Papel do estresse oxidativo no desenvolvimento da insuficiência renal

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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ROBERTO MEISTER BERNARDI

Papel do estresse oxidativo no desenvolvimento da insuficiência renal

isquêmica: possibilidade terapêutica do uso de antioxidantes.

CRICIÚMA – SANTA CATARINA 2007

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ROBERTO MEISTER BERNARDI

Papel do estresse oxidativo no desenvolvimento da insuficiência renal

isquêmica: possibilidade terapêutica do uso de antioxidantes.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol

Criciúma - Santa Catarina 2007

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Dedico esta dissertação à minha esposa, Fabiana e aos meus filhos, Gustavo e Isabela, que me dão inspiração e coragem para prosseguir durante todos os momentos de minha vida.

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Agradeço ao Professor e Amigo Felipe Dal Pizzol pela dedicação e confiança para o trabalho desenvolvido, durante todas as etapas deste mestrado. Agradeço a minha esposa que manteve a família unida nos momentos em que precisei me ausentar e agradeço aos meus pais que formaram a base para que toda uma vida pudesse ser construída.

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RESUMO

A isquemia renal é um evento comum na prática clínica que leva à rápida perda da função do órgão e ao acúmulo dos compostos nitrogenados no plasma. A insuficiência renal aguda (IRA) aumenta em 20% a mortalidade dos mais variados processos patológicos. Ainda não há uma terapia específica para a prevenção ou recuperação do tecido renal lesado. O evento isquêmico inicia a resposta inflamatória que se perpetua após a reperfusão sanguínea, em grande parte, devido à produção de radicais livres de oxigênio. Estudos têm demonstrado que o uso de antioxidantes pode diminuir o estresse oxidativo em vários tecidos e órgãos. Este trabalho se propõe a verificar o papel do uso do antioxidante n-acetilcisteína (NAC), associado ou não a deferoxamina (DFX), no evento isquêmico renal em modelo animal com ratos Wistar e comparar diferentes vias de administração do tratamento. Foram realizadas duas etapas de estudo. A primeira etapa envolveu cinco grupos com 15 ratos em cada grupo. Cada grupo recebeu tratamento com solução salina, NAC, NAC+DFX ou DFX pela via de administração subcutânea 10 minutos antes da isquemia renal. A isquemia renal durou 45 minutos e os ratos foram sacrificados em 1h, 6h e 12h após a reperfusão (cinco ratos em cada grupo em cada tempo). A segunda etapa foi realizada da mesma maneira, porém, o tratamento foi administrado pela via arterial, diretamente na aorta dos ratos, imediatamente acima das artérias renais. Após os tempos de reperfusão os animais foram sacrificados. Foram coletados os rins e plasma para análise de estresse oxidativo, com dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e proteínas carboniladas. A medida da função renal foi realizada com dosagem de uréia e creatinina plasmática. No grupo de terapia arterial também se verificou a atividade de mieloperoxidase (MPO) no tecido renal. Os resultados obtidos demonstraram que a terapia com NAC ou DFX apresentou diferenças significativas em relação ao controle na manutenção da função renal e na diminuição do estresse oxidativo. A terapia com NAC+DFX foi discretamente melhor que a terapia com NAC ou DFX isolados, sugerindo a importância do ferro livre no mecanismo de lesão tecidual. A terapia antioxidante diminuiu a expressão de MPO no tecido renal em relação ao controle após a isquemia. A terapia arterial e a subcutânea foram efetivas para o tratamento antioxidante e mostraram ser benéficas para a proteção da função renal e na diminuição do estresse oxidativo.

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ABSTRACT

The renal ischemia is a common event on the clinical setting that leads a quickly loss of renal function and retention of plasmatic BUN. Acute renal failure (ARF) elevates in 20% the mortality rate of others pathological processes. There is no specific therapy against the ischemic injury and to recovery the damaged tissue. The ischemic event turn on an inflammatory reaction that continues after the reperfusion due to the production of oxygen free radicals. Several studies have demonstrated the use of antioxidants to prevent oxidative damage and to diminish oxidative stress. The aim of this study is to examine the effects of N-acetylcysteine (NAC) alone or in combination with deferoxamine (DFX) in rats subjected to renal ischemia/reperfusion (I/R) and compares different routes of administration of these drugs. This study was divided in two steps. The first step was performed with five groups with 15 rats in each group. Each group was treated with saline solution, NAC, NAC+DFX or DFX by subcutaneous route 10 minutes before ischemia. The renal ischemia remained 45 minutes and then the rats were sacrificed at 1h, 6h and 12h after reperfusion (five rats in each time of reperfusion). The other step was performed in the same model but the drugs were infused in the arterial route. After the time of reperfusion the kidneys and plasma were collected to TBARS, Carbonyl, urea and creatinine analysis. In the arterial group was also measured the expression of MPO in renal tissue after I/R. The results showed that NAC or DFX therapy were significantly different from control group in renal function and to diminish oxidative stress. NAC+DFX were a little better than NAC or DFX alone in the prevention of oxidative stress suggesting the role of iron in tissue damage. The expression of MPO was markedly diminished due to the treatment with NAC and DFX. Both routes of administration of therapies were successful and the therapy with antioxidants seems to protect renal function and to diminish oxidative stress during renal I/R.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATP- adenosina trifosfato

DFX- deferoxamina

DNA – ácido desoxiribonucleico

EROs – Espécies reativas de oxigênio

Fe

++

- ferro II

Fe

+++

- ferro III

H

2

O

2

– peróxido de hidrogênio

HOCL- ácido hipocloroso

HOCL

-

ácido hipoclorito

ICAM I – moléculas de adesão intercelular

IRA – Insuficiência renal aguda

NAC- n-acetilcisteína

•OH – radical hidroxil

OH

-

- ânion hidroxila

O

2-•

- ânion superóxido

TBARS- substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

VCAM I- moléculas de adesão vascular

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Sumário

Introdução---09

Referencial Teórico---12

Insuficência renal aguda---12

Hemodinâmica renal---13

Isquemia renal---14

Avaliação da função renal---16

Espécies reativas de oxigênio---18

Sistemas de defesa antioxidante---20

Glutationa reduzida (GSH) ---20

Glutationa redutase (GSH-Rd)---20

Catalase---21

Superóxido dismutase---21

Antioxidantes não enzimáticos---22

NAC---22

DFX---22

Objetivos---23

Materiais e métodos---24

Resultados---27

Avaliação da função renal---27

Avaliação do estresse oxidativo no tecido renal ---40

Discussão---58

Conclusão---- ---65

Perspectivas futuras---66

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Introdução

Os rins são órgãos pares, sólidos, situados profundamente no retroperitônio, um de cada lado da coluna dorsal. São órgãos responsáveis pela excreção urinária e têm um papel fundamental no controle dos líquidos corporais, balanço hidroeletrolítico e ácido básico, além de importantes funções endócrinas como o metabolismo da vitamina D e a produção de renina e eritropoietina (Kabalin, 1998).

