ANÁLISE DE IMAGENS EM
TECNOLOGIA DE SEMENTES
Produção de Sementes (LPV-5705) Pós-graduação - Fitotecnia Primeiro Semestre de 2014 C.C.Francisco Guilhien Gomes Junior Tecnologia de Sementes Depto de Produção Vegetal
USP/ESALQ
11/05/2012 13h10 - Atualizado em 11/05/2012 14h14
Satélite russo registra maior foto já feita
da Terra, com 121 megapixels
Cada pixel da imagem corresponde a 1 km de distância
PIXEL, RESOLUÇÃO E TAMANHO DA IMAGEM
Tamanho
O tamanho de uma imagem digital está definido no número de linhas e colunas que a forma
Resolução
Capacidade que um sistema de
captura/reprodução de imagens tem para reproduzir detalhes
A resolução de uma imagem é o número de pixels impressos ou exibidos por unidade de medida Pixel:(“Pictures Elements”) É o menor ponto que forma uma imagem
x y Pixel = f(x,y)
Imagem digital
Imagem bitmap Imagem vetorialCDR, AI e EPS TIFF, JPEG, PNG, GIF, BMP e PSD
Representação de uma imagem
bidimensional
usando
números binários
codificados de modo a
permitir seu armazenamento, transferência,
impressão ou reprodução, e seu processamento por
meios eletrônicos
Tipos de imagens digitais
Cada pixel tem um valor independente de cor
Imagem
Vetorial
Imagem
Bitmap
Imagens digitais: vetorial e bitmap
A imagem vetorial pode ser redimensionada sem perda de qualidade
A resolução de uma imagem bitmap deve ser definida antes da impressão e o seu redimensionamento pode causar perda de qualidade As imagens vetoriais
são geradas a partir de linhas (vetores) e pontos, e são definidas por coordenadas e
fórmulas matemáticas
As imagens bitmap são geradas a partir de uma malha quadriculada, onde a menor unidade é chamada pixel Esquerda: semente de milho captada em imagem de 100dpi, 256tons de cinza e 8bits. Direita: ampliada 7x em tela (700%)
Resolução de imagem digital
Teixeira (2004)
Propriedades das cores
RG
B
-Modelo aditivo
C
M
Y
K
-Modelo subtrativo
Escala de cinzas
28x 28x 28 16,7 milhões de cores
Modelo
R
G
B
8 bits
Escala de
cinzas
8 bits
Pixel = f(x,y) Pixel = f(x,y) 28 256 níveis x y x yBits nos modelos
R
G
B
e
escala de cinzas
Imagem digital
Níveis de cinza
256 8 bits 128 7 bits 64 6 bits 32 5 bits 16 4 bits 8 3 bits 4 2 bits 2 1 bit Marques Filho e Vieira Neto (1999)IMAGEM BINÁRIA
Procedimentos não destrutivos para avaliação da
qualidade de sementes
Raios X
Microtomografia computadorizada de raios X Tomografia por ressonância magnética Câmera multiespectral
Fluorescência de clorofila
Avaliação de características físicas e morfológicas
de sementes e de plântulas
Descritores de cor, forma e tamanho das sementes Avaliação do vigor de sementes com base em imagens digitais de plântulas
Análise de imagens de sementes e de
plântulas
Procedimentos não destrutivos para avaliação
da qualidade de sementes
TESTE DE
RAIOS X
Procedimentos não destrutivos para avaliação
da qualidade de sementes
Raios X
Descoberta dos raios X
Físico alemão Wilhelm Conrad Röntgen (1845-1923) 8 de novembro de 1895: primeira chapa de raios X
Raios X
Características dos raios X
Fonte: google
Raios X
Como são gerados os raios X?
Elétrons acelerados emitidos pelo cátodo se chocam com um alvo metálico (ânodo de tungstênio) Ao atingir o alvo, os elétrons desaceleram e perdem a energia cinética, cedendo energia aos elétrons do ânodo, gerando energia térmica e radiação
Raios X: geração
O comprimento de onda gerado depende do nível de energia
Alto nível de energia
: ondas curtas Mais apropriados para objetos grandes e, oudensos
Possuem alta absorção e resolução e causam baixo dano aos tecidos
Baixo nível de energia
: ondas longas São apropriados para objetos pequenosExemplo: sementes
Possuem baixa absorção e resolução e causam alto dano aos tecidos
Fatores que afetam o nível de absorção
dos raios X pela
semente
Espessura e densidade dos tecidos
Composição da semente
Proteínas, carboidratos e lipídios: diferentes graus de hidrofobicidade
O teor de águada semente influencia a densidade óptica
Comprimento de onda da radiação ionizante
Raios X de menorcomprimento de onda => maiorpoder de penetração
35% de água 15% de água
Imagens radiográficas de sementes de
Tucumã (Astrocaryum aculeatum)
apresentando diferentes graus de umidade
Viabilidade da utilização de raios X em
sementes
CAUSA EFEITO
Radiografia de semente de milho doce
A pequena dose de radiação usada durante o teste não exerce influência negativa sobre a germinação (não provoca
mutação)
Não inviabiliza a semente (método não
destrutivo): relações
de causas e efeitos
ISTA - desde a década de 1980 (detecção de sementes cheias, vazias, danificadas mecanicamente ou por insetos).
