PROGRAMA DE APRIMORAMENTO
PROFISSIONAL
SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS
ANA CAROLINA MONTELEONE CASSIANO
Avaliação do perfil de anticorpos dos pacientes com prova cruzada positiva no hemocentro de ribeirão preto.
RIBEIRÃO PRETO 2017
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SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS
ANA CAROLINA MONTELEONE CASSIANO
Avaliação do perfil de anticorpos dos pacientes com prova cruzada positiva no hemocentro de ribeirão preto.
Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP elaborada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP/ Departamento de Apoio Médico (DAM)
Área: Imunogenética
Orientador(a): Neifi Deghaide
Supervisor(a)Titular: Tania Maria Beltramini Trevilato
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Cassiano, Ana Carolina Monteleone
Avaliação do perfil de anticorpos dos pacientes com prova cruzada positiva no hemocentro de ribeirão preto. Ribeirão Preto, 2017. 61 p. : il. ; 30 cm
Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Imunogenética. Orientador: Neifi Deghaide.
“Dedico este trabalho primeiramente а Deus, por ser essencial em minha vida, é Ele o autor de meu destino, o meu guia.”
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À minha família, pelo amor, incentivo e apoio incondicional.
À Dra. Neifi Deghaide, minha orientadora, pelo emprenho dedicado à elaboração deste trabalho.
Ao Gustavo Visconde Martins que acompanhou e enriqueceu esse trabalho com toda sua experiência profissional e pessoal.
Á todos os profissionais que trabalham no Laboratório de HLA do Hemocentro de Ribeirão Preto que tive o imenso prazer de conhecer e por me proporcionarem conhecimento não apenas racional, mas manifestação de caráter e afetividade, não somente por terem me ensinado, mas por terem me feito aprender.
Ao Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão-USP e ao Hemocentro de Ribeirão Preto, pela oportunidade.
“Meus irmãos, considerem motivo de grande alegria o fato de passarem por diversas provações, pois vocês sabem que a prova da sua fé produz perseverança.”
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CASSIANO, Ana Carolina Monteleone. Avaliação do perfil de anticorpos dos pacientes com prova cruzada positiva no hemocentro de ribeirão preto.
. 2017. 61 p. Monografia (Aprimoramento em Imunogenética) – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017.
O objetivo deste trabalho foi estabelecer um ponto de corte do nível de fluorescência dos anticorpos detectados pelo Painel de classe I e II dos loci HLA-A,B, e DRB1que correlacione com a prova cruzada positiva por citotoxicidade dependente de
complemento (CDC), e qual alelo se positiva com maior intensidade de média de fluorescência (MFI). Foi realizado um estudo retrospectivo de um banco de dados de pacientes em lista de espera para transplante renal cadastrados Laboratório de HLA da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto. O banco de dados foi composto de 4195 provas cruzadas contra doador falecido realizadas de 07/05/2015 até
07/05/2016. Os dados demográficos para análise demonstrou que dos 614 doadores falecidos com resultado positivo para prova cruzada 37,4 não possuíam DSA, e 62,5% possuíam o valor. Podemos observar que dos 614 pacientes analisados, 352 possuíam DSA para o locus A. 431 pacientes possuíam DSA para o locus B e 167 para o locus DR. Os demais não obtiveram valores de DSA. Foram avaliadas suas médias que foram respectivamente de 8.007, 8.308, 8.289. Neste estudo
demonstramos os níveis de MFI também corresponderam aos melhores pontos de corte de escolha quando avaliamos a sensibilidade e especificidade para a
correlação com a CDC. Ficou demonstrado que níveis de MFI≥1.500 tem melhor correlação com os resultados de prova cruzada por CDC nos loci A, B e DRB1.
ABSTRACT
CASSIANO, Ana Carolina Monteleone. Evaluation of the antibody profile of the patients with positive cross match in the hemocenter of Ribeirão Preto.
.2017.61 p. Monograph (Improvement in Immunogenetics) – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017.
The goal of this paper was to establish a cut-off point of the fluorescence level of the antibodies detected by the Class I and II Panel of loci HLA-A,B and DRB1 which correlates with positive cross-match by complement-dependent cytotoxicity which allele is positive with higher intensity of mean fluorescence. It was performed a retrospective study of a database of patients on the waiting list for renal
transplantation enrolled in the HLA Laboratory of the Blood Center of Ribeirão Preto. The database was composed of 4195 cross-proofs against deceased donors,
conducted between 05/05/2015 and 05/07/2016. The demographic data for analysis showed that 614 deceased donors with the cross test positive result 37.4% didn’t have DSA and 62.5% had the value. We can observe that of the 614 patients analyzed, 352 had DSA for the locus A. 431 patients had DSA for the B locus and 167 for the DR locus. The others didn't achieve DSA values. Were evaluated theirs averages that were respectively 8007, 8308, 8289. In this study we demonstrated that MFI levels also correspond to better cutoffs point when we evaluated a sensitivity and specificity for a correlation with a CDC. It was demonstrated that MFI≥1500 levels have a better correlation with the CDC cross-proof results at loci A, B and DRB1.
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Figura 1 – Estrutura gênica do MHC (Major Histocompatibility Complex)...14
Figura 2-Estrutura da molécula HLA de classe I e classe II...16
Figura 3- Gráfico que mostra o número de alelos nomeados por ano desde 1987 até o final de junho de 2016... 19
Figura 4: Nomenclatura atual do HLA... 26
Figura 5 - Número de Transplantes de Órgãos Sólidos e Tecidos entre janeiro e junho de 2016... 30
FIGURA 6- Transplante de Rim (em 22 estados, com 131 centros atuantes)... 33
Figura 7- Brasil é o segundo em número absoluto de transplantes renais (entre 30 países) - ano 2014... 34
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades das moléculas do MHC de classe I e II... 17
Tabela 2- Necessidade anual estimada e nº de transplantes no Brasil...29
Tabela 3- Relação dos maiores e menores valor de MFI e seus DSAs... 42
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Gráfico 1- Quantidade de pacientes com prova cruzada positiva e sua porcentagem com
relação a presença de DSA...41
Gráfico 2- Análise do DSA A-B-DR e sua relação com o resultado de MFI...42
Gráfico 3- Análise estratificada dos valores de MFI e suas médias com relação DSA-A...44
Gráfico 4- Análise estratificada dos valores de MFI e suas médias com relação DSA-A...44
Gráfico 5- Análise estratificada dos valores de MFI e suas médias com relação DSA-A...45
Gráfico 6- Média do MFI- DSA Anti-HLA-A...46
Gráfico 7- Frequência de - DSA Anti-HLA-A...46
Gráfico 8- Média do MFI- DSA Anti-HLA-B... 47
Gráfico 9- Frequência de - DSA Anti-HLA-B... 48
Gráfico 10- Média do MFI- DSA Anti-HLA-DR... 49
LISTA DE SIGLAS
ABTO- Associação Brasileira de Transplante de Órgãos. AGH- Anti-globulina Humana.
APC- Célula Apresentadora de Antígeno.
CDC- Citotoxicidade Depende de Complemento. CML- Cultura Mista de Linfócitos.
DF- Distrito Federal.
DNA- Ácido Desoxirribonucleico.
DSA- Anticorpo Específico Contra Doador. ELISA- Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay.
HCFMRP- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. HLA- Human Leukocyte Antigen.
IBGE- Instituto Brasileiro de Geografia e Estatistica.
IRODAT- International Registry on Organ Donation and Transplantation. IWHS- Workshop Internacional de Histocompatibilidade.
MAC- Complexo de Ataque a Membrana. MFI- Intensidade Média de Fluorescência. MG- Minas Gerais.
MHC- Major Histocompatibility Complex. OMS- Organização Mundial da Saúde. PCR- Reação de Cadeia da Polimerase.
PCR-SSO- Sequencia Específica de Oligonucleotideos PCR-SSP- Sequencia Especifica de Primers.
PR- Paraná.
PRA- Reatividade Contra Painel. RJ- Rio de Janeiro.
RS- Rio Grande do Sul. SAB- Single Antigen Beads.
SBT- Tipificação Baseada em Seqüênciamento. SC- Santa Catarina.
