1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
DAFNE BORGO
“Produção de Artemia adulta em cultivos intensivos sob
diferentes dietas para servir de alimento vivo em larvicultura
de polvos”
PONTAL DO PARANA 2011
2 DAFNE BORGO
Produção de Artemia adulta em cultivos intensivos sob diferentes dietas
para servir de alimento vivo em larvicultura de polvos
PONTAL DO PARANA 2011
Monografia apresentada à disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso,como requisito parcial à conclusão do curso Superior de Tecnologia em Aquicultura, Setor de Ciências de Terra, Universidade Federal do Paraná
3 Dedico este trabalho a minha família por todo apoio dedicado a mim e a todos que tenham algum interesse pela Aquicultura.
4 AGRADECIMENTOS
A todos que participaram de alguma forma direta ou indiretamente para a realização deste trabalho...
A minha Orientadora Prof° Dra Érica A. G. Vidal, por me convidar à participar do Laboratório de cultivo de Cefalópodes e Ecologia Experimental, bem como me auxiliar durante toda a realização deste trabalho.
Ao Prof° Dr° Luiz Mafra Jr. pelo apoio nos dias iniciais e acompanhamento do experimento , com dicas e ajuda em cálculos necessários com as microalgas.
Ao Prof° Dr° José Guilherme Bersano, pelas dicas e auxilio durante a realização do experimento, bem como por ceder seu laboratório e equipamentos essenciais para a realização deste.
A Prof° Dra Hedda Elizabeth Kolm por ceder equipamentos de seu laboratório e assim tornar possível a realização deste trabalho.
Ao mestrando José Hugo pela ajuda com os scripts do R e análises estatísticas!!!
A Técnica de Laboratório Vanessa Coquemala Bonilauri pelo cultivo das preciosas microalgas.
A todos os alunos da primeira turma do curso de Aquicultura
A todos os companheiros do Laboratório de Cultivo de Cefalópodes e Ecologia Experimental A todos os professores do curso de Aquicultura que se esforçam para torná-lo cada vez melhor...
A todas as pessoas muito especiais que fizeram parte essencial durante estes três anos de Faculdade pela parceria, amizade, risadas,banquetes gastronômicos e dias de sol e chuva... Nina, Gabi, Mah, Naths, Nanessa, Jay, Fer... Quero agradecer também ao meu companheiro amor e amigo, Icaro nestes quase três anos, por todos os momentos bons e difíceis que passamos juntos e que nos fizeram e fazem crescer.
Vocês são muito importantes pra mim. Amo vocês! Obrigada por tudo!!! A Laíza e a Bruna pelos cafés da tarde e risadas na reta final deste trabalho
Quero também agradecer muitíssimo a minha família, que mais uma vez me apoiou e acreditou em minha capacidade, evolução como pessoa, como profissional e sempre me deu o suporte para seguir em frente!! Amo muito todos vocês!
Por fim agradeço as oportunidades, experiências, sentimentos, dedicação, trabalho e realização que todos me propiciaram.
Obrigado!!!!!!
5 A cada passo dado
Uma Conquista... Uma Vitória...
Uma Perda.... Um Aprendizado... Não sabemos o que vem pela
frente...
Mas nunca deixe de caminhar!
6 LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.(A) Cistos de artêmia hidratados (200µm); (B) Náuplio de artêmia (500µm);(C) Metanáuplio
enriquecido(900µm);(D) artêmia enriquecida em estagio pré adulto(4,5mm)...16
FIGURA 2. Esquema da utilização de Artêmia como vetor de transferência de nutrientes específicos para larvas de organismos marinhos...17
FIGURA 3. Crescimento da Artêmia ...18
FIGURA 4 . Esquema da disposição dos tratamentos no experimento...20
FIGURA 5 . Composição do meio de cultivo de microalgas...22
FIGURA 6. Amostra de Rhodomonas lens para determinação do biovolume...23
FIGURA 7 . Amostra de Thalassiossira weisflogii para determinação do biovolume...23
FIGURA 8. Rotina de Enriquecimento de náuplios...24
FIGURA 9. Crescimento em comprimento de Artemia sp. submetida a três dietas microalgais. Valores são médias de 30 organismos ± Desvio Padrão de cada dieta. ...28
FIGURA 10. Crescimento em peso seco de Artemia sp. cultivada com a microalga Rhodomonas lens. Valores são médias de 300 organismos ± Desvio Padrão. ...29
FIGURA 11. Crescimento em peso seco de Artemia sp. cultivada com a dieta MIX (50% Rhodomonas lens + 50% Thalassiossira weisflogii). Valores são médias de 300 organismos ± Desvio Padrão. ...29
FIGURA 12. Crescimento em peso seco de Artemia sp. cultivada com a microalga Thalassiossira weisflogii. Valores são médias de 300 organismos ± Desvio Padrão. ...30
FIGURA13. Fêmea da dieta Rho com ovos aos 22 dias de cultivo...31
FIGURA 14. Fêmea da dieta Rho com marsúpio após 24° dia de cultivo...31
FIGURA 15. Fêmea da Dieta Mix com marsúpio no 26° dia de cultivo...32
FIGURA 16. Fêmea da dieta Tha com ovos no 28° dia de cultivo...32
FIGURA 17. Sobrevivência de Artemia sp. cultivadas sob diferentes dietas microalgais...33
FIGURA 18.Boxplot dos valores de comprimento (mm) de Artemia sp. cultivadas em três dietas microalgais.Mix=50+50%,Rho=R lens , Tha=T. weisflogii...34
FIGURA 19.Boxplot dos valores de Peso seco (mg) de Artemia sp. cultivadas em três dietas microalgais.Mix=50+50%,Rho=R lens , Tha=T. weisflogii ...36
FIGURA 20. Boxplot com os valores médios de sobrevivência das artêmias cultivadas em três dietas microalgais Mix=50+50%,Rho=R lens , Tha=T. weisflogii ...37
FIGURA 21. Boxplot dos valores médios ao residual de células dos cultivos de Artêmia entre as três dietas microalgais a partir de 7000 cel/ml...38
FIGURA 22. : Boxplot dos valores médios ao residual de células dos cultivos de Artêmia entre as três dietas microalgais a partir de 8500 cel/ml...38
7 LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Principais gêneros de microalgas e cianobactérias utilizadas em
aquicultura...19
TABELA 2. Distribuição Esquemática dos tratamentos...20
TABELA 3. Valores dos parâmetros Físico - químicos na dieta Rho...27
TABELA 4. Valores dos parâmetros Físico químicos na dieta Tha...27
TABELA 5. Valores dos parâmetros Físico químicos na dieta Mix...27
TABELA 6. Teste da ANOVA para as medições de Crescimento das artêmias para as três dietas microalgais...34
TABELA 7. Valores do Teste de Tukey relacionando as médias entre as três dietas microalgais...35
TABELA 8. Teste ANOVA para medições de Peso seco das artêmias para três dietas microalgais...35
TABELA 9.Teste de Tukey para as médias de peso seco das artêmias entre as três dietas microalgais...35
TABELA 10. Teste ANOVA para sobrevivência das artêmias cultivadas em três dietas microalgais ...36
TABELA 11. Teste da ANOVA para o residual de células dos cultivos de Artêmia entre as três dietas microalgais a partir de 7000 cel/ml...37
TABELA 12. Teste da ANOVA para o residual de células dos cultivos de Artêmia entre as três dietas microalgais a partir de 8500 cel/ml...38
8 ANEXOS
Anexo 1. Residual da contagem células remanescentes no cultivo de Artemia sp. em três diferentes dietas a partir de 7000 cel/ml...47 Anexo 2. Residual da contagem células remanescentes no cultivo de Artemia sp. em três diferentes dietas a partir de 8500 cel/ml...47
9 RESUMO
