KÁTIA CALVI LENZI DE ALMEIDA
A INCORPORAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3,
ORIUNDOS DA SEMENTE DE LINHAÇA (Linum
usitatissimum), INFLUENCIANDO O
DESENVOLVIMENTO CEREBRAL DE RATOS FILHOTES
NITERÓI 2007
Dissertação apresentada ao Curso de Pós- graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Investigativa.
A INCORPORAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3,
ORIUNDOS DA SEMENTE DE LINHAÇA (Linum
usitatissimum), INFLUENCIANDO O
DESENVOLVIMENTO CEREBRAL DE RATOS FILHOTES
Orientadores: Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura
Prof. Dr. Maria Angélica Guzmán-Silva
NITERÓI 2007
Lenzi de Almeida. – Niterói, 2007.
86f.
Dissertação de Mestrado (Patologia Investigativa – Programa de Pós-graduação em Patologia) –
Universidade Federal Fluminense
Orientadores: Gilson Teles Boaventura, Maria Angélica Guzmán-Silva
Bibliografia: f. 71-77
1. CÉREBRO. 2. ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3. 2. LINHAÇA. I. Universidade Federal Fluminense. II. Título.
Lista de Abreviaturas Lista de Figuras Lista de Tabelas Resumo Abstract 1. INTRODUÇÃO 13 2. REVISÃO DE LITERATURA 15 2.1. Lipídeos 15
2.1.1. Estrutura química e classificação 16
2.1.2. Ácidos graxos essenciais 17
2.1.3. Papel dos ácidos graxos poliinsaturados na saúde 19
2.1.4. Recomendações de consumo dos ácidos ômega-6 e ômega-3 22
2.2. Semente de linhaça 23
2.2.1. Linhaça como alimento funcional 26
2.3. Desenvolvimento pós-natal do cérebro 28
3. JUSTIFICATIVA 33 4. HIPÓTESE 34 5. OBJETIVOS 34 5.1. Objetivo geral 34 5.2. Objetivos específicos 35 6. MATERIAL E MÉTODOS 36 6.1. Material 36 6.2. Delineamento experimental 38 6.3. Métodos 41
6.3.1. Avaliação da qualidade protéica das rações 41
6.3.1.1. Análise biológica 41 6.3.1.2. Análise bioquímica 42 6.3.2. Coleta de material 43 6.3.2.1. Leite materno 43 6.3.2.2. Cérebro de filhotes 44 6.3.3. Análise bioquímica 44 6.3.3.1. Determinação do crematócrito 45
6.3.4. Análise estatística 47
6.3.5. Ética 47
7. RESULTADOS 48
7.1. Qualidade protéica e perfil lipídico das rações experimentais 48
7.2. Crematócrito e valor energético do leite materno 52
7.3. Composição de ácidos graxos do leite materno 53
7.4. Peso cerebral, peso corporal e peso cerebral relativo de filhotes no M0 56 7.5. Composição de ácidos graxos do cérebro dos filhotes ao M0 57 7.6. Peso corporal, peso cerebral e peso cerebral relativo de ratos filhotes no M30 60
8. DISCUSSÃO 62
9. CONCLUSÕES 74
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76
Nos dias atuais, existe um interesse considerável nos ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (PUFA) ômega-3 na saúde humana. Os ácidos
desta série, bem como os da série ômega-6 são conhecidos como essenciais na dieta dos humanos. Uma das principais fontes na dieta de PUFA é o pescado, rico nos ácidos graxos eicosapentaenóico (EPA) e docosaexaenóico (DHA) (VISENTAINER et al., 2003). Estes ácidos são particularmente propensos à oxidação ou ao ataque de radicais livres (PAPAS, 1999).
Os óleos das sementes oleaginosas, particularmente o óleo de linhaça, são ricos em ácido alfa-linolênico, precursor dos PUFA (CALDER, 1998). Particularmente, o ômega-3 têm sido objeto de interesse tanto de pesquisadores
como do setor das indústrias de alimentos, por serem estes ácidos essenciais para o desenvolvimento de uma melhor acuidade visual (CARLSON & MOSES, 2001), para o desenvolvimento e crescimento normal do organismo, por possuir um papel importante na prevenção de doenças cardiovasculares e câncer e por estarem associados ao tratamento de algumas patologias como a hipertensão, diabetes, artrite, problemas inflamatórios e autoimunes, entre outros (SIMOPOULOS, 2000).
Estudos mostram que a nutrição intra-uterina (BARKER, 1994) e pós-natal (MOURA et al., 2002) podem influenciar na ocorrência de risco para doenças crônicas no adulto, sugerindo que a nutrição precoce com ácidos graxos específicos tem um efeito marcante em idades mais avançadas da vida. Isto demonstra a importância de uma adequada oferta dos ácidos graxos essenciais (EFAs) durante a gestação, lactação e infância, constituindo períodos vulneráveis para o desenvolvimento cerebral (DUTTA-ROY, 1997).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Lipídeos
O termo lipídeos é usado normalmente para indicar, de uma forma pouco exata, uma ampla variedade de produtos orgânicos que possuem a característica comum de não serem solúveis em água e sim em solventes apolares (hexano, éter, clorofórmio, etc). Junto com as proteínas e os carboidratos, os lipídeos são um dos mais importantes nutrientes, que fornecem ao corpo a energia e mantêm outros processos celulares vitais. Os principais lipídeos incluem triglicerídeos, diglicerídeos, monoglicerídeos, ácidos graxos, colesterol, ésteres de colesterol e fosfolipídeos (SALEM, 1999).
2.1.1.
Estrutura
química e classificação
Quimicamente, os lipídeos são misturas de glicerídeos que, por sua vez, são estruturas formadas pela associação química entre o glicerol e uma, duas ou três moléculas de ácidos graxos. A maior parte dos lipídeos contém uma ou mais moléculas de ácidos graxos como parte da sua estrutura química básica. Os ácidos graxos estão formados de uma cadeia hidrocarbonada, variando no comprimento, de 2 a 20 ou mais átomos de carbono, com um grupo carboxílico (HO-C=O) a um extremo da cadeia e um grupo metílico (CH3) no outro. Os ácidos graxos mais
comuns nos alimentos consistem em um número par de átomos de carbono, variando de 12 a 22 carbonos, se bem que, ácidos graxos mais curtos, mais compridos ou com um número ímpar de carbonos têm sido identificados em alimentos preparados (SALEM, 1999).
Os ácidos graxos são, freqüentemente, nomeados em forma abreviada de acordo com suas estruturas químicas e são classificados como saturados, monoinsaturados e poliinsaturados, dependendo do número de duplas ligações. Os ácidos graxos saturados se encontram, predominantemente, em alimentos como carne, ovos, queijo, leite e manteiga, óleos de coco e palma, como também em vegetais hidrogenados. O ácido oléico é o mais comum dos ácidos graxos monoinsaturados e se encontra na maioria das gorduras animais, incluindo aves, carne de vaca e cordeiro, bem como em azeitonas, sementes e nozes. Já, os ácidos
graxos poliinsaturados - PUFA - se classificam, principalmente, nas séries ômega-6 (ω-6) e ômega-3 (ω-3), que se diferenciam na posição da primeira dupla ligação, contando desde o grupo metílico terminal da cadeia do ácido graxo. O ácido linoléico é o expoente mais importante da série ω-6 e está presente de forma abundante nos óleos vegetais como óleo de girassol, cártamo, milho, soja, algodão, etc. O ácido α- linolênico, representante da família ω-3, é encontrado em quantidades apreciáveis em sementes oleaginosas como a canola, soja e linhaça (DZIEZAK, 1989). Contudo, tanto nos vegetais (algas, microalgas, fitoplancton), quanto nos animais de origem marinha (peixes, crustáceos), encontram-se outros ácidos graxos com maior número de carbonos e com maior quantidade de duplas ligações, que também pertencem à série ômega-3. São os chamados ácidos graxos de cadeia muito longa, superior a 18 carbonos, conhecidos pela sigla LCPUFA (do inglês “Long Chain Polyunsaturated Fatty Acids”); eles são o ácido eicosapentaenóico (EPA, C 20:5, ω-3) e o ácido docosahexaenóico (DHA, C 22:6, ω-3) (CALDER, 1998).
2.1.2. Ácidos graxos essenciais
Os ácidos graxos linoléico e α-linolênico são precursores dos PUFA ω-6 e ω-3 de cadeia mais longa, respectivamente. Estes ácidos não podendo ser biosintetizados em animais, incluindo o homem, são necessários para a saúde, sendo considerados essenciais, e também conhecidos como EFA (do inglês “Essentials Fatty Acids”) (HORNSTRA, 2001). No entanto, uma vez consumidos, os ácidos linoléico e alfa-linolênico podem ser alongados até cadeias de pelo menos 20
ou 22 carbonos (Figura 1). O ácido linoléico pode ser metabolizado em outro ácido, o ômega-6, incluindo os ácidos alfa-linolênico, dihomo-alfa-linolênico e araquidônico. O ácido alfa-linolênico (LNA) é metabolizado em outros da série ômega-3, entre eles EPA e DHA. Este processo metabólico é mediado pelas enzimas chamadas elongases e dessaturases, as quais participam na formação dos ácidos graxos poliinsaturados, n-6 e n-3, resultando em uma competição metabólica entre os dois grupos (SALEM, 1999).