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TCD4+- Linfócito T Auxiliar. TCD8+- Linfócito T Citotóxico. TCR- Receptor de células T.
TCTH- Transplante de Célula Tronco Hematopoiética. Th- Linfócito T Helper.
USP- Universidade de São Paulo. UTR- Unidade de Transplante Renal.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...13
1.1 Complexo Principal de Histocompatibilidade...13
1.2 O Sistema HLA e Histocompatibilidade...20
1.3 Tipificação HLA...20
1.4 Método Sorológico...20
1.5 Tipificação Celular...21
1.6 Prova cruzada (Crossmatch)...21
1.7 Reatividade contra painel (Avaliação do grau de sensibilização aos antígenos HLA: Reatividade contra painel)...22
1.8 Métodos de Tipificação por DNA...23
1.9 Relevância do HLA em transplantes...26
1.10 Transplantes de órgãos e tecidos...28
1.11 Transplante Renal...31
1.12 Rejeição...35
1.13 Rejeição hiperaguda mediada por anticorpos ...36
1.14 Rejeição aguda...37
1.15 Rejeição crônica...37
1.16 DSA (Anticorpo Específico Contra Doador) e MF (Intensidade Média de Fluorescência)...37 2- OBJETIVOS...39 3– METODOLOGIA...40 4– RESULTADOS...41 5– DISCUSSÃO...50 6– CONCLUSÃO...52 REFERÊNCIAS...53
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Complexo Principal de Histocompatibilidade
Por se tratar de uma família gênica que inclui vários genes altamente polimórficos e que participam ativamente na defesa de vertebrados contra parasitas e outros patógenos, os antígenos codificados pelos genes do MHC (Major Histocompatibility Complex) estão expressos virtualmente em todas as células nucleadas do
organismo. O MHC controla a atuação do sistema imune em todos os vertebrados e por esse motivo tem se mantido durante a evolução destas espécies. Primeiramente foi identificado na década de 50 seguindo observações de que soro de pacientes apresentando reações febris póstransfusionais poderiam causar a aglutinação de leucócitos oriundos de seus doadores bem como de outros indivíduos. Por meio de estudos subsequentes foram demonstrados que anticorpos contra proteínas
leucocitárias (glicoproteínas) de outros indivíduos da população, poderiam estar presentes em soro de mulheres multíparas (FERNANDES et al., 2003).
O MHC de organismos distintos recebe denominação específica para cada espécie, nos humanos é denominado HLA (Human Leukocyte Antigen). O MHC humano está localizado no braço curto do cromossomo seis, que é uma região gênica,
hipervariada. Nesta região encontram-se glicoproteínas codificadas por genes altamente polimóficos envolvidos na resposta imunológica, que são as moléculas HLA. O MHC foi descoberto através de estudos em diferentes linhagens de
camundongos que ocorria a rejeição de tecidos. Na década de 40, foram descritos antígenos responsáveis pela rejeição de tumores e tecidos normais em
camundongos, que foram nomeados de histocompatibilidade-2(H-2) por George Snell e Peter Gorer. Mais tarde, a versão deste sistema em humanos tornou-se conhecida como MHC. Jean Dausset em 1958 descobriu o primeiro antígeno deste sistema e o chamou de MAC, identificado através de testes de leucoaglutinação em pacientes politransfundidos, isso foi possível por meio do desenvolvimento das técnicas de transfusão sanguínea. A partir desta descoberta, foram descritos vários antígenos leucocitários e surgiu a necessidade de se padronizar a nomenclatura
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para este sistema. Então foi idealizado o primeiro Workshop Internacional de
Histocompatibilidade (IWHS) em 1968, onde a nomenclatura passou a ser
denominada de HLA (Human Leukocyte Antigen), na qual a primeira especificidade identificada passou a ser chamada como HLA-A2. Com isso foi estabelecido o comitê de Nomenclatura para fatores do sistema HLA da Organização Mundial da Saúde (OMS). Até hoje, o termo HLA é usado como sinônimo de proteínas do MHC humano. Desde 1964, uma série de 13 reuniões colaborativas internacionais
ampliou os conhecimentos do sistema HLA e contribuiu para a padronização dos métodos de tipificação bem como da nomenclatura. A partir destes esforços, na região do braço curto do cromossomo 6 humano (segmento 6p21.3) foram
identificados vários loci gênicos localizados muito próximos. Existem dois tipos de genes polimórficos do MHC e que foram definidos como de classe I (HLA A, B, C) e classe II (HLA DR, DQ, DP), esses possuem maior relevância para os transplantes. Entre os grupos de classe I e II está um terceiro grupo chamado classe III, o qual codifica as proteínas do sistema complemento. As regiões se distribuem no sentido do centrômero para o telômero na forma: classe II, III, I (figura1) (ABBAS et al., 2008; BOUZAS, 2011; ZAGO et al., 2004).
Figura 1 – Estrutura gênica do MHC (Major Histocompatibility Complex)
.
Fonte: http://www.intechopen.com/books/autism-a-neurodevelopmental-journey-from-genes-to-behaviour/immune-dysfunction-in-autism-spectrum-disorder.
A molécula de Classe I do MHC apresenta três cadeias α1, α2 e α3 e é expressa na superfície de uma célula em associação com a cadeia β2 microglobulina que é codificada por genes localizados fora do complexo HLA. Portanto esta molécula
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apresenta quatro domínios, sendo que α3 e β2m se justapõem à membrana, e α1 e α2 formam uma fenda que constitui o local de ligação do peptídeo. Essa abertura é composta por 8 a 9 aminoácidos e é fechada em ambas as terminações. Possui genes (HLA A, B, C) que codificam proteínas da cadeia pesada de moléculas
clássicas de histocompatibilidade e também para as vias não clássicas (HLA-E, F, G, MICA e MICB). As moléculas de classe I clássicas são expressas em quase todas as células nucleadas. Elas são compostas por uma cadeia α pesada, com
associação não covalente a uma cadeia leve (β2-microglobulina), sendo que esta leve é codificada por um gene localizado no cromossomo. Essas moléculas se ligam ao receptor de células TCD8+ (GELLER, SCHEINBERG, 2005).
Entretanto a molécula de Classe II do MHC apresentam duas cadeias (α e β) formando quatro domínios; α1, α2, β1 e β2. A fenda de ligação ao peptídeo é formada por interações entre os domínios α1 e β1, com o TCR (receptor de células T). O MHC de classe II codifica proteínas das cadeias α e β e possui cinco tipos de moléculas expressas: HLA DR, DQ, DP, DM e DO. A região de classe II possui genes que codificam proteínas que são responsáveis pelo transporte de peptídeos. São expressas em linfócitos B, linfócitos T ativados, macrófagos e células
dendríticas e estão restritas aos receptores de células TCD4+ (ABBAS et al., 2008; DONADI, 2000).
As moléculas do MHC desempenham papel fundamental nas respostas imunes a antígenos estranhos. Cada molécula de MHC pode se ligar a vários peptídeos diferentes, mas apenas um por vez. Toda molécula de MHC, tanto a de Classe I como a de Classe II apresentam uma região não polimórfica ou não variante (semelhante a todas as formas alélicas de Classe I e II) e uma região variável ou polimórfica que apresenta uma sequência única àquele alelo. A molécula CD8 expressa na membrana do linfócito T liga-se à região não variante de todas as moléculas de Classe I do MHC do mesmo modo que a molécula CD4 liga-se a essa região nas moléculas de Classe II. A figura 2 mostra a estrutura das moléculas HLA de classe I e II respectivamente (ABBAS et al., 2008; DONADI, 2000).
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Figura 2-Estrutura da molécula HLA de classe I e classe II.
Fonte: http://pt.seebmo.org/informacoes.php.
Dentro do genoma humano o HLA é considerado o sistema mais polimórfico, e os antígenos por ele codificados são responsáveis pela resposta dos anticorpos contra aloenxertos. Além disso, outros sistemas polimórficos, podem propiciar uma
resposta contra outros antígenos em alotransplantes, mesmo sendo de menor relevância (ABBAS et al., 2008).
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Tabela 1. Propriedades das moléculas do MHC de classe I e II.