Os polvos são organismos aquáticos que têm gerado grande interesse em razão do seu alto valor de mercado e grande potencial para aquicultura, sendo apontado como uma das espécies mais promissoras para a aquicultura. No entanto, o cultivo desde a fase embrionária até sub adulto tem sido realizado com sucesso somente em escala experimental, assim, o cultivo de polvos é restrito à engorda de animais capturados na natureza. Atualmente, o gargalo tecnológico para o cultivo de polvos, reside nas altas taxas de mortalidade, registradas durante a larvicultura, sendo que os principais problemas estão na falta de conhecimento sobre as necessidades nutricionais das paralarvas, e influenciam nas taxas de sobrevivência e crescimento. Objetivo deste trabalho foi avaliar a sobrevivência e o crescimento de Artemia sp., cultivada sob três diferentes dietas microalgais. Em um contexto mais amplo, a proposta é desenvolver um protocolo de produção de artêmias de boa qualidade nutricional para utilização como alimento vivo na larvicultura de polvos. Neste trabalho foram testadas três dietas, duas constituídas integralmente pelas microalgas
Rhodomonas lens e Thalassiossira weisflogii e a terceira dieta foi uma mistura de 50% de
cada microalga (Mix). O experimento durou 25 dias e foram monitorados parâmetros físico-químicos, pH, oxigênio dissolvido e salinidade. A temperatura foi mantida a 26 ± 1 ºC. Foram avaliados a cada quatro dias crescimento em peso seco e comprimento, bem como taxa de sobrevivência e maturação sexual. Os resultados obtidos em relação a comprimento, peso seco, maturação sexual e sobrevivência, demonstraram estatisticamente que o melhor desempenho foi obtido com a dieta R. lens. As artêmias submetidas a esta dieta atingiram comprimento de 8 mm (P<0,001) e 7,13 mg de peso seco (P<0,001) no último dia do cultivo, maturação sexual ao 18° de cultivo, liberação de cistos no 28° dia e sobrevivência de 82,15%. A dieta Mix apresentou resultados de comprimento 7,31mm (P<0,001), peso seco 5,49mg (P<0,05),maturação sexual no 21° dia e sobrevivência de 81,67% ao final do experimento. O comprimento das artêmias no último dia de experimento para a dieta T. weisflogii, foi de 6,88mm, peso seco de 5,24mg, maturação sexual após o 22° dia, porém fêmeas com marsúpio não foram observadas até o 28° dia de cultivo, e taxa de sobrevivência foi de 80,15%. O desempenho superior da microalga R. lens pode ser remetido aos elevados teores de proteína e lipídeos constituintes dessa microalga. A dieta Mix, se mostrou eficiente nos desempenhos relacionados a comprimento, peso seco e também maturação sexual, provavelmente, pelo efeito da diluição da microalga R. lens, que constituía em 50% a dieta. Em relação à dieta Thalassiossira weisflogii, não foram obtidos bons resultados, esta se mostrou pouco interessante para enriquecimento de artêmias, uma vez que o crescimento e maturação sexual obtidos foram lentos e estatisticamente inferiores as outras duas dietas testadas.
10 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...15
2.1 Produção e enriquecimento de Artemia sp...16
2.2 Microalgas...18
3. OBJETIVOS...19
3.1 Objetivos específicos...19
4. MATERIAIS E MÉTODOS...20
4.1 Cultivo de Microalgas...21
4.2 Protocolo para cultivo de Microalgas...21
4.3 Protocolo para Eclosão de Artêmias...24
4.4 Taxa de Sobrevivência...25
4.5 Determinação do comprimento...25
4.6 Determinação do peso seco ...25
4.7 Contagem do residual de células...26
4.8 Maturação sexual e Fecundidade...26
4.9 Análise Estatística...26
5. RESULTADOS...27
5.1 Parâmetros Ambientais...27
5.2 Crescimento em comprimento...28
5.3 Crescimento em Peso Seco...28
5.4 Maturação Sexual e Fecundidade...30
5.5 Sobrevivência...32
5.6 Residual de células...33
6. ANÁLISE ESTATÍSTICA...33
6.1 Crescimento em Comprimento...33 X
11
6.2 Crescimento em Peso seco...35
6.3 Sobrevivência ...36 6.4 Residual de células ...37 7. DISCUSSÃO...37 8. CONCLUSÃO...42 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...43 ANEXOS...47 XI
12 1. INTRODUÇAO
Os polvos (ordem Octopodida) são exclusivamente marinhos, sendo representados por várias famílias. Os polvos Octopus, são costeiros, apresentam distribuição global e são animais epibentônicos, que vivem no substrato ou próximo a este. Normalmente, estão associados a habitats rochosos ou pedregosos, onde podem encontrar refúgio e uma vasta gama de fontes alimentares. Muitas espécies de polvo também vivem amplamente distribuídas no fundo de lama ou de areia, onde muitas vezes se enterram (BOYLE et
al.,2005).
O polvo comum Octopus vulgaris é uma espécie que tem gerado grande interesse, em razão de seu alto valor de mercado e grande potencial para a Aquicultura (MAZÓN et al., 2007). Ele tem sido apontado nos últimos anos como uma das espécies mais promissoras para a aquicultura por uma série de vantagens, tais como: 1) alta taxa de conversão alimentar, incorporando de 40% a 60% do alimento ingerido (MANGOLD; BOLETZKY, 1973; WELLS, 1978; MANGOLD, 1983); 2) altas taxas de crescimento (cerca de 3-8% de taxa de crescimento diário) (MANGOLD; BOLETZKY, 1973); 3) conteúdo protéico elevado, representando 70% a 90% do peso seco da composição do seu corpo (O’DOR; WELLS, 1987) e 4) alta fecundidade, produzindo de 100 a 500 mil ovos por fêmea (WELLS, 1978; MANGOLD, 1983; IGLESIAS et al., 1997).
Na Espanha, a engorda de polvos está concentrada ao longo da Costa Atlântica e no Mediterrâneo (MAZÓN et al., 2007). Os experimentos realizados com alimentos na Galícia (NW Espanha) (IGLESIAS et al., 1997; LUACES; REY, 1999; CHAPELA et al., 2006) e no Mediterrâneo (AGUADO GIMÉNEZ; GARCÍA GARCÍA, 2002) têm mostrado resultados excelentes usando uma dieta com misturas de caranguejo, mexilhão e peixe. No entanto, o cultivo desde a fase embrionária até sub-adulto, tem sido realizado com sucesso somente em laboratório e em escala experimental (CARRASCO et al., 2003; IGLESIAS et al., 2004), significando que o cultivo de polvo é atualmente restrito à engorda de sub-adultos capturados na pesca (MAZÓN et al., 2007). Embora a pesca do polvo em todo o mundo tenha experimentado um crescimento significativo nos últimos 20 anos, a sua produção ainda se encontra longe de atender a grande demanda do mercado por este molusco.
A espécie Octopus insularis, apresenta tamanho médio a grande, com manto e cabeça largos, braços relativamente pequenos e grossos e membrana interbraquial moderadamente profunda. A superfície ventral do manto, cabeça e membrana são cobertas com pequenas papilas, e papilas maiores são observadas na superfície dorsal do manto e cabeça (LEITE, 2007). Recentemente descrita, difere morfologicamente e geneticamente do
13 e nas águas rasas do NE brasileiro. O ciclo de vida dessa espécie é comum as espécies do gênero, a longevidade é inferior a dois anos, o crescimento é rápido, seguido da maturação sexual, cópula, desova, cuidado dos embriões por parte da mãe, e morte após a eclosão dos ovos (BOYLE, 1987). Uma vez que ainda não existem informações suficientes sobre a espécie do presente estudo, foram utilizados conhecimentos sobre o polvo comum (O.
vulgaris) como base para os estudos de larvicultura que serão realizados com O. insulares.