Figura 1. Competição metabólica entre as séries ômega-6 (ω-6) e ômega -3 (ω-3) (SALEM, 1999).
Um excesso de ácido linoléico vai impedir a transformação do LNA em seus derivados EPA e DHA, o mesmo acontecerá no caso contrário, com um menor consumo do ácido linoléico haverá uma diminuição da formação do ácido araquidônico. A concorrência entre os ácidos linoléicos e LNA está determinada pela afinidade da enzima delta-6-dessaturase por ambos ácidos graxos. Como a enzima tem maior especificidade pelos ácidos ômega-3, precisará de menores quantidades destes que dos ômega-6 para produzir a mesma quantidade de produto (MADSEM
et al.,1999). Isto significa que deve existir uma proporção maior de ácido linoléico
que de LNA. Portanto, é necessário um equilíbrio entre o aporte dos dois ácidos graxos através da dieta (SALEM, 1999).
2.1.3. Papel dos ácidos graxos poliinsaturados na saúde
Os ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 influenciam no metabolismo dos eicosanóides, na expressão genética e na comunicação intercelular. A composição destes ácidos nas membranas celulares depende, em grande dimensão, da quantidade ingerida na dieta. Portanto, é necessário considerar as recomendações das quantidades apropriadas para o consumo diário destes. As duas classes de PUFA devem ser muito bem diferenciadas, pois são metabolicamente diferentes e possuem funções fisiológicas opostas, deste modo o equilíbrio nutricional é importante para se conseguir a homeostase e desenvolvimento normal do organismo (SIMOPOULOS, 2000).
Nos últimos anos, muitos estudos e investigações clínicas têm sido realizados sobre o metabolismo destes ácidos, em geral, e sobre o ácido graxo ômega-3, em particular, de fontes marinhas e plantas. No entanto a mudança no nível dos PUFA na dieta poderia influenciar a produção e função biológica das citocinas, importantes mediadores biológicos cuja produção excessiva contribui ao desenvolvimento de diversas patologias. Além disso, o consumo aumentado destes sem uma proteção antioxidante adequada pode levar à peroxidação lipídica in vivo e, portanto reduzir seus efeitos benéficos, sendo necessária para minimizar esses riscos, a utilização de níveis apropriados de antioxidantes (MEYDANI, 1996).
Estudos clínicos com suplementação de ácidos graxos ômega-3, junto com um consumo reduzido de gordura têm sido sugerido para a prevenção de câncer de mama (STOLL, 1998). Há também evidências que estes ácidos podem inibir o crescimento de células neoplásicas in vitro e em explantes in vivo, visando a proteção contra o câncer de mama em humanos (ROSE et al., 1996).
As dietas com o ácido ômega-3 atuam evitando doenças cardíacas através de uma variedade de ações como a prevenção de arritmias, geração de prostanóides e leucotrienos com ações antiinflamatórias, inibição da síntese de citocinas, que aumentam a inflamação e favorecem a formação de plaquetas (UAUY & VALENZUELA, 2000). Portanto, a linhaça, bem como outras importantes fontes de LNA (por exemplo, óleos de canola, soja e nozes) deve ser incorporada à dieta a fim de se obter este efeito benéfico (CONNOR, 1999). Adicionalmente, fontes de origem marinha (óleo de peixe) induzem mudanças de ácidos graxos nos lipídeos do
sangue (triacilgliceróis, lipoproteínas), reduzindo o perfil lipídico aterogênico (LAYNE
et al., 1996). Já, o DHA é essencial para o desenvolvimento dos sistemas visual e
nervoso. O conteúdo deste ácido no cérebro e na retina é muito mais alto que em outros órgãos e há mecanismos que mantêm esta quantidade alta durante períodos de deficiência. Durante o crescimento do cérebro, há uma grande incorporação deste ácido que parece ter um papel importante no funcionamento das membranas celulares no Sistema Nervoso Central (SNC) (LAURITZEN et al., 2001). Estudos em primatas e humanos recém-nascidos revelam que o DHA é essencial para o desenvolvimento normal da retina e do cérebro, particularmente em crianças prematuras (SIMOPOULOS, 2000; LAURITZEN et al., 2001).
Os ácidos graxos são compostos essenciais das membranas das células imunes e são requeridos para o crescimento e manutenção das mesmas. Estudos em culturas de células, modelos animais e humanos têm indicado que a quantidade e tipo de ácidos graxos influenciam no crescimento e atividade de células imunes (KELLEY & RUDOLPH, 2000). No entanto, outros fatores, incluindo o tipo de célula, espécie animal, idade, saúde, duração da alimentação, nutriente antioxidante, concentração de soro, comprimento da cadeia e proporção entre as classes de ácidos graxos, devem ser também considerados (KELLEY & RUDOLPH, 2000).
2.1.4. Recomendações de consumo dos ácidos ômega-3 e
ômega-6
Considerando que os ácidos graxos da série ômega-6 e ômega-3 podem influenciar uma variedade ampla de funções biológicas, devido à associação dos mesmos na incorporação ou formação de parte das membranas celulares e serem essenciais para o crescimento e funcionamento do organismo humano, é necessário determinar as recomendações nutricionais relativas ao consumo destes ácidos graxos na dieta. Tem sido muito discutido por importantes grupos de estudo o consumo diário necessário destes ácidos graxos. Segundo SIMOPOULOS et al. (1999), uma recomendação importante seria reduzir os ômega-6, ainda que os
ômega-3 sejam aumentados na dieta de adultos e recém-nascidos, visando à saúde,
funcionamento mental e cardiovascular adequados. Isto é necessário para reduzir os efeitos adversos do excesso do ácido araquidônico e seus produtos eicosanóides.
Tal excesso pode ocorrer quando muito ácido linoléico e araquidônico estão presentes na dieta junto com um inadequado fornecimento de ômega-3. Portanto, acrescentando na dieta PUFA ômega-3 e diminuindo certos óleos vegetais com alto conteúdo de linoléico, pode se obter uma melhora na proporção ômega-6/ômega-3 (HARRIS, 1997). Por conseguinte, as recomendações estão ao redor de uma proporção de ácido ômega-6/ômega-3, desde 5:1 até 10:1. Já, na gravidez e lactância, é recomendado garantir uma ingestão de 300mg/dia de DHA (SIMOPOULOS, 2000).
2.2. Semente de linhaça
A linhaça é uma das sementes oleaginosas tradicionais, por causa da utilização de suas fibras em produtos têxteis. A partir da sua semente se pode obter um óleo com propriedades secantes devido ao alto teor de LNA. As frações obtidas podem também ser utilizadas para balanceamento de ração animal (TURATTI, 2001). Esta oleaginosa é rica em proteína, gordura e fibras dietéticas. Análises da linhaça canadense mostraram uma média de 41% de gordura, 28% de fibras dietéticas, 21% de proteína, 4% de resíduos e 6% de outros carboidratos (os quais incluiriam açúcares, ácidos fenólicos, lignana e hemicelulose). A quantidade de calorias presente em 100 gramas de linhaça é de 396Kcal, sendo 109Kcal de proteína e 287Kcal de lipídeos (TURATTI, 2001).
A produção mundial se encontra entre 2.300.000 e 2.500.000 toneladas anuais, sendo o Canadá o principal produtor. Na América do Sul, o maior produtor é a Argentina, com cerca de 80ton/ano. O Brasil apresenta uma baixa produção, cerca de 20ton/ano (ACEITES & GRASAS, 2000).
A linhaça é usada em produtos forneados e como componente de misturas de cereais matinais. Estão em desenvolvimento processos que incluem o óleo de linhaça em rações, de forma que os produtos para consumo humano como a carne,
ovos, leite, possam estar enriquecidos com ácidos graxos ômega-3 (TURATTI, 2001).
O mercado de produtos naturais já oferece o óleo de linhaça prensado a frio, encapsulado. Além disso, existe o uso medicinal da semente de linhaça em distúrbios gástricos, indigestão, úlceras duodenais e também como laxante suave. Na área de cosméticos, o óleo de linhaça é empregado em tratamentos dermatológicos (eczema, acne, pele seca), além de ser usado na formulação de sabonetes líquidos (TURATTI, 2001).
A parte oleaginosa da semente é composta por 57% de ácidos graxos ômega- 3, 16% de ômega-6, 18% de ácido graxo monoinsaturado e somente 9% de insaturados. A predominância do ômega-3 na mesma tem sido correlacionada com a prevenção das doenças coronarianas e câncer (TURATTI, 2001).
