Aspectos químicos do estudo de Hamelia patens Jacq

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: QUÍMICA ORGÂNICA

ASPECTOS QUÍMICOS DO ESTUDO DE Hamelia patens Jacq.

RAIMUNDO REGIVALDO GOMES DO NASCIMENTO

ORIENTADORA: Dra. MARY ANNE SOUSA LIMA

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Regivaldo Gomes do Nascimento, 2010. 158 f; il. color. enc.

Orientador: Profa. Dra. Mary Anne Sousa Lima Área de concentração: Química orgânica

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências. Depto. de Química Orgânica e Inorgânica, Fortaleza, 2010.

1. Alcalóides oxidólicos 2. investigação fitoquímica 3. Química vegetal I. Lima, Mary Anne Sousa (Orient.) II. Universidade Federal do Ceará – Pós-Graduação em Química III. Título

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AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a Deus por ter me dado saúde e disposição, e principalmente por ter colocado em meu caminho tantas pessoas importantes para a realização desse trabalho.

À minha família, em especial aos meus pais, Francisco do Nascimento e Luiza Gomes do Nascimento, e aos meus irmãos, Ednaldo, Regineide, Lucineide e Lucileide, pelo apoio e incentivo para continuar minha formação acadêmica.

Ao professor Manoel Andrade Neto, por ter me incentivado a estudar e ingressar no universo da pesquisa, me acolhendo em seu laboratório desde o inicio da minha formação acadêmica, sendo um amigo, orientador e incentivador.

À professora Mary Anne Sousa de Lima, por ter me recebido em seu laboratório e contribuído com sua orientação, dedicação e carinho na realização desse trabalho.

Ao professor Edilberto Rocha Silveira, pela coleta da planta.

Aos colegas do laboratório LAFIPLAM 1, em especial a Antônia, por ter contribuído significativamente no isolamento das substâncias aqui descritas, ao Artur, Henrique, Renata, Daniel, Elton e Profa. Mary Anne, pelos espectros.

Gostaria de agradecer também a Evilene, por me ajudar a enxergar além das dificuldades, me incentivando e apoiando nos meus projetos de vida.

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SUMÁRIO

LISTA DE SIGLAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE QUADROS

LISTAS DE FLUXOGRAMAS RESUMO

ABSTRACT

CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO... 14

CAPÍTULO 2 CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS... 16

2.1 Considerações Botânicas sobre a Família Rubiaceae... 16

2.2 Considerações Botânicas sobre o Gênero Hamelia... 16

2.3 Considerações Botânicas sobre a Espécie Hamelia patens... 17

CAPÍTULO 3 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO... 19

CAPÍTULO 4 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL... 31

4.1 Determinação estrutural dos constituintes químicos não-voláteis das folhas de H. patens (HPFE-D)... 31

4.1.1 Determinação Estrutural de HP-1... 31

4.1.3 Determinação Estrutural de HP-3... 4.1.4 Determinação Estrutural de HP-4... 4.1.5 Determinação Estrutural de HP-10... 58 71 80 4.2 Determinação estrutural dos constituintes químicos não-voláteis dos talos de H. patens (HPTE)... 94

4.2.1 Determinação Estrutural de HP-5... 4.2.2 Determinação Estrutural de HP-6... 4.2.3 Determinação Estrutural de HP-7... 94 104 108 4.3 Determinação estrutural dos constituintes químicos não-voláteis do caule de H. patens (HPCE)... 115

4.3.1 Determinação Estrutural de HP-8... 115

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5.1 Métodos Cromatográficos... 126

5.1.1 Cromatografia de Adsorção... 126

5.1.2 Cromatografia de Exclusão... 127

5.1.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)... 127

5.2 Métodos Espectrométricos... 127

5.2.1 Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e de Carbono-13 (RMN 13C)... 127

5.2.2 Espectrometria de absorção na região do Infravermelho (IV)... 129

5.2.3 Espectrometria de Massas (EM)... 129

5.3 Métodos Físicos... 129

5.3.1 Ponto de Fusão... 129

5.4 Estudo dos Constituintes Químicos Não Voláteis de H. patens... 130

5.4.1 Material botânico... 130

5.4.2 Obtenção do extrato etanólico das folhas de H. patens - HPFE... 130

5.4.3 Particionamento do extrato etanólico das folhas de H. patens - HPFE... 130

5.4.4 Fracionamento Cromatográfico de HPFE-D... 132

5.4.5 Fracionamento Cromatográfico de HPFE-D 1: Isolamento de HP-1... 132

5.4.6 Fracionamento Cromatográfico de HPFE-D 2: Isolamento de HP-2... 133

5.4.7 Fracionamento Cromatográfico de HPFE-D 3: Isolamento de HP-3... 5.4.8 Fracionamento Cromatográfico de HPFE-D 4: Isolamento de HP-4... 5.4.9 Fracionamento Cromatográfico de HPFE-B: Isolamento de HP-10... 5.5 Obtenção do extrato etanólico dos talos de H. patens - HPTE... 5.5.1 Particionamento do extrato etanólico dos talos de H. patens-HPTE... 5.5.2 Fracionamento Cromatográfico de HPTE-D: Isolamento de HP-5... 5.5.3 Fracionamento Cromatográfico de HPTE-H: Isolamento de HP-6 e HP-7... 5.6 Obtenção do extrato etanólico do caule de H. patens - HPCE... 5.6.1 Particionamento do extrato etanólico do caule de H. patens - HPCE... 5.6.2 Fracionamento Cromatográfico de HPCE-D: Isolamento de HP-8... 5.6.3 Recristalização da Fração HPCE-A: Isolamento de HP-9... 135 135 137 139 139 139 140 143 143 143 145 CAPÍTULO 6 CONCLUSÃO... 146

CAPÍTULO 7 CONSTANTES FÍSICAS... 147

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CCD Cromatografia em Camada Delgada

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

HPFE Extrato Etanólico das Folhas de Hamelia patens

HPCE Extrato Etanólico do Caule de Hamelia patens

HPTE Extrato Etanólico dos Talos de Hamelia patens

COSY Correlation Spectroscopy

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

EM Espectrometria de Massas

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

RMN 13_C _{Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13}

RMN 1_H _{Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1}

IV Infravermelho

IE Ionização por Elétrons

T.R. Tempo de Retenção

F.R. Fator de Retenção

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 _–Fotos de H. patens com detalhes para flores e frutos... 17

Figura 2 – Foto de H. patens em seu habitat natural... 18

Figura 3 _–Espectro de absorção na região do infravermelho de HP-1 (NaCl)... 39

Figura 4 _–Espectro de massas de HP-1 (70 eV, IE)... 39

Figura 5 _–Espectro de RMN 1_{H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-1...} ₄₀

Figura 6 _–Espectro de RMN 13_C_–_{BB [125 MHz, (CD3)2CO] de HP-1...} ₄₀

Figura 7 _–Espectro de RMN 13_C_–_{DEPT - 135°}_{[125 MHz, (CD3)2CO] de HP-1...} ₄₁

Figura 8 _–Espectro de 1_H,1_H_–_{COSY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-1...} ₄₂

Figura 9 _–Espectro de 1_H,13_C_–_{HMBC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-1...} ₄₃

Figura 10 _–Expansões do Espectro de 1_H,13_C_–_HMBC_[_{500 x 125 MHz, (CD} 3)2CO] de HP-1. 43 Figura 11 _–Espectro de 1_H,1_H_–_{NOESY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-1...} ₄₄

Figura 12 –Espectro de 1H, 13C – HSQC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-1... 45

Figura 13 –Espectro de absorção na região do infravermelho de HP-2 (NaCl)... 51

Figura 14 –Espectro de massas de HP-2 (70 eV, IE)... 51

Figura 15 –Espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-2... 52

Figura 16 –Espectro de RMN 13C – BB [125 MHz, (CD3)2CO] de HP-2... 52

Figura 17 - Espectro de RMN 13C – DEPT - 135°[125 MHz, (CD3)2CO] de HP-2... 53

Figura 18 –Espectro de 1H, 1H – COSY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-2... 53