Atualmente, o gargalo tecnológico para o cultivo de polvos em larga escala reside nas altas taxas de mortalidade registradas durante a larvicultura. Ao eclodir, alguns polvos são planctônicos, nadam ativamente e têm altas taxas metabólicas, sendo denominados de paralarvas. Os principais problemas da larvicultura residem na falta de conhecimento sobre as necessidades nutricionais das paralarvas e no ambiente físico de cultivo, os quais influenciam nas taxas de sobrevivência. (IGLESIAS et al., 2007; VIDAL et al.,2010)
O sucesso da aquicultura como bioindústria depende do desenvolvimento de alimentos que atendam todos os requerimentos nutricionais das espécies cultivadas e que apresentem viabilidade técnica e comercial para produção em larga escala (BLANCO & TACON, 1989). O desempenho de uma dieta depende de fatores como sua digestibilidade, seu conteúdo energético e sua composição (PIÑA, et al., 2004), que por sua vez, afetam diretamente a sobrevivência e o tempo de desenvolvimento larval (NEW et al., 2000). Além disso, a eficiência nutricional de um alimento larval é determinada pela sua ingestibilidade e, conseqüentemente, pelo seu tamanho e forma (CASTRO et al., 2006; AGH & SORGELOOS, 2005). Assim, apenas alimentos de tamanho apropriado para o consumo eficiente por parte dos organismos cultivados devem ser fornecidos. Entretanto, à medida que as larvas crescem, o fornecimento de alimentos maiores passa a ser necessário (DUERR et al., 1998). Quando o tamanho das presas deixa de interferir no mecanismo de ingestão, o uso de presas maiores (com um maior conteúdo energético individual) passa a ser vantajoso, pois deste modo o predador despenderá menos energia para suprir suas necessidades nutricionais do que se alimentando de várias presas menores (AGH & SORGELOOS, 2005).
Dentre os organismos utilizados como alimento vivo na larvicultura de organismos aquáticos, o cultivo de artêmias (Artemia sp.) é o mais amplamente utilizado (SCHAUER et al., 1980; BLANCO & TACON, 1989; LAVENS & SORGELOOS, 1996). As razões para este sucesso estão na praticidade e conveniência de sua obtenção, visto que os cistos são facilmente obtidos em grandes quantidades e secos, em uma fase dormente (DUERR et al., 1998). Após cerca de 24 horas de incubação, em água salgada, estes cistos eclodem,
14 liberando náuplios que podem servir diretamente de alimento para uma grande variedade de larvas de organismos marinhos (DUERR et al., 1998; LAVENS & SORGELOOS, 1996). A artêmia pode ainda, ter seu valor nutricional potencialmente melhorado através da ingestão de enriquecedores naturais ou artificiais (AGH & SORGELOOS, 2005).
Apesar dos contínuos estudos para se conseguir fechar o ciclo de vida dos polvos em cultivos, a mortalidade das paralarvas durante a fase planctônica, segue sendo quase total. A formulação de microdietas inertes, a busca por novas presas vivas e a melhora na composição de Artêmia sp., mediante as técnicas de enriquecimento apropriadas tem sido destacadas como áreas prioritárias para solucionar os problemas de cultivos das paralarvas (revisado por IGLESIAS et al., 2007).
O objetivo deste projeto foi produzir artêmias adultas com um nível nutricional adequado, obtendo uma boa taxa de sobrevivência destas para servir como alimento vivo para o cultivo de paralarvas de Octopus spp., em sistema fechado de recirculação, bem como avaliar a sobrevivência e o crescimento de Artemia sp., cultivada sob três diferentes dietas microalgais. Em um contexto mais amplo, a proposta é desenvolver um protocolo de produção de artêmias de boa qualidade nutricional para utilização como alimento vivo na larvicultura de polvos.
15 2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA
A transição da alimentação endógena para exógena é um fator crítico no cultivo de organismos aquáticos. Apesar dos maiores cuidados nos manejos empregados, as taxas de mortalidade são frequentemente altas durante o inicio da alimentação. Estas taxas podem ser creditadas aos diferentes valores nutricionais dos alimentos oferecidos ( LAVENS & SORGELOOS, 1984).
Ácidos graxos poliinsaturados (PUFA), tais como o linoléico 18:2n6,constituído por 18 carbonos e dupla ligação a partir do carbono 6, o linolênico (18:3n3), o eicosapentaenóico (20:5n3 – EPA) e o docosahexaenóico (22:6n3 –DHA), sendo os dois últimos conhecidos como ácidos graxos altamente insaturados-n3 (HUFA-n3), são nutricionalmente importantes para o crescimento e sobrevivência de organismos aquáticos (KAYAMA et al.,1980; FENUCCI et al.,1981;
De acordo com LEGER et al., 1986, a deficiência destes ácidos graxos é a provável causa de altas taxas de mortalidades .Vários estudos tem mostrado que estes ácidos graxos são essenciais para uma variedade de animais marinhos e de água doce.
O crustáceo branquiópodo Artemia sp. é provavelmente a presa viva mais amplamente utilizado na aquicultura mundial. Sua utilização para a substituição de presas naturais de larvas de peixes, remete ao início de 1930 (DHONT & VAN STAPPEN, 2003).Em meados do século XIX, havia apenas duas fontes comerciais de cistos deste crustáceo:O Grande Lago Salgado em Utah e na Baía de São Francisco, ambos nos EUA. Devido ao crescente desenvolvimento da aquicultura nas últimas décadas, e a intensa elevação do preço dos cistos a exploração de novos bancos naturais surgiram em outras localidades como, China, Argentina, Canadá, Colômbia, Austrália e França ou em países com gestão controlada da produção de Artemia, como Brasil e China (DHONT & VAN STAPPEN, 2003).
Artemia sp. tem movimentos relativamente lentos e é facilmente capturada e ingerida. O uso de juvenis ou adulto como presa viva, é reservado a algumas espécies de crustáceos decápodes, (DHERT et al., 1993; CONKLIN, 1995;RITAR et al., 2003; TLUSTLY et al, 2005) de peixes, a maioria ornamentais (LIM et al, 2001) e estágios iniciais de várias espécies de cefalópodes (DOMINGUES et al 2001;IGLESIAS et al., 2007). As artêmias se apresentam como uma opção viável para alimentação em cultivos aquícolas durante a fase larval devido a algumas características que tornam sua utilização adequada como, por exemplo: Amplo conhecimento sobre biologia, ecologia e características de cultivo, fácil processo de manipulação e eclosão dos cistos,cultivo até a fase adulta relativamente simples, possibilidade de consumo desde náuplios até a forma adulta.(Figura 1)
16 O valor nutritivo das artêmias varia de acordo com seu estágio de desenvolvimento, da origem dos cistos e do alimento ofertado às mesmas.
2.1 Produção e enriquecimento de Artemia sp.
Em comparação com outros crustáceos a artemia, tem um mecanismo de alimentação muito primitivo, sendo um filtrador obrigatório, não seletivo e contínuo (PROVASOLI et al.,1959). Devido a estas características, são considerados críticos na seleção da dieta os seguintes fatores: tamanho da partícula, (que não deve ser maior que 50 µm),digestibilidade, valor nutritivo do alimento e solubilidade das partículas. Esta característica de filtração não seletiva permite que se enriqueça o tubo digestivo das artêmias com produtos ricos em compostos variados como nutrientes essenciais (ácidos graxos, fosfolipídios, vitaminas, proteínas, aminoácidos) (SORGELOOS et al.,2001). Para o crescimento até a fase adulta tem se utilizado distintas dietas como por exemplo: leveduras, microalgas, bactérias, protozoários, farinha de algas e arroz (revisado por DHONT & LAVENS, 1996), obtendo se os melhores resultados de crescimento com microalgas. Tais taxas de crescimento dependem de vários fatores bióticos e abióticos, sendo a quantidade e qualidade do alimento disponível e a temperatura do cultivo os fatores considerados os mais importantes (DHONT & LAVENS, 1996).
