INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS DO ÁCIDO 2,4
DICLOROFENOXIACÉTICO SOBRE DIFERENTES POPULAÇÕES DE
NEURÔNIOS MIOENTÉRICOS DO DUODENO DE RATOS
Nathália Alves Diamante1 Aline Aparecida Ribeiro2 Vanessa Graciele Tibúrcio3 Amanda Flávia da Silva Rovida4 Renata de Britto Mari5 Sandra Regina Stabille6 Ricardo de Melo Germano7* DIAMANTE, N. A.; RIBEIRO, A. A.; TIBÚRCIO, V. G.; ROVIDA, A. F. S.; MARI, R. de B.; STABILLE, S. R.; GERMANO, R. M. Investigação dos efeitos do ácido 2,4 diclorofenoxiacético sobre diferentes populações de neurônios mioentéricos do duodeno de ratos. Arq. Ciênc. Vet. Zool. UNIPAR, Umuarama, v. 17, n. 2, p. 97-105, abr./jun. 2014.
RESUMO: O herbicida mais usado, tanto em pequenas como em grandes propriedades, por isso mais amplamente estudado
é o 2,4-D. Os estudos de toxicidade têm se concentrado sobre as alterações do sistema nervoso central, e por isto pouco se conhece sobre seus efeitos no sistema nervoso entérico. Com o objetivo de avaliar os efeitos do 2,4-D sobre os neurônios mio-entéricos do duodeno de ratos foi fornecido durante 60 dias doses de 2,4-D na concentração de 5mg/kg de peso de corpóreo para ratosWistarde dois grupos experimentais (n=5). Os animais dos grupos controle permaneceram o mesmo período sem receber 2,4-D. Ao final do período experimental os animais foram mortos, os duodenos foram coletados e processados por meio das técnicas histoquímicas de NADH-diaforase e NADPH-diaforase. Os neurônios foram quantificados e os resultados foram analisados estatisticamente. A densidade dos neurônios NADHd diferiu estatisticamente (P˂0,05) entre os grupos ex-perimental e controle, sendo maior no grupo controle. Já os neurônios NADPHd foram encontrados em maior quantidade no grupo experimental. Estes resultados sugerem que o 2,4-D possui ação neurotóxica sobre os neurônios do plexo mioentérico, interferindo na densidade neuronal mioentérica, quando se compara diferentes populações destes neurônios.
PALAVRAS-CHAVE: Plexomioentérico. Plasticidade neuronal. Intestino delgado. Herbicidas.
INVESTIGATION OF 2,4 DICHLOROPHENOXYACETIC ACID EFFECTS IN DIFFERENT POPULATION OF RAT DUODENUM MYENTERIC NEURONS
ABSTRACT: The 2,4-D herbicide is the most widely used, both in small and in large properties. Therefore, it is also the one
that is most broadly studied. Toxicity studies have been focused on changes in the central nervous system, and for this reason, little is known about its effect in the enteric nervous system. With the objective of measuring the effects of 2,4-D on the myen-teric neurons in the duodenum of rats, doses of 2,4-D were supplied for 60 days at a concentration of 5mg/kg of body weight to Wistar rats divided into two different experimental groups (n=5). The animals in the control groups remained without 2,4-D doses for the same period. At the end of the experimental period, the animals were euthanized and their duodenum were collected and processed through NADH-diaphorase and NADPH-diaphorase histochemical techniques. The neurons were quantified and the results were statistically analyzed. The density of NADHd neurons differed statistically (P<0,05) between the experimental and control groups, being higher in the control group. However, NADPHd neurons were found in a greater quantity in the experimental group. These results suggest that the 2,4-D has a neurotoxic action in the neurons from the myenteric plexus, interfering in the myenteric neuronal density, when different population of these neurons are compared.
KEYWORDS: Myenteric plexus. Neuronal plasticity. Small intestine. Herbicide.