RAS 2009 – capítulo específico (16) sobre o teste de raios X.
Raios X para análise de sementes
Histórico
Início da década de 1950 na Suécia: avaliação da
qualidade de sementes de Pinus sylvestris L.
(Simak e Gustafsson,1953)
Pinus sylvestris L.
Primeiro trabalho foi realizado por
Lundström
em
1903: sementes de coníferas
Raios X para análise de sementes
Histórico
Primeiro trabalho brasileiro foi realizado por
Silvio
M. Cicero
em 1998: avaliação de danos mecânicos
em sementes de milho
Setembro de 2001: inauguração do
Laboratório de
Análise de Imagens
do Departamento de
Produção Vegetal da USP/Esalq, financiado pela
FAPESP (primeiro laboratório para avaliação de
sementes utilizando raios X no Brasil)
Raios X
Como interpretar os resultados?
Conhecer a morfologia interna Conhecer o princípio do teste
Raios X
Como interpretar os resultados?
Trinca 3 Trinca 1 Trinca 2 Radícula Plúmula Raízes seminais
Raios X
Como interpretar os resultados?
1 mm
Crotalaria juncea L.
radícula hipocótilo plúmula cotilédones tegumentoRaios X
Raios X
Aplicações em Tecnologia de Sementes
Detecção de anormalidades em embriões Determinação do estádio de desenvolvimento das sementes
Estudos de alterações fisiológicas durante os processos de maturação, secagem, germinação ou condicionamento fisiológico
Identificação de injúrias mecânicas, injúrias causadas por insetos ou injúrias decorrentes de outros fatores adversos em pré e pós-colheita
Seleção de sementes cheias
Base para utilização de programas computadorizados na avaliação de alterações da morfologia interna
Embrião deformado PA Embrião com pequeno defeito PA PN Embrião sem defeito Socolowski e Cicero (2008) Tecoma stans
Raios X
Detecção de anormalidades em embriões
Raios X
Identificação de injúrias mecânicas
Gomes-Junior e Cicero (2012) Flor et al. (2004) milho doce soja Plântula anormal Plântula anormal
Raios X
Identificação de injúrias por “umidade”
Injúrias severas no eixoembrionário
Injúrias severas na região dos cotilédones
Plântula anormal soja Forti et al. (2010) Menezes et al. (2012) Semente de arroz: secagem a 50o C
Raios X
Identificação de injúrias causadas por secagem
Caruncho em feijão-caupi
Melo et al. (2010)
Raios X
Identificação de injúrias causadas por insetos
Forti et al. (2008)
Percevejo em feijão
Raios X
Seleção de sementes cheias
Totalmente formada Parcialmente formada Não formada
(Carvalho et al., 2010)
Sementes de mamona
Área do embrião = 57%
Raios X
Base para utilização de programas computadorizados na avaliação de alterações da morfologia interna
Espaço livre interno total = 1,28 mm2 Semente de algodão Semente de Xylopia aromatica Sokolowski et al. (2011) Marcos-Filho et al. (2010) Neethirajan et al. (2007)
Detecção de grãos de
trigo “germinados” com
base na densidade de
pixels
Raios X
1 Moega de entrada de sementes 2 Tubo de raios X 3 Ampliação da imagem 4 Interface de usuário 5 Unidade de classificação Posicionamento da semente Obtenção da imagem radiográfica Análise e processamento
dos dados Classificação
Raios X no controle de qualidade de
sementes
Fonte: google (adaptado)
Tomografia computadorizada de
raios X (TC)
É uma técnica que permite a visualização de
seções transversais
(cortes internos) de um
objeto de forma não destrutiva
A captura é feita através de uma série de
pequenas rotações
As informações de atenuação da radiação que
atravessa o objeto são gravadas para um plano
de interesse
Um algoritmo processa os dados para formar
uma imagem 2D
A combinação dessas imagens pode gerar a
visualização em 3D
Microtomografia de raios X
Tubo de raios X Intensificador de imagem Câmera CCD Projeções Imagem 3D Algoritmo de reconstrução Seções Análise das imagensDeterminação de parâmetros físicos Modelo 3D Sistema de circulação Amostra
Microtomografia computadorizada de
raios X (microTC)
