FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE HIDROLISADO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR EM

SISTEMA DESCONTINUO ALIMENTADO

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Dr. Silvio Silvério da Silva (presidente)

Dr. Adolfo Quesada Chanto

Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata

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Estudante:

Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues

Lorena-SP-Brasil

1997

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE HIDROLISADO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR EM

SISTEMA DESCONTÍNUO ALIMENTADO

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado

aprovada pela banca examinadora . -. ,...

~_.,..,

Dr. Silvio Silvério da Silva

Orientador e Presidente da Banca Examinadora

Lorena-SP-Brasil

1997

À minlia

fi[lia,

}1.úne.

AGRADECIMENTOS

À Faculdade de Engenharia Química de Lorena - FAENQUIL- através do Departamento de Biotecnologia - DEBIQ.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro.

Ao meu orientador Dr. Silvio Silvério da Silva, pela orientação recebida, pela confiança, pelo respeito e amizade.

Ao Dr. Arnaldo Márcio pelo auxílio na parte prática deste trabalho, pela coleta de amostras de madrugada e, principalmente, pela amizade.

Ao Dr. João Batista pelo valioso auxílio na análise estatística dos resultados.

Às doutoras Inês e Maria das Graças pelas sugestões apresentadas. À Rita e ao Paulinho pelo auxílio no laboratório.

À Zéa e Lourdes, amigas" inseparáveis.

Aos companheiros de curso pela amizade e companheirismo.

Em especial ao meu estagiário e amigo Aníbal C. M. Toseto ("Tn memorian") pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho.

Aos funcionários da planta piloto pela obtenção do hidrolisado.

À Ludmila, pelo auxílio na aquisição e tratamento das informações bibliográficas.

À Maria Eunice pelo auxílio com o inglês.

Às secretárias lrani e Valquiria pelo carinho e amizade.

Aos demais funcionários do DEBIQ que não foram citados, mas que de alguma forma contribuiram para a realização deste trabalho.

Ao meu marido, Gerson, e à minha filha, Aline, por suportarem as minhas ausências.

Aos meus pais, cujo auxílio e carinho possibilitaram a realização deste trabalho.

À minha família, especialmente à Tia Sônia, pelo carinho e grande incentivo.

BIOGRAFIA

Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues, filha de Custódio Esteves de Andrade e Lúcia Maria Godoy de Andrade, nasceu em Resende, Estado do Rio de Janeiro, a 20 de outubro de 1968.

Graduou-se em Engenharia Química pela Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, no ano de 1992.

Em 1995 ingressou no Curso de Mestrado em Biotecnologia Industrial, do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de Lorena.

RESUMO

Obtenção de Xilitol a partir de Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de-Açúcar em Sistema Descontínuo Alimentado. Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues. Dissertação de mestrado. Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Silvio Silvério da Silva (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. Adolfo Quesada Chanto e Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata. Agosto de 1997.

Avaliou-se a obtenção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em sistema descontínuo alimentado, utilizando-se vazão exponencial de alimentação. Empregou-se planejamento estatístico a fim de se verificar os efeitos da concentração de xilose mantida no meio fermentado (Se) e da concentração de xilose no meio de alimentação (Si) sobre os parâmetros fermentativos. Observou-se que nenhuma destas variáveis apresentou efeito significativo sobre o fator de conversão de xilose em xilitol. Entretanto, os efeitos destas variáveis sobre a concentração de xilitol foram significativos. Utilizando-se a metodologia de superfície de resposta obteve-se o seguinte modelo matemático para a concentração de xilitol (P), ao nível de 95 % de confiança:

P

=

15,896-1,410

So-

o,487

si - 0,032

5o

2

A maior produtividade em xilitol (0,62 gll.h) foi obtida utilizando-se 73 gil de xilose na alimentação e mantendo-se 40 g/1 de xilose no reator.

Nestas condições, obteve-se 44 gil de xilitol com um fator de conversão de O, 79 g/g e uma eficiência de fermentação de 85 %.

ABSTRACT

Obtenção de Xilitol a partir de Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de-Açúcar em Sistema Descontínuo Alimentado. Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues. Dissertação de mestrado. Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Silvio Silvério da Silva (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. Adolfo Quesada Chanto e Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata. Agosto de 1997.

Xylitol production from sugar cane bagasse hydrolysate by fed- batch process using exponential feeding rate was evaluated. A factorial design was employed to study the effects of the xylose concentrations in fermented (S0) and in feed (Si) media upon the fermentation parameters. lt was found that none of the variables had a significant effect on the xylose-to-xylitol conversion factor. However, their effects on the xylitol concentration were significant. A response surface methodology permitted to obtain the following mathematical model for xylitol production (P) at 95 % confidence level:

P

=

15,896 - 1,410 So- 0,487 s, - 0,032 So2

The xylitol productivity value (0.62 g/1.h) was attained with 73 gil of xylose in the feed medium and 40 g/1 of xylose in the reactor. Under these conditions, 44 gil of xylitol was produced with O. 79 g/g conversion factor and 85 % fermentation efficiency.

CONTEÚDO LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS NOMENCLATURA 1- INTRODUÇAO 1 2· REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3 2.1- MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 3

2. 1. 1- Utilização do Bagaço de Cana-de-Açúcar 6

2.2- XILITOL 8

2.2.1- Características e Aplicações 8

2. 2. 2- Processos de Produção de Xilitol 11 2.2.2.1- Processo Qulmico 11

2.2.2.2- Processo Biotecnológico 13 2. 2. 3- Princípio Bioquímico da Produção de xilitol 13 2.2.4- Fatores que Influenciam na Bioconversão de Xilose em Xilitol 18 2.2.5- Utilização de Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de-

açúcar na Bioconversão de Xilose em Xilitol 20

2.3- PROCESSO DESCONTINUO ALIMENTADO 23

3- MATERIAIS E MÉTODOS 25

3.1- OBTENÇÃO, CONCENTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE AÇÚCAR 25

3.2- TRATAMENTO DO HIDROLISAD0 25

3.3- MICRORGANISMO 27

3.4- PREPARO DE MEI0 27

3.5- PREPARO DO INÓCULO 28

Conteúdo _ii

3. 6. 1- Fermentações em Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de-

Açúcar 29

3. 6. 1. 1- Cultivo inicial em sistema descontínuo 29 3.6.1.2- Cultivos em sistema descontínuo alimentado com

vezêo

exponencial

de alimentação 31

3.6.1.3- Cultivo em Sistema Descontínuo Alimentado com Vazão Constante

de Alimentaçlio 31

3. 6. 2- Fermentações em Meio Sintético 32 3.6.2.1- Cultivo em Sistema Descontínuo 32 3.6.2.2- Cultivo em Sistema Descontínuo Alimentado com Vazão Exponencial

de Alimentação 32

3. 6. 2. 3- Cultivo em Sistema Descontínuo Alimentado com Vazão Constante

de Alimentaçl!lo 33

3. 7- MÉTODOS ANALfTICOS 33

3. 7. 1- Concentração Celular 33

3. 7. 2- Concentreçêo de Açúcares e Acido Acético 34 3. 7.3- Concentreçêo de Furlural e Hidroximetilfurlural 34 3. 7. 4- ConcentraçlJo de Etanol 35 3. 7. 5- Determineçêo do Coeficiente Volumétrico de Transferência de

Oxigénio ( kLa ) 35

3.8- DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATNOS 35

3. 9- DELINEAMENTO EXPERIMENTAL. 36

4- RESULTADOS E DISCUSSAO 40

4.1- CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO 40

4.2- CINÉTICA DA FERMENTAÇÃO DESCONTINUA 41

4.2.1- Cultivo descontínuo em hidrolisado hemicelulósico de bagaço 42 4.2.2- Cultivo descontínuo em meio sintético 48