Figura 19 _–Expansão do Espectro de 1H, 1H – COSY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-2... 54

Figura 20 _–Espectro de 1H, 13C – HMBC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-2... 54

Figura 21 _–Expansões do Espectro de1H, 13C –HMBC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-2. 55 Figura 22 _–Espectro de 1H, 1H – NOESY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de P-2... 56

Figura 23 _–Espectro de 1H, 13C – HSQC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-2... 57

Figura 26 _–Espectro de RMN 1_{H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-3...} ₆₇

Figura 27 _–Espectro de RMN 13_C_–_{BB [125 MHz, (CD3)2CO] de HP-3...} ₆₇

Figura 28 –Espectro de RMN 13_C_–_{DEPT - 135°}_{[125 MHz, (CD3)2CO] de HP-3...} ₆₈

Figura 29 –Espectro de 1_H,1_H_–_{COSY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-3...} ₆₈

Figura 30 _–Espectro de 1_H,13_C_–_{HMBC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-3...} ₆₉

(10)

Figura 35 _–Espectro de RMN1_{H [500 MHz, (CD3)2CO] HP-4...}₇₇

Figura 36 _–Espectro de RMN 13C – BB [125 MHz, (CD3)2CO] de HP-4... 77

Figura 37 _–Espectro de RMN 13_C_–_{DEPT - 135°}_{[125 MHz, (CD3)2CO] de HP-4...} ₇₈

Figura 38 _–Espectro de 1_H,13_C_–_{HMBC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-4...}₇₈

Figura 39 _–Expansões do Espectro de1_H,13_C_–_{HMBC [500 x 125 MHz, (CD} 3)2CO] de HP-4.. 79

Figura 40 _– Espectro de 1_H,13_C_–_{HSQC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-4...}₇₉

Figura 42 –Espectro de absorção na região do infravermelho de HP-10 (KBr)... 87

Figura 43 –Espectro de RMN1H [500 MHz, CD3OD] HP-10... 88

Figura 44 –Espectro de RMN 13_C_–_{BB [125 MHz, CD3OD] de HP-10...}₈₈

Figura 45 –Espectro de RMN 13C – DEPT - 135°[125 MHz, CD3OD] de HP-10... 89

Figura 46 –Espectro de 1H, 13C – HMBC [500 x 125 MHz, CD3OD] de HP-10... 89

Figura 47 –Expansões do Espectro de 1H, 13C – HMBC [500 x 125 MHz, CD3OD] de HP-10.. 90

Figura 48 –Expansões do Espectro de 1H, 13C –HMBC [500 x 125 MHz, CD3OD] de HP-10.. 91

Figura 49 _– Espectro de 1H, 13C – HSQC [500 x 125 MHz, CD3OD] de HP-10... 92

Figura 50 _– Expansões do Espectro de 1H, 13C –HSQC [500 x 125 MHz, CD3OD] de HP-10... 92

Figura 51 _–Espectro de 1H, 1H – COSY [500 x 500 MHz, CD3OD] de HP-10... 93

Figura 52 _–Expansões do Espectro de 1H, 1H – COSY [500 x 500 MHz, CD3OD] de HP-10.... 93

Figura 54 _–Espectro de absorção na região do infravermelho de HP-5 (KBr)... 100

Figura 55 _–Espectro de RMN1_{H [500 MHz, C5D5N] de HP-5...}₁₀₁

Figura 56 _–Expansão do espectro de RMN1_{H [500 MHz, C5D5N] de HP-5...} ₁₀₁

Figura 57 _–Espectro de RMN 13_C_–_{BB [125 MHz, C5D5N] de HP-5...}₁₀₂

Figura 58 –Espectro de RMN 13_C_–_{DEPT - 135°}_{[125 MHz, C5D5N] de HP-5...}₁₀₂

Figura 59 –Espectro de 1_H,13_C_–_{HMBC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-5...}₁₀₃

Figura 60 _–Expansão do Espectro de 1_H,13_C_–_{HMBC [500 x 125 MHz, (CD} 3)2CO] de HP-4... 103

Figura 62 –Espectro de RMN1H [500 MHz, CDCl3] HP-6... 106

Figura 63 –Espectro de RMN 13C – BB [125 MHz, CDCl3] de HP-6... 107

(11)

–

Figura 67 _–Espectro de RMN1_{H [500 MHz, CDCl3] de HP-7...}₁₁₃

Figura 68 _–Espectro de RMN 13_C_–_{BB [125 MHz, CDCl3] de HP-7...}₁₁₃

Figura 69 _–Espectro de 1H, 13C – HMBC [500 x 125 MHz, CDCl3] de HP-7... 114

Figura 70 _–Espectro de absorção na região do infravermelho de HP-8 (KBr)... 118

Figura 71 _–Espectro de RMN1_{H [500 MHz, C5D5N] de HP-8...}₁₁₈

Figura 72 _–Espectro de RMN 13_C_–_{BB [125 MHz, C5D5N] de HP-8...}₁₁₉

Figura 73 _–Espectro de RMN 13_C_–_{DEPT - 135°}_{[125 MHz, C5D5N] de HP-8...}₁₁₉

Figura 75 –Espectro de absorção na região do infravermelho de HP-9 (KBr)... 123

Figura 76 –Espectro de RMN1H [500 MHz, CD3OD] de HP-9... 124

Figura 77 –Espectro de RMN 13_C_–_{BB [125 MHz, CD3OD] de HP-9...}₁₂₄

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Metabólitos secundários isolados de espécies do gênero Hamelia... 20 Tabela 2 Estruturas químicas de metabólitos secundários isolados do gênero

Hamelia... 21 Tabela 3 Ocorrência de alcalóides oxindólicos... 23 Tabela 4 Estruturas químicas de alcalódes oxindólicos isolados de outras espécies 25

Tabela 5 Deslocamentos químicos de RMN 13_{C-BB de HP-1 com padrão de}

hidrogenação [RMN 13_{C-BB e DEPT 135°, [125 MHz (CD3)2CO]...} ₃₂

Tabela 6 Dados de RMN 1H, 13C e correlações de 1H, 13C-HSQC e 13C-HMBC nJ

(n=2 e n=3) de HP-1... 35 Tabela 7 Análise comparativa dos deslocamentos químicos () de RMN 13C de

HP-1 [125 MHz, (CD3)2CO] com a pteropodina [25 MHz, CDCl3]... 38

Tabela 8 Deslocamentos químicos de RMN 13C-BB de HP-2 com padrão de

hidrogenação [(CD3)2CO, (125 MHz)]... 47 Tabela 9 Análise comparativa dos deslocamentos químicos (de RMN 13_{C [125}

MHz, (CD3)2CO] de HP-1 e HP-2... 48 Tabela 10 Dados de RMN 1_H,13_{C e correlações de}1_H,13_{C-HSQC e}13_C-HMBCn_J

(n=2 e n=3) de HP-2... 49 Tabela 11 Análise comparativa dos deslocamentos químicos () de RMN 13_{C de}

HP-1 [125 MHz, (CD3)2CO] com a isopteropodina [25 MHz, CDCl3]... ₅₀

hidrogenação [(CD3)2CO, 125 MHz]... ₅₉

Tabela 13 Dados de RMN 1H, 13C e correlações de 1H, 13C-HSQC e 13C-HMBC nJ

(n=2 e n=3) de HP-3... ₆₁

Tabela 14 Análise comparativa dos deslocamentos químicos () de RMN 13C de HP-1 [125 MHz, (CD3)2CO] com a palmirina [25 MHz, CDCl3]... ₆₅

hidrogenação [RMN 13C-BB e DEPT 135°, [125 MHz (CD3)2CO]... 72 Tabela 16 Análise comparativa dos deslocamentos químicos (de RMN 13C [125

MHz, (CD3)2CO] de HP-3 e HP-4... 74 Tabela 17 Dados de RMN 1H, 13C e correlações de 1H, 13C-HSQC e 13C-HMBC nJ

(13)