A Insuficiência renal aguda (IRA) é uma patologia comum que afeta cerca de 5% dos pacientes que se encontram hospitalizados por diferentes patologias. A perda da função renal é uma situação clínica crítica que está associada com alta taxa de mortalidade. Apesar dos avanços tecnológicos, nas últimas quatro décadas não houve mudança na mortalidade associada com a IRA (Ysebeart ,2004). A insuficiência renal aguda ainda agrava outros estados patológicos como a sepse, cirurgias e estados pós-transplante. Uma das causas mais comuns de IRA é a isquemia (Tadahani ,1996).

A insuficiência renal aguda isquêmica é uma síndrome que se desenvolve após uma súbita queda no suprimento sangüíneo dos rins (Boventre, 2004). A insuficiência renal que ocorre após a isquemia é caracterizada pela diminuição da filtração glomerular, necrose tubular e aumento da resistência vascular (Erbas, 2004). Os mecanismos de lesão tecidual renal devido à isquemia e reperfusão são multifatoriais, interdependentes e envolvem hipóxia, resposta inflamatória e dano por radicais livres (Shehirli, 2003). A hipóxia tecidual no rim leva a depleção de ATP com conseqüente disfunção mitocondrial, acúmulo de sódio intracelular, cálcio e radicais livres de

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oxigênio. Subseqüentemente, múltiplos sistemas enzimáticos incluindo proteases, óxido nítrico sintases, fosfolipases e endonucleases, são ativados. Estes sistemas são responsáveis pela destruição do citoesqueleto, lesão de membranas citoplasmáticas, degradação de DNA e morte celular (Lien, 2003). Entre os mecanismos de lesão tecidual na isquemia e reperfusão, o papel dos radicais livres de oxigênio tem assumido cada vez mais importância. Durante a isquemia e reperfusão estes radicais são produzidas no tecido renal e podem ser os efetores de diversas alterações patológicas envolvidas na gênese da doença. O dano celular e a acidose gerada pela hipóxia aumentam a quantidade de ferro livre liberado da hemoglobina e, pela reação de Fenton, há formação de grande quantidade de radicais livres hidroxila. Estas radicais hidroxilas são potentes e têm alto poder de lesão tecidual devido à sua capacidade de causar peroxidação lipídica de membranas celulares (Ritter, 2004).

Estudos têm demonstrado que o uso de antioxidantes pode diminuir o dano celular do estresse oxidativo em uma variedade de situações clínicas (Fishbane, 2004; Ritter, 2004; Tylick, 2003). A n-acetilcisteína (NAC) é uma variante acetilada do aminoácido L-cisteína e precursora da glutationa reduzida (GSH). É uma excelente fonte de grupos sulfidrila e é convertida no corpo humano em metabólitos capazes de estimular a síntese de glutationa, promover a desintoxicação e agir diretamente neutralizando radicais livres de oxigênio (Kelly, 1998). A deferoxamina (DFX) é um quelante de ferro usado clinicamente no tratamento da hemocromatose. Alguns estudos demonstram a sua utilização na prevenção da lesão envolvendo radicais livres de oxigênio (Paller, 1994, Ritter, 2004; Ritter, 2004).

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Medidas preventivas com o objetivo de preservar a função renal ou medidas terapêuticas em episódios de isquemia, são de extrema importância no ambiente clínico. O estresse oxidativo é um grande contribuinte para o desenvolvimento do dano renal em episódios isquêmicos e terapias que evitam ou diminuam o dano oxidativo poderiam ser parte do tratamento dos casos de IRA.

Este trabalho em um modelo animal estudou os efeitos do uso do antioxidante NAC na lesão de isquemia e reperfusão renal. A NAC foi usada isoladamente ou em associação com a DFX em duas vias de administração. Foram testadas a via subcutânea e a via arterial para a administração do tratamento previamente a isquemia do tecido renal.

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Referencial teórico

Insuficiência renal aguda

A insuficiência renal aguda (IRA) é caracterizada pela deterioração da função renal por um período de horas a dias, resultando na incapacidade do rim excretar os produtos nitrogenados e manter o balanço hidroeletrolítico e a homeostasia. A definição de IRA inclui um aumento de creatinina sérica superior a 0,5 mg por decilitro acima do valor basal, um aumento de mais de 50% da creatinina acima do valor basal, a redução do clearance calculado de creatinina para menos de 50% ou uma redução da função renal que necessite de diálise (Boventre , 1996).

A IRA pode decorrer de inúmeras causas e é classificada em pré-renal, renal ou pós-renal. A azotemia pré-renal, ou isquêmica, é responsável por até 70% dos casos provenientes da comunidade e 40% dos casos que evoluem para IRA no ambiente hospitalar. O distúrbio pré-renal prolongado é o principal fator que leva à necrose tubular isquêmica. Os fatores que podem levar a redução da perfusão renal são variados: vômitos, diarréia, febre, uso de diuréticos, insuficiência cardíaca e choque hipovolêmico são algumas causas comuns. Em pacientes cirúrgicos a azotemia pré-renal é uma causa freqüente de perda da função pré-renal, tanto pela perda sanguínea do trans-operatório como por cirurgias especificas que levam a interrupção do suprimento sanguíneo ao rim.

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A IRA pode ser oligúrica, com um débito urinário menor que 400 mL ao dia, ou não oligúrica, com um débito urinário maior de 400 mL ao dia. Os pacientes com diurese preservada tendem a apresentar um melhor prognóstico que os oligúricos na evolução da IRA (Boventre, 1996). A necessidade de diálise em pacientes com IRA chega a 60% e a taxa de mortalidade pode variar de sete até 80% em pacientes em pós-operatório que desenvolvem a síndrome. Apesar da diálise e cuidados intensivos, porém, a mortalidade entre os pacientes com IRA severa permanece inalterada nos últimos 50 anos.

Hemodinâmica renal

Em condições normais, de repouso, o fluxo sanguíneo para os rins equivale a, aproximadamente, 20 % do débito cardíaco. Quando este valor é expresso em fluxo/ kg, o fluxo sanguíneo renal é oito vezes maior que o fluxo coronariano, refletindo a baixa resistência da circulação renal (Dworkin e Brenner, 1991). O sangue entra no rim através da artéria renal que se ramifica várias vezes até chegar ao glomérulo pela arteríola aferente. Cerca de 20% do plasma é filtrado no glomérulo para os túbulos renais e o restante deixa o rim pela arteríola eferente. Os néfrons localizados no córtex renal possuem os capilares próximos aos túbulos e modulam a reabsorção de água e solutos pelo rim. Nos néfrons justaglomerulares, localizados na medula renal, as

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arteríolas eferentes formam os vasos retos, os quais participam na concentração urinária com grande reabsorção de água.