WATANABE et al.,(1978) analisaram a composição de ácidos graxos de varias linhagens de Artemia sp., classificaram-nas em dois tipos: um de água doce , caracterizado pelo teor de 18:3n3, ácido linolênico, que é um ácido graxo essencial (EFA) para peixes de água doce,e o marinho,com alto teor de 20:5n3, eicosapentaenóico, que é um EFA para peixes marinhos.Embora qualquer tipo de cistos de artêmia possam ser satisfatórios para peixes de água doce, é necessário conhecer a composição de ácidos graxos da Artemia quando for utilizá-las para organismos marinhos (WATANABE et al.,1980), pois a classe quantitativa e qualitativa de EFA é o principal fator na variação nutricional de artêmia. A deficiência no teor de HUFA poderá ser corrigida adicionando dietas fortalecidas com HUFA-n3(LEGER et al., 1989). O enriquecimento de organismos utilizados como alimentos vivos pode ser desenvolvido alimentando-os com diferentes algas unicelulares, emulsões de
Figura 1: (A) Cistos de artêmia hidratados (200µm); (B) Náuplio de artêmia (500µm); (C) Metanáuplio enriquecido (900µm); (D) Artêmia enriquecida em estagio pré adulto(4,5mm)
17 óleos, micro cápsulas e dietas comerciais de enriquecimento, tanto separadamente como em varias combinações (SAKAMOTO;HOLLAND;JONES; 1982).
De fato, as técnicas de enriquecimento não só tornarão as presas vivas em transportadora de vários produtos, como também em alimentos atraentes para as larvas predadoras (SORGELOOS et al.,1986). (Figura 2)
BENGTSON et al. (1991) destacaram as principais técnicas de enriquecimento de Artêmia. Na técnica britânica, os náuplios são enriquecidos com a microalga Isochrysis
galbana, a desvantagem desse método é a obrigatoriedade da manutenção constante do
cultivo algal, além da variabilidade da composição de ácidos graxos poliinsaturados (AGP) nas algas. Na técnica japonesa (“método direto”), utiliza-se emulsão de óleo de peixe adicionada a uma mistura metíl-éster de AGP (n-3), que, quando ofertada aos náuplios, é ingerida e suas gotículas acumuladas no trato digestivo. Na técnica francesa, utiliza-se uma dieta composta de pó de Spirulina, levedura, aminoácidos, vitaminas, colesterol e óleo de peixe como enriquecedor. Na técnica belga, é utilizada uma mistura auto-dispersante de diferentes fontes de AGP (n-3),vitaminas, carotenóides e fosfolipídios. Neste trabalho serão utilizadas as técnicas britânicas e japonesas em conjunto.
No que se refere as paralarvas de polvos, o tamanho mais adequado de juvenis de artêmia para ser ofertado as paralarvas ao longo do cultivo é de 1,5 a 4,0 mm (IGLESIAS et al., 2004,2006, 2007). Ainda que, outros autores tenham observado que tamanhos inferiores a 1,5mm são aptos a serem oferecidos as paralarvas, nos primeiros dias de vida (NAVARRO & VILLANUEVA, 2000, 2003; VILLANUEVA et al., 2002,2004.), estes tamanhos se tornam pouco atrativos após os primeiros 20 dias de cultivo. Por isso, a otimização do
Figura 2: Esquema da utilização de Artêmia como vetor de transferência de nutrientes específicos para larvas de organismos marinhos de acordo com Merchie,1996
18 crescimento de náuplios de Artêmia até os tamanhos mais adequados e a melhora do perfil nutricional são importantes metas a serem alcançadas no cultivo de paralarvas de polvo, tendo ainda a finalidade de facilitar a gestão e disponibilidade do alimento vivo durante os experimentos e melhorar as taxas de crescimento e sobrevivência das paralarvas.
2.2 Microalgas
Apesar de existirem milhares de espécies de microalgas, relativamente poucas são utilizadas na aqüicultura. Na Tabela 1, é feita a referência aos principais gêneros de microalgas e cianobactérias produzidos em aqüicultura a nível mundial. Nas últimas décadas, centenas de espécies de microalgas foram testadas como alimento larval, entretanto não mais do que vinte espécies tiveram seu uso disseminado na aqüicultura (BROWN, 2002). Dentre os principais gêneros fornecidos direta e/ou indiretamente como alimento estão Chaetoceros, Thalassiosira, Tetraselmis, Isochrysis e Nannochloropsis (DUERR et al, 1998).
Vários fatores podem influenciar no valor nutricional das microalgas, incluindo a sua forma e tamanho, digestibilidade (relacionada à estrutura e composição da parede celular), composição bioquímica (nutrientes, enzimas, toxinas se presentes) e os requerimentos dos organismos alvo da alimentação (BROWN, 2002). De acordo com BROWN et al. (1997), a composição nutricional das microalgas pode variar também em função de diferentes condições de cultivo e da fase de crescimento da cultura.
Figura 3. Crescimento da Artêmia Fonte: Adaptado de DHONT,J.2005 CRESCIMENTO DA ARTÊMIA
19 Os métodos de cultivo de microalgas variam amplamente dependendo não só da espécie, mas também da intenção do uso do cultivo. As variações na oferta de nutrientes podem produzir alterações na composição bioquímica e, principalmente nos estoques de lipídeos.
A espécie Thalassiosira weisflogii é uma diatomácea e pertence à família Thalassiosiraceae (HOEK et al., 1995) e apresenta a seguinte composição segundo (RIZZI, 2010) 26,8% de carboidratos totais, 19,2% de proteínas e 27,5% de lipídeos.A espécie
Rhodomonas lens, é uma alga unicelular marinha pertencente à classe Cryptophyceae,
ordem Pyrenomonadales e família Pyrenomonadaceae (HOEK et al., 1995; TOMASELLI, 2004) e segundo (SEIXAS, 2009) é constituída por alto teor de proteínas 62%, 12% lipídeos e 11% carboidratos. Ambas apresentam boas características nutritivas, sendo de substancial interesse na aqüicultura, principalmente na alimentação de moluscos, peixes e crustáceos em estágios iniciais de desenvolvimento (BOUGARAN et al., 2003). Estas informações foram utilizadas como base para a escolha das microalgas usadas neste experimento.
3. OBJETIVOS
Avaliar a sobrevivência e o crescimento de Artemia sp., cultivada sob três diferentes dietas microalgais. Em um contexto mais amplo, a proposta é desenvolver um protocolo de produção de artêmias de boa qualidade nutricional para utilização como alimento vivo na larvicultura de polvos.
3.1 Objetivos Específicos
Testar três dietas microalgais, para a produção de artêmias em cultivos intensivos; Avaliar a sobrevivência e o crescimento de artêmias sob estas diferentes dietas. Tabela 1. Principais famílias e gêneros de microalgas e cianobactérias utilizadas em aquicultura
20 4. MATERIAIS E METODOS
Para a produção de artemia sob diferentes dietas microalgais, realizou-se um experimento no Centro de Estudos do Mar, localizado na cidade de Pontal do Paraná, Campus da Universidade Federal do Paraná. Tal experimento foi realizado no Laboratório de Cultivo de Cefalópodes e Ecologia Experimental Marinha, tendo duração de 25 dias, com inicio em 27 de outubro e termino em 20 de novembro de 2011.