4.3- CUL TNO DESCONTINUO ALIMENTADO COM VAZÃO EXPONENCIAL DE ALIMENTAÇÃO

EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 53

4.3.1-Análise estatística da influência da concentração de xilose na

alimentaçlio e no meio de cultura sobre os parâmetros fermentativos 71

4.4- CULTIVO DESCONTINUO ALIMENTADO COM VAZÃO CONSTANTE DE ALIMENTAÇÃO

Conteúdo _iii

4.5- CULTNO DESCONTÍNUO ALIMENTADO EM MEIO SINTÉTIC0 86

6- CONCLUSÕES 90

A

RA

•

6- REFERENCIAS BIBLIOG FICAS 92

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: COMPOSIÇÃO(%) DOS RESIDUOS AGRÍCOLAS E DA MADEIRA (KUHAD E

SINGH, 1993) 4

TABELA 2: Usos POTENCIAIS DE PRODUTOS DA HIDRÓLISE LIGNOCELULÓSICA

(KUHAD E SINGH, 1993) 7

TABELA 3: CARACTERÍSTICAS E PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DO XILITOL

(HYVÔNEN ETAL., 1982; BÃR, 1986) 9

TABELA 4: CONTEÚDO DE XIUTOL EM ALGUMAS FRUTAS, VEGETAIS E PRODUTOS

RELACIONADOS (WANG E VAN EYS, 1981) 10

TABELA 5: COMPARAÇÃO E PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DOS CARBOIDRATOS

HIDROGENADOS (NOTHENBERG, 1994) 12

TABELA 6: COMPARAÇÃO DA PRODUÇÃO DE XIUTOL, FATOR DE CONVERSÃO DE

XILOSE EM XILITOL E PRODUTIVIDADE DE DIFERENTES SISTEMAS FERMENTATNOS

PARA OBTENÇÃO DE XILITOL 21

TABELA 7: FATORES E NlvEIS AVALIADOS NO PLANEJAMENTO FATORIAL 22 COM TRÊS

REPETIÇÕES NO PONTO CENTRAL 37

TABELA 8: MATRIZ DE PLANEJAMENTO COMPOSTA PELOS DADOS NATURAIS E

CODIFICADOS SEGUNDO UM PROJETO FATORIAL 22 COM TRÊS REPETIÇÕES NO

PONTO CENTRAL 37

TABELA 9: MATRIZ DE PLANEJAMENTO COMPOSTA PELOS DADOS NATURAIS E

CODIFICADOS SEGUNDO UM PROJETO FATORIAL 22 COM FACE CENTRADA E TRÊS

REPETIÇÕES NO PONTO CENTRAL 38

TABELA 10: CARACTERISTICAS DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE

CANA-DE-AÇÚCAR OBTIDO POR HIDRÓLISE ÁCIDA E SUBMETIDO A DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES 40

TABELA 11: PARÂMETROS FERMENTATNOS PARA O CUL TNO DE

CANO/DA GU/LLIERMONDII EM SISTEMA DESCONTINUO EM HIDROLISADO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR. 44

'·

-

Lista de Tabelas _V

TABELA 12: PARÂMETROS To,

Xo,

(Y XJs)o, A E µo DA EQUAÇÃO 1 (ITEM 3.6.1.2) OBTIDOS POR CULTIVO DESCONTINUO DE CANO/DA GUILLIERMONDII EM

HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR. 45 TABELA 13: PARÂMETROS FERMENTATIVOS PARA O CULTIVO DE

CANO/DA GUILLIERMOND/1 EM SISTEMA DESCONTINUO EM MEIO SINTÉTICO 50

TABELA 14: PARÂMETROS To,

Xo,

(Y XJS)o, µo E A DA EQUAÇÃO 1, (-DS/DT) DA EQUAÇÃO 4 E F (VAZÃO CONSTANTE DE ALIMENTAÇÃO) OBTIDOS POR CULTIVO DESCONTINUO DE CANO/DA GUILLIERMONDIIEM MEIO SINTÉTICO 51 TABELA 15: CONSUMO DE XILOSE, ARABINOSE E ÁCIDO ACÉTICO, INTERVALO DE

TEMPO DE ALIMENTAÇÃO E INTERVALO DE TEMPO DE FERMENTAÇÃO, DURANTE O CULTIVO DE CANO/DA GUILLIERMONDI/ EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR EM REGIME DESCONTINUO-ALIMENTADO,

SUBMETIDO A DIFERENTES CONDIÇÕES DE ALIMENTAÇÃO (TABELA 9) 63 TABELA 16: CONCENTRAÇÃO DE XILITOL, DE CÉLULAS E DE ETANOL, DURANTE O

CULTIVO DE CANO/DA GUILLIERMOND/1 EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR EM CULTIVO DESCONTINUO-AUMENTADO,

SUBMETIDO A DIFERENTES CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO (TABELA 9) 66 TABELA 17: RAzÃO XILITOUETANOL, FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL,

EFICIÊNCIA DE CONVERSÃO E PRODUTIVIDADE, DURANTE O CULTIVO DE CANO/DA

GU/LLIERMOND/1 EM HIDROLISAOO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-

AÇÚCAR EM CULTIVO DESCONTINUO-ALIMENTADO, SUBMETIDO A DIFERENTES

CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO (TABELA 9) 68

TABELA 18: MATRIZ DE PLANEJAMENTO E PARÂMETROS FERMENTATIVOS DA

BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL POR CANO/DA GUIWERMOND/1, EM SISTEMA DESCONTINUO-ALIMENTADO, USANDO UM PLANEJAMENTO FATORIAL 22 COM 3

REPETIÇÕES NO PONTO CENTRAL 72

TABELA 19: ESTIMA TIVA DOS EFEITOS, ERROS-PADRÃO E TESTE T DE "STUDENT" PARA O FATOR DE CONVERSÃO DA BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL POR

CANO/DA GU/LLIERMOND/1 EM SISTEMA DESCONTINUO-ALIMENTADO, SEGUNDO UM PLANEJAMENTO FATORIAL 22 COM TRÊS REPETIÇÕES NO PONTO CENTRAL. ... 73 TABELA 20: ESTIMATIVA DOS EFEITOS, ERROS-PADRÃO E TESTE T DE "STUDENT"

Lista de Tabelas

TABELA 28: PARÂMETROS FERMENTATIVOS DA BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL EM MEIO SINTÉTICO EM SISTEMA DESCONTINUO-ALIMENTADO, COM VAZÃO

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: ETAPAS DO PROCESSO OE PRODUÇÃO DO XILITOL POR VIA QUÍMICA

(HYVÔNEN ET AL., 1982) 14

FIGURA 2: ESQUEMA DA FERMENTAÇÃO DE D-XILOSE EM LEVEDURAS (BARBOSA

ET AL., 1988) 16

FIGURA 3: VIA METABÓLICA UTILIZADA NA FERMENTAÇÃO DE XILOSE POR LEVEDURAS

(HAHN-HÂGERDAL ET AL., 1994) 17

FIGURA 4: REATOR DE HIDRÓLISE ÁCIDA ...•... 26

FIGURA 5: FERMENTADOR BIOFLO Ili 30

FIGURA 6: CONCENTRAÇÃO DE XILOSE (•). DE XILITOL (A), DE CÉLULAS (e) E PH (0) DURANTE O CULTIVO DESCONTINUO DE CANDIDA GU/WERMOND/1 EM HIDROLISAOO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR. ..•... 42 FIGURA 7: VELOCIDADE ESPECIFICA DE CRESCIMENTO EM FUNÇÃO DO TEMPO PARA

O CULTIVO DESCONTINUO DE CANDIDA GUIWERMOND/1 EM HIDROLISAOO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ...•... 43 FIGURA 8: VAZÃO DE ALIMENTAÇÃO EM FUNÇÃO DO TEMPO PARA A OBTENÇÃO DE

XILITOL A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM SISTEMA DESCONTINUO ALIMENTADO PARA µo

=

0,048 hº1 {•) EXPERIMENTO 1,

(0) EXPERIMENTO 8 E {.Ã..) EXPERIMENTO 3 46

FIGURA 9: VAZÃO DE ALIMENTAÇÃO EM FUNÇÃO DO TEMPO PARA A OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM SISTEMA DESCONTINUO ALIMENTADO PARA µo= 0,055 h" {•) EXPERIMENTO 10,

(0) EXPERIMENTOS 5, 6 E 7 E (.Ã..) EXPERIMENTO 11 46 FIGURA 10: VAZÃO DE ALIMENTAÇÃO EM FUNÇÃO DO TEMPO PARA A OBTENÇÃO DE

XILITOL A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM SISTEMA DESCONTINUO ALIMENTADO PARA µo

