4. Princípio de ação e reação do produto: base científica, explicação da metodologia, técnicas e reações envolvidas

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Instruções de Uso

1. Nome Comercial e marca da família de produtos FAMÍLIA HLA SOROLÓGICO DE CLASSE II

Marca: One Lambda

2. Formas de apresentação do produto e composição 2.1. Descrição de cada item que constitui a família

Código do produto Descrição do produto

MDR172 Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe II - HLA MDR172 - 10 placas

CDR5 Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR5 - 1 x 5mL CDR50 Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR50 - 1 x 50mL CDR1D Complemento de Coelho para HLA Classe II Liofilizado - CDR1D -

1 x 1mL

ABSG Reagente Controle Anti-Linfócito B IgG - ABSG - 1 x 1mL ABSM Reagente Controle Anti-Linfócito B IgM - ABSM - 1 x 1mL FB2-100 Reagente de Isolamento (separação) - FB2-100 - 1 x 10mL PC1-500 Reagente Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato - PC1-500 - 1 x

500mL

NS Reagente Controle Negativo - NS - 1 x 1mL

3. Descrição da finalidade ou uso do produto

A Placa para tipagem de HLA Terasaki é uma placa de poliestireno com 60, 72 ou 96 poços contendo anticorpos alo ou monoclonais conhecidos contra antígenos HLA. Cada poço contém 1 µl de um antissoro específico ou anticorpo monoclonal e 5 µl de óleo mineral. Cada placa contém um controle positivo e um negativo. Para uso na determinação de antígenos HLA classe II na superfície da célula através da metodologia de microlinfocitotoxicidade dependente de complemento.

Os controles ABSG, ABSM e NS são usados para testar a pureza das preparações celulares. Podem também ser usados em combinação para identificar a contaminação de preparo de células.

Os complementos CDR5, CDR50 e CDR1D são utilizados em ensaios de citotoxicidade dependentes de complementos para determinar os antígenos HLA de Classe II da superfície celular.

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2 O componente Fluorobeads B fornece um procedimento simples para o isolamento de Linfócitos B para uso em testes de tipagem HLA classe II usando corantes fluorescentes. PBS/Citrato é um reagente para ser usado no método de isolamento Fluorobeads B.

Material para uso em laboratório de imunologia na tipagem HLA, através deste teste determina-se a compatibilidade HLA entre indivíduos. Este teste é denominado de teste de histocompatibilidade.

4. Princípio de ação e reação do produto: base científica, explicação da metodologia, técnicas e reações envolvidas

Linfócitos viáveis são incubados com uma mistura de anticorpos ligados a complemento. Se o linfócito possuir um antígeno reconhecido por um anticorpo específico, a porção FAB do anticorpo se liga ao antígeno, formando um complexo antígeno-anticorpo. Após a formação destes complexos, com a fração C1q e o Ca++ do complemento ligam-se à porção FC do anticorpo.

Um anticorpo IgM é necessário para ligar uma molécula C1q ou dois anticorpos IgG são necessários para ligar uma molécula C1q. A ligação C1q inicia a cascata do sistema complemento qual induz a uma lise da célula com o complexo antígeno-anticorpo. Em uma reação negativa, os linfócitos se mantêm viáveis. Em uma reação positiva, os linfócitos estão mortos.

5. Componentes fornecidos e não fornecidos com o produto: especificações ou características qualitativas ou quantitativas

Código do

produto: Material Fornecido: Materiais necessários, porém, não fornecidos:

MDR172

1) 10 placas de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe II - HLA MDR172; 2) Worksheets identificando a especificidade de cada anticorpo monoclonal;

3) Instruções de uso.

1) Microsseringas HLA (micro dispensadores/dosadores); 2) Insta-Seal (OLI cat. TIS250U) lâminas cobertas ou lâminas de vidro e óleo mineral (Vaseline);

3) Reagentes corantes e fixadores:

- Para teste de exclusão de corante: eosina-Y (base sódica) e formaldeído, ou Stain-Fix (cat. SF-500 da One Lambda); - Para teste fluorescente: FluoroQuench AO/EB (cat. # FQAE-500 da One Lambda).

