Efeito do chá verde no modelo cancro da bexiga em murganho

(1)

Andreia Monteiro Almeida da Videira Henriques

EFEITO DO CHÁ VERDE NO MODELO CANCRO DA BEXIGA EM

MURGANHO

Orientador: Profª Doutora Paula Alexandra M. Oliveira

TESE DE MESTRADO

BIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL

(2)

Andreia Monteiro Almeida da Videira Henriques

EFEITO DO CHÁ VERDE NO MODELO CANCRO DA BEXIGA EM

MURGANHO

Orientador: Profª Doutora Paula Alexandra M. Oliveira

TESE DE MESTRADO

BIOLOGIA CLÍNICA LABORATORIAL

(3)

I JÚRI DE APRECIAÇÃO Presidente:__________________________________________ Orientador:__________________________________________ Arguente:____________________________________________ Arguente:____________________________________________ Data:____________________________________ Classificação:______________________________

(4)

II

Este trabalho foi elaborador originalmente com o intuito de obtenção do Grau de Mestre em Biologia Clínica Laboratorial.

(5)

III

A informação apresentada neste trabalho é da inteira responsabilidade do autor.

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IV

“_{Que la comida sea tu alimento y el alimento tu medicina”.}

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V Aos meus Pais

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VI

AGRADECIMENTOS

Os meus mais sinceros agradecimentos a todos os que, de alguma maneira, contribuíram para a realização desta dissertação.

À Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro por me ter aceitado como aluna do 2º Ciclo em Biologia Clínica Laboratorial para obtenção do Grau de Mestre, os meus agradecimentos!

À Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) pela atribuição da Bolsa de Integração à Investigação, BII/UNI/0772/AGR/2008, uma vez que foi o marco deste trabalho, o meu Muito obrigado!

Em especial à Professora Doutora Paula Oliveira, pelo apoio incondicional dedicado como minha Orientadora. Por todos os conhecimentos transmitidos, pela disponibilidade prestada, pela leitura crítica da presente dissertação, pelo seu incentivo, amizade e encorajamento que nunca faltaram, o meu muito Obrigado!

Às Professora Doutora Aura Colaço, Professora Doutora Maria João e Professor Bruno Colaço, pela disponibilidade e conhecimento transmitido durante a minha estadia na equipa, o meu Agradecimento!

Ao Professor Doutor Fernando Nunes pelo conhecimento, troca de ideias e disponibilidade prestada não só ao longo do Curso de Ciência Alimentar mas também por nos proporcionar a Avaliação do Chá Verde no Departamento de Química os Meus Agradecimentos!

Ao Professor Doutor José Baptista, Departamento de Tecnologia Alimentar da

Universidade dos Açores, pela troca de conhecimentos e leitura crítica e parcial da presente dissertação.

À Professora Doutora Ana Margarida Ferreira, pelo conhecimento e disponibilidade prestada durante a elaboração da avaliação do composto no Departamento de Química, os meus agradecimentos!

Às Professoras e funcionárias, especialmente à Sra Lígia Bento, pelo conhecimento transmitido, pelo apoio e incentivo durante o meu percurso no Laboratório de Anatomia Patológica da UTAD e durante o Mestrado na aquisição de conhecimentos relativos à histotecnologia, o meu Muito Obrigado!

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VII Aos meus amigos, o meu agradecimento sincero pelo apoio e amizade prestados ao longo destes anos e pela compreensão aquando a minha ausência ao longo deste tempo!

Às minhas irmãs e cunhados, pelo que sempre significaram para mim, pelo apoio e encorajamento prestados e principalmente pela amizade que nos une.

Em especial ao Élio por todo o apoio, carinho, incentivo, compreensão, encorajamento prestado desde que nos conhecemos, tanto nos bons como nos maus momentos, o meu Muito Obrigado!

Aos meus avós, pela amizade verdadeira e incondicional, pelo apoio, incentivo e encorajamento disponibilizados ao longo da minha vida. Pelos conhecimentos empíricos transmitidos que contribuíram grandemente para o que sou hoje. Os meus mais sinceros agradecimentos!

