapitinga (Piaractus brachypomus).

Tratamento Diluente + Crioprotetores Diluições

1:3 1:5

T1 Ringer + DMSO 10%

1:7 1:3 1:5

T2 ACP-104 + DMSO 10%

1:7 1:3 1:5

T3 Ringer + Metilglicol 10%

1:7 1:3 1:5

T4 ACP-104 + Metilglicol 10%

1:7

T5 Glicose 5% + Metilglicol 10% 1:7

T6 Glicose 5% + DMSO 10% 1:7

5.8. Congelamento e descongelamento seminal

Experimento 1: Congelamento em rampa em palheta de 0,25 mL

Utilizou-se 3 “pools” de sêmen das amostras com motilidades pós-ativação acima de 85%, para os tratamentos mencionados na Tabela 1.

As diluições dos criodiluentes foram realizadas em tubos de ensaio pequenos, os quais permaneceram resfriados a 4°C durante 30 minutos antes de colocar as amostras de sêmen correspondentes.

Após diluição, segundo cada tratamento, o sêmen+criodiluente foi envasado

em palhetas francesas de 0,25 mL (três palhetas por tratamento) (Fig. 9), vedadas

com álcool polivinílico e limpas com papel absorvente para evitar aderência de uma

palheta à outra.

Figura 9. Preenchimento de palhetas com as criodiluções.

Em seguida, foram dispostas em raques (suporte de alumínio) (Fig. 10) marcadas e colocadas sobre rampa de congelamento a 5 cm do nitrogênio líquido para obter a temperatura de -150ºC, recebendo somente os vapores. O controle da temperatura foi realizado através de um termômetro digital com sonda. Após 5 minutos, as raques foram transferidas para canecas identificadas dentro de botijão criogênico a -196ºC, onde permaneceram submersas de 12 a 15 dias.

Figura 10. Raques com globetes para o armazenamento das palhetas.

(Fig. 11), durante 8 segundos, retiradas com pinças, enxutas com papel toalha e cortadas com tesoura uma das extremidades. O sêmen descongelado foi alocado em Eppendorfs de 2 mL a temperatura ambiente de 26ºC. Uma alíquota de 1 µL de sêmen descongelado homogeneizada com 50 µL de solução ativadora de NaCl foi colocada em câmara de Makler, sendo avaliada usando o CASA. Foram realizadas três leituras de campos diferentes para cada palheta (Fig. 12 e 13). Vale ressaltar que todo o procedimento de leitura foi realizado em menos 1 minuto.

Figura 11. Descongelamento das palhetas em banho-maria.

Figura 12. Página principal do resultado da avaliação de motilidade com o sistema

CASA.

Figura 13. Representação dos movimentos dos espermatozóides de pirapitinga avaliados com o método CASA.

Experimento 2: Congelamento em rampa em palheta de 0,5 mL

Este experimento foi realizado com 3 “pools” com a mesma metodologia descrita no experimento 1, sendo que com palhetas francesa de 0,5 mL.

Experimento 3: Congelamento em “dry shipper” em palhetas de 0,5 mL

Neste caso foram realizadas 4 réplicas, ou seja, se formaram 4 “pools” de

sêmen. Utilizaram-se palhetas de 0,5 mL e o congelamento foi realizado em um

contêiner de vapor de nitrogênio (Taylor-Wharton, CX100 “dry shipper”) a -170ºC

(Fig. 14), permanecendo as raques durante 5 horas e logo transferidas ao nitrogênio

liquido. Os demais procedimentos foram realizados como no experimento 1.

Figura 14. Congelamento em “dry shipper” a -170°C.

5.9. Análise morfológica do sêmen

Com o sêmen de cada um dos 19 animais foram realizados esfregaços corados para calcular as morfoanomalias do sêmen fresco e pós-descongelação.

Uma alíquota de 1 μL de sêmen fresco ou descongelado foi diluída em 4 mL de solução formol-salina. A seguir, uma fração de 100 μL da amostra foi adicionada com 2 μL do corante azul de bromofenol (1g azul de bromofenol; 4g citrato de sódio;

100 mL água destilada; pH 8.0) em um Eppendorf. Uma gota desta solução foi depositada em lâmina histológica, realizado um esfregaço e deixado secar a temperatura ambiente. As leituras foram realizadas no programa SCA em microscópio de contraste de fases e campo claro a 400x.

O exame consistiu da observação das morfoanomalias (Tab. 2) de 100

espermatozóides focalizados em diversos campos ao longo de toda a lâmina.

brachypomus).

Parte do espermatozóide Morfoanomalias Macrocefalia Microcefalia Cabeça

Degenerada

Peça intermediária Degenerada

Proximal

Gota citoplasmática Distal

Dobrada

Cauda Enrolada (levemente e fortemente)

5.10. Análises estatísticas

Para as características seminais foi utilizada a média dos dados do mesmo peixe nas diferentes coletas, devido ao fato de que cada um deles foi induzido várias vezes. As amostras com sêmen contaminado que apresentaram alto movimento no teste de contaminação não foram usadas para as análises estatísticas de motilidade.

Finalmente foi calculada a média e erro padrão para todos os peixes do experimento.

No caso da análise dos testes de toxicidade e descongelamento, os dados das taxas de motilidades espermática e velocidades de cada experimento foram testados para distribuição normal. Os valores que não apresentaram essa distribuição foram transformados em Log x+1 para sua normalização. Então, os dados foram submetidos à análise de variância fatorial e as médias comparadas pelo teste de Duncan, com um nível de significância de 0.05% utilizando-se o pacote computacional Statistica 7, versão 2006.

Para a análise das morfoanomalias, se comparou as porcentagens de

alterações morfologicas encontradas do sêmen fresco e as morfoanomalias das

amostras pós-descongelamento, também entre os mesmos tratamentos. As

variáveis foram observadas quanto à homogeneidade da variância e à normalidade

dos resíduos, para depois serem transformadas e comparadas através do teste t.