4) Eliminação da Hemoglobina:

- De soro bovino liofilizado: EDTA PBS a 5%; azida sódica a 1%.

- De células vermelhas totais: solução salina; EDTA PBS a 5%; solução azida a 1%.

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3 5) Solução a 1% de tinta: soro albumina bovino (BSA); EDTA PBS 5%; azida sódica; tinta preta de caligrafia Higgins;

6) Solução 5% EDTA (dissódico) PBS;

7) Solução estoque de Brometo de etídio (EB): água destilada; PBS;

8) Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA);

- Solução stock: Dissolva 10 mg de CFDA em 1ml de acetona num tubo de vidro. Armazene a –20 °C em tubos de Beckman.

- Solução de trabalho: Use uma das seguintes:

• Preparado em PBS a pH 7,2: Acrescente 30 µl de solução stock CFDA a 5ml de PBS (pH 7,2). Armazene a 2–5 °C durante um período máximo de 1 semana.

• Preparado em PBS a pH 5,5: Acrescente 30 µl de solução stock CFDA a 5ml de PBS (pH 5,5). Armazene a 2–5 °C durante um período máximo de 1 semana.

CDR-5

1) 1 frasco com 5 mL de Complemento de Coelho para HLA Classe II;

2) Instruções de uso. Não aplicável.

CDR-50

1) 1 frasco com 50mL de Complemento de Coelho para HLA Classe II;

CDR-1D

1) 1 frasco com 5mL de Complemento de Coelho para HLA Classe II Liofilizado;

ABSG

1) 1 frasco com 1mL de Reagente Controle Anti-Linfócito B IgG;

ABSM

1) Reagente Controle Anti-Linfócito B IgM - ABSM - 1 x 1mL;

NS

1) 1 frasco com 1mL de Reagente Controle Negativo;

FB2-100 1) 1 frasco com 10mL de Reagente de Isolamento (separação);

2) Instruções de uso.

1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda ou equivalentes);

2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 ml e 1,5 ml, com tampas;

3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca++ e Mg++ (ou seja, Irvine Scientific, Nº de Catálogo 9249);

4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%; 5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente); 6) Aspirador ou pipetas descartáveis;

7) Reagente PBS/Citrato:

- Número de catálogo OLI PC1-500, ou - Reagente PBS/Citrato

(1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g. de citrato trissódico dihidratado e 2,5 g. de ácido cítrico em 90 ml de água destilada. Perfaça um volume final de 100 ml. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.

(2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10 ml de 10X citrato a 90 ml de PBS. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.

8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS)

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4 para inativar o complemento. Armazene a uma temperatura entre 2 a 5°C ou aliquote e congele a –20°C; - Solução de trabalho: Adicione 5 ml de solução stock de HIFCS a 95 ml de meio de McCoy ou equivalente.

PC1-500 1) 1 frasco com 500mL de Reagente Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato; 2) Instruções de uso.

1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda ou equivalentes);

2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 ml e 1,5 ml, com tampas;

3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca++ e Mg++ (ou seja, Irvine Scientific Nº de Catálogo 9242);

4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%; 5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente); 6) Aspirador ou pipetas descartáveis;

7) Reagente PBS/Citrato:

- Número de catálogo OLI PC1-500, ou - Reagente PBS/Citrato

(1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g. de citrato trissódico dihidratado e 2,5 g. de ácido cítrico em 90 ml de água destilada. Perfaça um volume final de 100 ml. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.

(2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10 ml de 10X citrato a 90 ml de PBS. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.

8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS)

- Solução stock: Aqueça o FCS a 56°C durante 30 minutos para inativar o complemento. Armazene a uma temperatura entre 2 a 5°C ou aliquote e congele a –20°C; - Solução de trabalho: Adicione 5 ml de solução stock de HIFCS a 95 ml de meio de McCoy ou equivalente.

5.1. Instrumentos requeridos, porém, não fornecidos:

• Microscópio de contraste de fase, que poderá ser invertido e com fluorescência, dependendo da metodologia de separação de linfócitos utilizada. Consultar sempre a Biometrix Diagnóstica para maiores esclarecimentos.