Para a realização do experimento foi necessária a montagem da estrutura física que consistia de uma mesa de madeira com suporte para nove galões de água de 20 litros cada cortados no fundo e com torneiras acopladas nas saídas para facilitar o manejo. Em seguida foi coletada a água do mar com salinidade de 30, a qual foi filtrada com peneira de 40 µm para reter partículas em suspensão e em seguida foi clorada na proporção de 1ml de cloro a 12% para cada 5 litros de água e por fim neutralizada com solução de tiossulfato, na proporção de 1 ml para cada litro de água filtrada. Em seguida, 15 l de água foram transferidos para cada um dos nove galões. Quatro lâmpadas de 60 watts foram instaladas na altura da parte mediana dos galões para promover o crescimento homogêneo das microalgas nos galões de cultivo. Todos os tratamentos foram mantidos a 26° C , com o uso de aquecedores de 300w com termostato e oxigenação constante com uso de compressor de ar distribuídos em cada galão. Foram avaliados a diariamente temperatura e salinidade e a cada dois dias oxigênio dissolvido e compostos nitrogenados (Amônia, Nitrito e Nitrato, com uso de kit colorimétrico)
Foram testadas três dietas, sendo que cada uma delas tinha três repetições sendo estas respectivamente:
Rhodomonas lens T1, T2,T3 (Dieta Rho)
Thalassiossira weissflogii T3,T4,T5 (Dieta Tha)
Rhodomonas + Thalassiossira (50%+50%) T7,T8,T9 (Dieta Mix)
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 Figura 4. Esquema da disposição dos tratamentos no experimento
21 4.1 Cultivo de microalgas
Existem vários métodos de cultivo de microalgas, mas o mais comumente utilizado é baseado na indução artificial de condições eutróficas que levam a um rápido desenvolvimento de explosões populacionais (blooms). Este método consiste na adição de um inóculo puro de microalga a um meio de cultivo (água do mar filtrada e esterilizada e adicionada de nutrientes) (LOURENÇO, 2006). Os cultivos microalgais da maioria dos laboratórios de larvicultura comumente utilizam meio de cultura estéril baseado no protocolo Guillard´s F/2 (DUERR et al, 1998).
4.2 Protocolo para cultivo das microalgas
O cultivo de microalgas utilizado foi fechado e contínuo (batch) pois este, permite que as taxas de crescimento e produção sejam máximas e quando em condições adequadas, a população microalgal se mantêm em fase de crescimento exponencial permanente, proporcionando uma biomassa de maior qualidade nutritiva, sendo que o mesmo apresenta volume e condições constantes a longo prazo. A temperatura do cultivo será mantida em 25±2°C e as culturas foram desenvolvidas com iluminação artificial (lâmpadas fluorescentes de 40 W), sendo submetidas a fotoperíodo integral. Para o cultivo das espécies
Rhodomonas lens e Thalassiosira weisflogii, foi utilizado o meio F/2 Guillard (Figura 5), em
uma salinidade de 29 (29‰). As culturas serão mantidas com agitação (aeração) constante, com um fluxo de ar atmosférico de 0,3L minˉ¹.
22 Após o inoculo do meio de cultivo, foram realizadas repicagens do cultivo afim de, facilitar o crescimento exponencial das microalgas que servirão de fonte de alimento para as artêmias. As microalgas utilizadas durante todo o experimento, são produzidas seguindo este protocolo de cultivo e foram fornecidas pelo Laboratório de Microalgas, do Centros de Estudos do Mar.
Para produção de artêmias adultas como fonte de alimento vivo foram realizados um cultivo das microalgas, Rhodomonas lens e Thalassiosira weisflogii,que foram ofertados aos náuplios de artêmias recém eclodidos. Estas microalgas foram previamente fotografadas com Câmera de Cabeça SC2 acoplada em microscópio eletrônico usando o software de captura de imagem AnaliSYS getIT.Posteriormente, foi retirada uma amostra de 30 células aleatórias, para serem medidas no programa de edição de imagens Photoshop CS2® para se obter uma média de tamanho das células e se determinar o biovolume de cada espécie sendo que estes para R. lens e T. weisflogii , foram respectivamente 1378 µm³ e 1648 µm³. As microalgas foram também contadas em Câmara de Sedgwick-Rafter para estimar a densidade por ml de células e se obter as quantidades necessárias em volume de microalgas a serem ofertadas as artêmia. Os valores obtidos na contagem inicial do estoque foram de 880.000 cel/ml de R. lens e 1.107.000 cel/ml de T. weisflogii.Após o 15° dia devido a um problema no cultivo das microalgas as densidades do estoque contadas foram de 600.000 cel/ml R. lens e 515.000 cel/ml T. weisflogii.
23
Após a obtenção do biovolume foi determinado um fator de correção de 1.1957 (volume de uma célula de Thalassiosira / volume de uma célula de Rhodomonas) que serve de equivalência para que sempre fosse ofertado a mesma quantidade de microalgas em todas as dietas. Inicialmente foi estabelecido uma densidade de 7000 cel/ml e após o 15°dia , este valor foi elevado para 8500 cel/ml por dieta. Foi então ofertado 117 ml de R.
lens, 73ml de T. weisflogii e o valor dividido pela metade para a dieta mix de cada
microalga. Após o 15° dia foram estabelecidos os volumes de 213 ml de R. lens e 207 ml de
T. weisflogii
Figura 6. Amostra de Rhodomonas lens para determinação do biovolume
24 As diferentes dietas testadas foram avaliadas em função das taxas de sobrevivência, comprimento e peso seco das artêmias. Tais parâmetros eram monitoradas a cada 4 dias, a partir do dia da eclosão dos náuplios.
4.3 Protocolo para Eclosão de Artêmias
Os cistos de Artemia sp. , previamente adquiridos, foram submetidos ao seguinte protocolo de eclosão: Inicialmente foi realizada a hidratação dos cistos que foram colocados em um béquer com água doce filtrada, adicionado solução de 20ppm de hipoclorito e deixados durante 1 a 2 horas com intensa aeração para hidratação e desinfecção dos cistos. Após este período foram bem lavadas com água doce em uma peneira de 120 µ para retirar o cloro e colocados para eclodir. A eclosão se baseou na transferência dos cistos para um galão cilíndrico-cônico, com água marinha filtrada, pré-aquecida a 28°C, com aeração intensa e Mantidos por 24 horas até eclosão dos náuplios. Após estas 24 horas , foi desligada a aeração e colocada uma fonte de luz intensa na parte inferior do galão para atrair os náuplios e facilitar assim a retirada dos cistos , uma vez que estes tendem a flutuar. A coleta dos náuplios foi realizada após cerca de 30 minutos , retirando-os pela torneira acoplada no galão, com auxilio de uma peneira de 120 μm. Por fim, realizou-se o enriquecimento dos náuplios no 2° dia de cultivo, com o produto comercial Super-Selco® , emulsão rica em lipídeos em todas as dietas.
.
Para o enriquecimento foram realizadas as seguintes etapas: Depois de separados, colocou - se os náuplios em água marinha filtrada e previamente aquecida em um béquer para evitar mortalidade dos organismos. O Selco foi pesado em uma Placa de Petri, na quantidade ideal a ser utilizada na proporção de 0,3g/l de água marinha filtrada, totalizando para cada galão 4,5g de emulsão. Esta quantidade de Selco foi batida em liquidificador com 1,5l de
Rotina para enriquecimento dos cistos de artemia
25 água marinha filtrada por três minutos para melhor homogeneização e a mistura foi adicionada nos galões de cultivo com temperatura de 26°C e mantida por 24 horas, após este período, as artêmias foram muito bem lavadas em água doce com auxílio de uma peneira de 120 µ e adicionadas novamente aos galões de cultivo para começar a receber a alimentação com as dietas testadas durante o experimento.