Diferença em relação à TC consiste no grau de resolução da imagem e no tamanho do objeto a ser analisado
Apresenta resoluções mínimas de 50 microns, favorecendo a visualização e caracterização da estrutura interna de objetos pequenos, como sementes
Microtomógrafo SkyScan 1172: Embrapa Instrumentação
Microtomografia de raios X
Posicionamento da amostra:
Seção 572
Seção 690
Semente de milho
Microtomografia computadorizada de raios X
2000 seções transversais
Microtomografia computadorizada de raios X
Imagem radiográfica Faxitron X-ray MX 20 DC 12 digital SkyScan 1172 Passo de rotação: 0,2° Rotação total: 180° Tamanho do pixel: 6,6µm Seção coronal
Seção transversal Seção sagital
Imagem detalhada do embrião
Tomografia por ressonância
magnética
A tomografia por ressonância magnética utiliza
fortíssimos campos magnéticos e ondas de
rádio para formar imagens de uma amostra
São utilizados os pulsos de radiofrequência
direcionados somente ao
hidrogênio
contido na
amostra
O excesso de energia liberado pelos prótons de
hidrogênio quando o pulso de radiofrequência é
desligado emite um sinal de uma bobina para o
computador
Por meio de cálculos matemáticos os sinais são
transformados em uma imagem
Monitoramento da secagem de sementes de cevada
Seefeldt et al. (2007)
Imagem por ressonância magnética
5 min 2 h 5 min 5 h 5 min 6 h 5 min
8 h 5 min 11 h 5 min 12 h 5 min 17 h 5 min
Koizumi et al. (2008)
Monitoramento da hidratação de sementes de soja
Imagem por ressonância magnética
Câmera multiespectral
Imagem multiespectral: imagens de um
mesmo objeto
, tomadas com
diferentes
comprimentos de ondas
eletromagnéticas
(luz visível, infravermelha, ultravioleta,
raios X ou qualquer outra faixa do
espectro)
Imagem colorida tradicional
Utiliza três filtros
para as bandas
R
ed,
G
reen e
B
lue
Imagem RGB
Limite do Infravermelho Comprimento de onda (nm) R e sp o st a re la ti vaImagem multiespectral
ultravioleta infravermelho Clorofila b Clorofila a Comprimento de onda (nm) Ab s o rb â n c iaImagem colorida tradicional
Clorofilas a e b
apresentam
quase o mesmo
Clorofila b Clorofila a Comprimento de onda (nm) Ab s o rb â n c ia
Imagem multiespectral
Em comprimentos
de onda específicos
as clorofilas a e b
apresentam
diferentes sinais e
podem sem
identificadas
Identificação de fungos em sementes de
espinafre
Olesen et al. (2011)
Olesen et al. (2011)
Identificação de fungos em sementes de
espinafre
Alternaria Cladosporium Fusarium Stemphylium Sem infecção Verticilium Int ens idade m édia Comprimento de onda (nm)Identificação de fungos em sementes de
espinafre
N ú m e ro d e p ix e ls N ú m e ro d e p ixe ls Intensidade do pixel Alternaria spp. Cladosporium spp. Fusarium spp. Verticillium spp. Stemphylium spp. Sem infecção Olesen et al. (2011)Câmera multiespectral no controle de
qualidade de sementes
Entrada das sementes Esteira móvel
Espectômetro e unidade de iluminação Classificação:
Sementes maduras e sadias Sementes imaturas Sementes infectadas por fungos
Fonte: google (adaptado)
Fluorescência de clorofila
Jalink et al. (1998)
A clorofila fluorescequando excitada em um determinado comprimento de onda 1. Um laser ou uma luz de LED excita a clorofila
2. Um filtro de largura de banda estreita filtra a fluorescência 3. A clorofila da semente é determinada
Fluorescência de clorofila em semente de
pimenta durante a germinação
M é d ia d e F C/p ix e l x1 0 0 0 ( va lo r e s c a la d e c in z a ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 40 30 20 10 0 Tempo (h) 68h 20min 50 http://www.phenovation.com
Lote de baixo vigor
Ocorrência de sementes esverdeadas
Lote de alto vigor
Sinal de fluorescência, baixo para alto: pretovermelholaranjaamareloverde
Fluorescência de clorofila em sementes
de soja
http://www.phenovation.com
Avaliação de características físicas e
morfológicas de sementes e de plântulas
Sementes Plântulas
Câmera CCD
Escâner de mesa