A formação da urina e a função de excretar os compostos nitrogenados dependem de forças que interagem para ocorrer a filtração glomerular. Estas forças podem ser expressas como: pressão capilar glomerular, pressão da cápsula de Bowman, pressão coloidosmótica glomerular e pressão coloidosmótica do ultrafiltrado. Além das pressões, a integridade da membrana basal glomerular é de extrema importância para o adequado funcionamento glomerular (Arendhorst e Navar, 1992). Como o glomérulo está situado entre as arteríolas aferente e eferente, mudanças seletivas na resistência destes vasos alteram a filtração glomerular e a função renal (Maddox e Brenner, 1996). A vasoconstrição da arteríola aferente diminui a filtração glomerular e o fluxo plasmático glomerular. Quando a arteríola aferente dilata aumenta o fluxo plasmático glomerular aumentando a filtração glomerular. A vasoconstrição da arteríola eferente diminui o fluxo plasmático, mas aumenta a pressão glomerular, aumentando a filtração glomerular.

Isquemia renal

O que se poderia esperar após a lesão isquêmica de algum órgão é que, com o restabelecimento do fluxo sanguíneo e a adequada oxigenação dos tecidos o dano fosse interrompido ou minimizado. As analises de vários estudos, porém, demonstram que no momento da reperfusão pode haver uma extensão da lesão tecidual com início

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de uma série de mecanismos deletérios ao tecido adjacente (Boventre ,2004; Molitoris, 2004; Brodsky , 2002).

O processo de isquemia-reperfusão (I/R) tem efeito imediato na microcirculação. Os efeitos iniciais incluem ativação de plaquetas, ativação de células endoteliais e ativação de células da musculatura lisa endotelial (Lefer, 1987). As plaquetas ativadas se aderem entre si e liberam mediadores pró-coagulantes levando a vasoconstrição e trombose dos pequenos vasos. Nas células endoteliais e musculares há uma depleção de ATP com conseqüente aumento do lactato intracelular, aumento de Ca2+_e

diminuição da atividade da Na-K-ATPase. Com a manutenção da isquemia, há destruição do citoesqueleto e consequente morte celular com impossibilidade de recuperação do tecido. Com o retorno do sangue oxigenado a isquemia termina e se inicia a reperfusão.

No momento da reperfusão iniciam-se diversos eventos secundários. Espécies reativas de oxigênio (EROS) são geradas a partir dos neutrófilos ativados e das células endoteliais submetidas à isquemia. Nas células endoteliais a conversão de xantina desidrogenase para xantina oxidase que depende de Ca2+ ocorre gerando O2- e H2O2

da hipoxantina e do oxigênio disponível. Estas EROS reagem com as membranas lipídicas, com os ácidos nucléicos, com proteínas e com carboidratos levando a sua oxidação e conseqüente degradação.

Após a I/R o endotélio produz substâncias pró-inflamatórias, incluindo endotelina 1 (ET-1), fator ativador plaquetário (PAF), leucotrienos e EROs (Lefer e Lefer, 1993) e diminui a produção de substâncias protetoras como adenosina, óxido nítrico (NO), prostaglandina I2 (PGI2). Há expressão de moléculas de adesão, resultando em

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adesão de leucócitos e subseqüente liberação de mais mediadores inflamatórios incluindo fator de necrose tumoral (TNF), proteinases, mais EROS, mais PAF e outras citoquinas (Lefer e Lefer, 1993). Estes mediadores causam destruição da lâmina basal e promovem a diapedese dos polimorfonucleares (PMNs) para dentro do endotélio, onde eles causam dano à parede do vaso e interstício. Estas relações, dos leucócitos ativados com o endotélio são maiores na medula que no córtex, demonstrando uma maior suscetibilidade a isquemia desta região do rim. Neste ambiente inflamatório a interrupção dos eventos poderia minimizar o dano tissular e, talvez o bloqueio dos EROS pudesse ser benéfico para a recuperação do tecido isquêmico.

Avaliação da função renal

A função mais importante dos rins é a filtração glomerular. Através da ultrafiltração passiva do plasma pela membrana glomerular, o rim é capaz de regular a quantidade total de sal e água do organismo, assim como regular o equilíbrio eletrolítico e eliminar os produtos do metabolismo protéico (Shoskes, 2007).

A taxa de filtração glomerular pode ser aferida calculando-se o clearance de algum produto ou substância que se encontra no plasma e é filtrado pelo glomérulo. O

clearance é a quantidade de plasma que é purificado desta substância por unidade de

tempo. Algumas substâncias têm sido usadas para estimar a taxa de filtração glomerular.

Uma destas substâncias é a inulina. A inulina é um polissacarídeo que é 100% filtrado no glomérulo e reflete fielmente a filtração glomerular. A inulina, contudo é uma

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substância exógena que deve ser infundida constantemente durante o período no qual o clearance será calculado.

O método mais utilizado para a estimativa de filtração glomerular é o clearance de creatinina de 24h (Levey,1990). É utilizada a creatinina endógena que é produzida em uma taxa constante. A taxa de produção de creatinina varia menos de 10% em cada indivíduo.

Um método mais simples de se estimar a taxa de filtração glomerular é a medida de substâncias plasmáticas que são marcadores de função renal. A creatinina plasmática é o marcador mais usado de função renal (Shoskes, 2007). Embora a creatinina seja produzida em uma taxa constante, existe uma variação de indivíduo para indivíduo. A taxa absoluta depende da massa muscular a qual é influenciada pela idade, sexo, e massa corpórea. Não há, portanto, um valor definitivo para o normal, que deve ser individualizado para cada caso. A relação com a filtração glomerular, contudo, é relativamente constante. Como uma regra geral, com uma perda de 50% de filtração glomerular, a creatinina plasmática tem o seu valor duplicado.

A uréia plasmática é outro marcador importante de função renal. A produção de uréia e sua excreção são extremamente variáveis e dependem de fatores como estado de hidratação, dieta e lesão tecidual. Não é um marcador definitivo de função renal isoladamente e deve ser analisada em conjunto com outros parâmetros.

Outro marcador ainda não utilizado regularmente é a cistatina C plasmática. È uma proteína encontrada nas células nucleadas que tem uma taxa constante de produção, sem sofrer alterações com a dieta, e o clearance não é influenciado pelas

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funções tubulares (Filler et al, 2005). Este teste , que ainda não é rotineiramente utilizado, poderá substituir a creatinina.

Espécies reativas de oxigênio

O termo radical livre refere-se a átomo ou molécula altamente reativo, que contém número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica (Halliwell e Gutteridge, 1990). O radical superóxido é formado após a primeira redução do oxigênio. Ele ocorre em quase todas as células aeróbicas e é produzido durante a ativação de neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos (Halliwell, 1986). O radical hidroxila (OH•_{) é considerado a ERO mais reativa em sistemas biológicos. A combinação}

extremamente rápida da OH•_{com metais ou outros radicais no próprio sítio aonde foi}

produzido confirma a sua alta reatividade. Assim, se o radical hidroxila for produzido próximo ao DNA e este estiver fixado a um metal, poderão ocorrer modificações de bases purínicas e pirimidínicas levando a mutação ou inativação do DNA. O radical hidroxila também pode inativar várias proteínas (enzimas e membranas celulares), ao oxidar seus grupos sulfidrila (-SH) a pontes dissulfeto (-SS). Além disso, pode iniciar a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados das membranas celulares, processo chamado de peroxidação lipídica (Halliwell e Gutteridge, 1986). O H2O2 não é um

radical livre, pois possui os elétrons emparelhados na sua última camada, porém tem uma ação extremamente deletéria. Ele participa da formação do radical hidroxila, tem meia vida longa e atravessa camadas lipídicas.