CLASSE I CLASSE II
Locus genético Humanos: HLA-A, -B, -C Humanos: DP, DQ, DR
Estrutura da cadeia Cadeia α+ β2 microglobulina
Cadeia α+ cadeia β
Distribuição celular Maioria das células nucleadas
Células apresentadoras de antígeno (macrófago, células dendríticas entre outras)
Envolvidas em apresentar antígeno
Células T citotóxica Células T helper
Fontes de fragmentos peptídicos Proteínas produzidas no citosol Membrana plasmática endocitada e proteínas extracelulares Domínios polimórficos α1 + α2 α1 + β1
Fonte: Adaptado de Mackay e Rosen, 2000.
Os alelos da região MHC têm expressão codominante, por conta disto cada indivíduo apresenta dois antígenos HLA para cada loci (exceto em casos de homozigoze), um de origem materna e um de origem paterna. Os antígenos HLA são codificados por uma série de genes estritamente ligados e localizados na região p21.3 do braço curto do cromossomo 6. A combinação particular de alelos
encontrados nesses 6 loci, em qualquer um dos cromossomos do par, é herdada em conjunto, antígenos derivados do pai ou da mãe é denominado de Haplótipo. A combinação de dois haplótipos parentais herdados por um indivíduo compreende o
genótipo HLA deste indivíduo. (ABBAS et al., 2008; DONADI, 2000).
Por ser altamente polimórfico, a maioria dos indivíduos são heterozigotos em cada
loci HLA. Os genes do MHC são expressos de forma codominante, ou seja, cada
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nos cromossomos maternos e paternos. Os seis alelos de Classe I são expressos juntos na superfície de cada célula nucleada. Entretanto, o HLA-C é geralmente expresso num nível mais baixo do que o HLA-A e HLA –B. Os loci da classe II também são expressos de forma codominante, porém são apenas ativos no subgrupo de células que expressam a classe II bem como a classe I. O HLA-DR tende a ser expresso em níveis mais altos do que o HLA-DP ou HLA-DQ. O polimorfismo proporcionado pelos genes HLA, associado com a sua tendência de estarem fortemente ligados uns aos outros, tem implicação importante na
identificação de histocompatibilidade entre doador e receptor em TCTH (BOUZAS, 2011; VOLTARELLI et al., 2008; ZAGO et al., 2004).
O polimorfismo genético é a variabilidade em um loci gênico, isto é, existem muitas versões alternativas de cada gene que codificam proteínas ligeiramente distintas. O MHC é o sistema genético mais polimórfico no organismo e consequentemente na população. Este polimorfismo extenso de genes MHC torna pouco provável que dois indivíduos escolhidos aleatoriamente expressem grupos de moléculas MHC
idênticas. Este polimorfismo é a base para a rejeição rápida de enxerto entre
indivíduos geneticamente diferentes. (ABBAS et al., 2008; DONADI, 2000; BOUZAS, 2011).
Segundo dados do HLA Informatics Group até junho de 2016, existiam mais de 9.900 variantes alélicas já identificadas até o momento nestes múltiplos loci MHC humanos (HLAs), incluindo cerca de 11.100 de classe I e acima de 3.920 de classe II. Dentre os loci HLA Classe I, o HLA-B é o mais polimórfico com 4.358 alelos. Os loci HLA-A e HLA-C apresentam 3.492 e 3.111 alelos, respectivamente. O locus HLA classe II que tem maior variabilidade é o DRB, com 2.135 alelos, enquanto HLA-DQA1 tem 73 e DQB1 940 alelos já identificados. (Fonte:
http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html).
Esta variabilidade alélica, que cresce continuamente pela descoberta de novos alelos, resulta na codificação de proteínas que diferem umas das outras em um ou mais resíduos de aminoácidos. Segundo o banco de dados www.hla.alleles.org, até junho de 2016 já foram cadastrados mais de 11.000 alelos.
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Os antígenos HLA mostram ainda variações características de um grupo racial para outro. As frequências de alelos HLA individuais variam fortemente dentro de uma população e entre populações distintas. Por exemplo, o alelo que codifica HLA-B8 é muito comum em populações caucasianas (frequência gênica de 7,7 – 16,3%), mas muito pouco frequente em populações asiáticas (frequência gênica de 0,0 –0,2%). Por outro lado, o alelo que codifica HLA-B46 é comum em populações asiáticas (frequência genética de 4,7 – 12,5%), mas virtualmente ausente em caucasianos. Esta diversidade mais uma vez reforça a necessidade do conhecimento das frequências de alelos e haplótipos em populações específicas (Middleton et al., 2000; Pena, 2005; Ferreira et al., 2005; Pimenta et al., 2006).
Figura 3- Gráfico que mostra o número de alelos nomeados por ano desde 1987 até o final de junho de 2016.
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1.2 O Sistema HLA e Histocompatibilidade
1.3 Tipificação HLA
Ocorreram avanços significativos nos últimos trinta anos em relação aos métodos de laboratório usados para definir a tipificação de genes e aloantígenos HLA. Tal
evolução culminou na disseminação do uso de técnicas de tipificação baseadas no DNA (Ácido desoxirribonucleico) para a definição dos alelos HLA (BOUZAS, 2011).
Com o avanço das técnicas que utilizam biologia molecular, é possível definir cada classe de molécula HLA pela identificação de sua sequência específica. Nesse caso, não são os antígenos expressos nas superfícies celulares que são tipificados, e sim, os grupos de alelos ou os alelos individualmente do DNA genômico. Para tal, o DNA é extraído das células nucleadas do sangue periférico, utilizando um kit comercial que se baseia em cinco etapas: a hemólise; a degradação e a retirada das
proteínas; a lise de leucócitos; a precipitação do DNA; e a purificação do DNA (BORTOLOTTO et al., 2009).
1.4 Método Sorológico
Os antígenos HLA Classe I foram definidos por métodos sorológicos que utilizavam um ensaio de microcitotoxicidade dependente de complemento, e painéis de anti-soros alogênicos contendo anticorpos anti-HLA. Estes anti-anti-soros foram altamente selecionados por especificidade HLA e geralmente são obtidos de gestantes imunizadas a antígenos HLA durante a gravidez. O conjunto de anti-soros usados deve ser capaz de reconhecer todas as especificidades sorológicas que são reconhecidas pela Organização Mundial da Saúde (OMS). A tipificação HLA demonstrou que alo-antígenos HLA expressam múltiplas especificidades ou
epítopos. Os epítopos que são comuns a mais de um antígeno são denominados públicos enquanto que os que são específicos de um único antígeno, particulares ou privativos. A fim de criar uma transição na nomenclatura da sorologia para os
métodos baseados em DNA, uma designação “equivalente sorológica” foi estabelecida. (Mickelson, 2004; Schreuder et. Al, 2005).
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1.5 Tipificação Celular
Um método de tipificação HLA que envolve células T in vitro para reconhecer certos antígenos HLA. O ensaio celular mais utilizado é a reação cultura mista de linfócitos (CML). As células que se proliferam neste ensaio são do tipo Th (Linfócito T Helper) e a medida quantitativa correlaciona-se com o grau de incompatibilidade. Outro método baseado em atividade celular é a chamada linfólise mediada por células que correlaciona a resposta a antígenos de classe I de células citotóxicas CD8+.
Denominado crossmatch ou Prova cruzada de Linfócitos, é realizado por
citotoxicidade depende de complemento (CDC) (método clássico) ou citometria de fluxo, que investiga a presença de anticorpos pré-formados no receptor que tenham especificidade para antígenos expressos nas células do doador. Este método
complementar,deve ser analisado com cautela em função da variedade de antígenos expressos na membrana dos linfócitos e pela possibilidade de existirem
autoanticorpos, fatores que podem falsear os resultados (D.SINGH,et. Al 2003).
Com o desenvolvimento do teste de microlinfocitotoxicidade Terasaki revoluciou a detecção dos antígenos HLA, que utiliza volume muito pequeno de soro e células. Denominando de “rejeição hiperaguda” em 1966, Kissmeyer-Nielson descreveu dois casos de anticorpos leucoaglutinantes contra o doador. Terasaki e colaboradores demonstraram pela primeira vez que a presença de anticorpo pré-transplante
aumenta o risco de rejeição do enxerto renal, em um estudo que reuniu 30 casos de rejeição, onde 24 (80%) apresentaram prova cruzada positiva. Estes resultados confirmados por outros estudos posteriormente acabou modificando a conduta dos transplantes renais, tornando o teste de reatividade contra painel (PRA) e a prova cruzada obrigatórios na rotina de avaliação pré-transplante (AMOST, et. Al 1995).