INVESTIGACIÓN DE LOS EFECTOS DEL ÁCIDO 2,4 DICLOROFENOXIACÉTICO SOBRE DIFERENTES POBLACIONES DE NEURONAS MIOENTÉRICAS DEL DUODENO DE RATONES
RESUMEN: El herbicida más utilizado, tanto en pequeñas como en grandes propiedades es el 2,4-D, por eso lo más
estu-diado. Los estudios de toxicidad se han centrado sobre las alteraciones del sistema nervioso central, y por lo tanto, poco se sabe sobre sus efectos en el sistema nervioso entérico. Con el objetivo de evaluar los efectos del 2,4-D sobre las neuronas mioentéricas del duodeno de ratas se ha administrado durante 60 días dosis de 2,4-D en la concentración de 5mg/kg de peso corporal para ratones Wistarde, dos grupos experimentales (n = 5). Los animales de los grupos control permanecieron el
DOI: https://doi.org/10.25110/arqvet.v17i2.2014.4926
1Bióloga – Bolsita do PEBIC/Fundação Araucária; Discente do Mestrado em Biologia Comparada - UEM. nathaliadiamante@gmail.com 2Bióloga – Discente do Mestrado em Biologia Comparada – UEM. alineribeiropvai@gmail.com
3Bióloga – Discente do Mestrado em Biologia Comparada – UEM. vanessinha.g7@hotmail.com 4Bióloga – Discente do Mestrado em Biotecnologia Ambiental – UEM. amanda_rovida@hotmail.com
5Professora Doutora da Universidade Estadual Paulista – UNESP - Câmpus Experimental do Litoral. Paulistaremari@clp.unesp.br 6Professora Doutora convidada do Departamento de Ciências Morfológicas – UEM. profasandra.regina@gmail.com
7Professor Doutor do Curso de Ciências Biológicas, Farmácia e do Mestrado em Ciência Animal da Universidade Paranaense – UNIPAR - Avenida Hum-berto Bruning, 360 - Jardim Santos Dumont - Paranavaí - PR, 87706-140, germano@unipar.br - * Autor para correspondência.
mismo período sin recibir el 2,4-D. Al final del periodo experimental los animales fueron sacrificados, los duodenos fueron recogidos y procesados a través de las técnicas de histoquímicas de NADH-diaforasa y NADPH-diaforasa. Las neuronas fue-ron cuantificadas y los resultados analizados estadísticamente. La densidad de las neufue-ronas NADHd difirió estadísticamente (P˂0,05) entre los grupos experimental y control, siendo mayor en el grupo control. Ya las neuronas NADPHd se encontraron en mayor cantidad en el grupo experimental. Estos resultados sugieren que el 2,4-D tiene una acción neurotóxica sobre las neuronas del plexo mioentérico, lo que interfiere en la densidad neuronal mioentérica al comparar diferentes poblaciones de estas neuronas.
PALABRAS CLAVE: Plexo mioentérico. Plasticidad neuronal. Intestino delgado. Herbicidas. Introdução
Os agrotóxicos estão entre os principais fatores de riscos para a saúde dos trabalhadores e ao meio ambiente (BRASIL, 2006).Os herbicidas ácidos são uma importante classe de agrotóxicos dos quais se destaca o ácido 2,4 diclo-rofenoxiacético (2,4-D) por sua grande utilização em todo mundo (RODRIGUES; SERRA, 1996).
De amplo espectro no controle de ervas perenes e de folhas largas, em culturas de milho, cana-de-açúcar e pastagens,o 2,4-D é um herbicida sistêmico que atua como hormônio regulador do crescimento das plantas (EPA, 2005). Macroscopicamente, caracteriza-se pela apresentação na for-ma de um pó branco de odor levemente fenólico (TSMAN, 1991).Recomenda-se cuidado na aplicação, evitando perí-odos de vento, que mesmo fracos podem espalhar vapores do 2,4-D por longas distâncias (ALMEIDA; RODRIGUES, 1988).
Com a utilização de aproximadamente nove mil to-neladas por ano o 2,4-D é o segundo herbicida mais utilizado no Brasil (WAITEet al., 2002; BERNARD et al., 2005),sdo encontra2005),sdo em mais de 600 produtos (EPA, 2005), no en-tanto, no Brasil apenas 17 estão registrados por possuírem o ingrediente ativo 2,4D em sua formulação (ANVISA, 2007).