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Os metais também apresentam uma ação catalítica na formação das EROs. Sua participação é demonstrada pelas reações de Fenton e Haber-Weiss (Dunford, 1987). O ferro é o metal mais abundante no organismo e está biologicamente mais capacitado a participar das reações de oxidação das biomoléculas que outros metais.

Reação de Fenton Fe++ + O2 --- Fe+++ + O2-• 2O2-• + 2H+ --- O2 + H2O2 Fe++ + H2O2 --- Fe+++ + OH- + OH • Reação de Haber-Weiss Fe+++ + O2-• --- Fe++ + O2 Fe++ + H2O2 --- Fe+++ + OH- + OH• O2-• + H2O2 --- O2 + OH- + OH-

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Sistemas de defesa antioxidante

Glutationa reduzida (GSH)

A GSH (L-γ- glutamil-L cisteinil-glicina) está presente na maioria das células e é o tiol (-SH) mais abundante no meio intracelular (Meister e Anderson, 1983). Sua capacidade redutora é determinada pelo grupamento –SH, presente na cisteína. A GSH pode ser considerada um dos agentes mais importantes do sistema antioxidante da célula. Diminui a suscetibilidade à lesão renal decorrente da isquemia e reperfusão (Shan et al, 1990), atua como transportadora e reservatório de cisteína e participa da detoxificação de agentes químicos e da eliminação de produtos da lipoperoxidação. Ainda é requerida para a síntese de DNA, de proteínas e de algumas prostaglandinas (Deneke e Fanburg, 1989).

Glutationa redutase (GSH -Rd)

A recuperação da GSH oxidada é feita pela GSH –Rd, uma etapa fundamental no processo de defesa antioxidante. A GSH-Rd catalisa a seguinte reação:

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A GSH-Rd é uma flavoproteína dependente da nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato reduzida (NADPH) e, portanto, também dependente do ciclo das pentoses. A velocidade com a qual o ciclo das pentoses trabalha depende da oferta de NADP+_{para glicose-6-fosfato desidrogenase. Com a ação da GSH-Rd há uma}

diminuição da razão NADPH/NADP+ o ciclo das pentoses deve acelerar para repor a necessidade de NADPH ( Ross e Moldeus, 1991).

Catalase

A catalase é uma hemeproteína citoplasmática que catalisa a redução de H2O2 a

H2O e O2. Representa um sistema de defesa antioxidante extremamente importante

devido ao H2O2 ser facilmente difusível através das membranas celulares. É

encontrada no rim, fígado, ossos, sangue e mucosas. Sua atividade é dependente de NADPH. A suplementação de catalase exógena previne a oxidação da GSH mediada pelo H2O2 (Scott, 1991).

Superóxido-dismutase (SOD)

A SOD corresponde á uma família de enzimas com várias proteínas em sua composição. A SOD-cobre-zinco está presente no citosol, e a forma SOD-manganês está localizada na mitocôndria. Esta enzima catalisa a dismutação do radical superóxido em H2O2 e O2 na presença de prótons H+ (Ross e Moldeus, 1991).

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Antioxidantes não enzimáticos

N-acetilcisteína (NAC)

A NAC é um precursor da GSH e é composto pela fórmula química C5H9NO3S.

Contém um grupo sulfidril (-SH) que é responsável pela ação antioxidante. O efeito benéfico da NAC é devido a sua capacidade de reduzir a cistina extracelular em cisteína ou ser uma fonte do grupo –SH. A NAC pode estimular a síntese de GSH, aumentar a atividade da glutationa-S-transferase, promover a detoxificação e agir diretamente contra os EROs.

Deferoxamina (DFX)

A DFX é o quelante de ferro mais utilizado no tratamento de intoxicação por este metal. Isto inclui situações clínicas como ingestão acidental de altas doses do íon ferro ou sobrecarga de ferro após transfusões sanguíneas. DFX forma um complexo termodinamicamente estável com o íon férrico, tornando o ferro indisponível para catalisar as reações biológicas, principalmente as que produzem radicais livres de oxigênio.

A ação antioxidante da NAC tem sido estudada em estudos experimentais nas mais variadas situações e sua associação com o DFX não está plenamente estabelecida. Há um questionamento se a diminuição da oferta de ferro poderá ter algum efeito na ação da NAC e um aumento na sua capacidade antioxidante.

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Objetivos

Objetivo geral

Determinar a eficácia terapêutica do tratamento com antioxidantes em um modelo animal de isquemia e reperfusão renal.

Objetivos específicos

1- Determinar o efeito terapêutico do uso de antioxidante, n-acetilcisteína, na isquemia e reperfusão renal.

2- Determinar o efeito terapêutico do uso de quelante de ferro, deferoxamina, na isquemia e reperfusão renal.

3- Determinar o efeito terapêutico do uso de antioxidante associado com quelante de ferro na isquemia e reperfusão renal

4- Determinar o efeito da terapia antioxidante em relação à via de administração 6- Determinar a função renal nos ratos submetidos à isquemia e relacionar com o efeito da terapia antioxidante e a via de administração.

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Materiais e métodos

Estudo em modelo animal

Este trabalho foi aprovado em seus aspectos éticos e metodológicos, de acordo com as Diretrizes e Normas Internacionais pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Extremo Sul Catarinense UNESC.

1- Animais e protocolo para indução da isquemia e reperfusão renal: Ratos Wistar adultos, pesando entre 250 e 350 gramas, do biotério da UNESC foram utilizados para indução da isquemia/reperfusão renal. A isquemia renal foi produzida usando a técnica de clampeamento da artéria renal bilateralmente, com clampes microvasculares, conforme previamente descrito (Rhoden et al, 2001). Brevemente, os ratos foram anestesiados com 100 mg/kg de quetamina administrados no subcutâneo e submetidos a laparotomia mediana abdominal. O pedículo renal foi dissecado, de cada lado e as artérias renais clampeadas por 45 min. Após o tempo de isquemia foram retirados os clampes e a reperfusão foi iniciada. Durante o procedimento os ratos foram mantidos anestesiados e aquecidos.

2- Desenho do estudo: após a isquemia renal de 45 min e reperfusão, nos tempos 1, 6 ou 12 horas , os ratos foram sacrificados. Os rins foram isolados e o plasma coletado para análise de marcadores de estresse oxidativo, mieloperoxidase e

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função renal. Os órgãos foram mantidos a – 80 °C até a medida dos parâmetros de estresse oxidativo.