As fibras dietéticas, no total, respondem por cerca de 30% do peso seco de linhaça. Relatórios sobre as proporções destas solúveis e insolúveis na semente variam entre 20:80 e 40:60. A faixa depende do método usado na análise química e extração de resina. A fração de fibra mais importante consiste de amidos resistentes, como a celulose e complexos polímeros com a lignana. O componente solúvel em água da fibra de linhaça é basicamente composto por resinas adesivas em níveis de 7% a 10%. Devido à presença das fibras solúveis, esta oleaginosa apresenta efeitos
fisiológicos na dislipidemia e arteriosclerose (CARTER et al., 1993; LEAF & WEBER, 1998; WHO, et al., 1995).
Os compostos fenólicos são comumente encontrados em plantas comestíveis e não-comestíveis e têm múltiplos efeitos biológicos, incluindo atividade antioxidante. Em sementes oleaginosas, os compostos fenólicos ocorrem como derivados hidroxilados dos ácidos benzóico e cinâmico, cumarinas, flavonóides e lignanas (OOMAH et al., 1995). Nas plantas, estes compostos são importantes para o desenvolvimento normal e defesa contra infecções e injúrias (KÄHKÖNEN et al., 1999).
Extratos etanólicos (95%) de linhaça exibem propriedades antioxidantes quando avaliados no sistema α-caroteno-ácido linoléico (SHUKLA et al., 1997). Estes autores, através da separação cromatográfica do extrato etanólico da linhaça obtiveram quatro frações, sendo que a atividade antioxidante mais elevada foi observada na fração I que continha uma quantidade moderada de compostos fenólicos. Já as frações II a IV apresentaram atividade antioxidante mais baixa. Separações adicionais da fração I utilizando cromatografia em camada fina indicaram que lignanas da linhaça estariam envolvidos nesta atividade.
O conteúdo de ácidos fenólicos na linhaça foi considerado mais baixo que o de outras sementes oleaginosas (WANASUNDARA et al., 1997). Trans-ferúlico foi o ácido fenólico predominante na linhaça e os ácidos transsinápico, trans-p-cumárico,
trans-cafeico e p-hidroxibenzoico foram encontrados em menores quantidades (DABROWSKI & SOSULSKI, 1984).
Sabe-se que os tocoferóis possuem uma forte atividade antioxidante, portanto a sua presença na semente de linhaça, especialmente α-tocoferol determinada por OOMAH et al. (1997), estaria colaborando com a atividade antioxidante desta semente.
2.2.1. Linhaça como alimento funcional
Alimentos funcionais são alimentos naturais ou produtos alimentícios elaborados que têm compostos bioativos que podem influenciar positivamente numa função humana atuando na prevenção ou tratamento de doenças ou desordens. Como um grande número de alimentos funcionais já tem sido introduzido no mercado internacional e nacional, suas afirmações de serem benéficos para a saúde podem desafiar o limite tradicional entre alimento e medicina. Assim, a regulamentação do conceito de alimentos funcionais tem sido examinada baseada em conceitos internacionais e é geralmente aceito que estes alimentos devem fornecer benefícios à saúde além de seus valores nutricionais normais dentro do modelo dietético diário (KWAK & JUKES, 2001).
A indústria de alimentos está já direcionada aos EFA ômega-3 para o fornecimento de alimentos suplementados. É necessário considerar alguns itens envolvidos no enriquecimento dos alimentos com ômega-3, como por exemplo, dosagem, segurança e fontes, para obter uma ingestão adequada destes ácidos (SIMOPOULOS, 2000).
Segundo GARCIA (1998), a incorporação de ômega-3 no alimento não é simples, já que são suscetíveis à oxidação, levando a sabores e odores fortes, não desejáveis. Mas, um manuseio cuidadoso dos compostos, modificações do processo e/ou mudanças na formulação podem ajudar a minimizar bastante esses problemas sensoriais.
A linhaça está sendo estudada por seus efeitos benéficos na saúde e é considerado um alimento nutracêutico, pelo fato de ser uma fonte natural de fito químicos (CARAGAY, 1992). Portanto, há um grande interesse em promover um maior consumo de linhaça através da dieta pelo seu potencial benéfico, especificamente por seu efeito anticarcinogênico (BENNETT, 1998; THOMPSON et
al., 1996) e antiaterogênico (PRASAD, 1997; PRASAD et al., 1998), vinculados ao
conteúdo de lignanas e ácidos graxos ômega-3 (YUAN et al., 1999). Já ARJMANDI
et al. (1998) considera que os altos níveis de LNA, da fibra solúvel e dos
constituintes não protéicos presentes na semente de linhaça, possuem um papel importante na redução de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), as quais são um fator de risco de doença cardiovascular.
o o
Vários mecanismos têm sido sugeridos para explicar as ações dos lignanas in
vivo incluindo as atividades antiaterogênica, anticarcinogênica e antioxidante. A
atividade antioxidante dos lignanas, na linhaça, funcionaria não somente inativando os radicais livres dos ácidos graxos e espécies reativas de oxigênio, mas também, tendo um efeito indireto in vivo nos sistemas antioxidantes endógenos, por exemplo, enzima glutationa (GSH) (YUAN et al., 1999).
2.3. Desenvolvimento pós-natal do cérebro
Após o nascimento, a partir do início da primeira mamada (que em ratos equivale a mais ou menos 2 horas), as crias passam a receber da mãe, uma dieta láctea pobre em glicídios e rica em lipídeos. Nesta fase, então, o metabolismo do recém-nascido está adaptado para utilizar lipídeos como principal substrato energético (ALBUQUERQUE, 1999).
Durante o pico de crescimento e o início da mielinização (que em ratos ocorre entre o 7 e o 14 dia pós-natal), há um rápido acúmulo de ácidos graxos saturados e insaturados de cadeia longa (EDMOND et al., 1998). O acréscimo de ácido graxo no cérebro em desenvolvimento tem como fonte, em parte, os captados da circulação materna (MARBOIS et al., 1992). Além disso, tem sido demonstrado que o fígado de ratos neonatos apresenta uma capacidade aumentada de sintetizar
corpos cetônicos, facilitada pelo grande conteúdo de lipídeos e carnitina presentes no leite materno, como também pelo aumento da beta-oxidação (EDMOND et al., 1985; WILLIAMSON, 1982; WEBBER & EDMOND, 1979; EDMOND, 1974; BAILEY & LOCKWOOD, 1973). Os corpos cetônicos no tecido cerebral em desenvolvimento, são substratos preferenciais, tanto para a obtenção de energia como para síntese de ácidos graxos, colesterol, fosfolipídeos e cerebrosídios (PATEL & CLARK, 1980).
Durante o desenvolvimento, o peso do cérebro aumenta progressivamente, atingindo em torno do 30 dia de vida pós-natal o mesmo peso do cérebro dos animais adultos (REINIS & GOLMAN, 1980). A deposição de lipídeos neste órgão até o 10 dia é muito inferior ao da proteína, porém, neste período começa a ser importante em função do processo de mielinização (ROUX & YOSHIOKA, 1972). O conteúdo de ácido desoxirribonucléico (DNA) do cérebro de ratos atinge valores máximos ao redor do 16 dia de vida pós-natal, indicando, portanto, que a proliferação celular já se encontra completa nesta idade (DOBBING & SANDS, 1974), começando a fase de hipertrofia.
Considerando que a síntese de ácidos graxos de cadeia longa é muito ativa durante o período pós-natal, os fosfolipídeos são necessários para a proliferação das membranas celulares e para a mielinização (MILLER et al., 1987). Por outro lado, a importância das membranas fosfolipídicas está associada à fluidez, bem como a função e atividade das enzimas ligadas a esta (LYNCH & THOMPSON, 1984; HOLUB & KUKSIS, 1978).
As propriedades físicas dos fosfolipídeos são em parte, determinadas pelo tamanho da cadeia carbônica e pelo grau de insaturação dos ácidos graxos que a compõe (NORDOY et al., 1991). Essas propriedades físicas, quando alteradas, afetam a habilidade dos fosfolipídeos em manter sua função estrutural, assim como a manutenção da atividade normal das enzimas ligadas à membrana. A deficiência de PUFA nos fosfolipídeos de membranas diminui a sua fluidez e, deste modo, pode alterar as funções das enzimas relacionadas às membranas (SARDESAI, 1992).
Os fosfolipídeos fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina são componentes essenciais da matriz estrutural de todas as células e das membranas subcelulares, sendo que em células animais e em bactérias predominam, respectivamente, a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina (LEHNINGER, 1993).
As fibras nervosas do cérebro estão envolvidas por uma membrana isoladora de múltiplas camadas denominada bainha de mielina. De forma semelhante ao isolante de um cabo elétrico, esta bainha permite a condução dos impulsos elétricos ao longo da fibra nervosa com velocidade e precisão. Quando se verificam lesões da mielina, os nervos não conduzem os impulsos de forma adequada (CALLEGARO, 2001; MERCK, 2007).