=

0,090 hº1 {•) EXPERIMENTO 2,

(0) EXPERIMENTO 9 E (.Ã..) EXPERIMENTO 4 47

Lista de Figuras _ix

FIGURA 11: CONCENTRAÇÃO DE XILOSE (•), DE XILITOL (ô), DE CÉLULAS (•) E PH (0) DURANTE O CULTIVO DESCONTINUO DE CANDIDA GU/LLIERMONDIIEM MEIO

SINTÉTICO 48

FIGURA 12: VELOCIDADE ESPECIFICA DE CRESCIMENTO EM FUNÇÃO DO TEMPO PARA O CULTIVO DESCONTINUO DE CANDIDA GU/LLIERMOND/1 EM MEIO SINTÉTICO 49

FIGURA 13: VAZ.ÃO DE ALIMENTAÇÃO EM FUNÇÃO DO TEMPO PARA A OBTENÇÃO DE XILITOL EM MEIO SINTÉTICO, EM SISTEMA DESCONTINUO ALIMENTADO, COM

µo= 0,080 h"1 52

FIGURA 14: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) (A), MASSAS DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) (B) E CONCENTRAÇÃO OEÁCIDOACÉTICO (+) EPH (0) (C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, OURANTE CULTIVO DE CANDIDA GU/LLIERMONDII EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO OE BAGAÇO, EM REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So.Méoo = 25 g/1 (EXPERIMENTO 1 ) ... 54

FIGURA 15: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS (•). DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) (A), MASSAS DE CÉLULAS (e), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) (B) E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO(+) E PH (0) {C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO DE CANDIDA GUILLIERMOND/1 EM HIDROLISAOO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So,MÉOIO

=

38 g/1 (EXPERIMENTO 2) 55 FIGURA 16: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) {A),

MASSAS DE CÉLULAS (e), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) (B) E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO ( +) E PH ( 0) { C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, OURANTE CULTIVO OE CANO/DA GU/LLIERMOND/1 EM HIDROLISAOO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So,MÉot0 = 28 gil (EXPERIMENTO 3) 56

FIGURA 17: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) (A), MASSAS DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) (B) E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO(+) E PH (0) (C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO DE CANO/DA GUILLIERMOND/1 EM HIOROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So,MÉ0t0 = 42 gil (EXPERIMENTO 4 ) 57 FIGURA 18: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS(•). DE XILOSE (•) E DE XILITOL {ô) (A),

MASSAS DE CÉLULAS (e), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (ô) (B) E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO(+) E PH (0) (C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO DE CANDIDA GUILLIERMOND/1 EM HIOROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM

Lista de Figuras _X

REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So,Méot0=35 g/1 (MÉDIA DOS

EXPERIMENTOS 5, 6, 7) 58

FIGURA 19: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (A), MASSAS DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (B) E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO(+) E PH (0) (C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO

DE CANO/DA GUILLIERMOND/1 EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM

REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So,MéDtO = 26 g/1 (EXPERIMENTO 8) 59

FIGURA 20: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS (•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (A), MASSAS DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (B) E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO(+) EPH (0) (C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO

DE CANDIDA GUILLIERMOND/1 EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM

REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So,Méoio = 38 g/1 (EXPERIMENTO 9) ... 60

FIGURA 21: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS {e), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (A), MASSAS DE CÉLULAS (•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (B) E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO(+) E PH (0) (C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO

DE CANDIDA GU/LLIERMOND/1 EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM

REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So,MéDtO = 27 g/1 (EXPERIMENTO 10) .... 61

FIGURA 22: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS (e), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (A), MASSAS DE CÉLULAS(•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (B) E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO(+) E PH (0) (C), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO

DE CANDIDA GU/LLIERMOND/1 EM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM

REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM So,Mé0t0 = 38 g/1 (EXPERIMENTO 11 ) .... 62

FIGURA 23: REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA INFLUÊNCIA DAS CONCENTRAÇÕES DE XILOSE DO MEIO FERMENTADO E DO MEIO DE ALIMENTAÇÃO SOBRE A

CONCENTRAÇÃO DE XILITOL ...•... 67

FIGURA 24: REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA INFLUÊNCIA DAS CONCENTRAÇÕES DE XILOSE DO MEIO FERMENTADO E DO MEIO DE ALIMENTAÇÃO SOBRE O FATOR DE

CONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL. 69

FIGURA 25: REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA INFLUÊNCIA DAS CONCENTRAÇÕES DE XILOSE DO MEIO FERMENTADO E DO MEIO DE ALIMENTAÇÃO SOBRE A

Lista de Figuras _xi

FIGURA 26: DISTRIBUIÇÃO DE RESIDUOS DO MODELO (EQUAÇÃO 15) QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO DE XILITOL POR CANDIDA GUILLIERMONDII A

PARTIR DE HIOROLISADO DE BAGAÇO 76

FIGURA 27: DISTRIBUIÇÃO DE RESIDUOS DO MODELO (EQUAÇÃO 16) QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO DE XILITOL POR CANDIDA GUILLIERMONDII A

PARTIR DE HIDROLISADO DE BAGAÇO 81

FIGURA 28: SUPERFICIE DE RESPOSTA E CURVAS DE NlvEL DESCRITAS PELO MODELO QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO FINAL DE XILITOL POR

CANO/DA GUILLIERMONDII A PARTIR DE HIDROLISADO DE BAGAÇO (X 1 E X2

REPRESENTAM OS VALORES CODIFICADOS PARA AS VARIÁVEIS So E

81,

RESPECTIVAMENTE 82

FIGURA 29: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS (•), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) (A), CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO(+) E PH (0) (B), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO DE CANDIDA GUIU.IERMOND/1 EM HIDROLISADO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO, EM REGIME DESCONTINUO ALIMENTADO COM

F MÉDIO= 60 ml/h 84

FIGURA 30: CONCENTRAÇÕES DE CÉLULAS (e), DE XILOSE (•) E DE XILITOL (~) E PH (0), EM FUNÇÃO DO TEMPO, DURANTE CULTIVO DESCONTINUO ALIMENTADO EM MEIO SINTÉTICO COM VAZÃO EXPONENCIAL DE ALIMENTAÇÃO (A) E COM VAZÃO

NOMENCLATURA

Símbolo

!

Definição

F vazão volumétrica de alimentação

Si concentração de xilose do meio de alimentação

to

tempo de início da alimentação

So concentração de xilose no fermentador no instante

to

Xo

concentração de células no fermentador no instante

to

Vo volume de meio no fermentador no instante

to

µo velocidade específica de crescimento no instante

to

-(dS/dt)o velocidade de consumo de substrato no instante

to

(Y XJS)o fator de conversão de xilose em células no instante

to

Msc massa de xilose consumida

MP massa de xilitol produzida

CsA concentração de xilose do meio de alimentação

Cso concentração de xilose no fermentador no início alimentação

Csoo concentração de xilose no fermentador no início do cultivo gil descontínuo

CP concentração de xilitol produzido gil

CPAc concentração de xilitol acumulada no fermentador g/1 CPO concentração de xilitol no fermentador no início da g/1

alimentação

V A volume de meio alimentado V m volume de meio no fermentador V arn volume de amostra retirado

~t,: tempo total de fermentação

~ÍA tempo necessário para a alimentação Y Pts fator de conversão de xilose em xilitol

E eficiência de conversão Qpv produtividade volumétrica

I

Unidade 1/h g/1 h g/1 g/1 h-1 g/1.h g /g g g g/1 da g/1 h h g /g % g/1.h xii

Nomenclatura

Qp produtividade mássica

!

Unidade

Símbolo

l

Definição

g/h

µx velocidade específica de crescimento celular h ·1

µs velocidade específica de consumo de substrato h"

µp velocidade específica de formação de produtos h·1

e·

concentração de oxigênio dissolvido na saturação %

C concentração de oxigênio dissolvido em % da saturação %

kLa coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio h·1

CV causa de variação GL graus de liberdade

SQ soma de quadrados

QM quadrado médio

1- INTRODUÇÃO

Os resíduos da exploração vegetal e agroindustrial se acumulam na biosfera, constituindo-se em fontes de poluição ambiental, além da perda de recursos potencialmente valiosos. Os constantes aumentos no custo dos combustíveis energéticos, a necessidade de controle da poluição ambiental e de mudanças sociais têm desafiado todos os países a utilizarem eficientemente seus recursos renováveis e também a reciclarem resíduos orgânicos tradicionais. Esta biomassa apresenta um imenso potencial para que se crie tecnologias em bioprocessos para aumentar a produção de vários produtos, dentre eles o xilitol.