3- Tratamento com antioxidantes: os ratos foram tratados com DFX (20 mg/kg) e/ou NAC (20 mg/kg), administrados uma vez 10 minutos antes da isquemia renal pela via subcutânea ou imediatamente antes do início da isquemia pela via arterial. No grupo controle foi administrado solução salina com igual volume aos grupos tratados (1 mL) e no grupo sham houve apenas laparotomia com manipulação do pedículo renal sem isquemia e sem tratamento.

4- Medidas do estresse oxidativo:

a)Medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS): como indício de peroxidação lipídica foi medido a concentração de TBARS plasmático durante uma reação ácida aquecida como previamente descrito (Drapper e Halley, 1990). Brevemente, as amostras obtidas foram misturadas com 1 mL de ácido tricloroacético 10% e 1 mL de ácido tiobarbitúrico, fervidas por 15 min e após a quantidade de TBARS foi determinada pela espectrofotometria na absorbância de 535 nm.

b) Medida do dano oxidativo em proteínas: o dano oxidativo em proteínas plasmáticas foi determinado pela medida de grupos carbonil conforme previamente descrito (Levine et al, 1990). Brevemente, as amostras obtidas foram precipitadas e

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as proteínas dissolvidas com dinitrofenilidrazina. Os grupamentos carbonil foram medidos pela espectrofotometria na absorbância de 370 nm.

c) Medida de mieloperoxidase: o tecido renal foi homogeneizado (50 mg/mL) com 0,5% de brometo de haxadeciltrimetilamonio em 10 mM 3-N- acido morfolinopropanosulfonico e centrifugado a 15000 x g por 40 minutos. Uma amostra do sobrenadante foi misturada com uma solução de 1,6 mM tetrametilbenzidina e 1 mM de peróxido de hidrogênio. A atividade da MPO foi medida espectrofotometricamente pela absorbância de 650nm a 37°C (Liaudet, 2001). Os resultados são expressos em miliunidades de MPO por miligrama de proteína, a qual foi determinada pelo método Bradford.

. d) Medida da função renal

Foram dosados no plasma dos animais a concentração de uréia e creatinina em rotina de laboratório de análises clínicas.

Análise estatística

A diferença entre os grupos foi avaliada pela análise de variância de uma via (ANOVA). Quando o valor F for significativo, comparações post hoc serão feitas pelo teste de Newman –Keuls.

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Resultados

O objetivo principal do tratamento antioxidante foi verificar a proteção da função renal. Como parâmetros da função renal foram dosados a uréia e a creatinina plasmáticas nos ratos submetidos à isquemia e reperfusão.

Uréia plasmática de ratos submetidos a isquemia renal por um período de 45 min seguidos de 1h, 6h ou 12h de reperfusão, sob os tratamentos com NAC, DFX ou NAC+DFX nas vias subcutâneas ou arterial.

Uréia 1h 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

sham salina nac dfx dfx+nac

Figura 1: Uréia plasmática com 1 h de reperfusão e tratamento subcutâneo. Uréia plasmática (mg/dL) de ratos adulos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 1h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração subcutânea, foram comparados com os grupos sham e salina. Não houve diferença entre os grupos. (n=5 para cada grupo)

(28)

Uréia 1h 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

sham salina nac dfx nac+dfx

Figura 2: Uréia plasmática com 1h de reperfusão e tratamento arterial. Uréia plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 1h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração arterial, foram comparados com os grupos sham e salina. Não houve diferença entre os grupos. (n=5 para cada grupo)

(29)

Uréia 6h 0 20 40 60 80 100

** ** **

*

Figura 3: Uréia plasmática com 6h de reperfusão e tratamento subcutâneo. Uréia plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 6h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração subcutânea, foram comparados com os grupos sham e salina. Houve diferença significativa entre os grupos NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

* diferente para sham ** diferente para o salina p< 0,001.

(30)

Uréia 6h 0 20 40 60 80 100 120 140

*

**

Figura 4: Uréia plasmática com 6h de reperfusão e tratamento arterial. Uréia plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 6h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração arterial, foram comparados com os grupos sham e salina. Houve diferença significativa entre o grupo NAC+DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

(31)

Uréia 12h 0 20 40 60 80 100

** **

* *

Figura 5: Uréia plasmática com 12h de reperfusão e tratamento subcutâneo. Uréia plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 12h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração subcutânea, foram comparados com os grupos sham e salina. Houve diferença significativa entre os grupos DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

(32)

Uréia 12 h 0 50 100 150 200 250

** *

Figura 6: Uréia plasmática com 12h de reperfusão e tratamento arterial. Uréia plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 12h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração arterial, foram comparados com os grupos sham e salina. Houve diferença significativa entre o grupo NAC+DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

(33)

Creatinina plasmática de ratos submetidos à isquemia renal por um período de 45 minutos seguidos de um período de 1h, 6h ou 12h de reperfusão, sob os tratamentos com NAC, DFX ou NAC + DFX nas vias subcutânea ou arterial.

Creatinina 1h 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

*/**

Figura 7: Creatinina plasmática com 1h de reperfusão e tratamento subcutâneo. Creatinina plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 1h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração subcutânea, foram comparados com os grupos sham e salina. Houve diferença significativa entre o grupo DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

(34)

Creatinina 1h 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

Figura 8: Creatinina plasmática com 1h de reperfusão e tratamento arterial. Creatinina plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 1h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração arterial, foram comparados com os grupos sham e salina. Não houve diferença significativa entre os grupos NAC, DFX ou NAC+DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

(35)

Creatinina 6h 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

**

Figura 9: Creatinina plasmática com 6h de reperfusão e tratamento subcutâneo. Creatinina plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 6h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração subcutânea, foram comparados com os grupos sham e salina. Houve diferença significativa entre o grupo NAC+DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

(36)

Creatinine 6h 0 0,5 1 1,5 2 2,5

*

Figura 10: Creatinina plasmática com 6h de reperfusão e tratamento arterial. Creatinina plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 6h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração arterial, foram comparados com os grupos sham e salina. Não houve diferença significativa entre os grupos tratados em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

* diferente para sham ** diferente para o salina p< 0,001

mg/d L

(37)

Creatinina 12h 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

*/** */** **

Figura 11: Creatinina plasmática com 12h de reperfusão e tratamento subcutâneo. Creatinina plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 12h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração subcutânea, foram comparados com os grupos sham e salina. Houve diferença significativa entre os grupos NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

* mg/dL

(38)

Creatinina 12h 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Figura 12: Creatinina plasmática com 12h de reperfusão e tratamento arterial. Creatinina plasmática (mg/dL) de ratos adultos submetidos à isquemia renal por um período de 45 min, seguido por um período de reperfusão de 12h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX, com administração arterial, foram comparados com os grupos sham e salina. Não houve diferença significativa entre os grupos NAC. DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina. (n=5 para cada grupo)

(39)

Os gráficos de função renal demonstram que com 1h de reperfusão não houve diferença entre os grupos para o tratamento subcutâneo ou arterial na dosagem de uréia plasmática.