Computador e programa para análise de imagens
Imagens em Time-lapse
Descritores de cor, forma e tamanho das sementes
Classificação do vigor de lotes de sementes
Construção da imagem da semente Curva de embebição (monitoramento) Taxa de crescimento da raiz Índices médios RGB
Descritores biomorfológicos Adaptado de Dell´Aquila (2006) Dell’Aquila (2009)
Índices
R
G
B
como indicadores da viabilidade
de sementes
Inicial Após envelhecimento
Escurecimento do tegumento de
sementes de lentilhaapós o envelhecimento (51 dias a 40 °C e teor de água de 14,4%)
Dell’Aquila (2006)
Índices médios
R
G
B
como indicadores da
viabilidade de sementes
Onobrychis viciifolia
Behtari et al. (2014)
Índices médios
R
G
B
como indicadores da
Índices médios
R
G
B
no monitoramento da
taxa de crescimento da raiz
Dell’Aquila (2009) Semente de rabanete
Método direto para a identificação de sementes com alto potencial de desempenho
Armazenamento das imagens de plântulas
Resultados rápidos, objetivos e precisos
Biossíntese incompleta Membranas incompletas MATURIDADE FISIOLÓGICA Degeneração das membranas Redução das atividades respiratórias e biossintéticas
Germinação lenta Redução do potencial de conservação Menor taxa de crescimento e de desenvolvimento
Menor uniformidade de desempenho Maior sensibilidade a adversidades Redução da emergência de plântulas em campo
Aberrações morfológicas (plântulas anormais) Perda do poder germinativo
MORTE Adaptado de Delouche e Baskin (1973)
Avaliação automatizada do vigor de sementes
baseada em imagens digitais de plântulas
Processamento de uma imagem digital de
plântula de milho
256 tons de cinza (8 bits) 300 dpi
Imagem binária Esqueleto em imagem binária
Algoritmo
contador de pixels Teixeira et al. (2006) Cn = média aritmética do comprimento (cm) n = número de plântulas medidas em "pixels" sob resolução (r) dada em dpi. Hipocótilo Raiz Baalbaki et al. (2009) Marcos-Filho et al. (2009) Programas Seed Vigor Imaging System (SVIS) Sistema de Análise de Sementes (SAS) Análise Automatizada do Vigor de
Sementes (Vigor-S)
Determinação de índices (escala de 0 a 1000)
Crescimento
Uniformidade de desenvolvimento Vigor
Determinação do comprimento médio das plântulas
Avaliação automatizada do vigor de sementes
alfacesoja
Comp. plântula em azul: 7,8 cm Índice de Crescimento: 837 Índice de Uniformidade: 947 Índice de Vigor: 870 Comp. plântula em azul: 4,5 cm
Índice de Crescimento: 435 Índice de Uniformidade: 925 Índice de Vigor: 582
Baixo vigor Alto vigor
Gomes-Junior et al. (2014)
Avaliação automatizada do vigor de sementes
de feijão (programa SVIS)
SVIS: índices de vigor para soja
(plântulas com três dias de idade)
Proposta da Ohio Seed Improvement Association
Alto vigor: > 500
Vigor médio: 200 - 500
Baixo vigor: < 200
Proposta da Ohio State University
Vigor excepcional: 800 - 1000
Alto vigor: 600 - 799
Bom vigor: 400 - 599
Baixo vigor: 200 - 399
Grãos: < 200
Cultivar Nitro
Lote Germ.(%) PCG (%) EASS (%) EP (%) IV IU
6 99 a* 96 a 97 a 99 a 902 ab 922 ab 7 88 b 80 b 77 b 92 b 752 c 882 c 8 99 a 97 a 97 a 100 a 918 a 907 bc 9 99 a 96 a 98 a 100 a 883 ab 934 a 10 99 a 93 a 95 a 95 a 861 b 921 ab C.V. (%) 5,5 5,5 6,0 5,3 3,6 2,9
Marcos Filho et al. (2006)
* Comparação na coluna (teste de Tukey: p≤ 0,05)
Avaliação automatizada do vigor de sementes
de melão: comparação com métodos tradicionais
Índice de Vigor UniformidadeÍndice de
Cuidados e limitações
Temperatura no germinador Parâmetros SVIS Temperatura °C Milho Soja 24 °C 25 °C 26 °C 24 °C 25 °C 26 °C Crescimento 531 B 459 B 734 A 612 B 573 B 731 A Uniformidade 832 B 861 A 859 A 867 A 872 A 870 A Vigor 621 B 579 B 765 A 739 B 722 B 800 A Uniformidade de umedecimento do substrato
Horário de instalação do teste de germinação e aquisição das imagens
Comparação entre cultivares com diferentes taxas de crescimento
Sementes dormentes