O xilitol é um adoçante com características peculiares como a não formação de cáries e prevenção das cáries já iniciadas em indivíduos que o utilizam em sua dieta. Além disso, pode ser utilizado por diabéticos, por pessoas obesas e por pacientes que apresentam desordens no metabolismo de gorduras. Estas características o tornam um produto com grande aplicabilidade em vários segmentos industriais como nos setores alimentício,

farmacêutico e odontológico. Convencionalmente, o xilitol é produzido por processo químico a partir de hidrolisados hemicelulósicos, o qual é de custo elevado. Uma tecnologia alternativa

e

promissora é a produção de xilitol por via biotecnológica a partir destes materiais.

A produção biotecnológica de xilitol tem sido objeto de estudos do Grupo de Processos Fermentativos (GPF) do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Os resultados obtidos têm sido bastante satisfatórios. Entretanto ainda existem várias dificuldades na fermentação de hidrolisados, devido principalmente à presença de compostos tóxicos ao metabolismo microbiano, como furfural, hidroximetilfurfural e ácido acético.

As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural ( < O, 1 g/1) encontradas no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar utilizado em trabalhos realizados pelo GPF, mostraram não ser inibitórias

à

produção de xilitol por Candida guilliermondii. A inibição pelo ácido acético tem

Introdução ₂

sido atenuada pelos tratamentos empregados no hidrolisado ou pela adaptação da levedura ao meio de fermentação. Portanto, pelos resultados obtidos pelo grupo é possível concluir que o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar pode ser utilizado na bioconversão de xilose em xilitol. O estudo de outros sistemas de fermentação, como o contínuo, o descontínuo alimentado, o emprego de células imobilizadas entre outros, em bioreatores de bancada é uma etapa importante no desenvolvimento de um processo econômico de produção de xilitol.

O presente trabalho tem por objetivo avaliar o sistema descontínuo alimentado para a obtenção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Para isto foi avaliada a influência da concentração de xilose mantida no fermentador durante a alimentação (So) e da concentração de xilose do meio de alimentação (Si), bem como a interação entre elas, sobre o processo, utilizando-se vazão exponencial de alimentação. O planejamento e a otimização dos experimentos foram baseados em conceitos de estatística multivariada, como projeto fatorial e análise de superfície de resposta.

2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 • MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

Os materiais lignocelulósicos são os compostos orgânicos mais abundantes na biosfera, representando aproximadamente 50 % da biomassa mundial (GOLDSTEIN, 1981; LUTZEN etal., 1983). Esta biomassa apresenta um imenso potencial para que se crie uma tecnologia em bioprocessos que aumente a produção de vários produtos, tais como glicose, polifenóis, ácidos orgânicos, metanol, etanol, acetona, butanol e proteína microbiana.

Estes materiais são constituídos basicamente por celulose, hemicelulose, lignina e outros constituintes em menores proporções (D'ALMEIDA, 1988). Entretanto, a sua composição exata não é bem definida, uma vez que varia de espécie para espécie em termos de seus constituintes químicos e das proporções entre eles (KUHAD e SINGH, 1993). A TABELA 1 apresenta a composição aproximada de alguns tipos de resíduos agrícolas e de madeira.

A celulose, principal componente da parede da fibra vegetal, é um homopolissacarídeo linear formado por unidades de D-glicose unidas através de ligações glicosídicas ~ (1-+4) (BISARIA e GHOSE, 1981; FENGEL e WEGENER, 1989; KUHAD e SINGH, 1993). A celulose contém regiões cristalinas e amorfas e a proporção de frações cristalinas está entre 50 e 90 %.

A lignina, por sua vez é uma macromolécula que possui uma estrutura polifenólica complexa que não é convertida em açúcares fermentescíveis (LADISCH, 1979). Sua estrutura não pode ser descrita como uma combinação simples de unidades monoméricas ligadas pelo mesmo tipo de ligação química, como no caso da celulose e da hemicelulose. É formada por moléculas de peso molecular elevado que atuam como um suporte para as fibras de celulose (FENGEL e WEGENER, 1989; KUHAD e SINGH, 1993). As ligninas presentes nas paredes celulares das plantas estão sempre associadas

Revisão Bibliográfica ₄

TABELA 1: Composição (%) dos Resíduos Agrícolas e da Madeira (KUHAD e SINGH, 1993).

Resíduos Hexosanas Pentosanas Lignina Cinzas Bagaço de cana-de-açúcar

₃₃

₃₀

₂₉

₄

Palha de Cevada

₄₀

₂₀

₁₅

₁₁

"Birch Wood"

40

33

21

4 Sabugo de Milho

42

39

14

2

Talo de Milho

₃₅

₁₅

₁₉

₅

Casca de Amendoim

₃₈

₃₆

₁₆

₅

Palha de Aveia

₄₁

₁₆

₁₁

₁₂

Pi nus

₄₁

₁₀

₂₇

8 Palha de Arroz

₃₂

₂₄

₁₃

₁₂

Casca de Arroz

₃₆

₁₅

19

20

Serragem

₅₅

₁₄

21

5

Palha de Sorgo

₃₃

₁₈

₁₅

₁₀

Palha de Trigo

30

24

18

10

Revisão Bibliográfica ₅

com as hemiceluloses, não só através da interação física como também de ligações covalentes.

Os constituintes menores da biomassa vegetal incluem extrativos e não-extrativos. As madeiras contêm entre 1 a 8 % de extrativos em base seca; os resíduos agrícolas contêm proporções mais elevadas. Estes extrativos consistem de graxas, gorduras, gomas, amidos, alcalóides, resinas, óleos essenciais e vários outros constituintes citoplasmáticos. Os não-extrativos compreendem entre 0,2 a 0,8 % da madeira em base seca e incluem compostos inorgânicos como sílica, carbonatos e oxalatos, sendo frequentemente responsáveis por determinadas características da planta, como cor, cheiro, resistência natural ao apodrecimento, sabor e propriedades abrasivas (D'ALMEIDA, 1988). Em resíduos agrícolas os não-extrativos podem estar em proporções maiores que 1 O % (KUHAD e SINGH, 1993).

A hemicelulose é a segunda fração mais abundante encontrada na natureza, podendo representar até aproximadamente 40 % do material da parede celular dos vegetais (BISARIA e GHOSE, 1981; TAYLOR

et

ai., 1990;

FERRARI

et

ai., 1992), agindo como substância de reserva e sustentação

(SCHLEGEL, 1975; FENGEL e WEGENER, 1989). Esta porção é constituída de 2 a 4 e, raramente, de 5 ou 6 tipos de açúcares (WHISTLER e RICHARDS, 1970). As hemiceluloses são formadas por pentoses (xilose e arabinose) e por hexoses (glicose, manose e galactose), e também por ácidos urônicos (KUHAD e SINGH, 1993). A hemicelulose encontra-se normalmente acetilada e a sua composição varia de uma espécie vegetal para outra (KUHAD e SINGH, 1993). Assim sendo, a xilose é o açúcar predominante nas madeiras duras (angiospermas), correspondendo a 80% dos açúcares presentes, enquanto as hexoses predominam nas madeiras moles {gimnospermas) (JEFFRIES, 1983; FENGEL e WEGENER, 1989).

Para a separação da fração hemicelulósica do complexo lignocelulósico têm sido empregados diferentes métodos, tais como: hidrólise ácida {LADISCH, 1979; TSAO, 1986), enzimática {MILAGRES e LACIS, 1991; KARNI et ai., 1993) e biológica (BISARIA e GHOSE, 1981); além da extração utilizando-se soluções alcalinas (du TOIT

et

ai., 1984) ou com dimetil sulfóxido

Revisão Bibliográfica ₆

A hidrólise ácida tem sido eficientemente empregada para a separação da fração hemicelulósica (LEE et ai., 1978). LADISCH (1979) constatou a formação de subprodutos indesejáveis, tais como furfural, hidroximetilfurfural, subprodutos da lignina e outros inibidores da fermentação durante a hidrólise ácida, além de corrosão ao equipamento e problemas ambientais e econômicos.