Quando se aumentou o tempo de observação para 6h após a reperfusão, houve diferença entre os grupos que receberam tratamento com NAC, DFX ou NAC+DFX em relação ao grupo salina no tratamento subcutâneo.

Na terapia arterial, com 6h de reperfusão, apenas o grupo que recebeu NAC+DFX apresentou diminuição dos níveis plasmáticos de uréia.

Com 12h de reperfusão no tratamento subcutâneo, houve maior proteção no tratamento com DFX. Apenas os grupos com DFX e NAC+DFX foram diferentes do controle, mostrando uma redução significativa da uréia plasmática.

No grupo arterial, com 12 h de reperfusão também só houve resultado favorável com NAC+ DFX para a dosagem de uréia plasmática.

A creatinina plasmática com 1h de reperfusão apresentou resultado significativo com o uso de DFX subcutâneo. No grupo arterial não se observou benefício com tratamento antioxidante.

Outra vez, no grupo subcutâneo houve importância do DFX associado com NAC para diminuição da creatinina plasmática. Na terapia arterial não se observou redução nos níveis plasmáticos de creatinina nos grupos tratados.

Com 12 h de reperfusão, todos os tratamentos foram melhores que o controle na manutenção da creatinina na terapia subcutânea. Na terapia arterial não houve redução da creatinina com o tratamento.

(40)

Avaliação do estresse oxidativo no tecido renal

TBARS em córtex e medula renal após 1h de reperfusão, sob os tratamentos com NAC, DFX ou NAC + DFX nas vias subcutânea ou arterial.

Tratamento subcutâneo Tratamento arterial

TBARS córtex 1 h 0 0,05 0,1 0,15 0,2

** * * * a TBARS medula 1h 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

** ** c 0 0, 5 1 1, 5 2 2, 5

TBARS córtex 1 h b TBARS Medula 1h 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

*

d Figura 13: TBARS (MDA equivalentes) em córtex e medula renal após 1h de

reperfusão com tratamento subcutâneo ou arterial.

Fig13a : TBARS em córtex renal após 1 h de reperfusão mostrando não ter diferença entre os tratamentos com NAC, DFX ou NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea. Fig13b: TBARS em córtex renal após 1 h de reperfusão mostrando não ter diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração intra-arterial. Fig13c: TBARS em medula renal após 1 h de reperfusão mostrando ter diferença entre os tratamentos com NAC e DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea (p<0,01). Fig13d: TBARS em medula renal após 1 h de reperfusão

(41)

mostrando não ter diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração intra-arterial.

(42)

TBARS em córtex e medula renal após 6h de reperfusão, sob os tratamentos com NAC, DFX e NAC + DFX nas vias subcutânea ou arterial.

TBARS córtex 6h 0 0,2 0,4 0,6 0,8

* * a TBARS medula 6h 0 0,2 0,4 0,6 0,8

c TBARS córtex 6h 0 1 2 3 4 5 6

* ** _** ** b TBARS medula 6h 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

*

**

d

Figura 14: TBARS (MDA equivalentes) em córtex e medula renal após 6h de reperfusão com tratamento subcutâneo ou arterial.

Fig14a: TBARS em córtex renal após 6h de reperfusão mostrando não ter diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea. Fig14b: TBARS em córtex renal após 6h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração intra-arterial (p<0,01).Fig 14c: TBARS em medula renal após 1 h de reperfusão mostrando não ter diferença entre os tratamentos com NAC , DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração

(43)

subcutânea. Fig14d: TBARS em medula renal após 6 h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração intra-arterial (p<0,01).

(44)

TBARS em córtex e medula renal após 12h de reperfusão, sob os tratamentos com NAC, DFX e NAC + DFX nas vias subcutânea ou arterial.

TBARS córtex 12h 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

** * ** */** */** a TBARS medula 12h 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

** * */** */** */** c TBARS córtex 12h 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

* ** b TBARS medula 12h 0 2 4 6 8 10

*

d

Figura 15: TBARS (MDA equivalentes) em córtex e medula renal após 12h de reperfusão com tratamento subcutâneo ou arterial.

Fig15a: TBARS em córtex renal após 12h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea (p<0,01). Fig15b: TBARS em córtex renal após 12h de reperfusão mostrando diferença entre o tratamento com NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração intra-arterial (p<0,01). Fig15c: TBARS em medula renal após 12h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea (p<0,01). Fig

(45)

15d: TBARS em medula renal após 12h de reperfusão mostrando não ter diferença entre os tratamentos em relação ao grupo salina com a administração intra-arterial .

* diferente em relação ao sham, ** diferente em relação ao salina.

Os gráficos de estresse oxidativo demonstram que a dosagem de TBARS com 1h de reperfusão foi diminuída apenas na medula renal do tratamento subcutâneo com NAC e DFX.

Com 6 h de reperfusão a via arterial mostrou diminuição do TBARS com todos os tratamentos no córtex e com DFX e NAC+DFX na medula. Já com o tratamento subcutâneo não houve diferença entre o tratamento e o controle.

A dosagem de TBARS foi diminuída com 12 de reperfusão com todos os tratamentos na via subcutânea, tanto em córtex quanto em medula. Na via arterial, com 12 h, apenas foi melhor o tratamento com NAC+DFX no córtex.

Aparentemente, na via arterial, no tempo mais precoce 6h, houve uma maior diminuição do estresse oxidativo e, na via subcutânea, este efeito foi mais tardio com 12h de reperfusão.

(46)

Carbonil em córtex e medula renal após 1h de reperfusão, sob os tratamentos com NAC, DFX ou NAC + DFX nas vias subcutânea ou arterial.

Carbonil cortex 1h 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

** a Carbonil medula 1h 0 0,2 0,4 0,6

c Carbonil córtex 1h 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

b Carbonil medula 1h 0 1 2 3 4 5

*

**

d Figura 16: Carbonil (mmol/mg proteína) em córtex e medula renal após 1h de reperfusão com tratamento subcutâneo ou arterial.

Fig16a: Carbonil em córtex renal após 1h de reperfusão mostrando diferença entre o tratamento com NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea (p<0,01). Fig16b: Carbonil em córtex renal após 1h de reperfusão mostrando não ter diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração arterial. Fig16c: Carbonil em medula renal após 1h de reperfusão mostrando não ter diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea.

(47)

Fig16d: Carbonil em medula renal após 1h de reperfusão mostrando diferença entre o tratamento com NAC em relação ao grupo salina com a administração arterial (p<0,01). * diferente em relação ao sham, ** diferente em relação ao salina

(48)

Carbonil em córtex e medula renal após 6h de reperfusão, sob os tratamentos com NAC, DFX ou NAC + DFX nas vias subcutânea ou arterial.