Tabela 18 Deslocamentos químicos de RMN C-BB de HP-10 com padrão de

hidrogenação RMN 13_{C-BB e DEPT 135°, [125 MHz, CD3OD]...} ₈₁

Tabela 19 Dados de RMN 1_H,13_{C e correlações de}1_H,13_{C-HSQC e}13_C-HMBCn_J (n=2 e n=3) de HP-10... 85

Tabela 20 Análise comparativa dos deslocamentos químicos () de RMN 13_{C de} HP-1 [125 MHz, CD3-OD] com o canferol-3-O-α -L-rhamnopiranosil-(1→6)- -D-galactopiranosídeo [125 MHz, DMSO-d6]... 86

Tabela 21 Deslocamentos químicos de RMN 13C-BB de HP-5 com padrão de hidrogenação RMN 13C-BB e DEPT 135°, [125 MHz, CD3OD]... 95

Tabela 22 Dados de RMN 13C, [125 MHz, (C5D5N)] de HP-5, em comparação com os dados da literatura... 99

Tabela 23 Dados de RMN 13_{C (125 MHz, CDCl3) de HP-6 em comparação com os} dados da literatura... 105

Tabela 24 Dados de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) de HP- 7 em comparação com os dados da literatura... 111

Tabela 25 Dados de RMN 13_{C (125 MHz, C5D5N) de HP- 8 e da literatura [ALAM}_et al., 1996 (150 MHz, DMSO-d6)] [VOUTQUENNE et al., 1999 (75 MHz, CDCl3)]... 117

Tabela 26 Deslocamentos químicos de RMN 13_{C-BB de HP-9 com padrão de} hidrogenação RMN 13_{C-BB e DEPT 135°, [125 MHz, (CD3)2CO]...} ₁₂₁

Tabela 27 Análise comparativa dos deslocamentos químicos () de RMN13C de HP-9 [125 MHz, (CD3-OD)] com dados da literatura... 122

Tabela 28 Particionamento do extrato etanólico HPFE... 131

Tabela 29 Fracionamento cromatográfico de HPFE-D... 132

Tabela 30 Fracionamento cromatográfico de HPFE-D 1... 133

Tabela 32 Fracionamento cromatográfico da fração (104-140) (5-23)... 134

Tabela 33 Fracionamento cromatográfica de HPFE-D 3... 135

Tabela 35 Fracionamento cromatográfico da fração (36-50) (2-4)... 136

Tabela 36 Fracionamento cromatográfico de HPFE-B... 138

Tabela 37 Particionamento do extrato etanólico HPTE... 139

(14)

(15)

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Proposta mecanística para as fragmentações que justificam os

principais picos registrados no espectro de massa de HP-1 ... 37

principais picos registrados no espectro de massa de HP-7 ... 110

(16)

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das

folhas de H. patens... 131 Fluxograma 2 Fracionamento cromatográfico de HPFE-D... 137 Fluxograma 3 Fracionamento cromatográfico de HPFE-B... 138

Fluxograma 4 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico dos

talos de H. patens... 142

Fluxograma 5 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico do

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RESUMO

Neste trabalho foi realizado a investigação fitoquímica de Hamelia patens

(Rubiaceae) nativa da Serra de Guaramiranga-CE. A realização de sucessivos tratamentos cromatográficos a partir do extrato etanólico das folhas possibilitou o isolamento dos alcalóides oxindólicos pentacíclicos pteropodina, isopteropodina e palmirina, já citados na literatura para a espécie, do alcalóide isopalmirina de caráter inédito na literatura, além do flavonóide canferol-3-O-α-L-rhamnopiranosil-(1→6) -D-galactopiranosídeo. O estudo do extrato etanólico dos talos possibilitou o isolamento dos esteróides -sitosterol e estigmasterol como mistura, do estigmast-4-en-3,6-diona, além do triterpeno ácido ursólico. A partir do extrato etanólico do caule foram obtidos o ácido vanílico e a mistura de esteróides -sitosterol e estigmasterol glicosilados. Para o isolamento dos metabólitos secundários foram empregadas técnicas cromatográficas convencionais como cromatografia em camada delgada, cromatografia filtrante, cromatografia flash, cromatografia preparativa e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). A caracterização estrutural dos compostos isolados foi realizada através de técnicas espectroscópicas como infravermelho, espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear, incluindo técnicas uni (RMN 1_{H e RMN}13_{C e DEPT 135) e bidimensionais (HMBC,} HSQC, COSY e NOESY), além de comparação com dados descritos na literatura.

Palavras chaves: Hamelia patens, Alcalóides oxindólicos, esteróides, triterpenos, RMN.

(18)

ABSTRACT

This work describes the phytochemical investigation of Hamelia patens

(Rubiaceae) native from Guaramiranga montain, Ceará, Brazil. Sucessive chromatographic treatment of the ethanol extract of leaves led to the isolation of the pentaciclic oxindole alkaloids pteropodine, isopteropodine, palmirine, and the new isopalmirine, besides the flavonoid kaempferol l-3-α-O-rhamnopyranosyl-(1-6)-β -D-galactopyranoside. The study of the ethanol extract of the stems led to the isolation of the steroids β-sitosterol and stigmasterol as mixture, stigmast-4-en-3,6-dione, and the triterpene ursolic acid. The ethanol extract of the trunk yielded vanillic acid and the -sitosterol and stigmasterol glucosilated. The isolation of the chemical constituents were performed by the use of chromatographic techniques, including flash cromatography, thin layer crohromatography, preparative crhomatography, and preparative high performance liquid chromatography (HPLC). The strucutral charactherization were performed by the use of infrared, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance, including one (1H NMR, 13C NMR and DEPT 135) and two-bidimensional pulse sequences (HMBC, HSQC, COSY e NOESY), and comparison with literature data.

(19)

Capítulo 1

(20)

1 INTRODUÇÃO

O uso de espécies vegetais, com fins de tratamento e cura das doenças e

de seus sintomas, remonta ao início da civilização, desde o momento em que o

homem despertou para a consciência e começou um longo percurso de manuseio,

adaptação e modificação dos recursos naturais para o seu próprio benefício. Esta

prática milenar ultrapassou todos os obstáculos e chegou até os dias atuais, sendo

amplamente utilizada por toda a população mundial como fonte de recurso

terapêutico eficaz. Certamente, a medicina moderna, composta por um grande

número de medicamentos com ações específicas sobre receptores, enzimas e

canais iônicos, não teria atingido o grau de desenvolvimento atual se não fosse com

o auxílio dos produtos naturais, notadamente os derivados de plantas superiores.

O uso de plantas medicinais representa muitas vezes o único recurso

terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. Dessa forma, usuários de

plantas medicinais de todo o mundo, mantêm em voga a prática do consumo de

fitoterápicos, tornando válidas informações etnofarmacológicas que foram sendo

acumuladas durante séculos [BHATTACHARJEE et al., 2005].

O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal, contando com

mais de 55.000 espécies catalogadas, de um total estimado entre 350.000 a 550.000

[SIMÕES et al., 2000]. Em decorrência desta alta complexidade, sua biodiversidade

ainda é pouco conhecida, apesar de representar um grande patrimônio nacional.

Além disso, o processo de colonização trouxe ao país muitas espécies utilizadas

pelos europeus e africanos.

A família Rubiaceae é uma das maiores famílias de dicotiledôneas da

(21)

espécies possuem importância econômica como o café (Coffea arabica) e o jenipapo

(Genipa americana), e outras são amplamente utilizadas na medicina como

Cinchona officinale, espécie da qual é extraída a quinina. Espécies de Palicourea e

Psychotria são tóxicas para o gado e Gardênia, Ixora e Mussaenda são utilizadas

como plantas ornamentais [CORRÊA et al., 1926]. Esta família é largamente

representada no Ceará, por arbustos e árvores, divididos em uma grande variedade

de gêneros endêmicos e espécies inéditas do ponto de vista botânico.

Hamelia patens Jacq. é uma espécie da família Rubiaceae com

ocorrência pantropical e utilizada na medicina tradicional. Uma série de aplicações

medicinais tradicionais é conhecida para esta espécie ao longo da América Latina

(do México à Argentina). No México, é usada para 42 diferentes fins medicinais,

especialmente estancar hemorragias, curar feridas e em perturbações menstruais

[REYES et al., 2004]. Estudos químicos anteriores com um espécimem nativa na

América Central revelou uma fonte prolífica de alcalóides oxindólicos.