Ao nascer, muitos dos nervos dos bebês não possuem bainhas de mielina maduras, o que explica que os seus movimentos sejam inábeis e com falta de coordenação. O desenvolvimento anormal destas bainhas pode dar lugar a defeitos neurológicos permanentes e, freqüentemente, extensos (MERCK, 2007; RUDICK, 1999).
Os acidentes vasculares cerebrais (AVC), as inflamações, as doenças auto- imunes e as alterações metabólicas figuram entre os processos que destroem a bainha de mielina no adulto, o que se conhece como desmielinização. O abuso de substâncias tóxicas (como as bebidas alcoólicas) costuma danificar ou destruir as mesmas. Quando a bainha é capaz de se reparar e regenerar por si mesma, a função nervosa pode restabelecer-se completamente. Mas ao se tratar de uma desmielinização extensa, o nervo que está no seu interior costuma morrer, o que causa um dano irreversível (CALLEGARO, 2001; MERCK, 2007).
As doenças desmielinizantes do SNC são condições adquiridas por uma lesão preferencial da mielina, com relativa preservação dos axônios. As deficiências clínicas são causadas pelo efeito da perda da mielina na transmissão dos impulsos elétricos ao longo dos axônios. A história natural das doenças desmielinizantes é determinada, em parte, pela capacidade limitada do SNC para regenerar a mielina normal e pelo grau de lesão secundária aos axônios que ocorre à medida que a doença segue seu curso. Outros processos patológicos podem comprometer a mielina, como ocorre na leucoencefalopatia multifocal progressiva. Além disso, há
distúrbios hereditários que comprometem a síntese e a substituição da mielina, denominados leucodistrofias (KUMAR et al., 2000).
3. JUSTIFICATIVA
Considerando que as doenças desmielinizantes do SNC são distúrbios adquiridos por lesão preferencial da mielina e que os sintomas decorrem do efeito da perda desta sobre a transmissão de impulsos elétricos ao longo dos axônios (KUMAR et al., 2000), este trabalho pretende contribuir com profissionais de saúde e pesquisadores de patologias neurológicas, em especial as de ordem desmielinizante, estudando a influência dos ácidos graxos ômega-3 de uma dieta à base de linhaça, sobre o perfil lipídico do leite materno e do cérebro de filhotes, os pesos - cerebral, corporal e cerebral relativo, de filhotes oriundos de pais que receberam esta dieta durante toda a vida.
4. HIPÓTESE
A utilização de uma dieta à base de linhaça influencia positivamente a incorporação de ácidos graxos ômega-3 pelo leite materno e cérebro, proporcionando um melhor desenvolvimento deste órgão em ratos filhotes.
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo geral
Verificar o efeito da semente de linhaça no desenvolvimento cerebral de ratos filhotes.
5.2. Objetivos específicos
1 - Avaliar a qualidade protéica e o perfil lipídico das rações experimentais;
2 - Determinar o crematócrito e o valor calórico do leite materno;
3 - Determinar a composição de ácidos graxos do leite materno;
4 - Determinar o perfil de ácidos graxos do cérebro de filhotes, no M0;
5 - Determinar os pesos corporal, cerebral e cerebral relativo dos filhotes nos momentos Zero (M0) e trinta (M30).
6. MATERIAL E MÉTODOS
6.1. Material
Semente de Linhaça
As amostras da linhaça foram fornecidas pela empresa Arma Zen Produtos Naturais LTDA, Rio de Janeiro – RJ, seguindo o seguinte processo de preparação: foram pesadas e trituradas em liquidificador para a obtenção da farinha de linhaça, que foi utilizada como fonte de proteína para o preparo das rações.
1 2 3 4 1 1 5 6 1 1
Rações
Todas as rações foram preparadas adicionadas das misturas de minerais e de vitaminas segundo as normas do COMMITTEE ON LABORATORY ANIMAL DIETS, 1979, modificadas segundo as recomendações da AIN-93G (REEVES et al., 1993).
Tabela 1 – Formulação das Rações (g/100g de alimento) com 17 % de proteína.
Nutrientes Caseína Linhaça Caseína Modificada
Caseína 20 14,12 20 Linhaça - 25 - Amido 52,95 45,83 49,95 Açúcar 10 10 10 Mix Minerais 3,5 3,5 3,5 Mix Vitaminas 1 1 1 Óleo 7 0 10 Celulose 5 0 11,33 B-Colina 0,25 0,25 0,25 Cistina 3 0,3 0,3 Total 100 100 100 VET (Kcal/100g) 355,64 388,91 372,64
1-Rhosther Industria e Comércio LTDA, 2-ArmaZem LTDA,
Animais
Foram utilizados, inicialmente, 18 Rattus norvegicus, variedade Albinus, linhagem Wistar, fêmeas, em idade fértil, oriundas do Laboratório de Nutrição Experimental e Dietética, da Faculdade de Nutrição da Universidade Federal Fluminense, local onde foram realizados os ensaios biológicos.
6.2. Delineamento experimental
O ensaio biológico foi desenvolvido utilizando 18 animais fêmeas que foram divididas em três grupos de seis animais:
1. Grupo Controle (GC), recebeu ração à base de caseína com 17% de proteínas,
ad libitum.
2. Grupo Linhaça (GL), recebeu ração à base de linhaça crua com 17% de proteínas, ad libitum.
3. Grupo Controle Modificado (GCM), recebeu ração à base de caseína 17% com modificações nos teores de lipídeos e fibras em função da concentração destes nutrientes na semente de linhaça.
O grupo GCM recebeu ração no sistema de pair feeding sendo sua oferta baseada no consumo do grupo GL no intuito de controlar diferenças de consumo alimentar identificadas em estudos anteriores.
As ratas foram mantidas em gaiolas individuais, com temperatura constante (24 ± 20°C) e iluminação controlada, ciclo claro-escuro 12/12h, recebendo água ad
libitum, durante todo o ensaio.
As mesmas receberam as rações experimentais a partir do desmame, assim como seus respectivos machos. Ao alcançarem a maturidade sexual (90 dias de vida), foram colocados em acasalamento por 15 dias, a partir do qual foram separados e as fêmeas continuaram recebendo as mesmas rações experimentais. Após o período de gestação, essas fêmeas geraram novos animais, que formaram então, a Geração F1 que foi analisada em dois momentos distintos: M0, até 2 horas após o nascimento e M30, com 30 dias de vida (Figura 2).
Nesta geração F1, todos os animais excedentes ao total de seis filhotes foram sacrificados até 2 horas após o nascimento (M0); e os animais restantes, de cada rata, em cada grupo, foram amamentados até 21º dia, quando foram desmamados de suas mães, passando a receber as rações experimentais, até o 30° dia quando foram sacrificados para a coleta de amostras do M30.
18 fêmeas em acasalamento, recebendo rações experimentais (gestação) Coleta de amostras
Figura 2 - Delineamento experimental.
Durante todo o período após o parto foram controlados o consumo de ração em cada gaiola, assim como a variação de peso tanto da mãe quanto das crias, até o desmame; somente das crias até o 30º dia.
Ao 21° dia, período de desmame dos animais, as ratas foram separadas de seus filhotes por 4 horas, e a seguir foram ordenhadas, objetivando a coleta de leite para posterior análise.
6.3. Métodos
6.3.1. Avaliação da qualidade protéica das rações
Todas as rações foram analisadas no Laboratório de Nutrição Experimental (LABNE) da Faculdade de Nutrição da Universidade Federal Fluminense. Foram utilizados para realização destas análises, animais pertencentes a geração F1.
6.3.1.1. Análise biológica
Para a avaliação biológica da qualidade protéica foi utilizado o Protein
Efficiency Ratio (PER). Este método se baseia na variação de peso corporal em
função da proteína ingerida. Ocorrendo variação do total de proteína devido a diferenças da qualidade protéica da dieta, é comum medir-se a variação do peso como um reflexo global da atuação da proteína ingerida. O PER é determinado pela razão entre o ganho de peso dos animais e o consumo de proteína destes entre o dia zero e o 28 (CAMPBELL, 1963).
O Coeficiente de Eficácia Alimentar (CEA) determina quanto um grama de ração ingerida promove o aumento de peso corporal e é determinado pela relação entre a variação de peso dos animais e a ração consumida por estes. Para o cálculo do CEA consideramos a variação de peso dos animais ocorrida entre o dia zero (após o desmame) e o 28°, e o consumo cumulativo de ração até o 28° dia. A média da variação ponderal dos animais foi utilizada como medida de tendência central de cada grupo, em cada período de registro (CAMPBELL, 1963).