4.4 Taxa de Sobrevivência
As taxas de sobrevivência foram obtidas a cada dois dias ao longo do experimento e se baseou no número de indivíduos presentes em cada réplica em relação ao número original do início do experimento. O procedimento de contagem se baseou na retirada de uma alíquota de 100 ml ao acaso de cada galão, e realizada a coleta aleatória de dez alíquotas de 1ml, dos 100ml iniciais. O número de indivíduos por ml foi contado com auxilio de um microscópio estereoscópico. Os indivíduos amostrados para coleta de comprimento e peso seco foram considerados nas contagens de sobrevivência.
4.5 Determinação do Comprimento
Para determinação do comprimento, foram retiradas alíquotas de 100 ml e ao acaso retirava-se alíquotas menores para então os indivíduos serem fixados em álcool 70% e mensurados. Foram medidos em média 30 indivíduos por dieta a cada 4 dias.O tamanho total dos exemplares foi medido da extremidade da cabeça até o fim do abdômen em microscópio estereoscópico com ocular micrométrica para se acompanhar o crescimento das artêmias nas três dietas, sendo que os indivíduos coletados, foram fotografados e posteriormente medidos com suas devidas conversões de escala no programa de edição de imagens Adobe PhotoshopCS2.
4.6 Determinação do Peso Seco
Para as medições de peso seco foram confeccionados cadinhos de papel alumínio previamente tarados em balança de precisão (cinco casas decimais) modelo Discovery OHAUS®. Posteriormente, foi coletada também de forma aleatória uma alíquota de 100ml e separados em alíquotas menores. Após a eclosão dos náuplios, foram retirados os indivíduos de cada dieta, e colocados 60 náuplios por cadinho para se obter um valor mensurável devido ao pequeno peso que os mesmos apresentaram no dia da eclosão. Após
26 o 2° dia de cada pesagem foram utilizados 10 indivíduos por cadinho, totalizando 30 cadinhos e 300 artêmias por dieta, as amostras foram levadas em estufa de cultura modelo FANEM 002CB a 60°C por 24 h e após este período, foram colocadas em dissecador de vidro por mais 30 minutos e então pesados. Os valores de peso seco foram obtidos através da subtração do peso dos cadinhos com as artêmias menos os cadinhos previamente confeccionados sendo que o resultado obtido foi dividido por 10 para se obter o peso médio individual de artemia para cada tratamento. A pesagem inicial foi realizada com 60 indivíduos por cadinho para obter um valor mensurável devido ao pequeno peso que estas apresentavam no dia da eclosão o valor obtido foi de 0,345 mg/indivíduo.
4.7 Contagem do residual de células
Para a contagem de células consumidas pelas artêmias nas diferentes dietas foi realizado o seguinte procedimento: diariamente foi retirada uma alíquota de 1 ml de cada dieta, em seguida adicionado uma gota de Lugol, para fixar as microalgas.Em seguida esta alíquota era colocada em Câmara de Sedgwick-Rafter e se realizava a contagem das células, seguida do seguinte cálculo: valor inicial de células (7500/ml até o 8° dia de cultivo e 8500 a partir do 9° dia) – número de células presentes na contagem diária. O valor resultante era então calculado para reposição diária do valor inicial em biovolume. Para a dieta Mix os residuais foram contados separadamente e posteriormente somados como dado único referente a cada dia de cultivo (anexos 1 e 2).
4.8 Maturação Sexual e Fecundidade
As artêmias das três dietas testadas foram avaliadas em função do tempo de maturação sexual por observação do comportamento reprodutivo, bem como a visualização de ovos e marsúpio cheio.Foi ainda coletado cinco fêmeas aleatórias de cada tratamento para se realizar a retirada do marsúpio e a contagem do número de cistos em cada fêmea.
4.9 Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas no Software livre R, através da analise de variância (ANOVA) e do teste de médias (Teste de Tukey), para avaliar as diferenças significativas entre as dietas à nível de significância de P<0,05
27 5.RESULTADOS
5.1 Parâmetros ambientais
Durante os 25 dias de cultivo, os parâmetros físico químicos,não apresentaram grande oscilações entre as diferentes dietas.Os valores de oxigênio dissolvido sempre se mantiveram acima de 7,0mg/l
Dieta Parâmetros Médias ± DP
Rhodomonas lens Oxigênio Dissolvido 7,4 ± 0,42mg/l Temperatura 26 ± 1°C Salinidade 32 ± 2 ups Amônia 0,25± 0,25mg/l Nitrito 0 Nitrato 0 pH 8,25± 0,25
Dieta Parâmetros Médias ± DP
T. weisflogii Oxigênio Dissolvido 7,3 ± 0,37mg/l Temperatura 26 ± 1°C Salinidade 32 ± 2ups Amônia 0,25±0,25mg/l Nitrito 0 Nitrato 0 pH 8,25± 0,25
Dieta Parâmetros Médias± DP Dieta Mix Oxigênio Dissolvido 7,45± 0,43mg/l
Temperatura 26 ± 1°C Salinidade 32 ± 2ups Amônia 0,25±0,25mg/l Nitrito 0 Nitrato 0 pH 8,25± 0,25
Em relação à temperatura, as médias ao longo do cultivo se mantiveram constantes em todos os tratamentos (26±1 °C). Quanto aos valores de salinidade, todas as dietas apresentaram média de 32 ups.,sendo o menor valor de 30 ups e a maior de 34 ups. Já quanto aos valores de compostos nitrogenados (amônia, nitrito e nitrato) os mesmos se
Tabela 3.Valores dos parâmetros Físico - químicos na dieta Rho
Tabela 4. Valores dos parâmetros Físico químicos na dieta Tha
28 mantiveram próximos a zero. Quando estes valores de amônia se aproximavam de 0,5 mg/L, foram realizadas trocas parciais de 30% do volume de água dos galões de cultivo. 5.2 Crescimento em comprimento
Em relação ao comprimento das artêmias entre as três dietas testadas, a que apresentou os maiores comprimentos médios finais foi a dieta composta apenas pela microalga Rhodomonas lens, seguida pela dieta Mix e a dieta que apresentou o menor comprimento final foi a dieta Thalassiossira weissflogii. As artêmias submetidas a dieta de
Rhodomonas lens apresentaram comprimento superior em todas as medições realizadas
após o inicio da alimentação, atingindo um comprimento médio final entre as repetições de 8 mm no 25° dia de cultivo, seguido da dieta Mix em que as artêmias alcançaram 7,49 mm e, por fim, a dieta com a microalga T. weisflogii apresentou comprimentos médio no ultimo dia de pesagem de 6,88 mm. Abaixo pode - se observar o crescimento em mm ao longo dos dias de cultivo para as três dietas ofertadas.
5.3 Crescimento em peso
Ao avaliar os dados referentes às medições de peso seco, foi possível observar um maior peso em miligramas na dieta composta por R. lens, sendo que em todas as medições realizadas, os pesos obtidos para as artêmias cultivadas com esta microalga foram sempre
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 4 8 12 16 20 24 Dieta Rho Dieta Tha Dieta Mix (mm)
Comprimento
Figura 9. Crescimento em comprimento de Artemia sp., submetida a três dietas microalgais. Valores são médias de 300 organismos ± Desvio Padrão de cada dieta.
29 superiores em relação as duas outras dietas avaliadas, resultando em um peso médio final 7,13 mg.
Em relação à dieta Mix, os valores de peso seco obtidos foram intermediários entre os tratamentos Rho e Tha, sendo que peso seco médio da dieta no último dia de pesagem foi de 5,49 mg. y = 0,209x - 0,5121 R2 = 0,90 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25
Dieta Mix
Dieta Rho
y = 0,2845x - 0,5534 R2 = 0,94 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25 Peso Seco (mg)Figura 10. Crescimento em peso seco de Artemia sp., cultivada com a microalga Rhodomonas lens. Valores são médias de 300 organismos ± Desvio Padrão.