Em especial aos meus pais, Jorge e Augusta, por tudo o que fizeram por mim contribuindo fortemente para que eu chegasse até este patamar… Pelo amor e amizade, pelo apoio, carinho, compreensão e encorajamento que nunca me faltou, por tudo o que hoje sou, independentemente de poder estar presente, MUITO OBRIGADO!

(10)

VIII

RESUMO

O cancro da bexiga é uma das neoplasias mais comuns do sistema urinário e está associado a uma elevada mortalidade e morbilidade. Os componentes alimentares com capacidade de retardar o envelhecimento celular e inibir o crescimento das células cancerosas, sem afectar o normal crescimento celular, têm adquirido especial atenção no âmbito das novas abordagens preventivas. O chá verde é uma das bebidas mais consumidas em todo o mundo. Devido às suas propriedades bioquímicas e farmacológicas e possível associação com a diminuição da incidência de cancro, este produto tem vindo a ser estudado em modelos in vivo e in vitro.

Este trabalho teve como objectivo avaliar o efeito do chá verde nas lesões uroteliais induzidas quimicamente pela administração oral da N-butil-N-(-4-hidroxibutil)nitrosamina (BBN) em murganhos, machos e fêmeas.

Foram adquiridos 21 murganhos machos e 20 fêmeas à empresa Harlan (Interfauna, Barcelona). Os animais foram divididos em seis grupos, Grupo: BBN+Chá verde (Grupo I e IV), Grupo: BBN (II e V) e Grupo: Chá verde (III e VI), separados por sexo. A BBN foi administrada por gavage durante 10 semanas. O chá verde foi preparado e disponibilizado diariamente numa concentração de 0,5%. Após 20 semanas os animais foram eutanasiados por overdose de pentobarbital sódico a 10% e foram recolhidas amostras da bexiga, do fígado, do baço, dos pulmões, dos rins e do coração para análise histopatológica. Também foram colhidas amostras de sangue por punção intracardíaca para avaliar possíveis alterações em alguns parâmetros bioquímicos. Com o intuito de avaliar o perfil químico do chá verde, recorreu-se à avaliação dos fenóis totais, flavonóides, capacidade antioxidante e recorreu-se ainda ao método HPLC com o intuito de caracterizar este produto quanto aos seus constituintes. Para além do chá disponibilizado aos animais foram avaliados mais 3 chá verdes com diferentes origens.

Foram identificadas lesões pré-neoplásicas, hiperplasia simples, displasia, papiloma e metaplasia epidermóide com e sem queratinização. Nos urotélios dos animais machos observou-se uma maior incidência de lesões comparativamente aos animais do sexo feminino. Em ambos os sexos, os grupos tratados a chá verde (grupo III e VI) não apresentaram alterações histológicas do urotélio. Nas análises bioquímicas os valores demonstraram que o chá poderá ter efeito negativo sobre a função hepática, no entanto deve ser realizado outro estudo em que se utilize controlos de ambos os sexos.

(11)

IX

No que diz respeito à caracterização deste composto observou-se a sua riqueza em diversos compostos fenólicos (Catequinas, Kampferol, Quercetinas, Ácido gálico e Ácido isoclorogénico), e ainda na metilxantina mais conhecida a Cafeina. Verificou-se também a sua elevada capacidade antioxidante com valores que variaram entre 0,9 mg Trolox/g de infusão e os 3,80 mg de Trolox/g de infusão. Os chás apresentaram teores diferentes.

No nosso trabalho apenas verificamos um efeito inibitório do chá verde no desenvolvimento das lesões pré-neoplásicas nas fêmeas, no entanto ainda existe pouco conhecimento acerca da sua farmacocinética, farmacodinâmica e aplicabilidade. É necessário efectuar mais estudos com o intuito de uma possível aplicação deste produto, como quimiopreventivo, no homem.

Palavras-chave: Chá verde, cancro de bexiga, N-butil-N-(-4-hidroxibutil)nitrosamina (BBN), quimioprevenção, murganho, roedores, género, tempos de infusão, condições edafo-climatéricas.

(12)

X

ABSTRACT

One of the mortality and morbidity leaders in the industrialized western society is bladder cancer. New preventive approaches are growing due to capacity of food compounds to retard the cell development, as well as to inhibit the cancer cells advance, without interfering the cell normal growth.