Foram descritos 66 casos de intoxicação por herbi-cidas fenoxiácidos entre 1962 e 1999 em que a maioria dos casos envolvia o 2,4-D (BRADBERRY et al., 2000). Além disso, um estudo realizado no Mato Grosso do Sul verifi-cou-se que dos 880 casos de intoxicação ocupacional, ocor-ridos entre 1992 e 2000, 13,4% envolviam herbicidas e, na maioria deles o principal causador foi o 2,4-D (RECENA et al., 2006).
Os efeitos de diferentes níveis de concentração do 2,4-D administrados em doses únicas ou continuados sobre alguns sistemas orgânicos animais, principalmente de cães e ratos, têm sido analisados (HANSEN; QUAIFE; HABER-MANN, 1971; EPA, 1987; KELLY; GUIDOTTI, 1989; TS-MAN, 1991; CHARLES et al., 1996a e 1996b; PAULINO; GUERRA; PALERMO-NETO, 1996; MATTSSON et al., 1997; GARABRANT; PHILBERT, 2002; AYDIN; ÖZDE-MIR; UZUNÖREN, 2005; BUKOWSKA et al., 2008).
Em experimentos com ratos não houve mortalidade significativa de animais que receberam administração aguda (15 dias) e crônica (42 dias), tanto na dosagem de 2,5 quanto na de 5,0 mg/kg/dia (MARGONATO; BATISTA; BARONI, 2003).
As pesquisas têm revelado que a dose tóxica do 2,4D para o ser humano, após ingestão, está em torno de 3 a 4 g e a dose letal é de 28 g (TSMAN, 1991). Já para ratos a dose letal é de 375 mg/kg de peso corpóreo (ALMEIDA; RODRIGUES, 1988), sendo considerado moderadamente tóxico para aves e não tóxicos para peixes (THOMPSON et al., 1984).
São sintomas da ingestão do 2,4-D pelo homem, queimação na língua e no esôfago, dor no peito, vômito, hemorragia gastrointestinal e gastrite aguda (BRADEBER-RY et al., 2000; ABDOLLAHY et al., 2004). Efeitos neu-rotóxicos incluem coma, hiperreflexia, ataxia, alucinações, convulsões e paralisia (BRADEBERRY et al., 2000). As pesquisas que verificam a neurotoxicidade do 2,4-D têm sido voltadas para análises do sistema nervoso central (EPA, 1987; TSMAN, 1991; MATTSSON et al., 1997). O 2,4-D parece ser inibidor moderado da fosforilação oxidativa e tem ação tóxica direta sobre os músculos estriados esqueléticos e uma possível, porém discutida, ação tóxica sobre os nervos (TSMAN, 1991). Contudo, o mecanismo da neurotoxicida-de do 2,4-D ainda não está esclarecido (BONGIOVANNI et al., 2007; BJORLING-POULSEN; ANDERSON; GRAND-JEAN, 2008; KONJUH et al., 2008).
Na divisão própria do sistema nervoso autônomo, além do sistema simpático e parassimpático, atualmente é re-conhecido o Sistema Nervoso Entérico (SNE) (STERNINI, 1988), como uma complexa rede de fibras nervosas e corpos celulares neuronais (SOUZA; FURLAN, 2001; FURNESS, 2006). Composto de interneurônios, neurônios sensoriais e neurônios motores, excitatórios e inibitórios, se estende ao longo de todo o tubo digestório (FURNESS, 2006).
O SNE é formado por diversos plexos, tendo como principais os plexos submucoso e mioentérico que atuam sobre os mecanismos da digestão e absorção de nutrientes, controlando a motricidade, fluxo sanguíneo e regulando pri-mariamente a atividade secretomotora do sistema digestório (GABELLA, 1969; STERNINI, 1988; COSTA; BROOKES; HENNIG, 2000; KUTCHAI, 2000; SCHEMANN; NEUN-LIST, 2004; PHILLIPS; POWLEY, 2007).