6. Condições de armazenamento, transporte, limites de temperatura, umidade ou proteção à luz

Validade e condições de armazenamento e transporte de cada um dos produtos pertencentes a esta família estão indicados a seguir:

Código do

produto Informações sobre transporte

Temperatura de armazenamento MDR172

Os produtos devem ser transportados congelados,

acondicionados com gelo seco. -65°C ou inferior CDR-5

acondicionados com gelo seco. -65°C ou inferior CDR-50

(5)

5 CDR-1D

Os produtos devem ser transportados

refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. 2°C-8°C ABSG

acondicionados com gelo seco. -20°C ou inferior. ABSM

acondicionados com gelo seco. -20°C ou inferior. NS

acondicionados com gelo seco. -20°C ou inferior.

FB2-100

refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. 2°C-8°C

PC1-500

refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. 2°C-8°C No caso de material congelado, somente descongelar o que será imediatamente utilizado. Se necessário, aliquotar o conteúdo em tubos de menor volume. Este volume deve ser determinado por cada laboratório, pois é dependente da rotina de cada um.

7. Precauções e esclarecimentos sobre riscos com o uso do produto Somente para uso em diagnóstico in vitro.

Cuidados especiais: quando do manuseio do produto, utilizar luvas descartáveis. Descartar se houver descongelamento prematuro.

CUIDADO: Todos os produtos de origem sanguínea devem ser tratados como potencialmente infecciosos. A fonte de material do qual esse produto foi derivado foi dada como negativa quando testada de acordo com os requerimentos para testes pela FDA. Nenhum método de teste conhecido pode assegurar que produtos derivados de sangue humano não transmitirão agentes infecciosos.

Não existem padrões Americanos que indiquem potência ou especificidade.

8. Orientação sobre os cuidados com a amostra biológica objeto do diagnóstico Manipular como material potencialmente infeccioso por tratar-se de material para teste diagnóstico que envolve amostra de origem sanguínea humana.

9. Descrição do Processo de Medição 9.1. Coleta e preparo da amostra

a. Sangue armazenado por menos de 24 horas: coloque 15-20 ml de sangue total em heparina de sódio (1000 unidades/10 ml de sangue) em tubo “vacutainer” tampa verde.

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6 b. Sangue armazenado por mais de 24 horas: coloque 15-20 ml de sangue total em tubo “Vacutainer” ACD ou CPDA.

c. Não use heparina de lítio. IMPORTANTE: o sangue deve ser armazenado horizontalmente entre 22 e 25°C. Não refrigere.

9.2. Isolamento de Linfócito a partir de Sangue Fresco

a. Centrifugue sangue citrificado ou heparinizado por 10 minutos a 400g. b. Colete a camada tamponada e dilua em volume igual de PBS (fosfato salino tamponado); misture bem.

c. Espalhe um máximo de 2 ml da mistura da camada tamponada/PBS sobre 1,5ml de Ficoll-Hypaque em tubos de 5ml, e centrifugue por 10 minutos a 1000g.

d. Colete aproximadamente 1 ml da interfase de cada tubo e transfira para tubos tipo “Fisher”. Centrifugue por 1 a 1 ½ minuto a 3000g em uma centrífuga tipo “Fisher”.

e. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o botão em PBS. Centrifugue por 1 min a 1000g (isto remove a maioria das plaquetas).

f. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o botão em PBS, e então, adicione 1 gota de trombina (100 unidades/ml). Misture.

g. Coloque os tubos para girar em uma roda vertical a 8 rpm ou inverta os tubos por 2-5 minutos ou até que apareçam agregados brancos.

h. Centrifugue por 3 minutos a 1000g em uma centrífuga tipo “Fisher” e transfira o sobrenadante para limpar os tubos tipo “Fisher”. Os agregados remanescentes podem ser poupados para o procedimento de isolamento de monócitos. Centrifugue o sobrenadante por 1 minuto a 1000g.

i. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o botão por 1 minuto a 1000g. Repita.

j. Ressuspenda o botão em meio de McCoy e ajuste as células para uma concentração de 2x106 células/ml de linfócitos totais para tipagem.