Figura 11. Crescimento em peso seco de Artemia sp., cultivada com a dieta MIX (50% Rhodomonas lens + 50% Thalassiossira weisflogii). Valores são médias de 300 organismos ± Desvio Padrão.
Dias de Cultivo
Peso Seco (mg)
30 A dieta Tha, apresentou sempre os menores valores médios de peso seco em todas as medições ao longo do experimento, sendo o peso médio no último dia de cultivo de 5,24 mg.
A dieta Rho resultou em um peso médio final de 1,64 e 1,89 mg superior em relação ao tratamento Mix e Thalassiossira respectivamente.
5.4 Maturação sexual e Fecundidade
Entre as três dietas avaliadas durante o experimento, verificou-se que a dieta Rho apresentou indivíduos adultos e também comportamento reprodutivo após o 18° dia de cultivo, sendo que no 21° dia foi possível observar fêmeas fecundadas e no 23° dia fêmeas com marsúpio cheio. De algumas fêmeas foram coletados o marsúpio e realizada a contagem do número de ovos que foi em média de 40 ± 3 por fêmea. O ciclo de vida durou 28 dias quando se observou a liberação de cistos da água.
y = 0,1982x - 0,4948 R2 = 0,89 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25
Dieta Tha
Peso Seco (mg) Dias de CultivoFigura 12. Crescimento em peso seco de Artemia sp., cultivada com a microalga Thalassiossira weisflogii. Valores são médias de 300 organismos ± Desvio Padrão.
31 Na dieta Mix a presença de adultos e o comportamento reprodutivo teve início no 20° e 21° dia de cultivo respectivamente e fêmeas com ovos e foram observadas a partir do 23° e com o marsúpio cheio após o 26° dia de cultivo respectivamente. A liberação dos cistos ocorreu após o 30° dia de cultivo.
Figura 13. Fêmea obtida da dieta Rho com ovos aos 22° dia de cultivo.
32 Na dieta Tha, a presença de adultos e o comportamento reprodutivo foi observado após 22° dia, sendo que no 25°dia de cultivo, poucas fêmeas apresentavam ovos e no 28° dia, ainda não havia sido observado fêmeas com marsúpio.
5.5 SOBREVIVÊNCIA
Em relação à sobrevivência todos os tratamentos apresentaram taxas elevadas, sendo a dieta Rho, a que apresentou a maior sobrevivência, sendo de 82,15%, seguido da dieta Mix com taxas de sobrevivência de 81,67% e a dieta Tha obteve taxa de 80,15%
Figura 15. Fêmea obtida na dieta Mix com marsúpio cheio no 26° dia de cultivo.
33
5.6
Residual de célulasA contagem do residual de células nos nove dias iniciais de cultivo foi semelhante entre as dietas sendo que a dieta Rho o maior valor residual foi de 1950 cel/ml e o menor foi de 10 cel/ml, no Tratamento Tha os valores de residual ficaram entre 1500 e 13 cel/ml e a dieta Mix os valores ficaram entre 1200 e 12 cel/ml. Os valores de contagem baixos em todas as dietas no 10° e 11°dia de cultivo ocorreram devido a um problema com o cultivo das microalgas ofertadas no experimento.
Em relação ao residual de células a partir do 9° dia de cultivo, os valores da contagem ficaram entre 201 e 1798 cel/ml para a dieta Rho, 268 e 1685cel/ml para a dieta Tha e 279 e 1840 cel/ml para a dieta Mix.
6.ANÁLISE ESTATÍSTICA
6.1 Crescimento em comprimento
De acordo com as sete medições e pesagens realizadas ao longo do experimento, as análises realizadas evidenciaram a diferença estatística entre as dietas Rho e Tha em relação ao comprimento, sendo que a dieta Rho obteve as maiores médias de comprimento durante todo o experimento.
34
O gráfico, evidência as médias de comprimento final de cada dieta, bem como os valores mínimos e máximos , os quais a dieta ofertada as artêmias com a microalga Rhodomonas
lens foi a que obteve as maiores médias de comprimento.
A ANOVA evidenciou a diferença estatística entre as três dietas, sendo que a microalga Rhodomonas lens foi superior em comparação as outras dietas.
Tabela da ANOVA G.L Soma dos quadrados Quadrado médio F P valor Fator 2 13.8258 6.9179 41.568 2,135e-13*** Resíduos 87 14.4788 0.1664
A análise dos dados obtidos com o teste da ANOVA, mostra que houve diferença significativa (P<0,05).
Figura 18. Boxplot dos valores de comprimento (mm) de Artemia sp., cultivadas em três dietas microalgais. Mix=50+50%,Rho=R lens , Tha=T. weisflogii.
35
Dieta/Comprimento Centro Lwr Upr P valor
Rho-mix 0.05416667 0.2905046 0.7928288 0.0000049
Tha- mix -0.4160000 -0.6671621 -0.1648379 0.0004623
Rho-Tha -0.9576667 -1.2088288 -0.7065046 0.0000000
O Teste de Tukey evidenciou diferença significativa ao nível de P< 0.001 entre as três dietas, sendo que a dieta R. lens foi muito superior em comparação as demais. A dieta Mix também apresentou diferença estatística em relação à dieta Tha P<0.001, apresentando maiores valores médios de comprimento em relação a dieta T. weisflogii.
6.2 Crescimento em peso ANOVA G.L Soma dos quadrados Quadrado médio F P valor Fator 2 71.123 35.561 84.897 2,2e-16*** Resíduos 87 36.442 0.419
Dieta/Peso seco Centro Lwr Upr P valor
Rho -mix 1.647397 1.2489318 2.04586150 0.0000000
Tha- mix -0.409470 -0.8079348 -0.01100517 0.0425968
Rho-Tha -2.056867 -2.4553315 -1.65840184 0.0000000
Os dados da Anova comprovam a significância entre as dietas, e o Teste de Tukey evidenciou diferença significatica entre as dietas Rho e Tha, bem como com a dieta Mix.
Tabela 7. Valores do Teste de Tukey relacionando as médias entre as três dietas microalgais.
Tabela 8. Teste da ANOVA para medições de Peso seco das artêmias para três dietas microalgais
36 6.3 Sobrevivência
A sobrevivência não apresentou diferença estatística entre as dietas, sendo que as taxas de mortalidade média em todas as dietas não ultrapassaram 20%.
ANOVA G.L Soma dos
quadrados
Quadrado
médio F P valor
Fator 2 75.55 37.77 1.1473 0.3231
Resíduos 74 2436.31 32.92
Figura 19. Boxplot dos valores de Peso seco (mg) de Artemia sp., cultivadas em três dietas microalgais.Mix=50+50%,Rho=R lens , Tha=T. weisflogii.
Tabela 10. Teste da ANOVA para sobrevivência das artêmias cultivadas em três dietas microalgais
37 6.4 Residual de células
Em relação a contagem do residual de células, diferenças significativas não foram verificadas entre dietas, tanto em relação a contagem inicial de 7000, como também na contagem de 8500 células por ml.