Green tea is one of the most consumed beverages on entire world. This product is being used in in vivo and in vitro studies, because of the several biochemical and pharmacological proprieties and association with cancer inhibition.

The aim of this study was verify the effect of green tea in urothelial lesion induced chemically by oral administration of N-butyl-N-(-4-hidroxybutyl)nitrosamine (BBN) in male and female mice.

21 males and 20 females mice acquired to Harlan (Interfauna, Barcelona) were divided in six groups: BBN+ green tea (I and IV), BBN (II and V) and green tea (III and VI), had gender as consideration. BBN was administered by gavage during 10 weeks and green tea was prepared and available diary at 0,5%. After 20 weeks all animals were euthanized with a solution of 10% pentobarbital and were collected organ samples for histopathological analysis and blood samples to evaluate possible hepatic alterations.

Green tea analysis was performed by total phenol, flavonoid and antioxidant capacity methodologies, as well as HPLC method, with an aim of characterize chemical composition. In these parameters three more green teas with different origins were evaluated.

Pre-neoplastic lesions were identified, simple hyperplasia, dysplasia, papilloma and epidermoid metaplasia with and without keratinization. In males the lesions incidence was higher than in females. At both sexes, the green tea groups (Group III and VI) have not presented histopathological alterations. In biochemical analysis data reveal that tea can have a negative effect on hepatic function.

About characterization of this compound was observed a richness in several phenolic compounds (Catechins, Kaempferol, Quercetin, Galic acid and Isoclorogenic acid), as well as in alkaloid (Caffeine). This product demonstrated an high antioxidant capacity, between 0,9 mg Trolox/g of infusion and the 3,80 mg of Trolox/ g of infusion.

At our experimental work we observed an inhibitory effect of green tea on development of lesions in females, however there is few knowledge about pharmacokinetic,

(13)

XI

pharmacodynamics and applicability of this product. It is necessary more studies with an aim of verify possible application, as chemoprevention in men.

Key words: Green tea, Bladder cancer, N-butyl-N-(-4-hidroxybutyl)nitrosamine (BBN), chemoprevention , mouse, rodents, gender , infusion, times of infusions, soil and climate conditions.

(14)

XII

PUBLICAÇÕES RELACIONADAS COM ESTE TRABALHO EXPERIMENTAL Sob a forma de Artigo

- Arantes-Rodrigues R, Henriques A, Pinto-Leite R, Faustino-Rocha A, Pinho-Oliveira J, Teixeira-Guedes C, Seixas F, Gama A, Colaço B, Colaço A, Oliveira PA. (2012) .The effects of repeated oral gavage on the health of male CD-1 mice. Lab Anim (NY). 2012 May;41(5):129-34. doi: 10.1038/laban0512-129.

- Henriques A, Arantes-Rodrigues R, Faustino-Rocha AI, Teixeira-Guedes CI,

Pinho-Oliveira J, Talhada D, Teixeira JH, Andrade A, Colaço B, PAiva-Cardoso MN, Pires MJ, Ferreira AMVD, Nunes F, Oliveira PA (2014). The effects of whole green tea infusion on mouse urinary bladder chemical carcinogenesis. Iran J Basic Med Sci, Vol 17 (2):145-148.

Sob a forma de abstracts em revistas do sci

-Andreia Videira, Regina Arantes, Rosário Pinto-Leite, Cecilia Freitas, Ricardo Nova, Carlos

Lopes, Aura Colaço, Paula Oliveira. Tunnel analyses applied to a green tea chemoprevention study in Mus musculus. 8th European Cytogenetics Conference, 02-05 July Porto. Chromosome Research (2011) 19 (Suppl1): S37-S231.

-Videira-Henriques A, Ferreira S, Almeida I, Arantes-Rodrigues R, Vasconcelos- Nóbrega

C, Vala H, A Colaço, PA Oliveira. Sex differences in bladder cancer chemoprevention by green tea. Virchows Archiv.

Sob a forma de Poster

-A Henriques, S Ferreira, I Almeida, L Bento, A Colaço, PA Oliveira. Urothelial lesions induced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine in male and female ICR strain of Mus musculus. 3ªs Jornadas de Biologia, UTAD, 21 and 22 /October/ 2009.