Desta forma, o presente trabalho descreve o estudo fitoquímico da

espécie H. patens nativa do Nordeste do Brasil, visando o isolamento e a

(22)

Capítulo 2

(23)

2 CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS

2.1 Considerações Botânicas sobre a Família Rubiaceae

Espécies de Rubiaceae são endêmicas nas regiões mais quentes,

principalmente nos trópicos, onde mais de 70% das espécies crescem. Esta vasta

família ocupa o quarto lugar de todo o reino vegetal, compreendendo cerca de

13000 espécies distribuídas em 350 gêneros.

Estas espécies estão distribuídas em 25 tribos: Henriquezieae,

Catesbaeeae, Cruckshanksieae, Retiniphylleae e Coussareeae existem somente na

América, principalmente na América do sul. Por outro lado, só no hemisfério oriental

ocorrem Knoxieae, Alberteae e Vanguerieae, enquanto que Naucleeae, Cinchoneae,

Rondeletieae, Condamineeae, Hedyotideae, Mussaendeae, Hamelieae, Gardenieae,

Guettardeae, Chiococceae, Ixoreae, Morindeae, Psychotrieae, Paederieae,

Anthospermeae, Spermacoceae e Stellatae ocorrem na Europa e nas Américas

[CHIQUIERI et al., 2004].

No Brasil há ocorrência de várias espécies distribuídas em 18 tribos:

Henriquezieae, Retiniphylleae, Coussareeae, Naucleeae, Cinchoneae, Rondeletieae,

Condamineeae, Hedyotideae, Mussaendeae, Hamelieae, Gardenieae, Guettardeae,

Chiococceae, Ixoreae, Psychotrieae, Paederieae, Spermacoceae e Stellatae

[CHIQUIERI et al., 2004].

2.2 Considerações Botânicas sobre o Gênero Hamelia

A tribo Hameliceae possui 4 gêneros com ocorrência no Brasil: Hamelia,

Coutarea, Bertiera e Hoffmannia. O gênero Hamelia é composto por sete espécies:

(24)

Hamelia patens Jacq., Hamelia sanguinea T. S. Elias, Hamelia rovisosae Wernham e

Hamelia xerocarpa Kuntze[CHIQUIERI et al., 2004].

2.3 Considerações Botânicas sobre a Espécie Hamelia patens

A espécie Hamelia patens Jacq. é uma planta muito comum na República

da Argentina, difundida por toda a América do Sul até as Antilhas e dispersa na

região mexicana e península da Flórida [CHIQUIERI et al., 2004]. Pode ser

encontrada em vários habitats, no entanto, cresce melhor em locais com boa

umidade e pleno sol à sombra parcial.

Na América Tropical, H. patens apresenta porte arbusto, podendo chegar

a uma altura de 3,6 m. Possui flores em cimos espiralados e corola de cinco pétalas,

sendo desfrutadas por borboletas. Os frutos são arredondados, pequenos e

brilhantes, podendo ser comidos por aves [CORRÊA et al., 1926].

(25)

Figura 2 – Foto de H. patens em seu habitat natural

(26)

Capítulo 3

(27)

3 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

Dentre as espécies do gênero Hamelia, somente as espécie H. magniflora

e H. patens foram submetidas à investigação fitoquímica. Nas classes de

metabólitos secundários isolados destacam-se os alcalóides do tipo oxindólicos,

indólicos, além de flavonóides do tipo flavanona, cujos esqueletos básicos estão

representados abaixo:

Dados da literatura revelaram os alcalóides oxindólicos como

estimulantes na produção de linfócitos e também na modulação positiva de

receptores muscarínicos M1 e 5-HT-2. A fração alcaloídica das folhas de H. patens

nativa no México demonstrou efeito relaxante do miométrio em teste in vivo com

ratos [REYES et al., 2004].Por outro lado, estudos realizados com a pteropodina (4) (Tab. 2, p. 21) revelaram as atividades antioxidante, antigenotoxica e na indução de

linfócitos em ratos[ROGELIO et al., 2008].

A Tabela 1 (p. 20) e a Tabela 2 (p. 21) a seguir apresentam um

levantamento bibliográfico acerca dos metabólitos secundários isolados do gênero

Hamelia, revelando como principais marcadores quimiotaxônomicos os alcalóides

oxindólicos pentacíclicos. No entanto, além do gênero Hamelia, esta classe de

alcalóides também pode ser encontrada em espécies de Uncaria e Gelsemium,

como mostrado na Tabela 3 (p. 23) e Tabela 4 (p. 25).

N H

O

N H

(28)

Alcalóides Oxindolicos

Substâncias Espécie Referência

Palmerina (1) H. patens BORGES et al., 1979

Isomaruquina (2) Maruquina (3)

H. patens BORGES et al., 1979

Pteropodina (4) H. patens BORGES et al., 1980

Especiofilina (5) H. patens BORGES et al., 1981

Isopteropodina (6) H. patens ADAMS et al.,1989

Rumberina (7) H. patens REYES et al., 2004

Alcalóides Indólicos

Magniflorina (8)

Ajmalicina (9) H. magniflora RUMBERO, 1991

Flavonóides

(2S) Narirutina (10)

(2R) Narirutina (11)

H. patens AQUINO, 1990

Outras classes de metabólitos (Triterpenos e Esteróides)

-Sitosterol (12) Ácido Ursólico (13)

-Sitosterol glicosilado (14)

H. patens SUBRAHMANYAM et al., 1973

Stigmast-4-en-3,6-diona (15) H. patens RIPPERGER, 1978

(29)

N H O N O O O CH₃ H H H CH₃ 7 O H N H O N O O O CH₃ H H H CH₃ N H N O H CH₃ O O H 8 1 N H O N O O O H H H CH₃ CH₃ O C H₃ 2 N H O N O O O H H H H CH₃ N H O N O O O H H H H CH₃ 3 N H O N O O O H H H CH₃ C H₃ 4 5

Tabela 2 – Estruturas químicas dosmetabólitos secundários isolados no gênero Hamelia.

(30)

(31)

Alcalóides Oxindolicos

Substâncias Espécie Referência

7(R)-Gleissoschizol oxindolico (16) Tabernaemontana corymbosa

KUAN et al., 2009

7(S)-Gleissoschizol oxindolico (17)

7(R), 16(R), 19(E)-Isositsirikina oxindolico (18)

7(S), 16(R), 19(E)-Isositsirikina oxindolico (19)

Paratunamida A (20) Cinnamodendron axillare

KAGATA et al., 2006

Paratunamida B (21)

Paratunamida C (22)

Paratunamida D (23)

Gelegamina A (24) Gelsemium elegans ZHEN et al., 2009

Gelegamina B (25)

Gelegamina C (26)

Gelegamina D (27)

Gelegamina E (28)

Matemona (29) Iotrochota purpurea CARLETTI et al., 2000

11-Methoxy-14-hydroxy-19-oxo-gelsenicina (30) Gelsemium sempervirens

KITAJIMA et al., 2003

11-Methoxy-14-hydroxygelsenicina (31)

11-Methoxygelsemoxonina (32)

Nb-Demethylalstophyllal oxindolico (33) Alstonia macrophylla WAH et al., 1996

Alstonal (34)

Nb-Demethylalstophyllina oxindolico (35)

Alstonisina (36)

17-Demethoxy-hydroisorhynchophyllina (37) Ervatamia yunnanensis

YU et al., 1999

17-Demethoxy-isorhynchophyllina (38)

Gelsecrotonidina (39) Gelsemium elegans YAMADA et al., 2008

14-Hydroxygelsecrotonidina (40)

11-Methoxygelsecrotonidina (41)

(32)

14-Hydroxygelsedilam (42)

Neolaugerina (43) Neolaugeria resinosa WENIGER et al., 1993

Isoneolaugerina (44)

15-Hydroxyisoneolaugerina (45)

Ácido Isopteropodico (46) Uncaria sinensis HONG et al., 1993

Ácido Pteropodico (47)

Ácido Mitraphylico (48)

Ácido Isorhynchophylico (49)

Ácido Rhynchophylico (50)

16, 17-Dihydro-17β-hydroxy isomitraphyllina (51) Mitragyna parvifolia PANDEY et al., 2006

16, 17- Dihydro-17β-hydroxy mitraphyllina (52)

Uncarina C (53) Uncaria tomentosa MUHAMMAD et al., 2001

Uncarina D (54)

Uncarina E (55)

Mitraphyllina (56)

(33)

N H O N H H H H OH N O N O H H O O Me H H O Me O Me N H O N O H H OH H O C H₃ N H O N O H H OH H O C H₃

16 17

18 19

N H O N O H O O O H O O OH O H O H O H 20 N H O N O H O H O O H O O OH O H O H O H N H O N O H O O O H O O OH O H O H O H N H O N O H O O O H O O OH O H O H O H 21

Tabela 4 - Estruturas dealcalóides oxindólicos isolados de outras espécies.