1.6 Prova cruzada (Crossmatch)
Independentemente do grau de sensibilização do receptor, este teste é fundamental, pois tem por objetivo verificar se o receptor tem anticorpos pré-formados contra o potencial doador (ZANE,2001).
22
Com o emprego do método de microlinfocitotoxicidade, a prova cruzada foi introduzida por Paul Terasaki e Rose Pane, nos anos 60. Tal implementação foi responsável pela diminuição dramática no número de rejeições hiperagudas. No início, essa prova era realizada diretamente com soro do receptor, linfócitos periféricos do doador e a adição de soro de coelho como fonte de complemento. Posteriormente, o método foi modificado, visando aumentar a sua sensibilidade, com a introdução de lavagem para a retirada de imunocomplexos antes da adição do complemento e a potencialização com a adição de anti-imunoglobulina humana (HOPKINS, 1990; SPEES EK, et al., 1969; JOHNSON, et al., 1972).
Em 1983, a citometria de fluxo começou a ser utilizada, sendo considerada mais sensível, porém menos específica (GAROVOY, et al., 1983).
Entre as limitações das técnicas que envolvem a microlinfocitotoxicidade, podemos destacar a necessidade do uso de células vivas; dificuldade em diferenciar
anticorpos citotóxicos não-HLA de anticorpos anti-HLA específicos, a não detecção de anticorpos não fixadores de complemento (como IgG2 e IgG4) e a
impossibilidade do seu uso em pacientes transplantados em tratamento com anticorpos citotóxicos contra células T ou timócitos ou anticorpos monoclonais anti-linfócitos (ZACHARY A, et al., 1995).
1.7 Reatividade contra painel (Avaliação do grau de sensibilização aos antígenos HLA: Reatividade contra painel)
Sobredito, candidatos a receptores de rim podem desenvolver anticorpos anti-HLA em decorrência de transfusões sanguíneas, gestação ou transplante prévio, que são extremamente deletérios para a evolução do enxerto. (WANG. Et al ,1996).
Inicialmente estes anticorpos eram detectados por microlinfocitotoxicidade, atualmente, existem métodos semi-automatizados, imunoenzimáticos ou
empregando fluorocitometria, onde o soro do paciente é avaliado contra antígenos HLA purificados e adsorvidos em placas ou micro pérolas de poliestireno. Em geral, costuma-se avaliar amostras de soro dos pacientes em lista de espera de rim
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cadavérico, colhidas em intervalos de três meses ou 10 a 20 dias após ter recebido transfusão sanguínea. O estudo seriado das amostras de soro permite selecionar a amostra mais positiva por ocasião da prova cruzada pré-transplante, em paralelo com a amostra de soro mais recente, possibilitando a detecção de anticorpos que sofreram queda no título, por ocasião do teste. Além disto, com a análise das reações é possível observar a definição das especificidades anti-HLA e evitar o transplante com rins de doadores que possuam o antígeno correspondente. O grau de reatividade de soro PRA (do inglês Painel Reative Antibody) pode varia de 0 a 100%. O receptor é considerado não sensibilizado quando o PRA for igual a 0. Pacientes com PRA variando de 11 a 50% são considerados sensibilizados e com PRA maior de 50% são, em geral, classificados como hipersensibilizados. Esta definição pode variar conforme o centro transplantador, sendo que em alguns, somente são considerados pacientes hipersensibilizados aqueles com PRA acima de 70% (LIEBER et al, 2007; SINGH et al., 2003).
1.8 Métodos de Tipificação por DNA
Os métodos de tipificação por DNA estão sendo mais usados pois discrimina todo o polimorfismo das proteínas HLA. O desenvolvimento desse método de tipificação aumentou o conhecimento da diversidade do MHC, do papel das moléculas de Classe I e II na resposta imune e dos fatores importantes na seleção de doadores voluntários não aparentados de células-tronco hematopoéticas. A maioria dos métodos atualmente em uso em laboratórios clínicos ou de pesquisa é baseada em amplificação de genes HLA específicos do DNA genômico usando a reação de cadeia da polimerase (PCR). Os métodos baseados em PCR
fornecem tanto a determinação direta da seqüência inteira da região de codificação de um alelo (SBT-Sequence based Typing- tipificação baseada em
seqüênciamento). O DNA é amplificado pela Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerase Chain Reaction” - PCR) utilizando oligonucleotídeos específicos para amplificar a região a ser estudada, através do emprego de iniciadores (“primers”) ou sondas (“probes”) de oligonucleotídeos com sequências conhecidas, sendo
(sequence-24
specific oligonucleotídes), respectivamente. Usados para tipificação dos alelos HLA de classe I ou II (FERNANDES et al., 2003).
No método PCR-SSP são realizadas várias reações de amplificação, cada uma contendo um par de iniciadores capaz de detectar um grupo de alelos ou um alelo. Os produtos de amplificação são submetidos a uma eletroforese em gel de agarose, contendo brometo de etídio que é uma substância fluorescente capaz de se
intercalar no DNA, tornando fluorescentes os produtos de amplificação quando o gel é submetido à luz ultravioleta, identificando assim, o grupo alélico ou o alelo
propriamente dito (FERNANDES et al., 2003).
Entretanto no método PCR-SSO, utiliza-se um par de iniciadores construídos para amplificar uma região genérica de um gene (por exemplo, HLA-DR). Parte do produto da PCR também é submetida à corrida eletroforética em gel de agarose para verificar o sucesso da amplificação. Em seguida, o DNA amplificado é hibridizado com sondas de oligonucleotídeos (microesferas) marcadas por
fluorescência capazes de reconhecer os diversos grupos de alelos do gene. Para identificar a intensidade da fluorescência em cada microesfera utiliza-se um
analisador de fluxo (LABScan™100). Os dados gerados pelo analisador de fluxo são analisados pelo aplicativo HLA Fusion 2.0 para a tipagem HLA (BOUZAS, 2011).
Outro método que poderá ser muito utilizado futuramente é o sequenciamento
automático das bases nitrogenadas. A identificação dos alelos é realizada através da comparação com um banco de dados referente às sequências já conhecidas
(FERNANDES et al., 2003).
A tipificação das moléculas de HLA tem grande importância no transplante de
medula, já que o grau de compatibilidade HLA entre o paciente e o doador é um dos pontos cruciais para o sucesso do transplante. Quanto maior o grau de
compatibilidade HLA, maior a probabilidade de pega do enxerto contra o hospedeiro (VOLTARELLI et al., 2008).
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Pata que ocorra uma interpretação correta dos resultados da tipificação HLA e selecionar doadores para transplantes, é necessária saber qual é o nível de
resolução utilizado nos testes. Um paciente e um doador que são compatíveis nos antígenos HLA-A e –B por método de baixa resolução podem não ser idênticos para alelos HLA-A e/ou –B em métodos de alta resolução. Estudos populacionais
fornecem informações, essenciais para fins de transplante. É necessário que se tenha uma predisposição genética e mecanismos moleculares relacionados ao desenvolvimento de enfermidades. As análises profundas do polimorfismo do
Sistema HLA em populações miscigenadas podem revelar diferentes frequências de alelos e haplótipos de HLA, em comparação com outros grupos raciais e étnicos, que pode influenciar as associações entre HLA e doenças. Estas diferenças contribuem para a discriminação entre alelos diretamente envolvidos no
desenvolvimento de doenças e aqueles apenas intimamente ligados. Estes estudos populacionais são importantes porque se conhecendo as frequências HLA podem-se estimar as chances de se encontrar um doador compatível para um paciente de um grupo étnico específico. Entretanto apenas este conhecimento da frequência não é suficiente e depende da existência de um amplo Registro de Doadores Voluntários com diversidade genética. A nomenclatura das especificidades HLA é definida por um Comitê Internacional que se reúne periodicamente para nomear alelos
recentemente descobertos e rever a nomenclatura vigente, e está exemplificada na figura 4. (DONADI, 2000; Marsh et al. 2002; NEPOM, B.S & NEPOM, G.T.,1995).