6.3.1.2. Análise bioquímica
Todas as rações foram analisadas quanto à composição dos ácidos graxos no Instituto Josué de Castro da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
A extração lipídica, saponificação e metilação dos ácidos graxos foram realizadas, em duplicata, partindo de uma alíquota de 0,2g ou 200µl de amostra (ração) de acordo com o método de LEPAGE & ROY (1987). Os ésteres metílicos foram quantificados por cromatografia gás-líquido, utilizando-se um cromatógrafo Perkin Elmer autosystem XL equipado com detector de chama ionizável e o software Turbochrom Navigator. Os ácidos graxos foram separados com coluna capilar SP 2560 (Supelco, USA) com 100mm x 0,25mm x 0,20µm. O hidrogênio foi utilizado como gás de arraste. As temperaturas de injeção e detecção foram respectivamente, 260°C e 280°C. A temperatura da corrida foi programada para iniciar a 135°C durante 5 minutos com subida de 2°C/minuto até 195°C. A partir daí, com subida de
4°C até alcançar 240°C, permanecendo por 2,5 minutos. O tempo total da corrida somou 45 minutos. A pressão do gás arraste foi de 32 Psi. A razão de split foi de 1:70. Os ésteres foram identificados por comparação com seu tempo de retenção com padrões conhecidos (Sigma, Supelco). Os resultados foram expressos como percentual de ácidos graxos totais.
6.3.2. Coleta de material
6.3.2.1. Leite materno
A retirada do leite foi realizada segundo a técnica descrita por KEEN et al. (1981), na qual as mães foram separadas dos seus respectivos filhotes no 21 dia de lactação por 4 horas. Aos 15 minutos, antes da retirada do leite, as ratas receberam injeção intraperitoneal do anestésico xilazina (Calmiun) 20mg/Kg e ocitocina (Naox) 5UI, para estimular a ejeção do leite. O mesmo foi estocado -20 C até o momento da análise.
6.3.2.2. Cérebro de filhotes
No dia do sacrifício os animais foram pesados no próprio biotério e transferidos para o laboratório, onde permaneceram para ambientação durante pelo menos 30 minutos. Os animais foram sacrificados por decapitação em guilhotina.
Os cérebros foram retirados, com auxílio de pinça e tesoura, pesados e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. Ao final do sacrifício as amostras foram acondicionadas em freezer à -20°C.
6.3.3. Análise bioquímica
As análises bioquímicas foram realizadas no Instituto Josué de Castro da Universidade Federal do Rio de Janeiro, no Laboratório de Nutrição Experimental da Universidade Federal Fluminense e no Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP).
6.3.3.1. Determinação do crematócrito
Para esta determinação foi seguida a técnica desenvolvida por LUCAS et al. (1978), na qual após homogeneização do leite ordenhado (1ml), este foi transferido para tubo de ensaio e aquecido em banho-maria à 4 C, durante 10 minutos. Uma vez transcorrido o tempo, 3 alíquotas de 75µl foram centrifugadas por 15 minutos, à 3500rpm. Neste momento duas colunas puderam ser observadas, na parte superior a coluna de creme e na inferior a coluna de soro.
Para calcular o teor de creme foi usada a seguinte fórmula:
% de Creme = Coluna de Creme (mm) x 100 ÷ Coluna Total (mm)
Para calcular o teor de gordura foi usada a seguinte fórmula:
% de Gordura = (% de Creme – 0,59) ÷ 1,46
Para calcular o conteúdo energético total foi usada a seguinte fórmula:
6.3.3.2. Determinação da composição dos ácidos graxos do leite
materno ao 21° dia e do cérebro de filhotes ao M0
A extração lipídica, saponificação e metilação dos ácidos graxos foram realizadas, em duplicata, partindo de uma alíquota de 0,2g ou 200µl de amostra (tecido ou leite) de acordo com o método de LEPAGE & ROY (1987). Os ésteres metílicos foram quantificados por cromatografia gás-líquido, utilizando-se um cromatógrafo Perkin Elmer autosystem XL equipado com detector de chama ionizável e o software Turbochrom Navigator. Os ácidos graxos foram separados com coluna capilar SP 2560 (Supelco, USA) com 100mm x 0,25mm x 0,20µm. O hidrogênio foi utilizado como gás de arraste. As temperaturas de injeção e detecção foram respectivamente, 260°C e 280°C. A temperatura da corrida foi programada para iniciar a 135°C durante 5 minutos com subida de 2°C/minuto até 195°C. A partir daí, com subida de 4°C até alcançar 240°C, permanecendo por 2,5 minutos. O tempo total da corrida somou 45 minutos. A pressão do gás arraste foi de 32 Psi. A razão de split foi de 1:70. Os ésteres foram identificados por comparação com seu tempo de retenção com padrões conhecidos (Sigma, Supelco). Os resultados foram expressos como percentual de ácidos graxos totais.
Ética
6.3.4. Análise estatística
Os resultados das diferentes análises foram expressos como média e desvio padrão. Esses cálculos foram realizados através do programa Microsoft Excel, versão 5.0. Já, as análises de variância (ANOVA - One Way) foram feitas utilizando- se o Teste de Scheffe e para a determinação da diferença entre as variáveis aplicou- se o Teste de Bonferroni com o uso do Software SPSS. Todos os resultados seguiram a distribuição normal, estabelecida ao nível de p<0,05.
6.3.5.
O presente trabalho faz parte do projeto “Estudo comparativo das propriedades funcionais das sojas (GLYCINE MAX L. MERRIL) orgânica e transgênica com a semente de linhaça (LINUN USITATISSIMUM) para aumentar a qualidade de vida desde a adolescência até a velhice: Estudos em ratos”, já aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Antônio Pedro da UFF, parecer nº 188/06.
7. RESULTADOS
7.1. Qualidade protéica e perfil lipídico das rações experimentais
Ao avaliarmos a qualidade protéica através do PER (Figura 3) nota-se que o GL (2,92 ± 0,06) se mostrou semelhante a GCM (3,04 ± 0,06), e ambos inferiores, com significância estatística quando comparados a GC (3,75 ± 0,04).
Figura 3 - Protein Efficiency Ratio dos animais ao final dos 28 dias
de experimento. Letras diferentes denotam diferença estatística ao nível de p<0,05. GL- grupo linhaça, GC- grupo caseína, GCM- grupo caseína modificada; (n=6/por grupo).
Ao analisarmos a figura 4, observamos que o GL (0,30 ± 0,006) e GCM (0,31 ± 0,006) apresentaram valores de CEA semelhantes entre si, porém ambos inferiores, com significância estatística, quando comparados a GC (0,38 ± 0,004).
Figura 4 - Coeficiente de Eficácia Alimentar dos animais ao final dos 28
dias de ensaio. Letras diferentes denotam diferença estatística ao nível de p<0,05. GL- grupo linhaça, GC- grupo caseína, GCM- grupo caseína modificada; (n=6/por grupo).
A tabela 2 mostra que, nas rações experimentais (GC, GCM e GL) foram encontrados um total de 31 ácidos graxos. Porém, cabe ressaltar que neste estudo, levamos em consideração para análise e discussão, apenas os ácidos já descritos pela literatura, como influentes, de alguma forma, no desenvolvimento cerebral.
Os resultados percentuais de ácidos graxos mostram que os ácidos majoritários em ordem decrescente, para o grupo GL foram o ácido C 18:3 n-3, o C 18:1 n-9 cis, seguido pelo C 18:2 n-6 cis, enquanto que em GC e GCM, foram os ácidos graxos C 18:2 n-6 cis, C 18:1 n-9 cis e C 16:0, conforme mostra a tabela 2.
0,01 ± 0,01 0,01 ± 0,01 0,02 ± 0,01 C 8:0 0,05 ± 0,00 0,04 ± 0,00 0,02 ± 0,01 C 10:0 0,04 ± 0,03 0,01 ± 0,00 0,01 ± 0,00 C 11:0 0,06 ± 0,01 0,05 ± 0,01 0,02 ± 0,01 C 12:0 0,03 ±0,01 0,02 ± 0,02 0,04 ± 0,04 C 13:0 0,21 ± 0,04 0,40 ± 0,36 1,41 ± 0,84 C 14:0 0,01 ± 0,00 0,02 ± 0,02 0,02 ± 0,01 C 14:1 0,65 ± 0,42 0,15 ± 0,16 0,31 ± 0,11 C 15:0 0,02 ± 0,02 0,02 ± 0,02 0,02 ± 0,01 C 15:1 12,92 ± 0,20 12,63 ± 0,12 8,09 ± 0,23 C 16:0 C 16:1 b a c C 17:0 0,12 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,09 ± 0,02 C 17:1 0,04 ± 0,02 0,03 ± 0,02 0,14 ± 0,02 C 18:0 0,23 ± 0,14 0,22 ± 0,16 0,27 ± 0,01 C 18:1 n-9 trans 3,49 ± 0,04 3,44 ± 0,01 5,24 ± 0,10 C 18:1 n-9 cis 0 ± 0 0,01 ± 0,00 0,12 ± 0,03 0,04 ± 0,01 0,01 ± 0,00 0,03 ± 0,04 C 18:2 n-6 cis 14,41 ± 0,09 53,69 ± 0,15 53,11 ± 0,14 C 20:0 0 ± 0 0,34 ± 0,01 0,31 ± 0,02 C 18:3 n-6 0,14 ± 0,05 0,21 ± 0,01 0,19 ± 0,01 C 20:1 n-9 0 ± 0 0,10 ± 0,07 0,15 ± 0,03 C 18:3 n-3 46,15 ± 0,64 5,38 ± 0,19 5,44 ± 0,03 C 20:3 n-6 0,06 ± 0,01 0,06 ± 0,00 0,05 ± 0,00 C 22:1 n-9 0,05 ± 0,01 0,08 ± 0,02 0,08 ± 0,01 C 20:3 n-3 0,13 ± 0,02 0,41 ± 0,01 0,36 ± 0,04 C 20:5 n-3 (EPA) 0,05 ± 0,01 0,08 ± 0,08 0,03 ± 0,01 C 24:0 0,14 ± 0,02 0,09 ± 0,08 0,16 ± 0,01 C 22:4 n-6 0,01 ± 0,00 0,04 ± 0,04 0,02 ± 0,01 C 24:1 n-9 0,01 ± 0,01 0,02 ± 0,01 0,02 ± 0,00 C 22:5 n-3 0,04 ± 0,04 0,01 ± 0,01 0,02 ± 0,01 0,02 ± 0,01 0,01 ± 0,00 0,02 ± 0,02 b a a a a b c a b c a b c a b b a a b a a b a a b a a c a b b a ab b a b C 22:6 n-3 (DHA) ab a b
Tabela 2 - Composição percentual de ácidos graxos nas rações experimentais.