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

N H

O N

O O

O H

H H

CH₃

C H₃

56

N H

O N

O O

O H

H H

CH₃

C H₃

(39)

Capítulo 4

(40)

4 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL

4.1 Determinação estrutural dos constituintes químicos não-voláteis das folhas de Hamelia patens

4.1.1 Determinação Estrutural de HP-1

Os sucessivos tratamentos cromatográficos da fração diclorometano,

obtida a partir da partição do extrato etanólico das folhas de Hamelia patens,

resultaram no isolamento de um sólido amorfo branco denominado de HP-1 (p.f.

211,7-212,3 °C).

A análise do espectro no infravermelho (Fig. 3, p. 39) revelou bandas

características de deformações axiais da ligação N-H em 3260 cm-1 e de ligações

C-N de aminas terciárias em 1086 cm-1_. _{Observaram-se também duas bandas}

relativas a deformações axiais de ligação C-O em 1212 e 1192 cm-1, além de

vibrações de deformações axiais da ligação C=O de éster α, -insaturado e de

-lactamas em 1707cm-1. Foram observadas ainda absorções características de

ligações C=C conjugada em 1627 cm-1; uma banda larga em 751 cm-1 relativa à

deformação angular fora do plano de C-H de anel aromático, além de deformações

axiais em 2949 e 2791 cm-1 de C-H alifáticos.

O espectro de RMN 13_{C-BB [125 MHz, (CD3)2CO] de HP-1 (Fig. 6, p. 40)}

apresentou 21 linhas espectrais. Sendo dois sinais de grupamentos de carbonila em

 180,5 (C-2) e 167,8 (C-22) referente às funções amida e éster conjugado,

respectivamente. Em adição, observaram-se oito sinais em [ 155,5 (C-17), 110,9

(C-16), 134,9 (C-8), 124,2 (C-9), 122,9 (C-10), 128,8 (C-11), 109,9 (C-12) e 142,9

(C-13)] que foram relacionados a carbonos sp2_{, dos quais o carbono em}__155,5

(41)

oxigenado e o outro de carbono nitrogenado [ 75,2 (C-3) e 73,2 (C-19)], além de um

grupamento metoxila em  51,1 (C-23).

Posterior comparação dos espectros RMN 13C-BB e DEPT 135° [125

MHz, (CD3)2CO] (Fig. 7, p. 41) revelou a presença de nove carbonos metínicos,

quatro carbonos metílênicos, dois carbonos metílicos e seis carbonos

não-hidrogenados. Estas informações, em adição ao valor do pico do íon molecular em

m/z 368 no espectro de massas (Fig. 4, p. 39), possibilitaram inferir a fórmula

molecular C21H24N2O4 para HP-1 (Tab. 5).

Tabela 5 – Deslocamentos químicos de RMN 13_{C-BB de HP-1 com padrão de} hidrogenação [RMN 13C-BB e DEPT 135°, 125 MHz, (CD3)2CO].

C CH CH2 CH3 Fómula Molecular

180,5 155,5 55,7 51,1

167,8 128,8 54,0 18,9

142,9 124,2 35,4

134,9 122,9 30,9

110,9 109,9

56,9 75,2

73,2 38,9 32,1

C4 C9H9 C4H8 C2H6 C21H23

C2O4 N2H C21H24N2O4

Análise detalhada do espectro de RMN 1_{H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-1}

(Fig. 5, p. 40), mostrou um total de 19 sinais. Neste espectro foram observados cinco

sinais na região de hidrogênios olefínicos em  7,40 (s, 1H, H-17); 7,30 (d, J=7,4 Hz,

1H, H-9); 7,18 (dt, J=7,7; 1,0 Hz, 1H, H-11); 7,01 (dt, J=7,7; 0,9 Hz, 1H, H-10) e 6,88

(d, J=7,7 Hz, 1H, H-12), um multipleto em _ 4,49 (m, 1H, H-19) de um hidrogênio

oxi-metínico, e um singleto característico de metoxila em  3,54 (s, 3H, H-23). Em

adição, foram observados ainda vários conjuntos de multipletos em 3,20 (m, 2H,

(42)

(m, 1H, 14a). Em 1,36 (d, J=6,2 Hz, 3H, H-18), foi observado um dubleto intenso

referente a hidrogênios de grupamento metila ligado a carbono mono-hidrogenado.

O espectro de correlação homonuclear 1_H,1_{H-COSY de HP-1 (Fig. 8, p.}

42) revelou o acoplamento do hidrogênio em  7,30 (H-9) com o hidrogênio em 

7,01 (H-10), e do hidrogênio em  7,18 (H-11) com os dois hidrogênios em  7,01

(H-10) e 6,88 (H-12), respectivamente. Foram observados ainda os acoplamentos do

hidrogênio em 4,49 (H-19) com os hidrogênios em  1,36 (H-18) e 1,61 (H-20); e

do hidrogênio em  3,33 (H-21) com os hidrogênios  1,61 (H-20). De acordo com

estes dados foi possível sugerir as seguintes subestruturas para HP-1:

Analisando o Espectro de Correlação Heteronuclear 1H, 13C-HSQC de

HP-1 (Fig. 12, p. 45) foi possível estabelecer inequivocadamente a correlação de

todos os hidrogênios a seus respectivos carbonos.

Através da análise detalhada do espectro bidimensional de correlação

homonuclear à longa distância 1H, 1H-HMBC da substância HP-1 (Fig. 9 e 10, p. 43)

foi possível visualizar as correlações dos hidrogênios em  1,64 (H-6b) e 1,47 (H-6a)

com o carbono _ 180,5 (C-2); dos hidrogênios em  3,33 (H-5a),3,20 (H-21a) e 1,95

(H-14a) acoplando com o carbono  75,2 (C-3) e dos hidrogênios em  2,34 (H-3),

(43)

1,64 (H-6b) e 1,47 (H-6a) com o carbono  56,9 (C-7), de acordo com a subestrutura

1.

Neste espectro verificaram-se os acoplamentos dos hidrogênios em  6,88

(H-12) e 7,01 (H-10) com o carbono  134,9 (C-8); dos hidrogênios em 7,18 (H-11)

e 7,01 (H-10) com o carbono em  124,2 (C-9); e do hidrogênio em  6,88 (H-12)

com o carbono  122,9 (C-10). Em adição, foram observados os acoplamentos do

hidrogênio em  7,18 (H-11) com o carbono  109,9 (C-12) e dos hidrogênios 7,18

(H-11) e 7,30 (H-9) com o carbono  142,9 (C-13), de acordo com a subestrutura 2.

Por outro lado, os acoplamentos dos hidrogênios  2,40 (H-15) e 7,4

(H-17) com o carbono  110,9 (C-16); dos hidrogênios  4,49 (H-19) com o carbono 

18,9 (C-18); dos hidrogênios  2,40 (H-15) e 3,20 (H-21a) com o carbono  38,9

(C-20) e dos hidrogênios  7,4 (H-17) e 2,40 (H-15) com o carbono  167,8 (C-22), H

H H

H 13 8

9 11 12

10

N

H

N

O

H H

H H H

H H

H

H 2

7 3

6 5

14 21

Subestrutura 1

(44)

sugeriram a construção do núcleo diidrofurano contendo uma carbometoxila em

C-16, conforme a subestrutura 3.