Separando/Isolando linfócitos B

Atualmente existem diferentes procedimentos para o isolamento de linfócitos B, sendo que os mais utilizados são:

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7 a. Através da observação empírica, notou-se que os linfócitos B têm a tendência de se aderir às superfícies sólidas, enquanto que os linfócitos T são relativamente não aderentes. Com isso, o uso da técnica de aderência em lã de nylon ainda pode ser usado por alguns laboratórios, sendo que a viabilidade em células não frescas é bem baixa, dificultando no processo de tipagem de classe II.

b. Através do processo onde pérolas imunomagnetizadas se ligam aos linfócitos (T ou B) e desta forma através da atração magnética esses linfócitos são isolados das demais células presentes na amostra. (FluoroBeads específicas para linfócito T ou B).

Seguem explicações mais detalhadas sobre as técnicas a seguir:

9.3. Micro técnica do canudo com lã de nylon: As proporções dadas abaixo são para coluna capaz de manusear até 10 x 106 células/mL.

a. Feche uma das saídas de um canudo plástico, flexível e transparente (0,6 x 12-14 cm) em ângulo de 45º;

b. Proceda com um bom retalhamento de 0,1g de lã de nylon esfregado encharcando-o em HBSS ou PBS em uma placa de Petri;

c. Encha ¾ do canudo com HBSS ou PBS, então, usando a ponteira de uma pipeta, gradualmente e emparelhadamente coloque a lã de nylon dentro do canudo para uma altura de aproximadamente 6 cm. Nesse estágio a coluna pode ser armazenada a 4°C por até 2 semanas;

d. Corte ou perfure o lado selado do canudo fazendo uma abertura de aproximadamente 2 mm;

e. Lave a lã de nylon com 5 ml HBSS ou PBS e então com 5ml de meio contendo HIFCS a 5%;

f. Quando o meio cobrir a lã de nylon, gire o canudo para a posição horizontal e incube por 30 min. a 37°C. Alternativamente, use meio pré-aquecido (morno);

g. Adicione 0,5ml de suspensão de linfócitos purificados (procedimento descrito acima) em HIFCS a 5% ao topo da coluna e permita ás células moverem-se por todo o percurso dentro da lã. Uma boa separação de célula T

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8 e B dependem da pureza da preparação de linfócitos iniciais; Portanto, a suspensão deverá ser isenta de granulócitos e plaquetas.

h. Adicione aproximadamente 0,2ml de HIFCS a 5% ao topo da coluna para prevenir ressecamento. Deixe a coluna deitada e incube a 37°C por 30min; i. Para recuperar os linfócitos T, realize 2 lavagens (8ml cada) com HIFCS a 5% morno (37°C) gotejando através da coluna que deverá estar na posição vertical. O eluente contém células T não aderentes;

j. Para recuperar as células B aderentes, adicione 1,5ml de HIFCS a 5% à coluna e repetidamente esprema o canudo. Continue esta etapa até que 8 ml do meio tenha sido usado;

k. Centrifugue ambas as suspensões de células T e B por 5 min a 1000g e lave-as 1 vez com 1ml de HIFCS a 5%;

l. Resuspenda as células em quantidade mínima de meio (e.g. 0,5ml), verifique a viabilidade, conte as células e ajuste a concentração para 2x106 células/ml;

m. Na média, esse procedimento deverá fornecer uma recuperação de 80-90% das células.

9.4. Isolamento de linfócitos B puros através de pérolas imunomagnetizadas – Fluorobeads B (One Lambda, Inc.)

Este procedimento leva menos de 10 minutos para ser completado, sendo que o procedimento é realizado totalmente à temperatura ambiente. Fluorobeads B é um reagente de separação composto de partículas imunomagnéticas acopladas a anticorpo monoclonal (CD19) específico para o linfócito B. Essas pérolas seletivamente se ligam aos linfócitos B e são então isoladas com o auxílio de um magneto (FBAMAG6 + 6 – One Lambda, Inc.).