Alterações nos neurônios do plexo mioentérico são responsabilizadas por manifestações como anorexia, constipação, diarreia, perda de peso, vômitos, náusea, en-tre outras evidenciadas em diferentes condições experi-mentais como diabetes, (ZANONI et al., 2005; ALVES et al., 2006; CHANDRASEKHARAN; SRINIVASAN, 2007; SHOTTON; ADAMS; LINCOLN, 2007; PEREIRA et al., 2008; SILVERIO et al., 2009); envelhecimento (SANTER, 1994; JOHNSON et al., 1998; BRITTO MARI et al., 2008; GAGLIARDO et al., 2008); desnutrição (MOREIRA et al., 2008); desnutrição ao longo do envelhecimento (COWEN et al., 2000; SCHOFFEN et al., 2005; ARAÚJO et al., 2006); infecções (SUGAUARA et al., 2008, 2009); enterites e coli-tes (BOYER et al. 2005, 2007; LOMAX et al., 2006) e carên-cia protéica (ALVES et al., 2009), intoxicações (PEREIRA; STABILLE, 2006; CORREA et al., 2011; PEREIRA et al., 2013).
Uma vez que o 2,4-D tem ação sobre o sistema nervoso central é de se esperar que atue também sobre os neurônios do sistema nervoso entérico, já que entre as ma-nifestações da intoxicação por 2,4-D encontram-se anorexia,
irritação gastrointestinal, náuseas, vômitos e diarreia (EPA, 1987).
Sabendo dos efeitos neurotóxicos do ácido 2,4 di-clorofenoxiacético o presente trabalho teve o objetivo de avaliar os efeitos do 2,4-D sobre os neurônios mioentéricos do duodeno de ratos por meio de análise quantitativa utili-zando para tanto as técnicas histoquímicas de marcação da população neuronal mioentérica.
Material e Métodos
Esta pesquisa foi desenvolvida de acordo com os princípios éticos da experimentação animal, aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Experimenta-ção Animal da UNIPAR (CEPEEA/UNIPAR), protocolo no 22625/2011.
Para a realização deste estudo foram utilizados 20 ratos machos (Rattusnorvegicus), da linhagem Wistar e de 60 dias de idade, provenientes do Biotério da Universidade Estadual de Maringá.
Os animais foram mantidos em caixas plásticas in-dividuais, em sala com ciclo de iluminação artificial contro-lado para 12 horas claro/12 horas escuro, a uma temperatura ambiente de 22ºC±2, pelo período de 60 dias, e receberam ração comercial para roedores e água sem restrição.
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n=5/grupo) .GC-I: grupo que serviu de
con-trole para os animais que foram submetidos à ingestão de 2,4-D. e ao final do período experimental tiveram seus neurô-nios evidenciados pela técnica histoquímica de NADH diafo-rase. GC-II: grupo de animais que serviu de controle para os
animais que foram submetidos à ingestão de 2,4-D. e ao final do período experimental tiveram seus neurônios evidencia-dos pela técnica histoquímica de NADPH diaforase.GE–I:
NADH: grupo experimental que recebeu durante 60 dias 5mg/kg de peso vivo/dia de 2,4-D diluído em 0,5 ml de água via gavagem, e ao final do período experimental tiveram seus neurônios evidenciados pela técnica histoquímica de NADH.
GE-II: NADPH: grupo experimental que recebeu durante 60
dias 5mg/kg de peso vivo/dia de 2,4-D diluído em 0,5 ml de água, via gavagem, e ao final do período experimental tive-ram seus neurônios evidenciados pela técnica histoquímica de NADPH.
Após o período experimental de 60 dias e jejum de 12 horas, os animais foram submetidos à anestesia inalató-ria profunda com isoflurano e mortos por superexposição ao anestésico (HECKER; LAKE; DIFAZIO, 1983), para coleta do duodeno.
O duodeno obtido de 10 animais (GE-I e GC-I) foi lavado e preenchido com solução de Krebs (pH 7,3). O méto-do de NADH-diaforase foi utilizaméto-do para evidenciar os
neu-rônios mioentéricos, metabolicamente ativos, e gânglios nos preparados de membranas. Para tanto, o segmento foi lavado com solução de Krebs e incubado em meio de reação cons-tituída de solução estoque de Nitro Blue Tetrazolium (NBT) conforme metodologia descrita por Gabella (1969).
O duodeno coletado de outros dez animais (GE-II e GC-II) foi lavado e preenchido com tampão fosfato (PB pH 7,4). O segmento foi então fixado em paraformaldeído por 30 minutos, imerso em Triton X-100 por 10 minutos e lavado três vezes (10 minutos cada lavagem) em PBS. Em sequência, o duodeno foi incubado para evidenciação dos neurônios nitrérgicos, em um meio de reação contendo Nitro
Blue Tetrazolium (NBT), seguindo a metodologia descrita
por Scherer-Singler et al. (1983).