Na TABELA 2 são apresentadas algumas aplicações de produtos obtidos da hidrólise dos materiais lignocelulósicos.

A xilose, contida nos hidrolisados hemicelulósicos, tem sido estudada como fonte de carbono em diversos processos fermentativos (JEFFRIES, 1985) visando obter produtos de interesse econômico, como proteína microbiana (PESSOA JÚNIOR et ai., 1996), etanol (ROBERTO et ai., 1991 a; ROSEIRO et ai., 1991; FERRARI et ai., 1992), acetona, ácido acético,

butanol, ácido butírico (SADDLER et ai., 1983), butanodiol (GROVER et ai.,

1990), ácido lático (SILVA etal., 1990a) e xilitol (MEYRIAL etal., 1991;

FELIPE, 1994; SILVA et ai., 1994).

2.1.1 • Utilização do Bagaço de Cana-de-Açúcar

A área cultivada com cana-de-açúcar no Brasil ultrapassa os 5 milhões de hectares, correspondendo a uma produção de 240 milhões de toneladas (ORLANDO FILHO et ai., 1994). O principal resíduo oriundo desta

biomassa vegetal é o bagaço, proveniente da extração da sacarose e equivale a aproximadamente 280 kg por tonelada de cana moída (MOLINA JÚNIOR

et ai., 1995). Apesar de ser utilizado para geração de energia em caldeiras (VENTURINI FILHO e ADDISON, 1992), como suplemento em rações (LACÔRTE et ai., 1986) dentre outros fins, o bagaço de cana-de-açúcar ainda representa um grande excedente - cerca de 5 a 12 milhões de toneladas (SURGI, 1988), o que acarreta sérios problemas para o meio ambiente.

A degradação ambiental e a questão energética são as principais preocupações da humanidade nesse final de século. Uma das soluções possíveis é a utilização racional da energia disponível e dos resíduos da

Revisão Bibliográfica ₇

TABELA 2: Usos potenciais de produtos da hidrólise lignocelulósica (KUHAD e SINGH, 1993).

PRODUTOS APLICAÇÕES

Carboidratos para alimentação animal; processos fermentativos; xarope de frutose

Licor de açúcares Processos fermentativos: proteína microbiana, etanol, butano!, ácidos orgânicos, antibióticos, enzimas, etc. Glicose

Xilose Etileno; butadieno; hidroximetilfurfural; ácido levulínico; processos fermentativos com organismos selecionados; furfural adiponitrito; xilitol

Outros açúcares Fermentação com organismos selecionados; carboidratos para alimentação animal.

Lignina Combustível; carbono preto; sulfonatos como dispersantes e emulsificantes; agentes quelantes, humectantes; resinas, fenol benzeno; resinas fenólicas; vanilina; dimetil-sulfóxido; metil mercaptano.

Revisão Bibliográfica ₈

biomassa vegetal (KUHAD e SINGH, 1993). Neste panorama mundial a utilização do bagaço de cana-de-açúcar, resíduo abundante e renovável, como substrato em processos biotecnológicos surge como uma tecnologia atrativa e promissora. Esta biomassa apresenta um elevado teor de carboidratos (van ZYL et ai., 1988), cuja bioconversão origina produtos de interesse comercial como, por exemplo, o xilitol (FELIPE, 1994; RODRIGUES et ai., 1996; SILVA et ai., 1997).

2.2· XIUTOL

2.2.1 • Características e Aplicações

O xilitol é um álcool pentahidroxilado (pentiol) de xilose, com fórmula molecular CsH120s (HYVÔNEN et ai., 1982). Este açúcar possui várias características que o tornam um produto de interesse industrial, com aplicações em alimentos e fármacos. Possui propriedades anticariogênicas e não-cariogênicas (MAKINEN e SCHEININ, 1971; WÃLER et ai., 1992; AGUIRRE-ZERO et ai., 1993). Pode ser usado clinicamente como substituto para o açúcar na dieta de diabéticos e pessoas obesas pois não necessita de insulina para o seu metabolismo (TOUSTER, 1974; EMODI, 1978; PEPPER e OLINGER, 1988). O xilitol também pode ser utilizado por pessoas com deficiência da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, uma vez que esta não é envolvida em seu metabolismo (YLIKAHRI, 1979). Além disso, não participa de reações de escurecimento do tipo "Maillard" (HYVÔNEN et ai., 1982), o que permite seu uso em alimentos açucarados corno leite condensado. Quando empregado juntamente com pectina e ácidos sua gelatinização é semelhante à da sacarose, podendo ser utilizado em geléias (MANZ et ai., 1973). Na TABELA 3 estão apresentadas algumas propriedades físico-químicas do xilitol.

Na natureza o xilitol encontra-se presente em muitas frutas, vegetais e cogumelos (Psalliota campestris) como mostrado na TABELA 4. Entretanto, devido às baixas concentrações em que ocorre nestas fontes, a

Revisão Bibliográfica ₉

TABELA 3: Características e propriedades físico-químicas do xilitol (HYVÔNEN

et ai.,

1982; BÃR, 1986).

Pro riedades Características ou valores Fórmula e PM Aparência Odor Ponto de fusão Ponto de ebulição pH de uma solução a 5 % Densidade da solução Solubilidade a 30 ºC CsH120s ; 152, 15 g/mol Pó cristalino de cor branca Nenhum

92-96 ºC 216 ºC (1 atm} 5-7

a 1 O %: 1,03 g/cm3; a 60 %: 1,23 g/cm3 68 g/ 100 g solução (igual a da sacarose) Viscosidade da solução a 20 ºC a 10 %: 1,23 cP; a 60 %: 20,63 cP

Calor de dissolução - 36,6 cal/g

Valor calórico 4 kcal/g

Índice de refração (25ºC) a 10 %: 1,3471; a 50 %: 1,4132

Higroscopicidade Em elevada umidade relativa, o xilitol é mais higroscópico que a sacarose e menos

Revisão Bibliográfica 1 O

---

TABELA 4: Conteúdo de xilitol em algumas frutas, vegetais e produtos relacionados (WANG e van EYS, 1981).

PRODUTOS XILITOL* Vinho de maçã

₁₂₀

Cenoura Beringela

86,5

300

180

258

Couve-flor Endívia . Alface 131 Cebola

₈₉

935

96,5

268

56

362

107

128

Ameixa Abóbora Framboesa

Geléia de cereja vermelha Morango

Espinafre

Cogumelo branco

sua extração é inviável economicamente (HEIKKILÃ etal., 1991; NOLLEAU et ai., 1993).

Na TABELA 5 é apresentada uma comparação entre o xilitol e outros polióis. O xilitol apresenta um poder adoçante semelhante ao da sacarose e superior ao do sorbitol (MANZ et ai., 1973 ; HYVÔNEN et ai., 1982). Comparado aos outros polióis o xilitol destaca-se por que, além de ser não-cariogênico, é cariostático, ou seja, capaz de inibir o desenvolvimento de cáries já existentes {BÁR, 1986; PEPPER e OLINGER, 1988). Outra propriedade especial é o seu elevado calor de dissolução negativo, que confere sensação de frescor, tornando-o apropriado ao revestimento de gomas de mascar.

Os efeitos colaterais mais significativos do uso oral de xilitol são os distúrbios gastrointestinais. A quantidade usual tolerada é de 30-70 g/dia em pessoas não adaptadas e de até 400 g/dia em pessoas adaptadas (MAKINEN, 1976). Segundo MAKINEN (1976) após um período de adaptação de pessoas que tiveram problemas na dieta com este adoçante não foi verificado nenhum distúrbio e nem diferenças clínicas significativas na composição química do sangue e da urina. Desta forma, a adaptação ao uso de xilitol foi comprovada e este adoçante foi tão bem tolerado quanto a sacarose.

A utilização de xilitol como adoçante em produtos alimentícios nos Estados Unidos foi aprovada pela FDA (Food and Drug Administration) (TABELA 5) que o classificou como GRAS (Generally Recognised as Safe) (MAKINEN, 1976).