Tabela 6 – Dados de RMN1_H,13_{C e correlações de}1_H,13_{C-HSQC e}13 C-HMBC nJ (n=2 e n=3) de HP-1.

C HSQC HMBC

δC δH 2JCH 3JCH

2 180,5 - - H-3, H-6a, _H-6b

3 75,2 2,34 (m) H-14a _{H-21a, H-21b}H-5a, H-5b,

5 55,7 2,34 (m)

3,20 (m) H-6b H-21b

6 35,4 1,95 (ddd, J = 7,6; 5,1;

0,84 Hz), 2,29 (m) H-5a H-3

7 56,9 - H-6a, H-_{6b, H-3} _{H-6b, H-14a}H-5a, H-5b,

8 134,9 - - H-6a, H-10, _H-12

9 124,2 7,30 (d, J = 7,4 Hz) H-10 H-11

10 122,9 7,01 (dt, J = 7,7; 0,85 Hz) - H-12

11 128,8 7,18 (dt, J = 7,7; 1,0 Hz) H-10 H-9

12 109,9 6,88(d, J = 7,7 Hz) H-11 H-10

13 142,9 - - H-9, H-11

14 30,9 1,64 (m)

1,47 (m) H-15 -

15 32,1 2,40 (m) H-14a H-21a

16 110,9 - H-17, H-15 H-14a

17 155,5 7,40 (s) - H-15

18 18,9 1,36 (d, J = 6,2 Hz) H-19 -

19 73,2 4,49 (m, 1H) - H-17, H-21a, _{H-21b, H-15}

20 38,9 1,61(m, 1H) H-21a, H-₁₅ H-14b

21 54,0 2,34 (m) 3,33 (m) - H-5a, H-5b

22 167,8 - - H-17, H-15

23 51,1 3,54 (s) - -

(45)

As interações dipolo-dipolo à longa distância do espectro de correlação

homonuclear 1_H,1_H_–_{NOESY de HP-1 (Fig. 11, p. 44), foram decisivas para a}

confirmação da estrutura final, através dos importantes acoplamentos do hidrogênio

em  7,30 (H-9) com os hidrogênios em  2,34 (H-3) e 1,95 (H-14a).

O espetro de massa (Fig. 4, p. 39), além de fornecer o pico do íon

molecular m/z 368, apresentou importantes sinais com razão massa/carga de 223,

208, 69 e 41, que sugeriram a proposta mecanística para os fragmentos do quadro

1, p. 37.

N

H N

O

COOMe

C H3

H H

H H H

H

8 7

10 11

12 13

2

6 5

15

16 20

17 18

22 23 19

9

(46)

Quadro 1 – Proposta mecanística para as fragmentações que justificam os principais picos registrados no espectro de massas de HP-1

C9H7NO

C8H10O3

C10H14O3

N

O

COOMe +

.

+

.

N

H N

O

COOMe

N

O

COOMe +

N

+

.

N

+

.

m/z 368

m/z 69

m/z 223

m/z 208

m/z 41

CH3

(47)

A posterior comparação dos dados de RMN 13C de HP-1 com dados

descritos na literatura para alcalóides oxindólicos (Tab. 7), possibilitou caracterizar

HP-1 como sendo a pteropodina, um alcalóide oxindólico já isolado anteriormente

das partes aéreas de H. patens [ADAMS et al., 1979].

Tabela 7 – Análise comparativa dos deslocamentos químicos () de RMN13_{C de}

HP-1 [125 MHz, (CD3)2CO] com a pteropodina [25 MHz, CDCl3].

C HP-1

Pteropodina [ADAMS et al., 1989]

δC δC

2 180,5 181,9

3 75,2 74,0

5 55,7 53,0

6 35,4 29,0

7 56,9 56,0

8 134,9 133,5

9 124,2 123,0

10 122,9 122,2

11 128,8 128,8

12 109,9 109,0

13 142,9 141,0

14 30,9 34,0

15 32,1 31,0

16 110,9 109,8

17 155,5 155,0

18 18,9 18,5

19 73,2 72,0

20 38,9 37,9

21 54,0 55,0

22 167,8 168,0

23 51,1 50,5

(48)

Figura 3 – Espectro de absorção na região do infravermelho de HP-1 (NaCl)

(49)

Figura 5 – Espectro de RMN 1_{H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-1}

Figura 6 – Espectro de RMN 13_C_–_{BB [125 MHz, (CD3)2CO] de HP- 1}

N

O

COOMe C

H3

N H

O

180,5

75,2 55,7 35,4 56,9

134,9 124,2 122,9 128,8 109,9

142,9

30,9 32,1

110,9 155,5 18,9

73,2 38,9 54,0

(50)

(51)

Figura 8 – Espectro de 1_H,1_H_–_{COSY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-1}

8 7 13

2

9

N H

O

H H

11 10 12

a

b

c

15

16 20

17 18

22 23 21

N

O

COOMe

C H3

H H

19

14 f

g e

a b c

d e

(52)

Figura 9 – Espectro de 1H, 13C – HMBC [500 x125 MHz, (CD3)2CO] de HP-1

Figura 10 - Expansão do Espectro de 1H, 13C – HMBC [500 x 125 MHz, (CD3)2CO] de HP-1 H H H H 13 8 9 11 12 10 a b c d e f g h 16 18 22 23

O

COOMe

C H₃ H H H H H 21 15 19 17

20 j i

l m n o p N H N O H H H H H H H H H 2 7 3 6 5 14 21 q r s t u a b d f e g j i q s p

u t

(53)

Figura 11 – Espectro de 1H, 1H – NOESY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-1

N

H N

O

COOMe

C H₃

H H

H

H 8

7

10 11

12 13

2

6 5

15

16 20

17 18

22 23

19

9

3 14

21

a

b

a

(54)

(55)

Sucessivos tratamentos cromatográficos da fração diclorometano, obtida a

partir da partição do extrato etanólico das folhas de H. patens, levaram ao

isolamento de um sólido amorfo branco denominado de HP-2 (p.f. 204,3-205,5 °C).

A análise do espectro no infravermelho (Fig. 13, p. 46) revelou banda

característica de deformação axial de ligação N-H em 3263 cm-1, além de banda em

1210 cm-1_{relativa a deformação axial de ligação C-O e vibrações de deformações}

axiais de ligações C=O de éster α, -insaturado e de -lactama em 1708 cm-1. Foi

observada ainda absorção característica de ligações duplas conjugadas em 1625

cm-1_{; uma banda larga em 754 cm}1 _{relativa à deformação angular fora do plano de}

C-H do anel aromático, além de deformações axiais em 2949, 2925 e 2800 cm-1 de

C-H alifáticos.

O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-2 (Fig. 15, p. 52)

mostrou-se bastante semelhante ao de HP-1, onde foram observados sinais de

hidrogênio aromáticos em  7,30 (d, J=6,6 Hz, 1H, H-9); 7,16 (dt, J=7,7; 1,3 Hz, 1H,

H-11); 6,97 (dt, J=7,7; 0,9 Hz, 1H, H-10) e 7,70 (d, J=7,7 Hz, 1H, H-12) e um sinal de

hidrogênio olefínico em 7,37 (s, 1H, H-17). Observou-se ainda um multipleto em

m, 1H, H-19) relativo a um hidrogênio oxi-metílico, e um singleto

característico de metoxila em  3,54 (s, 3H, H-23). Em 1,41 (d, 3H, H-18), foi

observado um dubleto intenso, que foi relacionado a hidrogênios de carbono metílico

ligado a carbono mono-hidrogenado.

No espectro de RMN 13_{C-BB [125 MHz, (CD3)2CO] (Fig. 16, p. 52) foram}

observadas 21 linhas espectrais. De maneira análoga a HP-1 foram identificados 2

(56)

comparação com o espectro de DEPT 135° [125 MHz, (CD3)2CO] (Fig. 17, p. 53 e

Tab. 8).