Para a obtenção dos preparados de membrana, o duodeno foi seccionado ao longo da extensão da borda me-sentérica e em seguida, foi microdissecado sob estereomi-croscópio.
Os preparados de membrana obtidos dos duodenos submetidos aos procedimentos pertinentes às histoquímicas de NADH e NADPH-diaforase foram desidratados em série crescente de álcoois (90%, 95% e absoluto), diafanizados por três imersões consecutivas em xilol e, em seguida, colocados entre lâmina e lamínula de vidro com resina sintética.
Os preparados de membrana foram destinados à quantificação dos neurônios mioentéricos.
Para a quantificação neuronal por área (mm2), o preparado de membrana do duodeno obtido de cada animal foi visualizado ao microscópio de luz Olympus BX40, com aumento de 40X. A imagem verificada no microscópio foi capturada por câmera digital de alta resolução e transferida para o computador. Os neurônios foram quantificados em 80 campos microscópicos por preparado de membrana.
A análise estatística foi realizada utilizando o Programa estatístico Sisvar (Versão 5.0). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA (one-way) e ao pós-teste T de Student. Os resultados foram descritos como média ± erro padrão, tendo sido adotado o nível de signifi-cância de 5%.
A área fornecida pela objetiva de 40x previamente mensurada foi de 0,096mm2, sendo que os 80 campos repre-sentaram a área total de 7,68mm2 de duodeno, permitindo a determinação da densidade neuronal por mm2 de duodeno.
Resultados
Foram analisados os dados referentes ao peso ini-cial, ao peso após 20 dias, após 40 dias e ao final do perío-do experimental (após 60 dias) de toperío-dos os grupos (tabela 1). O peso corporal dos animais não diferiu estatisticamente (P>0,05) entre os grupos.
Tabela 1: Média do peso corporal (g) inicial, após 20 dias, após 40 dias e ao final do período experimento dos grupos
con-trole I (GCI-NADH), grupo concon-trole II (GCII-NADPH), grupo experimental I (GEI - NADH) e grupo experimental II (GEII - NADPH)
Parâmetros GCI-NADH GCII-NADPH GEI-NADH GEII-NADPH
Peso inicial 283,2±9,57 242,2±4,43 281,8±3,34 238,6±3,64
Após 20 dias 399,6±34,18 341,6±10,85 384,4±26,17 337,2±11,94
Após 40 dias 472,8±39,49 422,2±25.26 448±43,20 394,8±22,2
Peso final 521,6±50,35 451,4±40,51 503,6±51,77 442,8±30,35
Na análise por microscopia de luz, os neurônios mioentéricos NADH-diaforase positivos (Figura 1a) e NA-DPH-diaforase positivos (Figura 1c) foram encontrados
or-ganizados em gânglios e interconectados por feixes de fibras nervosas demonstrando organização espacial característico para a espécie.
A quantificação de neurônios evidenciados pelas técnicas histoquímica de NADH-d (neurônios metabolica-mente ativos) e pela NADPH-d (neurônios inibitórios) dife-riu estatisticamente (P<0,05) entre os grupos controle e expe-rimental de cada técnica e também entre as técnicas (Tabela 2).
Tabela 2: Densidade Neuronal expressa em média e desvio
padrão dos neurônios do duodeno de ratos dos grupos GCI, GEI-NADH, GCII E GEII-NADPH.
Densidade neuronal expressa em mm2
Grupos NADHd+ NADPH+
GC (n=5) 84,3±18,30a 36,11±5,46a
GE (n=5) 64,14±4,86b 45,33±6,48b
Médias seguidas por letras diferentes na mesma coluna diferem es-tatisticamente pelo teste T de Student (P<0,05).
Discussão
Segundo Garabrant e Philbert (2002), a dose de 1mg/kg/dia foi determinada como a dose que não promove efeitos tóxicos (NOAEL – no observed adverse effectlevel) renais, hematológicos e hepáticos em ratos, contudo, poucos
são os relatos dos efeitos tóxicos do 2,4D sobre os neurô-nios mioentéricos, por este motivo optou-se por verificar os efeitos da ingestão da dose de 5mg/kg/dia, dose semelhante aquela utilizada por Correa et al. (2011) para o íleo e por Pereira et al. (2013) para o duodeno de ratos em um período experimental de 15 dias.