26
Figura 4: Nomenclatura atual do HLA. Cada alelo de HLA tem um número único, correspondendo a até 4 campos de dígitos separados por (:). O tamanho da
designação do alelo é dependente da sequência do alelo e genes próximos. Todos os alelos recebem pelo menos um nome de 4 dígitos, que correspondem aos campos 1 e 2; os campos 3 e 4 só são designados quando necessário.
Fonte: http://hla.alleles.org/announcement.html em 05/10/2016.
1.9 Relevância do HLA em transplantes
As moléculas MHC têm um efeito importante nos transplantes de órgãos, tecidos e células, devido ao papel fundamental que exercem sobre a ativação de células T e iniciação da resposta alogênica. A principal e mais conhecida causa de rejeição hiperaguda (que acaba levando a perda do enxerto), rejeição aguda, rejeição crônica e enxertos não funcionantes são os Anticorpos pré-formados contra antígenos HLA. Os pacientes denominados sensibilizados são os que desenvolvem algum nível de anticorpos anti-HLA e constituem um número considerável dentro da lista de espera em um centro de transplante (GEORGESCU D, FERRARI-LACRAZ S, VILLARD
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De acordo com dados obtidos do Sistema Estadual de Transplantes (SET-SP) em janeiro de 2017, existiam 1102 pacientes inscritos na lista de espera para
transplante renal, com status ativo e vinculados ao Laboratório de HLA da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto. Destes, 59,3% possuíam painel de anticorpos anti-HLA de classe I negativo e 17,7% dos pacientes com PRA
>80%(hipersensibilizados). Por apresentarem prova cruzada pré-transplante positiva a presença destes anticorpos frequentemente impede o transplante. Como
consequência permanece por longo tempo em lista de espera, acima do tempo médio de espera de outros pacientes. Para ser avaliado o nível de anticorpos anti-HLA, tanto no pré quanto no pós-transplante, é realizado o teste de reatividade contra painel (PRA). Que demonstra ser uma ferramenta importante, junto com as provas cruzadas, nas condutas clínicas. A avaliação de reatividade contra painel foi uma das poucas áreas na Imunologia de transplantes que mais evoluiu nos últimos 15 anos (McKENNA et al. 2000; E.F.CAMPOS et al, 2006;).
A principio o PRA foi desenvolvido para representar o grau de positividade que uma determinada amostra apresentava em provas cruzadas reais e evoluiu para testes sem utilização de células vivas. Com a aderência de moléculas HLA em placas de ELISA (Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay), foi possível evitar o uso de células vivas e permitir a criação de Kits comerciais para avaliação de Painel. Os testes que utilizam a plataforma Luminex® podem ser de 3 tipos : (1) no primeiro, são microesferas plásticas com várias moléculas HLA de classe I e II aderidas, que produzem um resultado positivo ou negativo;(2) no segundo teste, cada microesfera contém duas moléculas com dois alelos de cada locus HLA classe I ou II, fornecendo um valor de PRA expresso em porcentagem e especificidade limitada; (3) o terceiro teste é composto de molécula HLA classe I ou II com apenas um alelo aderido (Single Antigen Beads-SAB) (MARLIES et al, 2004 ;KAO et al, 1993; DONADI, 2000).
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Em transplantes renais com resultado de prova cruzada positivo por citometria de fluxo o seu prognostico ainda gera discussões. As diferentes metodologias e os níveis de sensibilidade geram muitas dúvidas sobre a relevância clínica destes anticorpos detectados por estas técnicas extremamente sensíveis. Atualmente toda a comunidade do transplante está discutindo os resultados das novas tecnologias e suas aplicações. Um aspecto importante a ser debatido é a alta sensibilidade dos testes de fase sólida, quando comparada com os demais testes, fato que pode dificultar o transplante em pacientes hipersensibilizados, por isso a importância de definições de pontos de corte, resultado da prova cruzada e a correlação entre todos os resultados e assim possibilitar a melhor escolha do tratamento com menor
intercorrências (FERRARI-LACRAZ et al., 2012; BRAY et al., 2004).
1.10 Transplantes de órgãos e tecidos
O processo de retirada de células é denominado Transplante. Os tecidos ou órgãos de um indivíduo podem ser inseridos em outro indivíduo ou nele próprio. Essas células, tecidos ou órgãos retirados de um indivíduo são chamados de enxertos e este indivíduo de doador. Já o indivíduo que recebe o enxerto é denominado receptor (ABBAS et al.,2008).
A maioria dos transplantes alogênicos realizados tem como doador, os membros da família geneticamente idênticos ou o mais parecido possível para a compatibilidade HLA. Em geral, são irmãos HLA A, B, DR idênticos com o receptor. A probabilidade de um indivíduo obter um irmão compatível é de 25% sendo influenciada pelo número de irmãos existentes em cada família. Para outros membros da família, a probabilidade é inferior a 5%. A importância do MHC foi descoberta por meio de estudos de rejeição de tecidos entre diferentes membros da mesma espécie e, posteriormente, verificou-se que todos os vertebrados possuem genes do MHC e seus produtos, e que as respostas de rejeição a transplantes eram mediadas por células T 14 (TERASAKI, 1964; OPELZ,2005; TERASAKI, 2012;).
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Tabela 2- Necessidade anual estimada e nº de transplantes no Brasil.
Córnea Rim Fígado Coração Pulmão
Necessidade estimada 18.249 12.166 5.069 1.622 1.622 Transplantes realizados 13.861 5.556 1.809 353 74
Fonte: IBGE*( Instituto Brasileiro de Geografia e Estatistica) - a partir do ano de
2015, o RBT passa a utilizar a estimativa da população. (antes era utilizado o CENSO).
O Brasil tem um programa de transplantes muito bem organizado, mas que deve ser zelado para que haja crescimento nos próximos anos. A regulamentação do
programa é justa, porem depende da atuação de vários profissionais, desde a identificação dos potenciais doadores até a efetivação dos transplantes e seu acompanhamento ambulatorial. Com mais de 190 milhões de habitantes, a fila para transplantes de córnea esta praticamente zerando, e atendendo cerca de 40% da necessidade anual para transplantes renais e 30% dos transplantes hepáticos. O Brasil possui quase 500 mil leitos hospitalares que são distribuídos em mais de seis mil hospitais, dos quais 1.884 apresentam mais de 80 leitos e dispõem de comissões intra-hospitalares de transplante, que são fundamentais na identificação do potencial doador e sua pronta notificação às centrais estaduais. O número de transplantes com doador vivo vem decrescendo quase que em todos os estados brasileiros, em compensação vem ocorrendo o crescimento do transplante com doador falecido (KAO et al,1993; DONADI,2000; MARLIES et al, 2004; Site da secretária da saúde;2016).
Devido a crise em diversos setores do país, a saúde também parece ter sido atingida, inclusive a doação e o transplante. Neste trimestre, houve queda não apenas em relação às previsões de crescimento, mas na comparação com 2015. A taxa de doador efetivo, por exemplo, em 2015 foi de 14,1 pmp, a previsão para este ano é 16 pmp, e a obtida no trimestre foi de 13,1 pmp, 7,1% menor que o ano passado e 18,1% abaixo da previsão. A taxa de efetivação da doação (28%) foi 4,8% menor que a do ano anterior (29,2%) e 12,5% abaixo do previsto (32%). Outro
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fator preocupante é que os três estados mais populosos, responsáveis por 40% dos habitantes, tiveram queda na taxa de doação: SP (8,2%) MG (19,6%) e RJ (18,5%) em comparação ao ano passado. Um alento, é que quase todos os estados, com exceção do Amapá, já estão notificando potenciais doadores, embora alguns não tenham conseguido efetivá-los. Entre as quatro maiores taxas de doação,
encontram-se os três estados da região sul, SC (30,5 pmp), RS (25,2 pmp) e PR (22,2 pmp), e o DF (28,8 pmp) (ABTO, 2016; Site da secretária da saúde;2016).