- Isolamento a partir de Sangue Total:

a. Dispense 5 ml de sangue dentro de um tubo de 15ml b. Adicione 5 ml de PBS/Citrato 1X e misture por inversão

c. Ressuspenda as FluoroBeads B completamente antes do uso. Agite em aparelho agitador tipo Vortex por 10 segundos.

d. Adicione 100 ul de FluoroBeads T à amostra teste. Imediatamente tampe o tubo e inverta-o por 2-3 minutos para dispersar as pérolas magnéticas

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9 e. Agite delicadamente o tubo através de rotação por 5 minutos à temperatura de 22-25°C para permitir que as pérolas se liguem às células B (não exceder 5 minutos). Pode ser usada rotação manual ou mecânica.

f. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 5 minutos. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Remova então o tubo do magneto.

g. Adicione 2-3 ml de PBS/Citrato 1X (PC1-500). Agite o tubo para a ressuspensão das beads.

h. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 1 minuto. i. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Remova então o tubo do magneto.

j. Repita esta etapa de lavagem somente com o PBS/Citrato 1X mais duas vezes.

k. Proceda com os procedimentos de identificação e marcação da célula descrita abaixo, ou ressuspenda as células (beads) em 0,5 mL de meio McCoy ou equivalente com 5% HIFCS.

9.5. Procedimento de Marcação e Concentração da Célula

A. Pelo método CFDA:

1. Destampe e coloque o tubo em um separador magnético por 1 minuto. Remova o sobrenadante. Ressuspenda as células (beads) com PBS. Repita esta etapa duas vezes.

2. Adicione 0,5mL de CFDA (solução de trabalho, pH 5.5) e misture. 3. Incube o tubo horizontalmente no escuro por 10 minutos a 20-25°C. 4. Repetir etapa #1

5. Ressuspenda as células em 0,5mL de meio McCoy ou equivalente com 5% HIFCS.

6. Adicione 1µL de suspensão celular a um poço branco de uma placa Terasaki. Verifique a contagem de células através de um microscópio de fluorescência. Ajuste a concentração para 2 x 106/mL (2.000 células por poço).

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10 7. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5ml e

armazenadas horizontalmente a 2-5°C por até 2 dias antes de serem aplicadas nas placas para o teste.

B. Método do FQAE – FluoroQuench (corante) com Brometo de etídeo e

Laranja de acridina:

1. Transfira 1 µl de células (beads/pérolas) para um poço branco de uma placa Terasaki

2. Adicione 5 µl de FQAE (cat. OLI # FQAE-500) ao poço.

3. Verifique a contagem da célula através de um microscópio de fluorescência. Ajuste, remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Remova então o tubo do magneto.

4. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5ml e armazenadas horizontalmente a 2-5°C por até 2 dias antes de serem aplicadas nas placas para o teste.

Após este procedimento, teremos células B prontas para tipagem HLA de classe II. Obs.: o protocolo a seguir é um protocolo recomendado, partindo-se do pressuposto de que o laboratório estará utilizando a metodologia do FQAE como corante das células. Tempos de incubação podem variar dependendo da força de tipagem dos reagentes e/ou complemento utilizado. (A One Lambda sugere 30 minutos com o anticorpo e 60 minutos com o complemento, nas placas de tipagem de HLA).

- Procedendo com o teste:

Devido à resistência de cada reagente, tome os cuidados necessários quando dispensar as células e os reagentes. Não toque o fundo dos poços com as agulhas das seringas.

Descongele as placas à temperatura ambiente (20-25°C) por 15 minutos, e use-as dentro de 1 hora após a retirada do freezer. Agite o tubo contendo sua amostra por inversão – não agite através do procedimento de pipetagem repetitiva.

1. Para cada poço adicione 1µl de uma suspensão de linfócitos B (2 x 106 células/ml) para as placas de tipagem HLA, usando uma seringa de 50 µl conectada a um dispensador de repetição.

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11 3. Incube as placas à temperatura ambiente (20 a 25°C) por 60 minutos para as

placas monoclonais e avance para a etapa # 6.

_{Para placas com alosoro, incube por 30 minutos a 20-25°C.}

4. Adicione 5uL de complemento DR (CDR-5, CDR-50 ou CDR1D) a cada poço da placa com alosoro. Incube por 1 hora no escuro.