Ao longo do experimento foram observadas altera-ções comportamentais dos animais, como irritabilidade du-rante o manuseio, sintoma característico da intoxicação por 2,4D (EPA, 1987; SCHVARTSMAN, 1991; MATTSSON et al., 1997), porém não houve morte dos ratos.
O peso dos animais nos diferentes grupos não di-feriu estatisticamente (P>0,05) em nenhum período do tra-tamento, indicando que a dosagem de 5mg/kg/diade 2,4-D, durante 60 dias, não promove alterações no peso corporal de ratos. Resultados semelhantes foram observados em tra-balhos nas doses de 2,5 e 5mg/Kg/peso em experimentos conduzidos por um período de 15 dias sobre o duodeno e o jejuno de ratos (PEREIRA; STABILLE, 2006; NANNI, 2010; CORREA et al., 2011, PEREIRA, et al., 2013). Doses superiores variando entre 15 e 70 mg/kg/dia também não in-terferiram no ganho de peso de ratos (STURTZ et al., 2006; KONJUH et al., 2008).
A organização ganglionar dos neurônios NADH e Figura 1: Fotomicrografia de preparados de membrana do duodeno de ratos evidenciando neurônios do plexo mioentérico dos grupos
con-trole (A, C) e experimental (B, D) marcados por diferentes técnicas: em A e B neurônios corados pela histoquímica da NADH-diaforase; em C e D neurônios corados pela histoquímica da NADPH-diaforase. Barra=100 µm
NADPH, vistos neste trabalho, estão de acordo com o descri-to na literatura para neurônios do plexo mioentérico (ZANIN et al., 2001; FURNESS, 2006; PEREIRA et al., 2013) evi-denciando que na dose utilizada no período de 60 dias, não promove alterações desta distribuição espacial. Os neurônios mioentéricos foram encontrados entre as camadas longitudi-nal e circular da túnica muscular como já observado para o intestino delgado de ratos e outros animais (MOLINARI et al., 1994; STABILLE; LIMA; GERMANO, 1999; MIRAN-DA-NETO et al., 2001; HANSEN, 2006; CORREA et al., 2011; PEREIRA, et al., 2013).
Os neurônios evidenciados pela NADH-diaforase, encontram-se em maior densidade no grupo controle em comparação ao experimental, esta diminuição na quantidade de neurônios NADHd+ em animais submetidos a ingestão de 2,4-D, sugere um possível efeito neurotóxico deste herbicida sobre os neurônios do sistema nervoso entérico, que segundo Miranda-Neto et al. (2001; 2005) os neurônios corados pela histoquímica da NADH-diaforas e evidencia apenas neurô-nios metabolicamente ativos, sendo esta condição confirma-da quando utilizaconfirma-das técnicas de coloração confirma-da população total em comparação a NADH, onde a marcação neuronal foi de cerca de 80% da população total (YOUNG et al., 1993).
Quanto ao mecanismo envolvido na diminuição dos neurônios mioentéricos NADH-d+ poderia ser atribuído ao estresse oxidativo, visto quese acredita que o estresse oxi-dativo seja um evento secundário no processo patogênico incluindo as intoxicações pelos herbicidas derivados do 2,4D (BAYNES; THORPE, 1999, BONGIOVANNI et al., 2007). O estresse oxidativo ocorre num sistema celular quando o oxigênio reativo leve à danos nas membranas ou partes in-ternas das células, modifique proteínas, como o colágeno e a elastina ou provoque mudanças nas moléculas de DNA (GUTTERIDGE; HALLIWELL, 1992). Proteínas que são danificadas por estresse oxidativo têm diminuição da ativi-dade biológica, levando à perda do metabolismo de energia, sinalização celular, transporte e, em última instância, pode conduzir à morte celular (VINCENT et al., 2004).