Tabela 8 – Deslocamentos químicos de RMN 13_{C-BB de HP-2 com padrão de} hidrogenação [RMN 13C-BB e DEPT 135°, (CD3)2CO, 125 MHz].

C CH CH2 CH3 Fórmula Molecular

180,5 155,4 54,8 51,1

167,7 128,6 54,3 18,9

142,5 125,4 35,5

134,8 122,7 31,3

112,0 110,2

57,7 73,2

72,3 39,1 31,7

C4 C9H9 C4H8 C2H6 C21H23

C2O4 N2H C21H24N2O4

A posterior construção de uma tabela de comparação entre os dados de

RMN 13C de HP-1 e HP-2 permitiu visualizar que as principais diferenças estão

relacionadas aos deslocamentos do carbono C-3, que se encontra em _ 72,3 (C-3)

em HP-2, e portanto mais desprotegido em HP-1 em  75,2 (C-3), Tab. 9 (p. 48), a

(57)

Tabela 9 – Análise comparativa dos deslocamentos químicos (de

RMN 13C [125 MHz, (CD3)2CO] de HP-1 e HP-2.

C HP-1 HP-2

δC δC

2 180,5 180,5

3 75,2 72,3

5 55,7 54,8

6 35,4 35,5

7 56,9 57,7

8 134,9 134,8

9 124,2 125,4

10 122,9 122,7

11 128,8 128,6

12 109,9 110,2

13 142,9 142,5

14 30,9 31,3

15 32,1 31,7

16 110,9 112,0

17 155,5 155,4

18 18,9 18,9

19 73,2 73,2

20 38,9 39,1

21 54,0 54,3

22 167,8 167,7

23 51,1 51,1

De acordo com estes dados foi observado que HP-2 é um isômero

estrutural de HP-1, já que possuem a mesma fórmula molecular C21H24N2O4. Este

dado foi confirmado pelo espectro de massas que mostrou o pico do íon molecular

em m/z 368 (Fig. 14, p. 51).

Os espectros de correlação bidimensional heteronuclear - HSQC (Fig. 23,

p. 57) e HMBC (Fig. 20, p. 54 e Fig. 21, p. 55) de HP-2 também demonstram

semelhanças com a análise feita para HP-1, e determinou a correlação inequívoca

de cada carbono e seu respectivo hidrogênio, de acordo com a Tab. 10 (p. 49), a

(58)

Tabela 10 – Dados de RMN1_H,13_{C e correlações de}1_H,13_{C-HSQC e}13_C-HMBCn_J (n=2 e n=3) de HP-2.

C HSQC HMBC

δC δH 2JCH 3JCH

2 180,53 - - H-3

3 72,3 2,36 (m, 1H) - H-21a, H-5a

5 54,8 3,27 (m, 2H) e 2,44 (m, 2H) - H-3

6 35,5 1,94 (m, 1H); 2,29 (m, 1H) H-5b -

7 57,7 - H-6a H-9, H-5a, H-14a

8 134,8 - - H-10, H-12

9 125,4 7,30 (d, J=6,6 Hz, 1H) - H-11

10 122,7 6,97 (dt, J=7,7; 0,9 Hz, 1H) - H-12

11 128,6 7,16 (dt, J=7,7; 1,3 Hz, 1H) H-10 H-9

12 110,2 7,70 (d, J=7,7 Hz, 1H) H-11 H-10

13 142,5 - - H-9, H-11

14 31,3 0,87 (m, 1H) e 1,56 (m, 1H) H-3 -

15 31,7 2,46 (m, 1H) - H-17, H-21a, H-19

16 112,0 - H-17, H-15

17 155,3 7,37 (s, 1H) - H-15

18 18,9 1,41 (d, J=6,2 Hz, 3H) H-19 -

19 73,2 4,37 (m, 1H) H-18 H-17, H-21b

20 39,1 1,63 (dt, J=13,1; 3,7 Hz, 1H) H-21a, H-15 H-18

21 54,3 3,39 (dd, _{e 2,41 (m, 2H)}J=13,1; 3,7 Hz, 2H) - H-3

22 167,7 - - H-17, H-15, H-23

23 51,1 3,54 (s, 3H) - -

Porém, após a análise detalhada no espectro homonuclear - NOESY (Fig.

22, p. 56) de HP-2, foram observados importantes acoplamentos à longa distância

entre o hidrogênio aromático H-9 em  7,30 (H-9) com os hidrogênios em  1,36

(H-18), e 4,37 (H-19).

De posse dessa análise e após comparação com dados de RMN 13_C

descritos na literatura (Tab. 11, p. 50), HP-2 foi caracterizado como o epímero de

(59)

HP-1 denominado de isopteropodina. Este alcalóide já foi isolado anteriormente da

parte aérea de H. patens [ADAMS et al., 1989].

Tabela 11 – Análise comparativa dos deslocamentos químicos () de RMN 13_{C de}

HP-2 [125 MHz, (CD3)2CO] com a isopteropodina [25 MHz, CDCl3].

C HP-2

Isopteropodina [ADAMS et al, 1989]

δC δC

2 180,53 181,6

3 72,3 72,2

5 54,8 53,6

6 35,5 30,3

7 57,7 57,1

8 134,8 133,8

9 125,4 124,5

10 122,7 122,5

11 128,6 127,7

12 110,2 109,8

13 142,5 140,5

14 31,3 34,9

15 31,7 30,6

16 112,0 109,9

17 155,4 155,0

18 18,9 18,6

19 73,2 71,2

20 39,1 38,0

21 54,3 54,1

22 167,7 167,6

23 51,1 51,0

(60)

(61)

Figura 15 – Espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-2

Figura 16 – Espectro de RMN 13C – BB [125 MHz, (CD3)2CO] de HP-2

N

H N

O

COOMe O

112 167,7 _51,1

155,4 18,9

73,2 39,1 54,3

31,7 31,3 72,3 57,7

134,8 54,8 35,5 125,4 122,7 128,6

110,2 142,5

(62)

Figura 17 - Espectro de RMN13C – DEPT - 135°[125 MHz, (CD3)2CO] de HP-2

(63)

Figura 19 – Espectro de 1H, 1H – COSY - [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-2 –

Expandido

(64)

(65)

Figura 22 – Espectro de 1H, 1H – NOESY [500 x 500 MHz, (CD3)2CO] de HP-2

N

H N

O C

H₃

COOMe

O

H

16

22 23

17 18

20 21

15 14 3

7 8

5 6 10 11

12

13

2

(66)

(67)

Sucessivos tratamentos cromatográficos da fração diclorometano. obtida a

partir da partição do extrato etanólico das folhas de H. patens, resultaram no

isolamento de um sólido amorfo branco denominado de HP-3 (p.f. 100,3-101,1 °C).

A análise do espectro no infravermelho de HP-3 (Fig. 24, p. 66) revelou

banda característica de deformação axial N-H em 3259 cm-1 e de ligações C-N de

aminas terciárias em 1086 cm-1_._{Observaram-se também uma banda em 1209 cm}-1

de ligação C-O, e vibrações de deformações axiais C=O de éster α, -insaturado e

de -lactamas em 1706 cm-1. Foi observada ainda absorção característica de ligação

dupla conjugada em 1630 cm-1_{; uma banda em 755 cm}-1 _{relativa à deformação}

angular fora do plano de C-H de anel aromático, além de deformações axiais em

2948 e 2791 cm-1_{de C-H alifáticos.}

O espectro de RMN 13C-BB [125 MHz, (CD3)2CO] de HP-3 (Fig. 27, p. 67)

apresentou 22 linhas espectrais. De modo Semelhante a HP-1 e HP-2, a análise

detalhada deste espectro revelou dois sinais em  180,5 (C-2) e 167,8 (C-22)

característicos de carbonilas de amida e de éster conjugado, respectivamente.