Figura 5 - Número de Transplantes de Órgãos Sólidos e Tecidos entre janeiro e junho de 2016.
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Em contrapartida o número de transplantes realizados tem crescido e de acordo com a Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos (ABTO), no ano de 2006 foram realizados 3299 transplantes renais, tendo aumentado, em 10 anos, para 5579. Dos transplantes realizados até junho de 2016 obtivemos um total de 20.180, destes, 19% foram transplantes de órgãos sólidos (rim, coração, fígado, pâncreas isolado, pulmão,e pâncreas/rim), 76% de tecidos (córnea, ossos, pele e valva) e 5% de células progenitoras hematopoiéticas (medula óssea). Esses dados podem ser observados na Figura 5.
1.11 Transplante Renal
O primeiro transplante renal bem sucedido ocorreu em 1954, onde ocorreu à transferência de um sinenxerto (rim doado por um gêmeo monozigótico), Com o avanço da medicina, conhecimentos e testes de histocompatibilidade, aumentou-se a taxa de sucesso dos transplantes (ZANE,2001).
No transplante renal, quanto maior a compatibilidade HLA entre doador e receptor, melhor será a sobrevida do enxerto, principalmente no primeiro ano do transplante. Estudos demonstram que a similaridade entre HLA-A, HLA-B, HLA-DR são
importantes para prever o prognostico do transplante. A similaridade entre os loci HLA-A e –B é importante tanto no período inicial quanto no tardio, após o
transplante. Já a compatibilidade no loci HLA-DR só é importante nos três primeiros meses após o transplante, devido a sua expressão limitada á APCs (célula
apresentadora de antígeno) e células dendriticas. (ABBAS, 2008).
Os pacientes com doença renal em estágio terminal podem ser considerados candidatos ao transplante renal. A avaliação imunológica pré-operatória inclui: tipagem do grupo sanguíneo ABO e dos antígenos de histocompatibilidade (HLA) do receptor e potencial doador, pesquisa de anticorpos no soro do receptor contra o potencial doador (prova cruzada ou crossmatch); avaliação do estado de pré-sensibilização contra os antígenos HLA (%PRA) e sorologia viral (DANIEL P. STITES. 2000).
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Tipos de transplante:
Considerando à origem do enxerto e seu receptor, os transplantes podem ser classificados em:
1. Auto-enxerto: transplante onde doador e receptor são a mesma pessoa.
2. Isoenxerto: transplante realizado em indivíduos geneticamente idênticos. 3. Aloenxerto: transplante onde doador e receptor são da mesma espécie, porém
geneticamente distintos.
4. Xenoenxerto: transplante em que o doador e receptor são de espécies distintas.
Clinicamente, os transplantes renais realizados se classificam, quanto à relação doador/receptor, em três tipos:
1. Doador vivo aparentado: neste transplante o doador está geneticamente relacionado ao receptor.
2. Doador vivo não-aparentado: trata-se de doador sem relação genética com o receptor.
3. Doador cadáver: é o doador em morte encefálica decorrente de traumatismo ou acidente vascular craniano, que do ponto de vista ético seria o doador de órgãos ideal para todos os tipos de transplante. No caso do transplante renal, sua
utilização tem sido crescente. Neste tipo de transplante não há parentesco com o receptor e é possível graças aos esforços das equipes multidisciplinares de captação de órgãos (ABBAS, 2008).
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FIGURA 6- Transplante de Rim (em 22 estados, com 131 centros atuantes).
Fonte: RBT 2016 (JAN/JUN) – Associação Brasileira de Transplante de Órgãos (ABTO).
Atualmente, os transplantes com finalidade terapêutica tornaram-se comuns devido à compreensão dos mecanismos envolvidos na rejeição do enxerto e o advento de terapias imunossupressoras eficientes (BENJAMIN et al., 2002). De 1997 até Junho de 2016 foram realizados 78.664 transplantes renais em números absolutos no Brasil, só no ano de 2015 foram 5.556, comparado com o ano de 2005 (3.372) notamos um aumento significante. Em se tratando de região, a sudeste ganha com 3.103 transplantes renais realizado no ano de 2015, seguido da região Sul com 1.253 transplantes e Nordeste com 899. As que menos realizaram foram as regiões norte com apenas 130 e centro oeste com 171. Na lista de espera os pacientes ativos totalizam 19.700 até junho de 2016, sendo que o estado que mais possui pacientes na lista de espera é o estado de São Paulo com 10.030, em segundo Minas Gerais com 2.312, e Paraná com 1.151. Os estados de Sergipe e Mato
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Grosso não possuíam nenhum paciente em lista de espera até junho de 2016. No ano de 2015 5.556 transplantes renais foram concluídos, divididos em: 1.172 de doado vivo e 4.384 de doador falecido. As principais causas da não concretização da doação de órgãos de potenciais doadores foram de 44% recusados na entrevista, 15% por contraindicação médica e 12% parada cardíaca. Ainda é grande o número de recusa familiar, que gira em torno de 685 no ano de 2015, o número de óbitos no estado de São Paulo é indisponível. (Centrais Estaduais de Transplantes).
Situando o Brasil no contexto internacional, podemos destaca-lo como o segundo do mundo em número absoluto de transplantes de rim - 4959 -, e também de fígado e de córneas (ABTO, 2016).
Figura 7- Brasil é o segundo em número absoluto de transplantes renais (entre 30 países) - ano 2014.
Fonte: International Registry on Organ Donation and Transplantation (IRODAT) 2014 (último dado disponível).
Em São Paulo, no final da década de 60 se iniciou as atividades de transplantes no Brasil. Com o crescimento deste procedimento foi necessário regulamentar esta atividade, que se inicia com diagnóstico de morte encefálica, ate a distribuição do órgão. (ABTO, 2016).
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No ano de 1986, na cidade de Ribeirão Preto- São Paulo, o sistema começa a ser construído, quando foi constituído o São Paulo Interior Transplantes (SPIT). A coordenação do sistema era feita pela Unidade de Transplante Renal - UTR do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo. A Secretaria de Estado da Saúde, o Banco de Órgãos, Tecidos e Substâncias Humanas foram criados em julho de 1990, e a partir daí foram publicadas outras normas legais, atualizando e aperfeiçoando as legislações
anteriores e regulamentando as atividades de retirada e transplante de órgãos e de tecidos.A lei 8.489, de novembro de 1992, regulamentada em 1993, incorporou o conceito de morte encefálica e restringiu as possibilidades de emprego de doadores vivos. Além disso definiu a doação como consentida e determinou critérios para cadastrar equipes e hospitais de transplante (Central Estadual De Transplante).
No período de 2002 a 2005 foram pagos pelo SUS (sistema único de saúde) 12.352 transplantes de órgãos e de tecidos no Estado de São Paulo, isso demonstra um desenvolvimento crescente no setor de transplantes, sendo que esse número
representa mais de 40% dos transplantes realizados em todo o Brasil, o que faz com que São Paulo seja referência para os demais Estados.Atualmente o sistema
gerencia as informações de mais de 16.000 receptores em lista de espera, recebendo um enorme volume de documentos (próximo de 90.000 por ano).
Devemos destacar que o receptor possui acesso, através da internet, à sua situação e à evolução de sua posição na lista de espera, permitindo um maior controle social e transparência do sistema (ABTO, 2016).
1.12 Rejeição
A rejeição do enxerto é classificada de acordo a histopatologia e/ou tempo transcorrido entre o transplante e o início da rejeição, além dos mecanismos envolvidos no processo. A rejeição do aloenxerto renal pode ser mediada tanto por mecanismos humorais como celulares. Nas rejeições humorais, destaca-se a rejeição hiperaguda que é mediada por anticorpos pré-formados oriundos de sensibilização prévia contra antígenos do doador. A primeira barreira a ser evitada para este tipo de rejeição é a incompatibilidade ABO e, depois, anticorpos contras as
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moléculas HLA. O diagnóstico da presença de rejeição nos pacientes é, geralmente, avaliado por critérios clínicos como: febre, oligúria, aumento de peso e, especialmente, por um rápido incremento nos níveis de creatinina. A rejeição é confirmada pelos resultados da biópsia do enxerto, considerando critérios da classificação Mundial Banff 1997 (RACUSEN, SOLEZ et al. 1999).