Pereira e Stabille (2006) observou uma redução de 21,98% e 10,47% no número de neurôniosdos grupos trata-dos com 5,0 e 2,5mg/kg de 2,4-D. A diminuição do núme-ro de neurônios NADHd+ também foi observada em ratos submetidos a outras condições adversas de saúde, como por exemplo, no diabetes (CLEBIS et al., 2004). O estresse oxi-dativo seguido dos danos oxioxi-dativos nos tecidos, são pontos finais comuns de doenças crônicas, como aterosclerose, dia-betes, artrite reumatoide e também por doenças hepáticas e renais provocadas pelas intoxicações (BAYNES; THORPE, 1999, BONGIOVANNI, et al., 2007).
Neurônios mioentéricos nitrérgicos podem ser evi-denciados pelo método histoquímico da enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase (NADPH-diaforase) (SCHERER-SINGLER et al., 1983), em cuja subpopulação neuronal encontra-se em maior densidade no grupo experi-mental. São neurônios que sintetizam o óxido nítrico (NO) como neurotransmissor, que no sistema nervoso entérico funciona como inibitório para o músculo liso do tubo diges-tório (BELAI et al., 1992).
Este aumento da população nitrérgica, sugere maior resistência destes neurônios à morte celular (SANTER, 1994), porpossuírem mecanismos de defesa contra danos
causados por radicais livres (COWEN et al., 2000), contu-do, cabe destacar que o NO tem ação benéfica e prejudicial nas células (WALLACE; MILLER, 2000; DANIELS et al., 2005), mesmo não tendo sido este, o enfoque desta pesquisa.
Correa et al. (2011) registrou um aumento, apesar de não significativo (P>0,05), na expressão da subpopulação de neurônios NADPHdp no jejuno de ratos do grupo expe-rimental, em experimento conduzido por um período de 15 dias e na dosagem de 5mg/kg/dia de 2,4-D, resultados seme-lhantes foram descritos para o duodeno em condições expe-rimentais semelhantes (PEREIRA, et al., 2013). A diferença dos resultados pode ser atribuída, a maior exposição dos ra-tos ao 2,4D, que foi de 60 dias, impondo neste caso, a uma maior condição de alterações metabólicas, nos neurônios nitrérgicos do grupo experimental. Segundo Paulino et al. (1996) os sinais de intoxicação pelo 2,4D são dose e tempo dependentes em animais de laboratórios, assim também pode se esperar que sua detecção tecidual também o seja.
Há relatos de que os neurônios NADPHdp são re-sistentes ao envelhecimento, ao diabetes e a outras condições adversas (DAWSON et al., 1991; BELAI et al., 1995; JO-HNSON et al., 1998; FURLAN et al., 2004). São também mais resistentes às condições que determinam morte celu-lar, por apresentarem possível efeito defensivo antioxidan-te (BOLAÑOS et al., 1997), porém não são absolutamenantioxidan-te imunes às alterações fisiológicas destes processos, podendo progressivamente tornarem-se comprometidos (PHILLIPS; KIEFFER; POWLEY, 2003).
O mecanismo de ação do 2,4-D ainda não foi to-talmente compreendido (BONGIOVANNI et al., 2007), res-salta-se porém que o 2,4-D seja um inibidor da fosforilação oxidativa (SCHVARTSMAN, 1991; BRADBERRY et al., 2000). O uso extensivo deste herbicida motiva pesquisas so-bre suas propriedades e efeitos soso-bre os organismos vivos e o meio ambiente. (AMARANTE-JUNIOR, 2002).
Conclusão
Os resultados obtidos nessa pesquisa permitiram verificar que a ingestão de 2,4D na dose de 5mg/kg/dia, por 60 dias, interfere na expressão neuronal, levando a diminui-ção na densidade dos neurônios metabolicamente ativos, su-gerindo provável efeito tóxico do 2,4D, contudo o aumento da reatividade dos neurônios nitrérgicos, pode indicar maior resistência desta subpopulação à ação deste herbicida.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Fundação Araucária pela concessão da bolsa PEBIC para o primeiro autor, e a UNI-PAR pelo suporte financeiro para o desenvolvimento da Ini-ciação Científica.
Referências
ABDOLLAHI, M. et al. Pesticides and oxidative: a review.
Medical Science Monitor, Hicksville, NY, v. 10, n. 6, p.
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Recebido em: 21/12/2013 Aceito em: 20/08/2014