Ácidos Graxos GL GC GCM c a b b a b c a b b a a b a b b a b b a a b a a b a a C 18:2 n-6 trans 22,98 ± 0,26 22,34 ± 0,26 22,13 ± 0,10
Os resultados são expressos como médias com estimativas dos desvio padrão. Resultados expressos em percentagem do total de ácidos graxos. Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Negrito = percentagem dos ácidos majoritários nas diferentes rações. GL – Grupo Linhaça, GC – Grupo Caseína, GCM – Grupo Caseína Modificada; (n=6/por grupo).
do
7.2.
Crematócrito
e
valor
energético do leite materno
Ao crematócrito do leite materno, o GL apresentou um maior percentual de gordura (31,79 ± 0,20), ou seja, um maior acúmulo lipídico, quando comparado aos demais grupos GC (23,10 ± 0,65) e GCM (28,65 ± 0,38); sendo este último, também superior ao GC. Houve diferença estatística significante entre todos, como observado na figura 5.
Figura 5 – Crematócrito do leite materno ao 21° dia. Letras diferentes denotam
diferença estatística ao nível de p<0,05. GL- grupo linhaça, GC- grupo caseína, GCM- grupo caseína modificada; (n=6/por grupo).
Observando as médias referentes ao valor energético (Kcal/100ml) leite materno (Tabela 3), observa-se que GL e GCM (228,85 ± 5,93 e 226,90 ± 6,07 respectivamente
)
apresentaram valores superiores à GC (186,57 ± 5,57), porém com diferença estatisticamente significante somente entre GL e GC.b
a
b
Tabela 3 - Valor energético do leite materno ao 21°dia.
Valor energético do leite materno
GRUPOS (Kcal/100ml)
GL 228,85 ± 5,93
GC 186,57 ± 5,57
GCM 226,90 ± 6,07
Letras sobrescritas diferentes denotam diferença significativa (p<0,05). GL- grupo linhaça, GC- grupo caseína, GCM- grupo caseína modificada (n=6/por grupo).
7.3. Composição de ácidos graxos do leite materno
A tabela 4 mostra que, no leite materno dos animais do GC, GCM e GL foram encontrados um total de 36 ácidos graxos. Porém, cabe ressaltar que neste estudo, levamos em consideração para análise e discussão, apenas os ácidos já descritos pela literatura, como influentes, de alguma forma, no desenvolvimento cerebral.
Como mostrado na tabela 4, o leite materno do GL apresentou teor de 21,15% do ácido alfa-linolênico C 18:3 n-3, sendo superior estatisticamente ao leite dos demais grupos, onde o GC apresentou 1,71% e o GCM 1,58%. Outro resultado de grande relevância é o aumento significativo nas concentrações dos ácidos graxos C 20:5 n-3 (EPA) e C 22:6 n-3 (DHA), encontrados no GL, em comparação aos demais grupos (GC e GCM).
1,87 ±1,20 2,99 ± 1,55 2,71 ± 1,43 C 8:0 6,57 ± 4,65 8,58 ± 3,31 9,57 ± 4,56 C 10:0 0,07 ± 0,07 0,04 ± 0,02 0,06 ± 0,05 C 11:0 5,68 ± 4,82 6,38 ± 3,27 7,11 ± 3,09 C 12:0 0,03 ±0,02 0,02 ± 0,01 0,03 ± 0,01 C 13:0 5,69 ± 4,88 4,28 ± 2,28 4,99 ± 2,02 C 14:0 0,02 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,01 ± 0,01 C 14:1 0,10 ± 0,05 0,13 ± 0,02 0,20 ± 0,10 C 15:0 0,04 ± 0,02 0,04 ± 0,01 0,02 ± 0,01 C 15:1 20,63 ± 1,67 18,00 ± 1,91 13,73 ± 2,79 C 16:0 1,90 ± 1,02 2,21 ± 0,78 0,93 ± 0,38 C 16:1 0,08 ± 0,02 0,09 ± 0,02 0,19 ± 0,06 C 17:0 0,05 ± 0,02 0,06 ± 0,02 0,11 ± 0,06 C 17:1 3,53 ± 0,74 3,52 ± 0,45 4,54 ± 0,73 C 18:0 0,03 ± 0,03 0,05 ± 0,06 0,03 ± 0,02 C 18:1 n-9 trans 21,32 ± 6,76 23,38 ± 5,04 20,90 ± 5,99 C 18:1 n-9 cis 0,04 ± 0,02 0,06 ± 0,01 0,03 ± 0,04 C 18:2 n-6 trans 26,23 ± 4,20 24,68 ± 3,14 9,60 ± 1,95 C 18:2 n-6 cis 0,11 ± 0,06 0,09 ± 0,02 0,05 ± 0,02 C 18:3 n-6 0,30 ± 0,31 0,27 ± 0,09 0,06 ± 0,02 C 20:1 n-9 1,58 ± 0,52 1,71 ± 0,62 21,15 ± 4,35 C 18:3 n-3 0,05 ± 0,02 0,07 ± 0,02 0 ± 0 C 21:0 1,07 ± 1,08 0,58 ± 0,28 0 ± 0 C 20:2 0,03 ± 0,02 0,03 ± 0,01 0 ± 0 C 22:0 0,11 ± 0,12 0,06 ± 0,03 0,21 ± 0,09 C 20:3 n-6 0,26 ± 0,06 0,28 ± 0,05 0,24 ± 0,17 C 22:1 n-9 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,43 ± 0,08 C 20:3 n-3 1,44 ± 0,68 1,42 ± 0,21 0,30 ± 0,11 C 20:4 n-6 (AA) 0 ± 0 0 ± 0 0,10 ± 0,01 C 23:0 0 ± 0 0 ± 0 0,14 ± 0,06 C 22:2 0,08 ± 0,02 0,08 ± 0,01 0,99 ± 0,29 C 20:5 n-3 (EPA) 0,07 ± 0,08 0,08 ± 0,05 0,07 ± 0,04 C 24:0 0,41 ± 0,39 0,33 ± 0,07 0,12 ± 0,13 C 22:4 n-6 0,12 ± 0,11 0,06 ± 0,02 0,02 ± 0,01 C 24:1 n-9 0,19 ± 0,13 0,14 ± 0,03 0,94 ± 0,27 C 22:5 n-3 0,32 ± 0,15 0,27 ± 0,03 0,48 ± 0,10 C 22:6 n-3 (DHA)
Tabela 4 - Composição percentual de ácidos graxos do leite materno.
Ácidos Graxos GL GC GCM b a b b a a b a a c a b b a a b a a b ab a b a a c a b b a a b a b b a ab b a a b a a b a a b a a b a ab b a ab b a ab b a a b a a b a a b a a b a a b a a b a a b a a
Os resultados são expressos como médias com estimativas dos desvio padrão. Resultados expressos em percentagem do total de ácidos graxos. Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Negrito = percentagem de 18:3n-3 no leite materno dos diferentes grupos e a expressão significantemente maior do EPA e do DHA no GL . GL – Grupo Linhaça, GC – Grupo Caseína, GCM – Grupo Caseína Modificada (n =6/por grupo).
b a a
b a a
b a ab
Tabela 5 - Somatória do percentual de grupos de ácidos graxos no leite materno das mães dos diferentes grupos.