2.2.2· Processos de Produção de Xilitol

2.2.2.1- Processo Químico

Atualmente o xilitol é produzido por processo químico através da redução catalítica da xilose purificada em presença de catalisador de Níquel (MEL.AJA e HÁMÃLÃINEN, 1977; HYVÔNEN et ai., 1982). Este processo é de

TABELA 5: Comparação e principais caracteristicas dos carboidratos hidrogenados (NOTHENBERG, 1994).

Propriedades Sorbltol Manitol Maltitol (crist.)

Fórmula Química CsH140s CaH140a C12H24011

Classificação Monossacarídeo Monossacarídeo Dissacarídeo hidrogenado hidrogenado hidrogenado

Pto. fusão (ºC) 93-97 165-169 148 - 151 Calor de _{-26,5 -28,9 -18,9} dissolução (cal/g) Solubilidade a 26°C 235 22 165 ( g/100 g H20) Doçura relativa _{0,6 0,5 0,9} (sacarose= 1)

Aprovado Gras Aprovado

Status FDA _{interinamente,} Gras solicitado (a)

como aditivo

Status CEE Aprovado aditivo Aprovado aditivo Aprovado aditivo Preço

internacional 1,8-2,0 3,5-5,0 3,5-4,0

(US$ / kg)

custo elevado, uma vez que ocorre em reatores a elevada pressão e temperatura, além de requerer extensivas etapas de purificação da xilose antes de sua hidrogenação e várias etapas de purificação final para remoção do catalisador para que o xilitol possa ser empregado para fins alimentícios e farmacêuticos (OJAMO et ai., 1988; HEIKKILÁ et ai., 1990; NOLLEAU et ai.,

1993).

O esquema apresentado na FIGURA 1 representa o processo químico de produção de xilitol proposto por HYVÔNEN et ai. (1982).

2.2.2.2- Processo Biotecnológico

O processo biotecnológico oferece certas vantagens em relação ao processo químico, principalmente por não necessitar de uma solução de xilose de elevada pureza, já que a bioconversão de xilose em xilitol ocorre no próprio hidrolisado hemicelulósico (ROSEIRO et ai., 1991). Neste processo não há formação de componentes tóxicos no meio fermentado, reduzindo significativamente os custos relacionados com a separação e purificação do produto final. Entretanto, a eficiência e a produtividade da fermentação dependem principalmente do microrganismo, do meio de fermentação e das condições de condução do processo fermentativo (BARBOSA et ai., 1990; TAYLOR et ai., 1990).

2.2.3- Principio Bioquímico da Produção de xilitol

A obtenção de xilitol por via microbiológica é possível graças à capacidade de alguns microrganismos, especialmente leveduras, de sintetizarem a enzima xilose redutase (EC 1.1.1.21), a qual catalisa a redução de xilose em xilitol como primeiro passo na utilização de xilose (BARNETI, 1976; JEFFRIES, 1983). Esta reação requer a participação dos cofatores NADPH ou NADH. A seguir, o xilitol é oxidado a xilulose pela xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9) com participação de NAD+ como cofator

Revisão Bibliográfica 14

---

Hidrólise da

matéria-prima

solução rica em açúcares

Troca Iônica

e

Descoloração

Purificação final

. solução de pentose prurificada

Hidrogenação

Melaço de Açúcares

Fracionamento

e

Cristalização

Cristalização

e

Melaço __ de Poliol

XI LOS E

XILITOL

FIGURA 1: Etapas do processo de produção do xilitol por via química

(SLININGER et ai., 1987). A xilulose formada é fosforilada a xilulose 5-fosfato

a qual pode ser convertida a piruvato através da conexão da via das fosfopentoses com a via Embden Meyerhof Pamas (WEBB e LEE, 1992; NOLLEAU et ai., 1993).

Na FIGURA 2 é apresentado um esquema do metabolismo inicial da xilose em leveduras proposto por BARBOSA et ai. (1988).

As enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase diferem na especificidade pelas coenzimas NADPH, NADH, NAD e NADP (HORITSU

et ai., 1992; NOLLEAU et ai., 1993). Em Candida utilis, Debaryomyces hansenii

e Candida tropicalis a enzima xilose redutase requer apenas NADPH como coenzima, enquanto que a xilitol desidrogenase requer apenas NAD (SKOOG e HAHN-HÂGERDAL, 1988; ROSEIRO etal., 1991, HORITSU etal., 1992). NOLLEAU et ai. (1993) constataram baixos níveis de atividade de xilose redutase dependente de NADH nas leveduras Candida guilliermondii e

Candida parapsilosis. Resultados semelhantes foram encontrados por SILVA et ai. ( 1996 b) para a levedura Candida guilliermondii. Em estudos realizados

com as leveduras Candida shehatae e Pichia stipitis, a xilose redutase mostrou ser dependente tanto de NADPH quanto de NADH (BRUINEMBERG et ai.,

1984).

O esquema proposto por HAHN-HÃGERDAL et ai. (1994) (FIGURA 3) representa a principal via metabólica envolvida na fermentação de xilose por leveduras.

Durante o metabolismo de xilose em leveduras ocorre a oxidação completa de 1 mol de glicose 6-fosfato a C02, pela via das fosfopentoses, gerando 12 moles de-NAO(P)H a partir de NAD(Pt (BARBOSA et ai., 1988). Portanto, a produçã'õ de xilitol é favorecida por uma excessiva produção de NADPH durante o consumo de xilose (TAYLOR et ai., 1990). Segundo Jeffries (1982), citado por GONG et ai. (1983), o metabolismo de xilose ocorre em um ciclo fechado, o que garante a regeneração do NADPH necessário para a redução de xilose em ~mtot-, já que o xifüol produzido é eventualmente catabolisado, produzind<f' glicose 6-fosfato, que é rnetabolizada pela via das fosfopentoses regenerando esse cofator e mantendo o ciclo (FIGURA 3).

Xilose Xilo~

fT

NADPH NADP+ Xilulose Xilulose 5-fosfato

l

ADP

Via das pentose fosfato Via El\'IP

Cadeia respiratória

FIGURA 2: Esquema da fermentação de 0-xilose em leveduras (BARBOSA

Xilose Glicose

Transporte de açúcar para o interior das células 1'/ Xilose NADPH~~ NADP+ ~ Xilitol 1f Glicose NADH NAD+ NADP+ NADPH~ 6

l

Glucose6P

l

---- -Frutose 6P Rlbulose 6P •• .>

.>""

l

R

.b, &P , .: • •• •• / •• • Frutose 1,6-dlfoslato

/-

...

/

~

Sedoheptulose,' Gliceraldeldo dihldroxiacetona

: : ~NADH

• ' NAO+

Entrose 4P ,' Frutose 6P _{, #} ,' NAo•

- • .. " • , ' NADH Glicerol 3P

t

Xilulose

!~

Xilulose 6P

---

.'

---

Frutose 6P Plruvato Glicerol

nA -

Acetll C~oA NAD~cetaldeido

T\

Etanol

NAD+ NADH NAD+

NAD,...__~ Cadeia Respiratória

Acetato

FIGURA 3: Via metabólica utilizada na fermentação de xilose por leveduras (HAHN-HÃGERDAL

et ai.,

1994).

2.2.4· Fatores que Influenciam na Bioconversão de Xilose em Xilitol

Os principais fatores que interferem na fermentação da xilose para a produção de xilitol são: a concentração de açúcares no meio (HORITSU

et ai., 1992; NOLLEAU et ai., 1993; ROSA, 1996), a temperatura e o pH (SUNINGER et ai., 1990; VANDESKA et ai., 1993; ROSA, 1996), o fornecimento de oxigênio (FURLAN et ai., 1994; GUEBEL et ai., 1991;

NOLLEAU et ai., 1995), a fonte de nitrogênio (LU et ai., 1995; SILVA, et ai., 1994) e a forma de condução do processo (RODRIGUES et ai., 1997).