Foram observados ainda oito sinais referentes a carbonos sp2_[__{110,9 (C-16), 136,2}

8), 110,2 9), 155,5 17) 156,7 10), 113,2 11), 111,4 12) e 133,8

(C-13)], dos quais os carbonos em  155,5 (C-17) e 156, 7 (C-10) encontram-se

oxigenados. Outra diferença observada no espectro de HP-3 foi a presença de um

carbono adicional relativo a um grupamento metoxila em 56,0 (C-24). Comparando

os espectros RMN 13_{C-BB e DEPT 135° [125 MHz, (CD3)2CO] (Fig. 28, p. 68),}

observaram-se oito linhas espectrais referentes a carbonos metínicos; quatro

(68)

A partir destas informações foi possível elucidar a fórmula molecular de

HP-3 como sendo C22H26N2O4 (Tab. 12), em acordo com o pico do íon molecular em

m/z 398 no espectro de massa (Fig. 25, p. 66).

Tabela 12 – Deslocamentos químicos de RMN 13C-BB de HP-3 com padrão de hidrogenação (RMN 13_{C-BB e DEPT 135°, 125 MHz (CD3)2CO).}

C CH CH2 CH3 TOTAL

156,7 155,5 55,7 56,0

136,2 113,1 54,0 51,1

133,8 111,4 35,4 18,9

110,9 110,2 30,9

57,4 75,3

73,2 37,6 32,1

C5 C8H8 C4H8 C3H9 C20H25

C2O5 N2H C22H26N2O5

O estudo do espectro de RMN 1_{H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-3 (Fig. 26,}

p. 67) revelou quatro sinais de hidrogênios em  7,46 (s, 1H, H-17), 6,80 (m, 1H, H-

9), 6,76 (m, 1H, H-11), 6,95 (d, J=2,4 Hz, H-12), além de dois sinais simpleto e

intensos em 3,55 (s, 3H, H-23) e 3,78 (s, 3H, H-24), e um outro dupleto em  1,37

(d, J=6,2 Hz, 3H, H-18), relacionados a hidrogênios de grupamentos metoxilas e

metila, respectivamente. De maneira análoga aos espectros de HP-1 e HP-2, o

espectro de HP-3 mostrou ainda conjuntos de multipletos em  2,46-2,31, 1,48 (m,

2H, H-6a) e 1,96 (m, 2H, H-6b).

O Espectro de Correlação Heteronuclear – HSQC de HP-3 (Fig. 32, p. 70)

permitiu a associação de cada carbono ao seu respectivo hidrogênio de forma

inequívoca.

Por outro lado, a análise do espectro bidimensional HMBC (Fig. 30, p. 69)

(69)

e dos dois hidrogênios aromáticos em  6,95 (H-12) e 6,80 (H-9) com o carbono em

 136,2 (C-8), subestrutura 1.

A posição relativa do grupo metoxila adicional foi determinada atavés dos

acoplamentos dos hidrogênios  6,95 (H-12), 6,80 (H-9) e 3,78 (H-24) com o carbono

 156,72 (C-10). Em adição, foram observados os acoplamentos do hidrogênio em 

6,95 (H-12) com o carbono  113,20 (C-11) e dos hidrogênios em  6,80 (H-9), 6,95

(H-12) com o carbono (C-13), conforme subestrutura 2.

Ainda analisando este espectro, observaram-se os acoplamentos dos

hidrogênios em  7,46 (H-17) e 2,42 (H-15) com o carbono em  110,9 (C-16); o

acoplamento do hidrogênio  4,50 (H-19) com o carbono  18,9 (C-18) e dos

hidrogênios  3,55 (H-23), 7,46 (H-17) e 2,42 (H-15) com o carbono em  167,8

(C-22), levando à proposição da subestrutura 3, p. 61.

N

H N

O O

CH₃

H H H

7

5 6 8 10 11

13

2

24

3 9

12

O CH₃

H H

8 11

12 9

10

24

13

Subestrutura 1

(70)

Tabela 13 _– Dados de RMN1_H,13_{C e correlações de HSQC e HMBC}n_J_{(n=2 e} n=3) de HP-3.

C HSQC HMBC

δC δH 2JCH 3JCH

2 180,5 - H-3

3 73,3 2,37 (m) H-5a, H-6a _{e H-14a} -

5 55,7 3,19 (dd, _{2,46 (m)}J=11,9; 1,8 Hz) H-6a -

6 35,4 1,96 (ddd, _{0,85 Hz) ; 2,31 (m)}J=6,85; 5,0; H-5b -

7 57,4 - - H-14b

8 136,2 - H-9 H-12

9 110,2 6,80 (m) - -

10 156,7 - H-9 H-12 e H-24

11 113,2 6,76 (m) H-12 -

12 111,4 6,95 (d, J=2,35 Hz) H-11 -

13 133,8 - H-12 H-9

14 30,9 1,48 (m) _{1,66 (m)} H-15 H-20

15 32,1 2,42 (m) H-20 e H-_14a H-17, H-19 _{e H-21a}

16 110,9 - H-17 e H-15 -

17 155,5 7,46 (s) - H-15 e H-19

18 18,9 1,37 (d, J=6,2 Hz) H-19 -

19 73,2 4,50 (m) - H-17

20 37,6 1,61 (m) H-19, H-15 _{e H-21a} H-18

21 54,0 _{2,37 (m)}3,34 (m) - -

22 167,8 - - H-17, H-23 _{e H-15}

23 51,1 3,55 (s) - -

24 56,0 3,78 (s) - -

COOMe C

H₃

H

16 15

17 19

20

22 23

(71)

Adicionalmente, o espectro homonuclear 1H, 1H – NOESY de HP-3 (Fig.

31, p. 70), revelou importantes acoplamentos dipolo-dipolo a longa distância do

hidrogênio em  6,95 (H-12) com os hidrogênios da metoxila em  3,76

(H-24),_{}b) e 196a), conforme o fragmento mostrado abaixo.

O espectro de massa (Fig. 25, p. 66) apresentou picos semelhantes a

HP-1 (m/z 223, 208, 41 e 60), com o surgimento de dois picos (m/z 367 e 297)

caracterizando a presença da metoxila adicional, como mostrado na proposta

mecanística no quadro 2, p. 63.

N

H N

O O

CH₃

H

H H

3 7

8 9 10 11

13

2 12

(72)

Quadro 2 – Proposta mecanística para as fragmentações que justificam os principais picos registrados no espectro de massa de HP-3

OCH3

.

C8H10O3 C10H14O3 C10H9NO2 N H N O O O CH₃ COOMe +

.

N H N O O COOMe + N H N O O CH₃ + C4H5O3

.

N O COOMe +

.

N O COOMe +

m/z 208

CH3

.

N

+

.

m/z 69

N +

.

m/z 41

m/z 367

m/z 297

m/z 223

(73)

Os dados acima discutidos e a posterior comparação com dados de RMN

13_{C descritos na literatura (Tab. 14, p. 65) para o alcalóide oxindólico palmirina,}

revelou a semelhança entre as duas substâncias. Este alcalóide também já foi

isolado a partir da parte aérea de H. patens [BORGES et al., 1979].

N

H N

O

O O

CH₃

COOMe 23 22

16

15

17 19

20 21

14 3

7

5 6 8

9 10 11

12

13

2

18 24

(74)

Tabela 14 – Análise comparativa dos deslocamentos químicos () de RMN 13C

de HP-3 [125 MHz, (CD3)2CO] com a palmirina (25 MHz, CDCl3).

C HP-3

Palmirina [BORGES, 1979]

δC δC

2 180,5 181,0

3 73,3 72,3

5 55,7 53,6

6 35,4 34,9

7 57,4 57,6

8 136,2 135,3

9 110,2 109,9

10 156,7 156,0

11 113,2 112,2

12 111,4 111,9

13 133,8 133,8

14 30,9 30,3

15 32,1 30,7

16 110,9 110,0

17 155,5 155,1

18 18,9 18,6

19 73,2 71,3

20 37,6 38,2

21 54,0 54,1

22 167,8 167,6

23 51,1 51,0

24 56,0 55,7

(75)

(76)

Figura 26 – Espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de HP-3