Ácidos graxos GL GC GCM
∑ n-6 10,01 ± 2,03 26,43 ± 3,42 28,07 ± 4,95
∑ n-3 23,01 ± 4,33 2,15 ± 0,62 2,12 ± 0,34
∑ LC-PUFA 3,26 ± 0,77 2,26 ± 0,33 2,46 ± 1,30 Os resultados são expressos como médias com estimativas do desvio padrão. Resultados expressos em percentagem do total de ácidos graxos. Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Negrito=percentagem de ∑n-3 no leite materno dos diferentes grupos. GL – Grupo Linhaça, GC – Grupo Caseína, GCM – Grupo Caseína Modificada; (n=6/por grupo).
Ao observarmos a tabela 5, notamos que o leite materno do GL apresentou teor significativamente maior do somatório de ácidos da família n-3 (23,01 ± 4,33%), quando comparado à CG e GCM (2,15 ± 0,62% e 2,12 ± 0,34%, respectivamente. Ao analisarmos os somatórios de LC-PUFA, notamos que o GL apresentou resultado maior (3,26 ± 0,77), com significância estatística, quando comparado a GC (2,26 ± 0,33); porém à análise do somatório de n-6, observamos que o GL apresentou valor significativamente menor (10,01 ± 2,03), quando comparado aos demais grupos, GC e GCM (26,43 ± 3,42 e 28,07 ± 4,95, respectivamente).
7.4.
Peso
corporal,
peso cerebral
e peso cerebral
relativo de
filhotes no M0
Observando-se as médias referentes ao peso cerebral dos animais no pós- natal imediato (Tabela 6), nota-se que o GL apresentou a maior média numérica (0,25 ± 0,009g), tendo apresentado significância estatística quando comparado aos demais grupos, GC (0,18 ± 0,006g
)
e GCM (0,20 ± 0,008g).Em relação ao peso corporal dos animais, ainda no pós-natal imediato (Tabela 6), não houve diferença estatística entre os grupos estudados.
Já o peso cerebral relativo (Tabela 6 e Figura 6), neste momento zero, apresentou maior valor percentual com significância estatística em GL (4,68 ± 0,21g), comparado aos demais grupos GCM (3,56 ± 0,18g) e GC (3,42 ± 0,14g). Não houve diferença estatística entre os dois últimos grupos.
b a b
a a a
a a a
Tabela 6 - Peso cerebral (P. Cerebral), peso corporal (P. Corporal), peso cerebral relativo (P. Cerebral Relativo) de filhotes no M0 do ensaio.
GRUPOS P. Cerebral (g) P. Corporal (g) P. Cerebral Relativo (%)
GL 0,25 ± 0,009 5,55 ± 0,10 4,68 ± 0,21
GC 0,18 ± 0,006 5,56 ± 0,24 3,42 ± 0,14
GCM 0,20 ± 0,008 5,62 ± 0,11 3,56 ± 0,18 Letras sobrescritas diferentes denotam diferença significativa (p≤0,05).
GL- grupo linhaça, GC- grupo caseína, GCM- grupo caseína modificada (n=6/por grupo).
7.5. Composição de ácidos graxos do cérebro dos filhotes ao M0
No cérebro de filhotes ao M0, foram encontrados um total de 30 ácidos graxos (Tabela 7). Porém, cabe ressaltar que neste estudo levamos em consideração para análise e discussão, apenas os ácidos já descritos pela literatura, como influentes, de alguma forma, no desenvolvimento cerebral.
0,08 ± 0,10 0 ± 0 0,01 ± 0,00 C 11:0 0,02 ± 0,01 0,01 ± 0,00 0 ± 0 C 12:0 0,07 ±0,04 0,05 ± 0,04 0,02 ± 0,01 C 13:0 1,57 ± 0,01 1,64 ± 0,02 1,60 ± 0,09 C 14:0 0,08 ± 0,07 0,10 ± 0,01 0,07 ± 0,04 C 14:1 1,70 ± 0,49 2,00 ± 0,14 2,24 ± 0,18 C 15:0 0,04 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,03 ± 0,02 C 15:1 29,33 ± 0,05 29,78 ± 0,01 30,00 ± 1,27 C 16:0 1,84 ± 0,13 1,87 ± 0,19 1,79 ± 0,06 C 16:1 1,84 ± 0,11 1,90 ± 0,11 2,17 ± 0,01 C 17:0 1,24 ± 0,62 1,47 ± 0,31 1,68 ± 0,31 C 17:1 16,82 ± 0,40 16,35 ± 0,38 15,54 ± 0,24 C 18:0 C 18:1 n-9 trans a a b C 18:1 n-9 cis 0,06 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,04 ± 0,01 C 18:1 n-9 isômero 10,32 ± 0,14 10,69 ± 0,33 11,98 ± 0,17 C 18:2 n-6 trans 3,40 ± 0,04 3,29 ± 0,41 3,70 ± 0,16 C 18:2 n-6 cis 0,06 ± 0,01 0 ± 0 0,06 ± 0,00 C 18:3 n-6 0,81 ± 0,02 0,77 ± 0,02 1,11 ± 0,12 C 18:3 n-3 0,07 ± 0,01 0,05 ± 0,01 0,07 ± 0,01 C 20:3 n-6 0,15 ± 0,01 0,11 ± 0,06 0,08 ± 0,02 C 22:1 n-9 0,08 ± 0,02 0 ± 0 0,11 ± 0 C 20:3 n-3 0,09 ± 0,01 0,12 ± 0,04 0,08 ± 0,02 C 20:4 n-6 (AA) 0,31 ± 0,03 0 ± 0 0,51 ± 0,04 C 22:2 12,87 ± 0,11 12,57 ± 0,25 7,91 ± 0,29 C 20:5 n-3 (EPA) 0,05 ± 0,01 0,04 ± 0,00 1,31 ± 0,15 C 24:0 0,13 ± 0,02 0,15 ± 0,01 0,05 ± 0,00 C 22:4 n-6 0,06 ± 0,01 0,01 ± 0,00 0,04 ± 0,03 C 24:1 n-9 3,32 ± 0,13 3,42 ± 0,09 0,95 ± 0,03 C 22:5 n-3 2,71 ± 0,03 3,01 ± 0,11 0,18 ± 0,05 C 22:6 n-3 (DHA) 0,10 ± 0,06 0,15 ± 0,01 2,41 ± 0,22 10,85 ± 0,53 10,41 ± 0,06 14,33 ± 0,25
Tabela 7 - Composição percentual de ácidos graxos do cérebro de filhotes ao M0.
Ácidos Graxos GL GC GCM b a b a a b b ab a ab a b b a ab b a a b a ab ab a b b a a b a a b a a c a b b a b b a b c a b b a b b ab a c a b b a ab c a b c a b c a b c a b b a b b a a c a b c a b c a b
Os resultados são expressos como médias com estimativas do desvio padrão. Resultados expressos em percentagem do total de ácidos graxos. Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Negrito=percentagem dos ácidos graxos majoritários presentes no cérebro de filhotes dos diferentes grupos. GL – Grupo Linhaça, GC – Grupo Caseína, GCM – Grupo Caseína Modificada; (n=6/por grupo).
Os resultados percentuais de ácidos graxos mostram que os ácidos majoritários em ordem decrescente, para o grupo GL: o ácido C16:0, o C18:0, seguido pelo C22:6 n-3 (DHA), enquanto que nos GC e GCM, foram os mesmos, com exceção do C20:4 n-6 (AA), conforme mostra a tabela 7. Os cérebros dos
b a a
c a b
c a b
c a b
c a b
filhotes pertencentes ao GL apresentaram teor do ácido C22:6 n-3 (DHA), significantemente maior que os cérebros dos filhotes pertencentes aos demais grupos (GL 14,33 ± 0,25%, GC 10,41 ± 0,06% e GCM 10,85 ± 0,53%).
Tabela 8- Somatória do percentual de grupos de ácidos graxos totais do cérebro de filhotes, no M0, provenientes de mães alimentadas com as três rações experimentais.
Ácidos graxos GL GC GCM ∑ n-6 9,96 ± 0,44 16,75 ± 0,14 16,99 ± 0,25 ∑ n-3 17,32 ± 0,03 10,67 ± 0,01 11,40 ± 0,61 ∑ PUFA 1,25 ± 0,15 0,93 ± 0,09 1,03 ± 0,05 ∑ EFA 1,18 ± 0,14 0,88 ± 0,06 0,96 ± 0,04 ∑ LC-PUFA 26,15 ± 0,33 26,69 ± 0,22 27,56 ± 0,41 Os resultados são expressos como médias com estimativas do desvio padrão. Resultados expressos em percentagem do total de ácidos graxos. Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). GL – Grupo Linhaça, GC – Grupo Caseína, GCM – Grupo Caseína Modificada; (n=6/por grupo).