A influência da concentração inicial de xilose no meio de fermentação para a produção de xilitof tem sido objeto de vários estudos. Segundo GONG et ai. (1981) a produção de xilitol por Candida tropicalis HPX2 foi favorecida quando aumentou-se a concentração de xilose de 50 para 200 gil. Entretanto, quando a concentração de xilose é superior a 300 gil a pressão osmótica exercida pela alta concentração deste açúcar pode interferir negativamente na produção de xilitol (GONG et ai., 1981; OJAMO et ai., 1988). De acordo com constatações de OJAMO et ai. ( 1988) a interferência negativa de altas concentrações de xilose na produção de xilitol por

Candida guillierrnondii pode ser reduzida ou mesmo eliminada alterando-se a

condução do processo para descontínuo alimentado. Em estudos realizados por NOLLEAU et ai. (1993) o maior fator de conversão de xilose em xilitol obtido com Candida parapsilosis (0,74 g/g) ocorreu quando utilizou-se 100 g/1 de xilose e com Candida guillierrnondii (0,69 g/g) quando usou-se 300 gil de xilose. Segundo estes autores, as atividades das coenzimas NADPH e NADH parecem ser dependentes do fornecimento de oxigênio e da concentração inicial de xilose. VANDESKA et ai. (1993) encontraram o máximo rendimento em xilitol durante fermentação com Candida boidinii utilizando-se 150 gil de xilose, declinando com utilização de 200 gil deste açúcar.

Na fermentação em meio contendo mistura de glicose e xilose, a glicose é utilizada preferencialmente e a inibição da fermentação de xilose pode ocorrer dependendo das concentrações relativas destes açúcares no meio (BICHO et ai., 1988; du PREEZ et ai., 1986). SILVA et ai. (1996a) verificaram um aumento de 46 % no rendimento em xilitol por

trabalhos com Pachysolen tannophilus, constatou-se um efeito benéfico no consumo de xilose com a presença de 0,5 % de glicose no meio (JEFFRIES

et ai., 1985). Segundo FELIPE et ai. (1993) o efeito da glicose está relacionado

com a proporção em que esta se encontra em relação à xilose, e quanto maior a relação glicose/xilose, maior a inibição causada pela glicose. Segundo estes autores, em experimentos com Candida guilliermondii, quando a concentração de glicose foi inferior a 1 O o/o da concentração inicial de xilose a produção de xilitol não foi afetada.

O pH também é um fator capaz de influenciar a bioconversão de xilose em xilitol. Segundo PELCZAR et ai. (1980) as leveduras crescem melhor em meios ácidos com pH entre 3,5 e 3,8, sendo que os limites situam-se entre pH 2,2 e 8,0, de acordo com a espécie. Segundo ROBERTO et ai. (1996a) o pH inicial do meio afeta a produção de xilitol, sendo que o melhor resultado obtido com a levedura Candida guilliermondii ocorreu com um pH inicial de 5,3 (fator de conversão 0,68 g/g e produtividade 0,51 gll.h). Em estudos realizados com Candida shehatae a produção de etanol aumentou de 45 para 55 gil quando o pH passou de 4,5 para 6,0 (KASTNER et ai., 1996).

A temperatura influencia no crescimento, metabolismo, viabilidade e capacidade fermentativa das leveduras (GONG et ai., 1983;

BROCK e MADIGAN, 1994). A faixa de temperatura ótima para crescimento das leveduras é de 20 a 30 ºC, embora para algumas espécies esta faixa possa ser mais ampla, O a 47 ºC (PELCZAR et ai., 1980). Segundo du PREEZ et ai. ( 1986) em Candida shehatae CBS 2779 a produção de xilitol foi

favorecida com o aumento de temperatura de 22 para 36 ºC. O mesmo comportamento foi observado por BARBOSA et ai. ( 1988) para Candida guilliermondii, sendo que a concentração máxima de xilitol acumulada

(23 gil) e a maior velocidade específica de crescimento (0,89 hº1) ocorreram na temperatura de 35 ºC. SILVA (1994), trabalhando com esta mesma levedura verificou que a maior produção e o maior rendimento (O, 77 g/g) em xilitol foram obtidos na temperatuta de 30 ºC.

A disponibilidade de oxigênio no meio é outro fator que exerce grande influência na fermentação de xilose, sendo o rendimento em xilitol dependente da velocidade de transferência de oxigênio (DELGENES et ai.,

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1989; NOLLEAU et ai., 1993). Esta influência está relacionada com a regeneração de coenzimas e com a produção de ATP durante a fosforilação oxidativa (JEFFRIES, 1983; NOLLEAU et ai., 1993). Em condições aeróbias, ocorre a maior produção de massa celular, enquanto que em condições limitadas de oxigênio, uma grande parte da xilose é convertida em xilitol e a produção de etanol é baixa (LIGTHELM etal., 1988; GROOTJEN etal., 1991).

Para a levedura Candida guillierrnondii o fator de conversão obtido sob uma taxa de transferência de oxigênio de 2,2 mmol/1.h foi de 0,66 g/g, enquanto para Candida parapsilosis o fator de conversão foi de 0,75 g/g a um taxa de 0,4 mmol/1.h (NOLLEAU et ai., 1995). Em estudos realizados por MOLWITZ

et ai. (1996) com a levedura Candida guillierrnondii o fator de conversão

aumentou de O, 15 para 0,46 g/g quando a aeração diminuiu de 0,5 para 0,05 wm. Segundo estes autores sob uma aeração de 1 vvm nenhum xilitol foi detectado e a concentração celular foi de 24,4 g/1.

Na TABELA 6 encontram-se os resultados obtidos por alguns autores em diferentes sistemas fermentativos. Nesta tabela observa-se que a forma de condução do processo exerce grande influência sobre os parâmetros fermentativos.

2.2.6· Utilização de Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de- açúcar na Bioconversão de Xilose em Xilitol

Os hidrolisados hemicelulósicos ácidos oriundos da biomassa vegetal contêm substâncias inibitórias do metabolismo microbiano (FERRARI

et ai., 1992; KUHAD e SINGH, 1993). Dentre estes compostos estão aqueles oriundos da degradação de açúcares, como furfural e hidroximetilfurfural (JEFFRIES e STREENATH, 1988; FERRARI et ai., 1992), ácido acético (van

ZVL et ai., 1991; MEYER et ai., 1992 a e b), ácidos levulínico e fórmico (LADISCH et ai., 1983), compostos fenólicos derivados da lignina, tais como seringaldeído e vanilina, além de extrativos como resinas ácidas, taninos e terpenos (LEE e McCASKEY, 1983; TRAN e CHAMBERS, 1985; FERRARI

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et ai., 1992). Tais compostos devem ser removidos do meio ou terem suas

concentrações reduzidas para que o hidrolisado possa ser utilizado em processos de bioconversão (JEFFRIES et ai., 1983; van lYL et ai., 1988), uma vez que a interferência na atividade microbiológica leva a uma redução da eficiência de conversão dos seus açúcares componentes. Desta forma, diferentes tratamentos do hidrolisado têm sido utilizados, destacando-se o aquecimento (MARCHAL et ai., 1986); o tratamento com carvão ativo e resinas trocadoras de íons (van ZYL et ai., 1991; DOMINGUEZ et ai., 1996; PARAJÓ

et ai., 1996); a neutralização pela alteração do pH com bases e ácidos

(ROBERTO et ai., 1991 b; ALVES, 1997) e o tratamento com sais de alumínio (RAMOS, 1996). Pode-se destacar ainda a adaptação do microrganismo ao hidrolisado (CHEN e GONG, 1985; FELIPE et ai., 1996a; SENE, 1996); a utilização de alto nível de inóculo (CHUNG e LEE, 1985; FELIPE, 1994; FELIPE et ai., 1996b) e o reciclo de células (YU et ai., 1987; SENE, 1996) como formas de minimizar o efeito dos compostos tóxicos sobre o metabolismo microbiano.

Em fermentação empregando Saccharomyces cerevisiae foi verificada uma fase lag de crescimento celular além da inibição da multiplicação da levedura em presença de furfural na concentração de 3 gil (AZHAR et ai., 1981). O efeito inibitório do furfural também foi verificado na fermentação de xilose por Pichia stipitis (WEIGERT et ai., 1988; ROBERTO

et ai., 1991 a). Por outro lado, a presença de furfural nas concentrações de 0,2

a 1,0 gil em fermentações utilizando a levedura Candida guilliermondii favoreceu o rendimento em xilitol (OJAMO et ai., 1988), indicando que o furfural pode também estimular a formação de xilitol.