Tratamento subcutâneo Tratamento intra-arterial

Carbonil córtex 6 h 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

** * */** */** ** a Carbonil medula 6h 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

sham salina nac dfx dfx+nac * */** */** **

c b

Carbonil córtex renal 6h

0 2 4 6 8 10

**

** *

d

Carbonil medula renal 6h

0 2 4 6 8 10 12

** **

**

Figura 17: Carbonil (mmol/mg proteína) em córtex e medula renal após 1h de reperfusão com tratamento subcutâneo ou arterial.

Fig7a: Carbonil em córtex renal após 6h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea (p<0,01). Fig7b: Carbonil em córtex renal após 6h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração arterial (p<0,01). Fig7c: Carbonil em medula renal após 6h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea (p<0,01). Fig7d: Carbonil em medula renal após 6h de reperfusão mostrando diferença

(49)

entre o tratamento com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração arterial (p,0,01).

(50)

Carbonil em córtex e medula renal após 12h de reperfusão, sob os tratamentos com NAC, DFX e NAC + DFX nas vias subcutânea e arterial.

Carbonil córtex 12h 0 0,1 0,2 0,3 0,40,5 0,6 0,7

** * ** */** ** a Carbonil medula 12h 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

** * */** */** */** c Carbonil córtex 12h 0 1 2 3 4 5 6 7

* b Carbonil medula 12h 0 2 4 6 8 10 12 14

sham salina nac dfx nac+dfx **

** _**

d

Figura 18: Carbonil (mmol/mg proteína) em córtex e medula renal após 12h de reperfusão com tratamento subcutâneo ou arterial.

Fig18a: Carbonil em córtex renal após 12h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea (p<0,01). Fig18b: Carbonil em cortex renal após 12h de reperfusão mostrando não ter diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração arterial. Fig18c: Carbonil em medula renal após 12h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração

(51)

subcutânea (p<0,01). Fig18d: Carbonil em medula renal após 12h de reperfusão mostrando diferença entre os tratamentos com NAC, DFX e NAC+DFX em relação ao grupo salina com a administração subcutânea (p<0,01).

* diferente em relação ao sham, ** diferente em relação ao salina

Os gráficos de estresse oxidativo demonstram que com 1h de reperfusão, a dosagem de carbonil foi reduzida com NAC+DFX no córtex renal com tratamento subcutâneo. Também foi reduzida na medula renal com NAC na via de administração arterial.

Com 6h de reperfusão o tratamento com NAC, DFX e NAC+DFX mostrou eficácia na via subcutânea, tanto em córtex renal quanto em medula renal. Na via arterial, apenas o NAC isolado não demonstrou eficácia.

Com 12 h de reperfusão, todos os tratamentos nas duas vias de administração mostraram diminuição da dosagem de carbonil na medula renal.

(52)

Mieloperoxidase em córtex e medula renal após isquemia e reperfusão nos tempos 1, 6 ou 12 h sob o tratamento com NAC, DFX e NAC+ DFX na via arterial.

MPO córtex renal - terapia arterial

1h MPO córtex 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

sham salina NAC DFX NAC+DFX

Figura 19: Concentração de MPO de leucócitos (mU/ml) de córtex renal de ratos submetidos a isquemia de 45 min e reperfusão durante 1h. Os grupos que receberam tratamento com NAC, DFX ou NAC+DFX (n=5 para cada grupo) não apresentaram diferença significativa em relação ao grupo salina.

(53)

6h MPO córtex 0 0,5 1 1,5 2

**

Figura 20: Concentração de MPO de leucócitos (mU/ml) de córtex renal de ratos submetidos a isquemia de 45 min e reperfusão durante 6h. O grupo tratado com NAC+DFX (n=5 para cada grupo) mostrou diferença significativa em relação ao grupo salina (p<0,01).

**

* mU/mL

(54)

12h MPO córtex 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

**

Figura 21: Concentração de MPO de leucócitos (mU/ml) de córtex renal de ratos submetidos a isquemia de 45 min e reperfusão durante 12h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX (n=5 para cada grupo) mostraram diferença significativa em relação ao grupo salina (p<0,01).

(55)

MPO medula renal - terapia arterial 1h MPO medula 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Figura 22: Concentração de MPO de leucócitos (mU/ml) de medula renal de ratos submetidos a isquemia de 45 min e reperfusão durante 1h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX (n=5 para cada grupo) não mostraram diferença significativa em relação ao grupo salina.

(56)

6h MPO medula 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

**

Figura 23: Concentração de MPO de leucócitos (mU/ml) de medula renal de ratos submetidos a isquemia de 45 min e reperfusão durante 6h. O grupo tratado com NAC+DFX (n=5 para cada grupo) mostrou diferença significativa em relação ao grupo salina(p<0,01).

(57)

12h MPO medula 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

**

** **

Figura 24: Concentração de MPO de leucócitos (mU/ml) de medula renal de ratos submetidos a isquemia de 45 min e reperfusão durante 12h. Os grupos tratados com NAC, DFX ou NAC+DFX (n=5 para cada grupo) mostraram diferença significativa em relação ao grupo salina (p<0,01).

A concentração de MPO de leucócitos foi marcadamente diminuída tanto em córtex quanto em medula renal após 12h de reperfusão com o tratamento antioxidante com NAC e DFX.

(58)

Discussão

A insuficiência renal por si mesma é um quadro grave no ambiente clínico e terapias diretamente voltadas para a sua prevenção ou tratamento ainda não são disponíveis. A perspectiva de que a terapia antioxidante possa prevenir ou minimizar o dano ao tecido renal durante o insulto isquêmico é muito atraente e poderia ser de fácil realização.

Este trabalho com modelo animal de isquemia e reperfusão simula os eventos clínicos de má perfusão renal que levam a IRA. Demonstramos que o tratamento prévio com NAC e DFX teve um papel protetor da função renal e na diminuição do estresse oxidativo, através da medida de TBARS e carbonil. Sabemos que o evento isquêmico gera um dano tecidual que pode ser minimizado ao se diminuir o tempo de isquemia, ao se diminuir a resposta inflamatória ou ao se diminuir o estresse oxidativo.

O tempo de isquemia é importante na determinação da lesão. Um tempo superior a 60 minutos sem o resfriamento do órgão causa lesão tecidual irreversível com morte celular. O tempo de 45 minutos adotado neste trabalho causa uma isquemia tecidual moderada que pode se recuperar após a reperfusão. A interrupção aguda do fluxo renal não reflete fielmente, porém, uma situação clínica de baixo débito na qual existem mecanismos compensatórios para manter a pressão de perfusão renal até determinado limite. Além disso, a oclusão da veia renal pode levar a trombose venosa dificultando a drenagem do órgão após a reperfusão. O tempo de reperfusão também foi um fator importante na demonstração da ação da terapia antioxidante. No tempo inicial de 1h de reperfusão não houve uma vantagem clara dos grupos tratados em relação ao grupo

(59)

controle. Quando se analisam os gráficos percebe-se que com 6 h de reperfusão o grupo arterial apresentou resultados mais favoráveis com menor dano oxidativo. Quando o tempo de reperfusão foi estendido para 12 h os resultados foram favoráveis aos grupos tratados em ambas as vias de administração. Isto pode sugerir que nas primeiras horas a lesão tecidual pode ser semelhante no grupo tratado e não tratado devido à ação deletéria direta da isquemia e, que apenas na fase de recuperação a atenuação dos EROS e ferro livre possa ser de maior importância na proteção renal.