Ao observarmos a tabela 8, notamos que os cérebros de filhotes pertencentes ao GL apresentaram teor de 17,32 ± 0,03% do somatório de ácidos graxos da família n-3, enquanto os outros grupos (GC e GCM) apresentaram teores menores 10,67 ± 0,01% e 11,40 ± 0,61%, respectivamente, sendo a diferença significativa. O mesmo ocorre ao analisarmos os somatórios de PUFA (GL 1,25 ± 0,15; GC 0,93 ± 0,09; GCM 1,03 ± 0,05) e EFA (GL 1,18 ± 0,14; GC 0,88 ± 0,06; GCM 0,96 ± 0,04), onde os cérebros do GL apresentaram percentuais superiores, com significância estatística, quando comparados aos cérebros dos demais grupos.
Ao observarmos, o somatório de LC-PUFA notamos que o GL apresentou resultado inferior, quando comparado aos demais grupos (GL 26,15 ± 0,33%, GC 26,69 ± 0,22% e GCM 27,56 ± 0,41%), com diferença estatística entre todos. Já ao observarmos o somatório de n-6, observamos também um resultado menor no GL, quando comparado aos demais grupos (GL 9,96 ± 0,44%, GC 16,75 ± 0,14% e GCM 16,99 ± 0,25%).
7.6.
Peso
corporal,
peso cerebral
e peso cerebral
relativo de ratos
filhotes no M30
Observando-se as médias referentes ao peso cerebral dos animais aos 30 dias de ensaio (Tabela 9), nota-se que não houve diferença estatística entre os grupos.
Em relação ao peso corporal dos animais, ainda ao final do ensaio (Tabela 9), o GL (47,3 ± 3,2g) e o GCM (43,9 ± 1,5g)apresentaram as menores médias, tendo mostrado valores estatisticamente inferiores aos encontrados no GC (64,5 ± 0,4g), o mesmo ocorrendo com o peso cerebral relativo (GL 2,89 ± 0,16g, GC 2,15 ± 0,12g e GCM 3,16 ± 0,12g).
a a b
a b a
a a b
Tabela 9 - Peso cerebral (P. Cerebral), peso corporal (P. Corporal) e peso cerebral relativo (P. Cerebral Relativo) de filhotes no M30 do ensaio.
GRUPOS P. Cerebral (g) P. Corporal (g) P. Cerebral Relativo (%)
GL 1,34 ± 0,03 47,3 ± 3,2 2,89 ± 0,16
GC 1,39 ± 0,08 64,5 ± 0,4 2,15 ± 0,12
GCM 1,39 ± 0,03 43,9 ± 1,5 3,16 ± 0,12 Letras sobrescritas diferentes denotam diferença significativa (p<0,05). GL- grupo linhaça, GC- grupo caseína, GCM- grupo caseína modificada (n=6).
8. DISCUSSÃO
A energia fornecida pelos diversos nutrientes nas espécies animais é essencial para a manutenção, crescimento e reprodução (HEPHER, 1993). Para alguns animais, a fonte de gordura utilizada na ração pode influenciar significativamente o crescimento e utilização dos nutrientes. A energia, de modo geral, provém do uso da proteína, lipídeos e carboidratos. Os lipídeos são a fonte de energia melhor utilizada pelos animais, além de fornecer energia metabólica, são requeridos para a manutenção da estrutura e função da membrana celular e fornecem ácidos graxos essenciais aos animais (HAYASHI et al., 2004).
No presente estudo, a ração à base de linhaça, apresentou um maior teor de do ácido alfa-linolênico, superior estatisticamente, quando comparada as demais rações. Além deste ácido, esta ração de linhaça apresentou valores superiores,
também no que diz respeito a somatórias de ácidos da família n-3, de PUFA e EFA,
onde ela apresentou percentuais superiores, quando comparada as demais rações.
Essas diferenças são devido à composição da semente de linhaça, que apresenta elevada percentagem (57%) de ácidos graxos da série n-3, que ocasionaram este acréscimo no percentual (TURATTI, 2001).
Este resultado vem mostrar, que provavelmente, pode-se direcionar o perfil em ácidos graxos do produto final de acordo com a fonte de lipídeo empregada, devido às diferenças nas quantidades destes nas composições dos diferentes óleos, inclusive no que se refere ao teor de ácidos graxos das séries ω-3 no qual a linhaça é a oleaginosa mais rica (VISENTAINER et al., 2003).
Resultados semelhantes foram encontrados por VISENTAINER et al. (2003), onde a ração preparada com óleo de linhaça também apresentou concentrações bastante superiores do ácido alfa linolênico (18:3 n-3), quando comparadas a rações sem a presença da oleaginosa.
A maturação do sistema nervoso central, em humanos, tem início na fase intra-uterina e persiste até os 7 anos, apresentando maior intensidade nos primeiros 2 anos de vida (PATIN et al., 2006). Já em ratos, o início também se dá na fase intra-uterina, porém persiste apenas até o 30° dia de vida (REINIS & GOLMAN,
1980). O processo morfogênico, diretamente associado à função do cérebro, requer uma oferta de ácidos graxos específica, especialmente de AA e DHA. Esse processo torna a nutrição materna essencial ao feto durante a gestação e lactação, pois há aumento funcional e bioquímico das demandas maternas de PUFA (XIANG et al., 1999; KOLETZKO et al., 2001).
Os PUFAs da série ômega-3 são encontrados no cérebro e na retina e participam do crescimento contribuindo para o processo de mielinização e desenvolvimento da função da visão, no desenvolvimento psicomotor e em vários aspectos da função neural em relação ao comportamento (MARTINEZ, 1992; PRESA-OWENS et al., 1996).
Com o nascimento, esses EFAs são transferidos aos lactentes em quantidades suficientes pelo leite materno de mães com adequado estado nutricional. Em países em desenvolvimento, onde as condições de saúde e nutrição são precárias, possíveis deficiências podem acarretar prejuízos nos processos de elongação e dessaturação, ou seja, no processo de formação de AA e DHA a partir dos ácidos linoléico e linolênico, respectivamente (MARTINEZ, 1992; XIANG et al., 1999; KOLETZKO et al., 2001).
Evidências demonstram a influência da dieta na composição do leite materno. A alimentação materna é de grande importância para o adequado desenvolvimento do feto e, posteriormente, para o lactente. Nos últimos anos, estudos foram e
continuam sendo realizados com o objetivo de conhecer os fatores que podem afetar a qualidade do leite materno e suas possíveis conseqüências (ROCQUELIN et al., 1998; SAUERWALD et al., 2001).
Sabe-se que a mudança da qualidade da gordura da dieta materna pode influenciar o padrão de EFA do leite produzido, dentro de 2 a 3 dias (INSULL et al., 1959). PRESA-OWENS et al. (1996) estudando o padrão de EFA do leite de 40 nutrizes na Espanha, referiram que, apesar de o peixe apresentar maior nível de EPA do que DHA, a composição do leite de mulheres que consumiram grandes quantidades de peixe apresentou níveis maiores de DHA. Estudo de HENDERSON
et al. (1992), utilizando óleo de peixe como suplemento para nutrizes, mostrou que o
consumo de 1g por dia de PUFA da série ω-3 resultou em valores médios de 0,08% de EPA, 0,14% de DPA e 0,37% de DHA no leite secretado.
No presente estudo, o crematócrito do leite materno de ratas alimentadas com ração à base de linhaça (GL), apresentou um maior acúmulo lipídico, quando comparado aos demais grupos que receberam rações à base de caseína (GC e GCM). Outros trabalhos (CONNOR, 1999; LAYNE et al., 1996; UAUY & VALENZUELA, 2000) que falam da importância de uma dieta rica em ácidos graxos essenciais no período de gestação e lactação, devido a transferência dos mesmos, oriundos da dieta, para o leite materno, vem confirmar o resultado encontrado neste estudo. Este, ainda é reforçado pelo fato do GL ter apresentado valor de crematócrito superior ao GCM, que apesar de ter recebido ração à base de caseína, possuía a mesma concentração de lipídeos do GL, reforçando, desta forma, que o
ácido ômega-3, presente em abundância na semente de linhaça (TURATTI, 2000), interferiu diretamente no maior acúmulo lipídico.
Enquanto muitos grupos populacionais preferem consumir dietas ricas em proteína animal, o custo elevado e a disponibilidade limitada destas proteínas, obrigam a maioria das nações de terceiro mundo a utilizar as proteínas de origem vegetal, tornando a linhaça um potencial substituto destas proteínas nos alimentos (SOUZA et al., 2000; ROE, 1992).
O lipídeo é o componente em maior quantidade no leite, perfazendo mais de 50% de suas quilocalorias (Kcal) totais. Uma parte deste nutriente é captado da circulação, onde é encontrado em grandes concentrações provenientes da dieta, e outra é produzida na própria glândula mamária, a qual utiliza principalmente a glicose para a lipogênese (LEITE et al., 2002).
Ao avaliarmos as médias referentes ao valor energético do leite materno (Kcal/100ml) encontradas neste trabalho, observa-se que o GL apresentou resultado superior aos demais grupos, porém com significância estatística somente quando comparado ao GC