-A Henriques, MJ Pires, S Ferreira, I Almeida, A Colaço, PA Oliveira. Evaluation of the

hepatic profile in mice treated with green tea. 3ªs Jornadas de Biologia, UTAD, 21 and 22/October/ 2009.

-Videira-Henriques A., Ferreira S., Almeida I., Pires MJ., Nunes F., Ferreira AM, Colaço A.,

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XIII

Young European Scientist – Meeting, from the 24th to the 26th September 2010, held at Fundação Eng. António de Almeida and Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Portugal.

-Videira-Henriques A, Gomes-Almeida I, Ramos-Ferreira S, Pires MJ, Nunes FM, Ferreira AM, Colaço A, Oliveira PA. Effect of green tea in bladder cancer induced chemically in Mus musculus ICR. X International Symposium on Experimental Techniques, I Congress of The Medical Society of Investigation on Complementary Therapeutics. Join Meeting 2010. Pólo III da Universidade de Coimbra, 1 - 2 / October/ 2010.

(16)

XIV

Í

NDICE

AGRADECIMENTOS ... VI RESUMO……….VIII ABSTRACT………...…….X PUBLICAÇÕES RELACIONADAS COM ESTE TRABALHO EXPERIMENTAL……….….XII ABREVIATURAS E NOMENCLATURA ...XVII ÍNDICE DE FIGURAS ...XIX ÍNDICE DE TABELAS………..………..XXII

1. INTRODUÇÃO ... 1

1.1 HISTÓRIA E MERCADO DO CHÁ (CAMELLIA SINENSIS (L.)) ... 2

1.2. CAMELLIA SINENSIS (L.) ...3

1.2.1. CARACTERÍSTICAS DA PLANTA ... 4

1.2.2. CARACTERÍSTICAS EDAFO-CLIMÁTICAS EXIGIDAS ... 4

1.3. COMPOSIÇÃO DO CHÁ VERDE ... 5

1.3.1. POLIFENÓIS ... 5

1.3.1.1. BIOSSÍNTESE DOS CONSTITUINTES POLIFENÓIS ... 5

1.3.1.2. PROPRIEDADES DOS POLIFENÓIS ... 6

1.3.2. ALCALÓIDES ... 6

1.3.2.1 BIOSSÍNTESE DA CAFEÍNA ... 7

1.3.2.2. PROPRIEDADES DOS ALCALÓIDES ... 8

1.4. TECNOLOGIA DO CHÁ VERDE ... 8

1.5. APLICABILIDADE NA BIOMEDICINA: UM MODELO NA INVESTIGAÇÃO DO CANCRO .. 12

1.5.1. BIOMEDICINA EXPERIMENTAL: MODELO ANIMAL E INDUÇÃO QUÍMICA ... 13

1.5.1.1. CARCINOGÉNESE QUÍMICA ... 13

1.5.1.1.1. CARCINOGÉNESE E AS ETAPAS DE INDUÇÃO ... 13

1.5.2. MURGANHO UM ALIADO NA INVESTIGAÇÃO BIOMÉDICA ... 15

1.5.2.1. HOUSING DO MURGANHO EM LABORATÓRIO ... 16

1.5.2.1. SISTEMA URINÁRIO DO MURGANHO: BEXIGA ... 17

1.5.2.1.1. CLASSIFICAÇÃO DAS NEOPLASIAS DO UROTÉLIO... 18

1.5.2.2. REQUISITO PARA O MODELO DE CARCINOGÉNESE UROTELIAL ... 18

1.5.2.2.1 COMPOSTOS CARCINOGÉNEOS: INDUÇÃO QUÍMICA ... 19

1.5.2.2.2. COMPOSTOS CARCINOGÉNEOS: VIAS DE ADMINISTRAÇÃO DA BBN ... 21

1.5.3. QUIMIOPREVENÇÃO DO CANCRO: PREVENÇÃO OU TRATAMENTO? ... 21

2. MATERIAL E METODOLOGIA ... 25

2.1. APLICABILIDADE NA BIOMEDICINA: MODELO CANCRO DA BEXIGA ... 26

(17)