O transplante renal, por exemplo, é uma situação de extrema importância clínica na qual o tempo de isquemia e o dano após a reperfusão podem levar ao sucesso do tratamento ou a perda do órgão. As soluções de preservação são aplicadas diretamente no leito arteriovenoso do rim para aumentar a sua ação protetora durante a fase isquêmica até o momento da reperfusão. A chegada do sangue rico em oxigênio no território isquêmico leva a intensa produção de radicais livres com dano tecidual. Outras situações clínicas de baixo débito, como o choque hipovolêmico e as situações cirúrgicas nas quais o pedículo renal deve ser ocluído por determinados períodos podem levar a I/R e dano tecidual.

Outro ponto, então, a ser determinado era se a administração da terapia antioxidante teria o mesmo efeito sendo administrada na via subcutânea ou sendo administrada diretamente no território vascular. Neste estudo verificamos a possibilidade do uso de terapia antioxidante antes do evento isquêmico de maneira sistêmica (subcutânea) e de maneira direta ao órgão (arterial).

A NAC é rapidamente absorvida após uma dose oral, porém devido a um extensivo metabolismo de primeira passagem pelo fígado, apenas uma pequena

(60)

porcentagem (5%) chega intacta no plasma e nos tecidos. Após uma dose oral já aparece no plasma em menos de uma hora (Kelly, 1998). A sua administração subcutânea desvia o metabolismo de primeira passagem hepático e antecipa a sua biodisponibilidade plasmática, porém é dependente da perfusão tecidual periférica que pode estar prejudicada em estados de baixo débito. A terapia intravenosa de NAC também apresenta uma grande inativação da sua forma livre através das ligações com proteínas plasmáticas e teciduais formando dissulfidos (Harada, 2002).

A terapia arterial , diretamente no leito vascular previamente a oclusão, poderia oferecer ainda mais biodisponibilidade do antioxidante ao tecido isquêmico e, no momento exato da reperfusão já ter ação protetora às EROS. Em nosso estudo, contudo, não houve uma vantagem exclusiva do tratamento arterial em relação ao tratamento subcutâneo visto que obtivemos proteção renal no tratamento subcutâneo. Estes achados podem mostrar que nos ratos previamente saudáveis não haveria necessidade de dissecção vascular e injeção intra-arterial para se ter efeito desejado. Talvez em animais hipovolêmicos ou em estado de choque as observações poderiam ser diferentes. A circulação periférica em estados hipovolêmicos estaria diminuída, prejudicando a biodisponibilidade do antioxidante na administração subcutânea.

Quando se pensa em proteção renal, pensa-se em preservação de néfrons e preservação da função renal. Os indicadores de função renal mais empregados clinicamente são a dosagem plasmática de uréia e creatinina. São indicadores plasmáticos da queda ou diminuição da filtração glomerular, com subseqüente acúmulo dos compostos nitrogenados. Não fornecem quantitativamente o grau de função renal

(61)

individual e nem a taxa de filtração glomerular exatos, que poderiam ser determinados por métodos de imagem e pelo cálculo do clearance da creatinina.

Na analise da uréia e creatinina plasmática não se verificou uma superioridade evidente na aplicação da terapia arterial, como já foi mencionado. Em alguns resultados o tratamento subcutâneo foi melhor na manutenção dos níveis de uréia e creatinina. Na terapia arterial só houve melhora nos níveis de uréia com o tratamento com NAC+DFX nas 6 e 12 h. Já com a terapia subcutânea somente o NAC em 6h não foi melhor que a terapia com salina na dosagem de uréia. A dosagem de creatinina não sofreu modificação no tratamento arterial em nenhum tempo de reperfusão. Com o tratamento subcutâneo houve melhora com DFX na 1a hora, com DFX+NAC na 6a hora e com NAC, DFX e NAC+DFX na 12a_{hora. O tratamento subcutâneo foi melhor na}

manutenção da uréia e creatinina que o tratamento arterial e, o DFX sozinho ou associado ao NAC parece apresentar um papel superior ao NAC isolado.

Uma redução na creatinina plasmática foi demonstrada por Di Mari et al (1997) usando altas doses de NAC intravenoso (1g/kg) imediatamente antes e depois da isquemia renal bilateral em ratos. Nosso estudo também demonstrou uma proteção com uso de NAC isolado ou em associação com DFX. Slusser et al (1990), relataram que a isquemia renal depleta os estoques de glutationa no tecido renal. A glutationa é uma importante enzima que age diretamente neutralizando as EROS e também age como um substrato para a glutationa peroxidase em reações que degradam EROS. Nicoleta

et al, demonstraram que a NAC repõe os estoques de glutationa em menos de 24h

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A inflamação gerada no tecido após a isquemia também tem efeito sobre a função renal. EROS são considerados importantes componentes dos processos inflamatórios e eles são produzidos em um grande número de células, incluindo neutrófilos, em resposta as citoquinas e agem como mensageiros secundários estimulando expressão gênica (Hensley, 2000). A NAC tem seus efeitos antiinflamatórios por diminuir a produção de citoquinas pela ativação do NF-κB, pela diminuição da expressão de VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina (Zafarulla, 2003). Além disso, Araújo et al (2005), recentemente demonstraram que a NAC reduz a infiltração intersticial de macrófagos e linfócitos em rins de ratos após 48 h da IR.

Apesar dos efeitos benéficos da NAC, podemos ter efeitos adversos pela sua administração. O metabolismo oxidativo da NAC pode gerar espécies reativas de tióis que podem ser consideradas intermediárias nos processos de dano oxidativo aos tecidos (Sagrista, 2002) . In vitro, NAC aumentou a produção de OH em um ambiente com Fe+++ – citrato e H2O2 reduzindo a forma férrica para sua forma catalítica Fe++

(Sagrista, 2002). Além disso, o ferro livre exerce papel importante na catalisação de reações enzimáticas na formação de radicais livres. O uso do DFX poderia aumentar o efeito protetor da NAC ou por si só diminuir o estresse oxidativo. Nosso experimento mostra uma ação benéfica do DFX isolado e associado a NAC na função renal, principalmente nas primeiras horas de reperfusão. Talvez a grande oferta de ferro livre ocasionada pelo dano tecidual seja atenuada pelo quelante de ferro nos primeiros instantes da reperfusão, aonde a sua aplicação teria mais importância.

A dosagem de carbonil e TBARS foi usada como marcador para dano oxidativo. O dano oxidativo pode se relacionar com dano tecidual. Com o tempo de 12h de