1.13 Rejeição hiperaguda mediada por anticorpos
A rejeição hiperaguda é caracterizada por hemorragias e oclusão trombótica da vasculação do enxerto, que começa dentro de minutos a horas depois que os vasos sanguíneos do hospedeiro são anastomosados aos vasos do enxerto, e é mediada por anticorpos preexistentes na circulação do hospedeiro que se ligam aos antígenos endoteliais do doador. A ligação do anticorpo ao endotélio ativa o sistema complemento e induz alterações no endotélio do enxerto, promovendo a trombose intravascular. As células endoteliais passam a secretar formas de fator de Von Willebrand com peso molecular elevado, que acabam levando à adesão e agregação de plaquetas. (CAI et. al., 2005).
Com a utilização da prova cruzada pré-transplante para pesquisa de anticorpos anti-HLA pré-formados e órgãos ABO compatíveis, a rejeição hiperaguda é,
perfeitamente, evitada. (TERASAKI et. al., 2005). A rejeição tipo hiperaguda detectada atualmente é, em geral, devida à presença de anticorpos da classe IgG contra aloantígenos não HLA clássicos, expressos nas células endoteliais
vasculares, ou à reativação de células de memória contra antígenos de histocompatibilidade clássicos ou não. Esses anticorpos geralmente surgem
transfusão de sangue, transplante anterior ou gestações múltiplas. Se o título desses aloanticorpos for baixo, a rejeição hiperaguda poderá se desenvolver lentamente, ao longo de vários dias (ABBAS, 2008). Atualmente, com o propósito de minimizar a rejeição acelerada, alguns centros vêm utilizando métodos mais sensíveis, como a citometria de fluxo, para a detecção de baixos títulos de aloanticorpos (LOPEZ- HOYOS, FERNANDEZ- FRESNEDO, et al. 2004).
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1.14 Rejeição aguda
A rejeição aguda é um processo de lesão vascular e parenquimatosa mediado pelas células T, por macrófagos e por anticorpos, começando geralmente depois da
primeira semana do transplante. A diferenciação das células efetoras e a produção de anticorpos que mediam a rejeição aguda ocorrem em resposta ao enxerto, o que explica o retardamento do início da rejeição aguda. A ativação primária dos linfócitos T exerce um papel central na rejeição aguda ao responder aos aloantígenos
presentes nas células vasculares endoteliais e parenquimatosas. A lise das células do enxerto é provocada diretamente por linfócitos T citotóxicos ativados ou por células inflamatórias recrutadas por linfocinas liberadas por linfócitos T auxiliadores, levando à necrose do enxerto (NORONHA et al, 2014; ABBAS,2008).
1.15 Rejeição crônica
A rejeição crônica é caracterizada por fibrose com perda das estruturas normais do órgão, ocorrendo em prazo prolongado. Como a terapia para controlar a rejeição aguda melhorou, a rejeição crônica mostra-se como a forma principal da perda de aloenxerto. A patogenia da rejeição crônica é menos conhecida do que a da rejeição aguda. (ABBAS, 2008).
Entre os fatores que predispõem ao aparecimento da rejeição crônica estão
incluídos: o tempo de isquemia fria, o número de episódios de rejeição, o número de incompatibilidades HLA e a infecção por citomegalovírus (NORONHA et al, 2014; ABBAS,2008).
1.16 DSA (Anticorpo Específico Contra Doador) e MF (Intensidade Média de Fluorescência)
Desde a década de 60 é conhecida a presença de anticorpos pré- formados contra antígenos HLA. Mesmo em períodos tardios do pós-transplante, a produção desses anticorpos pode ocorrer desencadeando anticorpos específicos contra o doador (DSA- Donor Specific Antibody). (MOURA et al., 2009; CARO-OLEAS et al., 2012).
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A presença de DSA tem alta relevância clinica, segundo o que estudos recentes sugerem, a presença de anticorpos anti-HLA em pacientes pós-transplante tem se mostrado fortemente associados com a rejeição mediada por anticorpos, rejeição aguda acelerada e com a perda do enxerto. Apos o transplante estes anticorpos aparecem na circulação, levando a um prejuízo causado por eles que
frequentemente aumenta com o tempo. Por essas razoes, é importante o seu monitoramento. (LI et al., 2008; ENG et al., 2009).
Desde que Patel e Terasaki relataram em 1969 a relevância da prova cruzada prévia para o resultado do transplante houve um grande avanço cientifico na detecção de anticorpos anti-HLA, como por exemplo, a adição da anti-globulina humana (AGH), que melhorou a sensibilidade da prova cruzada padrão por citotoxicidade
dependente de complemento (CDC). (GIBNEY et al., 2006; PICASCIA, 2012).
A rejeição humoral aguda tem sido significantemente correlacionada com o
desenvolvimento de DSA contra antígenos HLA do doador. Estudos realizados em 2001 demonstraram que 80% dos pacientes que desenvolveram anticorpos DSA podem desenvolver tanto rejeição aguda como crônica. (LI et al., 2008).
O acompanhamento é feito de modo que para cada DSA, é medida a fluorescência do anticorpo (MFI) em vários períodos pós-transplante. O MFI indica o quanto de um determinado anticorpo se ligou á superfície da célula estudada e através de um cálculo médio de intensidade de fluorescência pode detectar o quanto aquela célula estava expressando determinado marcador. (CAI, J, 2005; COOPER et al., 2011).
[Digite texto] 2- OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho foi estabelecer um ponto de corte do nível de fluorescência dos anticorpos detectados pelo Painel de classe I e II dos loci HLA-A,B, e DRB1 que correlacione com a prova cruzada positiva por Citotoxicidade Dependente de
Complemento (CDC), e qual alelo se positiva com maior intensidade de intensidade média de fluorescência (MFI).
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3– METODOLOGIA
Estudo retrospectivo de um banco de dados de pacientes em lista de espera para transplante renal cadastrados no Laboratório de HLA da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto.
O banco de dados foi composto de 4195 provas cruzadas contra doador falecido realizadas de 07/05/2015 até 07/05/2016.
Os bancos de dados utilizados nas análises possuem resultados de exames de pacientes em lista de espera para transplante renal cadastrados no Laboratório de HLA da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto.
O paciente cadastrado deve possuir tipagem HLA (loci AB e DRB1) para análise da compatibilidade com o provável doador, assim como a reatividade contra Painel atualizada para avaliação de anticorpos doador específicos. Quando o paciente é selecionado para concorrer a um órgão, é realizada a prova cruzada por
Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), contra linfócitos T e B do possível doador falecido.
Para detecção de anticorpos anti-HLA foram utilizados os testes LABScreen®Mixed e LABScreen® Single Antigen (SAB) e o critério de positividade destes testes definido a partir de MFI ≥1500.
Todas as variáveis foram comparadas com os resultados das provas cruzadas por Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), contra linfócitos T e B.
Para o banco de dados que avaliou os anticorpos HLA-A -B e DRB1 foram utilizadas apenas amostras que possuíam resultado de Painel na mesma data do soro testado nas provas cruzadas por Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), contra doador falecido, resultando em 615 amostras.
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4– RESULTADOS
Os dados demográficos para análise dos anticorpos HLA-A B e DRB1 obtidos foram: 4195 provas cruzadas contra 614 pacientes com resultado positivo para prova cruzada. Dentre eles 37,4% não possuíam Antígeno contra doador especifico (DSA), e 62,5% possuíam o valor. (Gráfico1)
Gráfico 1- Quantidade de pacientes com prova cruzada positiva e sua porcentagem com relação a presença de DSA.
Fonte: Cassiano, 2017.
Podemos observar que dos 614 pacientes analisados, 352 possuíam DSA para o locus A. 431 pacientes possuíam DSA para o locus B e 167 para o locus DR. Os demais não obtiveram valores de DSA, como observado no Gráfico 2.
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Gráfico 2- Análise do DSA A-B-DR e sua relação com o resultado de MFI.
Fonte: Cassiano, 2017.