OBS.: Placas Monoclonais (LMT ou SMT): Não é necessária esta etapa de adição de complemento de coelho e este período de incubação. Da etapa (4) avance diretamente para a etapa (6)

5. Em cada poço adicione 5uL de FQAE.

6. As placas podem ser lidas de imediato ou então poderão ser armazenadas a 2-5°C por até 2 dias.

Célula morta ocorrerá em qualquer poço teste onde o antígeno HLA na superfície da célula é reconhecido pelo seu anticorpo anti-HLA conjugado. Para teste de fluorescência, os linfócitos negativos (vivos) aparecem verdes, e os linfócitos positivos (mortos) aparecem vermelhos (quando usando corante fluorescente da One Lambda com laranja de acridina e brometo de etídio – FQAE-500).

9.6. Avaliação Microscópica dos Testes

- É feito o “score” da reação pela estimativa de percentual de células mortas. Se houver linfócitos mortos no controle negativo, o percentual de células mortas nos poços restantes tem que ser ajustado de acordo. O padrão ASHI de leitura é:

Score % de células mortas Interpretação

1 0 - 10 % Negativo 2 11 - 20 % Negativo duvidoso 4 21 - 50 % Positivo fraco 6 51 - 80 % Positivo 8 81 - 100 % Fortemente positivo 0 --- Ilegível

As frequências fenotípicas para HLA de classe I variarão de modo diferente nas diferentes populações (i.e., caucasóides, negróides, orientais, etc.). Referência 4.

(12)

12 10. Procedimentos de calibração do processo de medição

Não existe procedimento de calibração para a metodologia em questão.

11. Procedimentos de cálculos e obtenção dos resultados da medição

Não existe cálculo para a obtenção dos resultados da medição. O resultado é feito pelo “score” da reação pela estimativa de percentual de células mortas realizada pela leitura microscópica.

12. Limitações do processo de medição (utilização de testes adicionais mais específicos ou sensíveis, quando os resultados obtidos assim o sugerirem)

Dificuldades na separação celular e contaminação da preparação de linfócitos com células vermelhas, leveduras, monócitos, plaquetas ou granulócitos podem causar resultados errôneos. Ainda cabe salientar, que resultados errôneos podem ocorrer quando concentrações de células estão acima ou abaixo do nível aceitável. Contaminação bacteriológica ou mudança no pH de reagentes monoclonais podem causar reações falso negativas. Certos antígenos HLA frequentemente exibem especificidades fracas. Estes são chamados antígenos de reação cruzada e são detalhados por antígenos e anticorpos de cada placa na folha guia de reação modelo que acompanha a placa.

13. Controle interno de qualidade a ser adotado pelo usuário para assegurar o desempenho adequado do processo de medição

Uma amostra com tipagem previamente conhecida deverá ser utilizado anterior ao início dos testes de rotina para averiguar a confiabilidade do novo lote de placa recebido no laboratório. Somente utilizar as placas dentro de seu prazo de validade.

Caso o laboratório deseje testar a pureza de suas preparações celulares ou ainda em combinação identificar a contaminação da preparação de células, os Controles da One Lambda poderão ser utilizados conforme explicados abaixo:

NS = soro controle normal é usado para determinar o background de células mortas. Este soro é proveniente de soro humano do sexo masculino que não tenha sofrido transfusão com sangue AB negativo.

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13 ABSM, ABSG, ABSMD = Controles anti-linfócitos B são usados para determinar a pureza dos linfócitos B. Os controles anti linfócitos B são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos linfócitos B sem reatividade contra granulócitos, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. (OBS.: ABSG na diluição de trabalho fornecida, não é recomendado para o teste de células com leucemia crônica linfocitária, nas placas LCT30D da One Lambda).

AGSM, AGSMD = Controles anti-granulócitos são utilizados para determinar a pureza dos granulócitos. Estes controles são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos granulócitos, mas sem reatividade contra linfócitos B, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste.

AMSM, AMSMD = Controles anti-monócitos são usados para determinar a pureza de monócitos. Os controles anti-monócitos são anti-corpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a monócitos, mas sem reatividade contra granulócitos, linfócitos B, linfócitos T, plaquetas e células vermelhas do sangue teste.