ANOVA G.L Soma dos
quadrados
Quadrado
médio F P valor
Fator 2 247926 123963 0.358 0.7004
Resíduos 69 23894751 346301
Figura 20. Boxplot com os valores médios de sobrevivência das artêmias cultivadas em três dietas microalgais Mix=50+50%,Rho=R lens , Tha=T. weisflogii
Tabela 11. Teste da ANOVA para o residual de células dos cultivos de Artêmia entre as três dietas microalgais a partir de 7000 cel/ml
38
ANOVA G.L Soma dos
quadrados
Quadrado
médio F P valor
Fator 2 319478 159739 0.9534 0.3887
Resíduos 105 17591808 167541
Figura 22. Boxplot dos valores médios ao residual de células dos cultivos de Artêmia entre as três dietas microalgais a partir de 8500 cel/ml
Tabela 12.Teste da ANOVA para o residual de células dos cultivos de Artêmia entre as três dietas microalgais a partir de 8500 cel/ml
Rho Tha Dieta
Figura 21. Boxplot dos valores médios ao residual de células dos cultivos de Artêmia entre as três dietas microalgais a partir de 7000 cel/ml
39 7. DISCUSSÃO
As artêmias submetidas à dieta composta exclusivamente pela microalga
Rhodomonas lens obtiveram as maiores taxas de crescimento em peso, comprimento,
sobrevivência, fecundidade e maturaram mais cedo, consequentemente, esta foi a melhor dieta, entre as testada para produção intensiva de artemia.
Segundo LAVENS e SORGELOOS (1996), no manual de produção e uso de alimento vivo para aquicultura publicado pela FAO, tanto a temperatura quanto a salinidade podem ter efeitos significativos em relação ao crescimento, sendo o efeito da temperatura mais pronunciado. Porém, os valores de temperatura e salinidade não tiveram variações acentuadas entre as dietas, por esta razão, a composição nutricional das microalgas foi o fator determinante das taxas de crescimento em comprimento e em peso das artêmias. Tais fatores resultaram em um melhor desempenho obtido pela dieta composta pela microalga R.
lens. Estes resultados podem estar relacionados aos altos teores de proteína (62%), lipídeos
(12%) e carboidratos (11%) da microalga Rhodomonas lens (SEIXAS, 2009). Já o gênero
Thalassiossira apresenta a seguinte composição, 19,2% de proteínas, 26,8% de
carboidratos totais e 27,5% de lipídeos (RIZZI, 2010) podendo então ter sido o elevado conteúdo protéico da microalga Rhodomonas lens em relação à Thalassiossira que influenciou os resultados em ganho de peso, uma vez que, as proteínas são responsáveis pela formação de massa muscular e as proteínas do músculo produzem esqueletos carbônicos que podem ser utilizados como fonte energética ou lipogênese. (SEIXAS, 2004)
A superioridade da dieta composta por Rhodomonas lens pôde também ser evidenciada através da pequena variação entre as repetições em relação ao crescimento em comprimento, uma vez que todos os valores ficaram próximos a 8 mm na última medição realizada, diferentemente das outras dietas, em que a variação entre as repetições foi mais pronunciada. A dieta Mix também se mostrou superior em relação a dieta Thalassiossira.
No que se refere às paralarvas de polvos, o tamanho mais adequado de juvenis de artêmia para serem, ofertado as paralarvas ao longo do cultivo, é de 1,5 a 4,0 mm (IGLESIAS et al., 2004,2006, 2007). Ainda que outros autores tenham observado que tamanhos inferiores a 1,5mm são aptos a serem, oferecidos as paralarvas nos primeiros dias de vida (NAVARRO & VILLANUEVA, 2000, 2003; VILLANUEVA et al., 2002,2004.), estes tamanhos se tornam pouco atrativos para as paralarvas após os primeiros 20 dias de cultivo. Por esta razão, a otimização do crescimento de náuplios de artêmia até os tamanhos maiores, mais adequados, e a melhora do perfil nutricional são importantes metas a serem
40 alcançadas no cultivo de paralarvas de polvo. Neste contexto, os resultados obtidos através do presente trabalho representam um importante passo para a produção intensiva de artêmias de boa qualidade nutricional para serem oferecidas as paralarvas de polvo durante a larvicultura.
Segundo (DHONT e LAVENS 1996) os fatores que estão diretamente associados a taxas de sobrevivência das artêmias, são temperatura e salinidade. Porém, como as artêmias são organismos muito resistentes às variações de salinidade e, como este parâmetro não apresentou grande variações entre as três dietas testadas, não podem ter influenciado as taxas de sobrevivência e durante o experimento.
Quanto aos residuais de células, como não foi observada diferenças significativas entre as três dietas, a densidade de células remanescentes não pode ser considerada como um fator que influenciou no crescimento em peso, comprimento e sobrevivência entre as dietas. Mesmo se considerarmos o tamanho das células de cada microalga ofertada nas três dietas, de 8-12µm para Rhodomonas lens e 12-40µm para Thalassiossira sp (FERREIRA,2009) uma vez que as artêmias podem filtrar partículas de tamanhos entre 1 e 50µm (SEIXAS,2009) e segundo (REEVE, 1963), a taxa de filtração das artêmias independe do tamanho das células, então não podemos considerar que o fator tamanho celular das diferentes microalgas, tenham influenciado nestas taxas,tal fato evidencia a influência da composição nutricional das microalgas no desempenho eficaz do cultivo intensivo de artêmias.
Fatores ambientais como baixas concentrações de oxigênio dissolvido ou salinidades muito elevadas desencadeiam a formação dos embriões até a fase de gástrula sendo então recobertos por uma casca marrom, isto é, os cistos, gerando assim uma paralisação metabólica (DHONT e VAN STAPPEN 2003). Porém, como os valores de oxigênio dissolvido se mantiveram acima de 7,0 mg/l, este fator não dever ter influenciado. Porém, a salinidade que se manteve por volta dos 32 ups pode ter influenciado no processo de produção de cistos, pois as artêmias naturalmente habitam ambientes com maiores salinidades, geralmente acima de 35 ups. Os valores de pH também podem ter influenciado na formação de cisto, já que a faixa ideal para as artêmias é de 6,5 a 8,0. Durante o experimento, todos as dietas mantiveram uma média de pH em torno de 8,5 fato que pode ter sido responsável, pelo menos parcialmente, pela na formação de cistos ao invés da liberação direta de náuplios na água.
A dieta Mix apresentou sempre resultados intermediários entre as dietas, em todos as medições de crescimento em peso, em comprimento e em relação a maturação sexual e fecundidade, tais resultados podem ser remetidos ao efeito de diluição da dieta , uma vez
41 que 50 % da composição desta era da microalga R. lens. Em relação à dieta que ofertou a microalga Thalassiossira weisflogii, não foram obtidos bons resultados. Esta dieta se mostrou pouco eficiente para o cultivo intensivo de artêmias, uma vez que tanto o crescimento em comprimento e em peso foram inferiores as demais dietas testadas e a maturação sexual foi tardia, tornando assim os cultivos intensivos mais onerosos.
42 8. CONCLUSÃO
A dieta com a microalga Rhodomonas lens resultou em um melhor desempenho para o cultivo intensivo de artêmias.
A microalga R. lens, pode ser considerada uma ótima opção de cultivo intensivo para artêmias, pois promove um rápido crescimento e aceleração da maturação sexual, bem com taxas altas de sobrevivência em cultivos intensivos.
Em relação à dieta Thalassiossira weisflogii, não foram obtidos bons resultados. Esta dieta se mostrou pouco eficiente para o cultivo intensivo de artêmias, uma vez que tanto o crescimento em comprimento e peso seco foram inferiores as demais dietas testadas e a maturação sexual foi tardia.
O desempenho superior da dieta R. lens pode ser remetido aos altos teores de proteína e lipídeos constituintes dessa microalga. O Tratamento Mix se mostrou eficiente no que se refere ao crescimento em comprimento, peso seco e também à maturação sexual, provavelmente, pelo efeito da diluição, já que 50% da composição desta dieta era da microalga R. lens. Estudos mais aprofundados em relação ao perfil de ácidos graxos e teores nutricionais devem ser avaliados, para confirmar o melhor desempenho em relação aos outros tratamentos realizados no experimento.
43
9. REFERÊNCIAS
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