XV 2.1.1.1.ANIMAIS ... 26 2.1.1.2.PRODUTOS ... 26 2.1.1.2.1.CHÁ VERDE ... 26 2.1.1.2.2. N-BUTIL-N-(4-HIDROXIBUTIL)NITROSAMINA(BBN) ... 26 2.1.1.2.3. ÁGUA ... 27 2.1.1.2.4. RAÇÃO ... 27 2.1.2 METODOLOGIA ... 27

2.1.2.1 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS EM QUE DECORREU O ENSAIO ... 27

2.1.2.2. PROCEDIMENTO UTILIZADO NA PREPARAÇÃO DO CHÁ VERDE ... 29

2.1.2.3. PROCEDIMENTO UTILIZADO NA PREPARAÇÃO DA BBN ... 29

2.1.2.4. VIA DE ADMINISTRAÇÃO - GAVAGE ... 29

2.1.2.5.TRABALHO EXPERIMENTAL ... 30

2.1.2.5.1.PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 30

2.1.2.5.2. PESAGENS ... 30

2.1.2.5.3. ÍNDICE DE HOMOGENEIDADE PONDERAL (HP) ... 31

2.1.2.5.4. GANHO PONDERAL (GP) ... 31

2.1.2.5.5.EUTANÁSIA ... 31

2.1.2.5.6. RECOLHA DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS ... 32

2.1.2.5.7 ESTUDO HISTOLÓGICO E HISTOPATOLÓGICO ... 32

2.1.2.5.7.1 TÉCNICA DE COLORAÇÃO PELA HEMATOXILINA-EOSINA ... 32

2.1.2.5.7.2. OBSERVAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO HISTOPATOLÓGICA ... 33

2.1.2.5.8. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS ... 33

2.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 33

2.3 ANÁLISE QUÍMICA DO CHÁ VERDE ... 34

2.3.1 DOSEAMENTO DOS POLIFENÓIS TOTAIS PRESENTES NO CHÁ VERDE ... 34

2.3.2. DOSEAMENTO DE FLAVONÓIDES PRESENTES NO CHÁ VERDE ... 35

2.3.3. AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE PRESENTE NO CHÁ VERDE ... 35

2.3.4. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CHÁ VERDE: HPLC ... 36

2.3.4.1. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS E ALCALÓIDES ... 36

2.3.4.1.1. IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES PRESENTES NO CHÁ VERDE... 37

2.3.4.2. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS ... 37

3. RESULTADOS E ANÁLISE ... 38

3.1 APLICABILIDADE EM BIOMEDICINA: MODELO CANCRO DA BEXIGA ... 39

3.1.1. ÍNDICE DE HOMOGENEIDADE PONDERAL ... 39

3.1.2 GANHO PONDERAL (GP) ... 40

3.1.3 VARIAÇÃO DO PESO CORPORAL ... 41

(18)

XVI

3.1.5. CONSUMO DE COMIDA ... 43

3.1.6. VARIAÇÃO DO PESO MÉDIO INICIAL E DO PESO MÉDIO FINAL DOS MURGANHOS E DOS ÓRGÃOS RECOLHIDOS. ... 44

3.1.7. PESOS RELATIVOS DOS DIFERENTES ÓRGÃOS DOS DIFERENTES GRUPOS DE ANIMAIS... 44

3.1.8. ANÁLISE MACROSCÓPICA ... 47

3.1.9. ESTUDO HISTOPATOLÓGICO ... 47

3.1.10 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS ... 51

3.2 ANÁLISE QUÍMICA ... 51

3.2.1. DOSEAMENTO DE FENÓIS TOTAIS PRESENTES NO CHÁ VERDE ... 52

3.2.2 DOSEAMENTO DE FLAVONÓIDES PRESENTES NO CHÁ VERDE ... 53

3.2.3. AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE PRESENTE NO CHÁ VERDE…………..54

3.2.4. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CHÁ VERDE ... 55

3.2.4.2. COMPOSIÇÃO QUÍMICA: VISUALIZAÇÃO A 280 NM ... 59

3.2.4.2.1. CROMATOGRAMAS REFERENTES À AMOSTRA A ... 59

3.2.4.2.2. CROMATOGRAMAS REFERENTES À AMOSTRA B ... 61

3.2.4.2.3. CROMATOGRAMAS REFERENTES À AMOSTRA C……… 3.2.4.2.4. CROMATOGRAMAS REFERENTES À AMOSTRA D ... 65

3.2.4.3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA: EXTRACÇÃO A 325 nm ... 67