ATSG, ATSM, ATSMX, ATSMD = Controles anti-linfócitos T que são utilizados para determinar a pureza de linfócitos T. Os controles anti-linfócitos T são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a linfócitos T, mas sem reatividade contra granulócitos, linfócitos B, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. OBS.: ATSMX é o único controle anti-T para ser utilizado com células isoladas com FluoroBeads T.

ALSG, ALSM = Controle anti-linfócitos totais são usados para determinar a reatividade do complemento. Este controle é feito com anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos linfócitos humanos. OBS.: não utilize ALSG como controle para teste com DTT (Ditiotreitol), pois o DTT irá degradá-lo.

14. Valores de referência obtidos em populações sadias ou valores demográficos, epidemiológicos, estatísticos, desejáveis, terapêuticos ou tóxicos

Este dado não está disponível para a metodologia em questão.

15. Características de desempenho do produto A. Potência e especificidade:

(14)

14 Reagentes-teste foram precisamente caracterizados por screenings separados sequenciais sorológicos. Painéis de amostras de referência de linfócitos congelados foram usados em dois screenings separados.

Dois terços de todos os reagentes selecionados são fortes com reatividade HLA específica claramente definida (com 70% de índice de força), permitindo não mais que 10% de reações falso positivas e 15% de reações falso negativas. O restante um terço de reagentes não vão de encontro com esse critério, mas são exaustivamente investigados quanto à sua utilidade quando usados para sustentar outros anticorpos bem-definidos. Anticorpos multiespecíficos são usados somente se anticorpos não monoespecíficos são disponíveis para uma especificidade em particular. Anticorpos multiespecíficos foram escolhidos com o mesmo desempenho característico para todas as especificidades como o anticorpo monoespecífico. Screening contra um painel de linfócitos frescos preparados é utilizado para confirmar e validar a força do soro e sua especificidade. As análises são feitas usando técnicas computadas no Eighth International Histocompatibility Workshop em 1980. (referência 4).

B. Controle Negativo

O antissoro do controle negativo é originário de um sangue saudável humano masculino do tipo AB, o qual não possui reatividade citotóxica em testes com doadores de linfócitos selecionados ao acaso. Este controle é usado para determinar a viabilidade do linfócito.

C. Controle Positivo:

O controle positivo trata-se de um anticorpo monoclonal com ação fortemente citotóxico aos linfócitos humanos. Este controle é usado para determinar a atividade de complemento.

16. Referências Bibliográficas que comprovem ou fundamentem as informações fornecidas

1. Terasaki PI, Bernoco F, Park MS, Ozturk G, and Iwaki Y. Microdroplet testing for HLA A, B, C and D antigens. Am J. Clin Pathol 69:103-120, 1978.

2. Danilovs J, Terasaki PI, Park MS, Ayoub G. B lymphocyte isolation by thrombin nylon wool. In Histocompatibility Testing. Terasaki PI, Ed., UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, CA 287-288, 1980.

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15 3. ASHI Laboratory Manual, 2nd ed. Edited by Zachary, Andrea A. and Teresi,

Gary, p. 199, 1990.

4. Terasaki PI, Ed., Histocompatibility Testing. Los Angeles, CA, 1980. 5. Nikaein A, Ed., ASHI Procedure Manual, 3rd Edition, ASHI, Lenexa, KS.

17. Identificação do Distribuidor do produto Biometrix Diagnóstica Ltda.

Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba - PR CEP: 82840-360 Tel.: (41) 2108-5250 Fax: (41) 2108-5252 DDG: 0800-7260504 E-mail: biometrix@biometrix.com.br www.biomertix.com.br CNPJ: 06.145.976/0001-39

18. Identificação do Fabricante do produto País de Origem: Estados Unidos da América Fabricante: One Lambda, Inc.

21001 Kittridge Street Canoga Park – CA EUA

19. Registro ANVISA número 80298490001

20. Responsável Técnica Ana Carolina Martins CRF/PR: 12700

21. Revisões

Revisão Descrição da Alteração Data

00 Elaboração 09/2006

01

Revisão: Formação, layout, produtos descontinuados, alteração nas condições de armazenagem e transporte, inclusão das denominações comerciais de cada item da família, inclusão de número de registro

e alteração de Responsável Técnica.

02/2011