Alguns autores verificaram que a concentração de furfural e de hidroximetilurfural decresceu ou esgotou-se do meio durante a fermentação (AZHAR etal.,1981; TRAN e CHAMBERS, 1986), mas não conseguiram explicar tal fato. WEIGERT et ai. (1988) constataram o desaparecimento do furfural do meio de fermentação e sua transformação em álcool furfurílico pela enzima álcool-desidrogenase. Estes autores constataram ainda que a presença de álcool furfurílico (3,2 gil) inibiu o crescimento celular.

Vários estudos relatam o efeito do ácido acético sobre o metabolismo microbiano. Segundo JEFFRIES et ai. (1985), a presença deste ácido constitui-se em uma das principais diferenças entre a fermentação em meio sintético e a de hidrolisados hemicelulósicos. Para a levedura

Pichia stipitis o ácido acético foi um dos principais inibidores na fermentação de

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar (van ZYL et ai., 1988; van 2YL et ai., 1991). O mesmo foi constatado por du PREEZ et ai. (1991) em fermentações utilizando Candida blankii.

De modo geral, o efeito do ácido acético sobre o metabolismo microbiano deve-se à sua concentração e ao pH do meio de fermentação (HERRERO et ai., 1985; van ZVL et ai., 1991). Segundo HERRERO et ai. (1985), o ácido acético, no pH ótimo de crescimento de leveduras (4-5), encontra-se com mais da metade de suas moléculas não-dissociadas, o que permite uma difusão das mesmas para o citoplasma onde se dissociam ocasionando uma queda no pH intracelular. Como consequência, o gradiente de prótons através da membrana celular não pode ser mantido, ocorrendo um desacoplamento da produção de energia e o transporte de vários nutrientes é prejudicado. Este processo pode também influenciar no controle da glicólise (PAMPULHA e LOUREIRO-DIAS, 1990).

FELIPE et ai. (1995) estudaram a influência do ácido acético na fermentação de xilose por Candida guilliermondii em meio sintético. Estes autores constataram que a presença de até 1,0 g/1 deste ácido estimulou o consumo de xilose. Tal fato foi também observado no cultivo de

Pachysolen tannophilus (LEE e McCASKEY, 1983) e Klebsiella pneumoniae

(YU e SADDLER, 1982).

2.3· PROCESSO DESCONTINUO ALIMENTADO

Sistemas contínuo e descontínuo-alimentado de fermentação frequentemente conduzem a melhores fatores de conversão e produtividades de metabólitos microbianos que cultivas descontínuos (KUMAR et ai., 1991).

Na literatura consultada poucos trabalhos relatam a utilização do sistema descontínuo alimentado para a produção de xilitol. Os estudos realizados sobre a bioconversão de xilose em xilitol utilizando este sistema de fermentação foram feitos em meio sintético (du PREEZ et ai., 1989; YAHASHI

et ai., 1996; VANDESKA et ai., 1996).

Segundo YAHASHI et ai. (1996), a alimentação de glicose no cultivo de Candida tropicalis em meio contendo xilose proporcionou maior produtividade em xilitol (3,26 g/1.h) quando comparado com o sistema descontínuo (2,71 g/1.h). Segundo estes autores, este aumento deve-se ao fato de a xilose não ser desviada para o crescimento celular ou para a regeneração de NADPH. Desta forma, uma vez que hidrolisados hemicelulósicos contêm tanto xilose corno glicose, este sistema de fermentação pode ser conduzido com sucesso utilizando-se esta matéria-prima corno substrato para a bioconversão de xilose em xilitol.

Na fermentação de xilose por Candida boidinii em sistema descontínuo alimentado o maior crescimento celular ocorreu quando xilose e glicose foram utilizadas como meio de alimentação em relação a xilose pura, obtendo-se 39,41 gil de xilitol (VANDESKA et ai., 1996). A formação de xilitol por Candida boidinii foi favorecida pelo aumento na concentração inicial de xilose, mas ao mesmo tempo ocorreu inibição no crescimento pelo substrato, levando a um longo tempo de fermentação (VANDESKA et ai., 1995). Segundo estes autores, uma forma de contornar estes problemas seria a utilização do processo descontínuo alimentado, visando manter o crescimento e a concentração de substrato em níveis adequados durante o período de cultivo.

MEINANDER e HAHN-HÂGERDAL (1997), em estudos realizados com cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae em cultivo descontínuo alimentado com alimentação de glicose, obtiveram uma eficiência de conversão de xilose em xilitol de 100 %, com uma produtividade volumétrica de 0,57 g/1.h. De acordo com estes autores, o emprego de glicose como co- substrato para a produção de xilitol deve ser feito em sistema descontínuo alimentado para evitar problemas de inibição da fermentação de xilose pela glicose.

3- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 • OBTENÇÃO, CONCENTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO HIDROUSADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA·DE ÃÇÚCAR

O bagaço de cana-de-açúcar, proveniente da Usina Santa Bárbara em Santa Bárbara d'Oeste - SP, foi seco em estufa a 100 ºC, até peso constante, a fim de determinar-se o seu teor de umidade. A hidrólise ácida do bagaço de cana-de-açúcar foi realizada nas instalações da planta piloto do Departamento de Engenharia Química (DEQUI) da FAENQUIL em reator de aço inox AISI 316 (FIGURA 4) com capacidade volumétrica total de 250 litros, equipado com camisa de óleo térmico para aquecimento indireto por resistência elétrica. Operou-se em regime descontínuo sob as seguintes condições: 100 mg de ácido sulfúrico para 1 g de matéria seca, 121 ºC, tempo de reação 1 O minutos, relação sólido-líquido 1: 1 O. O hidrolisado obtido foi primeiramente centrifugado em uma centrífuga industrial para a retirada da massa residual de sólidos.

A fim de aumentar o teor de xilose para 3, 4 e 5 vezes a sua concentração original, o hidrolisado foi concentrado em evaporador à vácuo de 4 litros de capacidade útil, operando a 70 ± 5 ºC. Os hidrolisados foram caracterizados quanto ao pH, à concentração dos açúcares (xilose, glicose e arabinose) e à concentração de ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural.

3.2· TRATAMENTO DO HIDROUSADO

Empregou-se o tratamento proposto por RAMOS (1996), que consiste na alteração do pH inicial para 8,0 pela adição de óxido de cálcio comercial (pó), seguida de aquecimento a 50 ºC e posterior adição de sulfato

1- Reator de Hidrólise 2- Condensador

3-Tanque para os Condensados 4- Centrífuga Semicontínua 5- Sistema de Agitação

de alumínio (solução a 30 %) de modo a obter-se uma concentração de 10 g/1 na solução. O hidrolisado tratado foi deixado em repouso por 1 hora, e, em seguida, seu pH foi ajustado para 5,5 pela adição de óxido de cálcio comercial. A cada alteração de pH o hidrolisado foi filtrado para a remoção do precipitado formado.

O hidrolisado tratado foi autoclavado (SOC. FABBE LTDA) a 111 ºC por 15 min.

3.3· MICRORGANISMO

Utilizou-se a levedura Candida guilliermondii FTI 20037 selecionada por BARBOSA et ai. (1988). As células foram mantidas a 4 ºCem ágar extrato de malte (Merck).

3.4· PREPARO DE MEIO

Os meios de fermentação e de alimentação foram compostos por hidrolisado (fator de concentração 3, 4 ou 5) e suplementados com os seguintes nutrientes (em g/1): sulfato de amônia (5), cloreto de cálcio (0,1) e extrato de farelo de arroz (20). Para os experimentos em meio sintético substituiu-se o hidrolisado por uma solução de xilose de modo a alcançar 48 ou 73 g/1 no meio e por solução de glicose para alcançar 3,5 ou 6,0 g/1 no meio.

As soluções de sulfato de amônia e cloreto de cálcio foram preparadas na concentração de 30 % (p/v) e a solução de farelo de arroz foi preparada adicionando-se 200 g de farelo "ln natura" para 1 1 de água destilada. Estas soluções foram esterilizadas separadamente a 121 ºC por 20 min. O extrato de farelo de arroz foi obtido centrifugando-se a solução de farelo assepticamente a 1070 x g por 15 min (centrífuga Cu-5000 - Damon/lEC