Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células

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Análise dos Efeitos Terapêuticos

dos Electrões de Auger em

Culturas de Células

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Trabalhos Práticos 2

Análise dos Efeitos Terapêuticos dos

Electrões de Auger em Culturas de Células

Disciplina: Trabalhos Práticos

Curso: Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade do Porto

Aluna: Adriana Alexandre dos Santos Tavares

Orientador:

João Manuel R. S. Tavares

Professor Auxiliar do Departamento de Engenharia Mecânica e Gestão Industrial da FEUP

Co-Orientador:

Luís F. Metello

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Análise dos Efeitos Terapêuticos dos

Electrões de Auger em Culturas de Células

• Conteúdos da Apresentação:

–

Culturas de Células;

–

Ciclo Celular;

–

Possíveis Destinos Finais das Células Irradiadas;

–

Apoptose ou Morte Celular Programada – Principais Vias para Início;

• Apoptose e Necrose;

–

Radiofármaco;

• Radiofármaco Ideal para Terapêutica com Electrões de Auger;

–

Citometria de Fluxo;

–

Procedimento de Irradiação;

–

Estudos de Influxo e Efluxo;

–

Análise da Apoptose Radioinduzida;

–

Conclusões Finais;

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Cultura de Células

• Cultura células – o que são?

–

Tipo de cultura de tecidos que envolve um conjunto de técnicas que

permitem cultivar e/ou manter células isoladas fora do organismo de

origem.

–

Remover células de fragmentos de órgãos antes ou durante a cultura,

com concomitante separação das células vizinhas.

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Tipos de Cultura de Células

• Culturas Primárias

–

Obtidas por recolha cirúrgica de

pequenas peças de tecido;

–

Culturas inicialmente

heterogéneas, com o tempo

tornam-se dominadas por

fibroblastos;

–

Tempo de sobrevivência in vitro

reduzido;

–

Propícia a desenvolvimento de

contaminações.

• Linhas Celulares

–

Crescimento rápido e contínuo;

–

Proliferação limitada (cerca de 30

divisões celulares) ou ilimitada

(ex: células tumorais);

–

Mais homogéneas, estáveis e

reprodutíveis que culturas

primárias;

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Ciclo Celular

• Definição:

conjunto de transformações dinâmicas e contínuas que

decorrem desde a formação da célula até ao momento em que ela própria,

por divisão, origina duas células-filhas D carácter cíclico, com períodos de

crescimento e de divisão.

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Ciclo Celular

• Células de mamíferos

em cultura

• Fase G1 D 1 a 8 horas;

• Fase S D 6 a 8 horas;

• Fase G2 D 2 a 4 horas;

• Fase M D < 1 hora.

• Total ≈ 10 a 20 horas

A célula prepara-

se para se dividir

Mitose

A célula divide-se

Início ciclo

celular

A célula aumenta de

tamanho, biossíntese

Célula

retida

A célula decide se

prossegue ou não no ciclo

celular

A célula replica o

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Possíveis Destinos Finais de Células

Irradiadas

• Ausência de efeito;

• Atraso na divisão;

• Apoptose;

• Falha reprodutiva;

• Instabilidade genómica;

• Mutação;

• Transformação;

• Efeito bystander;

• Respostas adaptativas.

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Apoptose ou Morte Celular Programada –

Principais Vias para Início

Apoptose

Iniciada via receptores de

morte

Iniciada por estímulos agentes

externos (ex: radiação)

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Apoptose e Necrose

Normal

Edema reversível

Edema Irreversível

Desintegração

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Radiofármaco

• Dois componentes:

– Radionuclídeo

D

emissões energéticas corresponder aos

objectivos esperados e ao detector de radiação utilizado.

– Fármaco

D

seleccionado, com base na sua localização

preferencial num dado tecido ou órgão ou na participação

fisiológica que terá sobre determinadas células ou receptores.

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Citometria de Fluxo

• Técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas

suspensas num meio líquido em fluxo.

• Através de um aparelho de detecção óptico-eletrónico é possível analisar

características físicas e/ou químicas de uma simples célula.

Comparação da Citometria Fluxo e Microscopia Clássica

Microscopia Clássica

Citometria de Fluxo

Detecção visual

Detecção electrónica

Centenas de células analisadas

Milhares e milhões de células analisadas

Análise qualitativa

Análise quantitativa

Células imobilizadas na lâmina e contadas

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Procedimento de Irradiação

• Culturas de fibroblastos expostas a actividades de 740, 1480, 2220, 2960 e

3700 MBq/ml (20, 40, 60, 80 e 100 mCi/ml) de

99m

_Tc;

• Concluído o processo de irradiação D determinar quais as doses ideais

de irradiação;

• Irradiar apenas com as doses ideais e para diferentes doses absorvidas,

que se prevê situarem entre 1 e 2 Gy, utilizando-se intervalos cada 0.5 Gy.

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Estudos de Influxo e Efluxo

• Estudo de influxo

• Quantidade de

99m

_{Tc-Pertecnetato de}

Sódio que penetrou a membrana

celular.

• Estudo de efluxo

• Quantidade de

99m

_{Tc- Pertecnetato}

de Sódio que entrou na célula, mas

foi de seguida expulso para o seu

exterior.

Compreender a capacidade de difusão do radiofármaco pela membrana

celular e sua consequente captação por parte da célula.

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Análise da Apoptose Radioinduzida

• Citometria de fluxo com recurso à técnica da dupla marcação com

anexina V e iodeto de propídio.

Reagente

Diagnóstico Celular

Anexina V

Iodeto de Propídio

Células Viáveis

2

2 Início de Apoptose

3

2

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Conclusões Finais

• Linhas celulares D grande disponibilidade e elevada capacidade de

reprodutibilidade.

• Radiação D apoptose, pela indução de danos ao ADN irreparáveis.

• Crescente interesse da comunidade científica relativamente aos

radionuclídeos emissores de electrões de Auger, dos quais o

99m

_{Tc faz}

parte.

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Perspectivas Futuras

1. Contribuição para a criação de um texto de revisão actualizado e

completo sobre o tema da Dissertação;

2. Melhorar o conhecimento actual do papel do

99m

_{Tc enquanto agente}

irradiante no contexto terapêutico, pela análise dos efeitos

radiobiológicos em culturas de células seleccionadas;

3. Utilização de técnicas de citometria de fluxo para avaliação dos efeitos

da radiação na célula, nomeadamente, a indução da apoptose;

4. Estudo de efluxo e influxo do

99m

_{Tc-Pertecnetato de Sódio em culturas}

de células, de forma a relacionar o seu papel enquanto agente

terapêutico com a sua dinâmica celular.

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FIM