Os valores do MFI desde o menor até o maior podem ser observados na Tabela 3 e sua respectiva média. O DSA-A para se positivar foi necessário o valor mínimo de 1.507 e máximo de 20.578. Com relação ao DSA-B foi observado valor mínimo de 1.505 e máximo de 20.526, já no DSA-DR os valores
encontrados foram 1.510 para mínimo e 20.044 para máximo. Foram avaliadas suas médias que foram respectivamente de 8.007, 8.308, 8.289.
Tabela 3- Relação dos maiores e menores valor de MFI e seus DSAs. MFI
(do menor ao maior)
MÉDIA DO MFI
DSA- A 1.507-20.578 8.007
DSA- B 1.505-20.526 8.308
DSA- DR 1.510-20.044 8.289
[Digite texto]
Foram realizadas as análises das variáveis Maior DSA A,B,DRB1 utilizando o ponto de corte de >1.500-3.000 MFI obtivemos a primeira variável, com 19% para DSA Anti-HLA-A, 16% para DSA Anti-HLA-B e 20% DSA Anti-HLA-DR. Para a segunda variável de >3.000-5.000 os valores encontrados foram 14% para DSA A, 17% para DSA B e 19% para DSA Anti-HLA-DR. Na terceira variável >5.000-10.000, os valores obtidos foram 31% para DSA Anti-HLA-A , 27% DSA Anti-HLA-B para e 28% para Anti-HLA-DR. Para a quarta variável >10.000 , os dados analisados foram de 36% DSA Anti-HLA-A , 40% DSA Anti-HLA-B e 33% DSA Anti-HLA-DR. Esses dados podem ser observados na Tabela 4, e nos Gráficos 3,4 e 5.
Tabela 4- Análise estratificada dos valores de MFI e suas médias com relação DSA.
Fonte: Cassiano, 2017. DSA Anti- HLA-A DSA Anti-HLA-B DSA Anti-HLA-DR
Faixa de MFI N % Média
MFI N % Média MFI N % Média MFI >1.500-3.000 70 19 2245 68 16 2253 33 20 1966 >3.000-5.000 52 14 3771 73 17 3972 31 19 3937 >5.000-10.000 112 31 6945 117 27 7379 48 28 7624 >10.000 118 36 14282 173 40 13621 55 33 14982 Total 352 431 167
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Gráfico 3- Análise estratificada dos valores de MFI e suas médias com relação DSA-A.
Fonte: Cassiano, 2017.
Gráfico 4- Análise estratificada dos valores de MFI e suas médias com relação
DSA-A.
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Gráfico 5- Análise estratificada dos valores de MFI e suas médias com relação DSA-A.
Fonte: Cassiano, 2017.
Com esse estudo foi possível observar quais DSAs obtiveram valores de MFI mais altos, e que por consequência tiveram uma positividade mais forte no painel. Com relação ao DSA Anti-HLA-A podemos perceber que o alelo A23 teve a maior média dos valores de MFI 11.717, o de menor média foi o A34 com 5.302. (Gráfico 6). Além disso, foi possível demonstrar qual a maior e menor frequência desses alelos (Gráfico 7). O A2 foi o mais frequente, com a contagem de 102, e o A33 o menor, com apenas 2.
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Gráfico 6- Média do MFI- DSA Anti-HLA-A.
Fonte: Cassiano, 2017.
Gráfico 7- Frequência de - DSA Anti-HLA-A.
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Entretanto no valor DSA Anti-HLA-B destaca-se o DSA B41 com a maior média dos valores de MFI 14.267, o de menor média foi o B45 com 2.775. (Gráfico 8). Para os critérios da frequência foram obtidos que o B15 teve uma maior frequência, de 89; e o B41 e 45 foram os menos frequentes, presentes em apenas 2. (Gráfico 9).
Gráfico 8- Média do MFI- DSA Anti-HLA-B.
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Gráfico 9- Frequência de - DSA Anti-HLA-B.
Fonte: Cassiano, 2017.
No gráfico seguinte é possível notar que no DSA Anti-HLA-DR, o alelo DR9 possui a maior média dos valores de MFI 14.202 e o de menor média foi o DR12 com apenas 1.544. (Gráfico 10). Com relação ás frequências, observamos que o DR13 foi o mais frequente com 37, e o DR12 e 9 apareceram em apenas 1(Gráfico 11).
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Gráfico 10- Média do MFI- DSA Anti-HLA-DR.
Fonte: Cassiano, 2017.
Gráfico 11- Frequência de - DSA Anti-HLA-DR.
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5– DISCUSSÃO
Com a proposta de desvendar a relevância dos anticorpos doador específicos no pós transplantes, David-Neto et al, realizaram uma pesquisa sobre o tema pela técnica de Luminex . Encontraram que 16 (17%) pacientes foram transplantados com presença de anticorpos doador específicos e que 8 (50%) deles o anticorpo doador especifico desapareceu espontaneamente. Nos outros 50%, títulos baixos de anticorpos doador específicos não comprometeram o enxerto em 5 anos, enquanto que títulos altos se revelaram deletérios nesse período de segmento.
Para compreendermos melhor a dinâmica dos anticorpos doador específicos, quantifica-se seus valores de titulo em intensidade de fluorescência (MFI). Morris et al.mostraram que MFI <2000 poderia ser um ponto de corte para a não contra
indicação ao transplante renal. Os pacientes transplantados com prova cruzada com CDC negativa e que tinham títulos baixos de anticorpos doador específicos
(MFI<2000), tiveram sobrevida do enxerto equivalente aos que não apresentaram anticorpos doador específicos, em um segmento de 18 meses.
Já Singh et al., encontraram uma relação nos limites de intensidade de florescência (MFI normalizado) para rejeições mediadas por anticorpos, onde os anticorpos doador específicos com classe I com MFI maior ou igual a 100 e classe II com MFI maior ou igual a 200 foram os limites inferiores associados ao maior risco para rejeição. Entretanto, só os anticorpos doador específicos classe II com MFI maior que 500, mostraram diminuição da filtração glomerular e aumento da proteinúria. Analisando os resultados sobre mortalidade e sobrevida do enxerto, não houve diferença para todos os MFI menores do que 1000, no segmento de dois anos. Assim, os autores concluem que a presença de anticorpos doador específicos pré-transplante associa-se a resultados inferiores para o rim transplantado. Entretanto não são todos os pacientes com anticorpos doador específicos pré-transplante que evoluem para rejeição mediada por anticorpos, suportando a hipótese de que outros fatores poderiam influenciar a evolução.
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Dados obtidos por Terasaki, com 2231 pacientes com transplante renal, mostraram uma prevalência de casos de rejeição crônica significativamente superior no grupo de pacientes com aloanticorpos anti-HLA quando comparados aos que não
possuíam tais anticorpos (Terasaki e Ozawa, 2005).
Neste estudo demonstramos que o cross match positivo foi coerente na maior porcentagem de pacientes com DSA positivo (62,5%). Foi possível demonstrar que embora a prova cruzada seja positiva, isso não indica que esteja presente o DSA e principalmente o MFI elevado.
Em um estudo retrospectivo Pinto ,A. H.C. observou em 298 transplantes de rim, com doador vivo ou falecido, realizados entre 2001 e 2006, todos com XM T e B CDC negativos e sem nenhuma informação sobre presença de anticorpos
detectados por Luminex à época do transplante foi obtido valores de corte do MFI >1.500.
Gerbase-Delima et al, em seus estudos sobre transplante renal e o impacto da harmonização do Hla, define como ponto de corte do MFI > 1,500.
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6– CONCLUSÃO
Ficou demonstrado que níveis de MFI≥1.500 tem melhor correlação com os
resultados de prova cruzada por citotoxicidade dependente de complemento nos loci A, B, DRB1. (62,5% DSA positivo e 37,4% DSA negativo) Entretanto vale ressaltar que os valores de MFI, não são preditivos para que não seja realizado o transplante visto que diversos outros fatores podem interferir no resultado do transplante,
causando rejeição. Como por exemplo técnica utilizada, imunossupressão,
população estudada, variabilidade nos tempos de coleta da amostra de soro. E nem todos pacientes com anticorpos doador específicos pré-transplante evoluem para rejeição, confirmando a hipótese que outros fatores podem influenciar a evolução.
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