3.2.4.3.1. CROMATOGRAMAS REFERENTES À AMOSTRA A ... 67

3.2.4.3.2. CROMATOGRAMAS REFERENTES À AMOSTRA B ... 70

3.2.4.3.2.CROMATOGRAMAS REFERENTES À AMOSTRA C ... 72

3.2.4.3.4.CROMATOGRAMAS REFERENTES À AMOSTRA D ... 74

3.2.4.4. ESPECTROS UV ... 76

3.2.4.5. IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS ... 76

4. DISCUSSÃO ... 80

5. CONCLUSÃO... 92

(19)

XVII

ABREVIATURAS E NOMENCLATURA % - percentagem

ABTS -Ácido 2,2 – azino – bis – 3 – etilbenzotiazolina – 6 – sulfónico

ALT - Alanina aminotransferase AST - Aspartato aminotransferase

BBN - N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN) BCPN - N-butil-N-(3-carboxipropil)nitrosamina C - catequina CYP - citocromos P450 DBN - N-nitrosodibutilamina dl – decilitros

DNA – Ácido desoxirribonucleico EC -Epicatequina

ECG - Epicatequina galato EGC - Epigalocatequina

EGCG – Epigalocatequina galato ERO - Espécies reactivas de oxigénio FA - Fosfatase Alcalina

FANFT - N-[4-(5-nitro-2-furil)-2-tiazolil]formamida g - gramas

Gavage - entubação gástrica

GC-MS – Cromatografia gasosa acoplada de separação por massa Gp – Ganho ponderal

h – horas

H&E – Hematoxilina e eosina Hp – Homogeneidade ponderal

(20)

XVIII

In vitro- Cultura de células In vivo – Modelo Animal K2S2O8 - Persulfato de potássio

MAPKs - mitogen activated protein kinases mg – miligramas

min – minutos ml – mililitros

MNU - N-metil-N-nitrosourea (MNU) Na2CO3 – Carbonato de sódio

NaCH3COO - Acetato de sódio

nm - nanómetros ºC – graus Celsius Outbred

p - probabilidade

PDA- photodiode array detector Pi - peso inferior

Ps - peso superior

SAH – S-adenosil-L-homocisteina SAM- S-adenosina-L-Metionina Spectrum UV – Espectro Ultra-violeta TEAC - Total equivalent antioxidant capacity

(21)

XIX

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA1-FLUXOGRAMADEOBTENÇÃODECHÁVERDE ... 8

FIGURA2-A)PLANTAÇÃODECAMELLIASINENSIS(L.)DEPORTOFORMOSO(ILHADESÃO MIGUEL,AÇORES);B)FOLHASDECAMELLIASINENSIS(L.).L(ILHADESÃOMIGUEL, AÇORES) ... 9

FIGURA3-ENROLADORDECHÁ ... 10

FIGURA4-CRIVODACASACHÁPORTOFORMOSO(ILHADESÃOMIGUEL,AÇORES) ... 10

FIGURA5-SECADORDACASACHÁPORTOFORMOSO(ILHADESÃOMIGUEL,AÇORES) ... 11

FIGURA6-ETAPASDOPROCESSODECARCINOGENESE(ADAPTAÇÃODEKLAUNIG ET AL, 2004;OLIVEIRA ET AL,2007) ... 14

FIGURA7-EFEITOSPREVENTIVOSDOCANCROASSOCIADOSHÁINGESTÃODECHÁVERDE E/OUEXTRACTOSDECHÁVERDE ... 22

FIGURA8-N-BUTIL-N-(4-HIDROXIBUTIL)NITROSAMINA(BBN) ... 27

FIGURA9-EXEMPLODEUMAETIQUETAUTILIZADANAIDENTIFICAÇÃODASGAIOLAS ... 28

FIGURA10-PROTOCOLOEXPERIMENTAL ... 30

FIGURA11-VARIAÇÃOMÉDIADOPESOCORPORALDOSMURGANHOSMACHO ... 41

41 FIGURA12-VARIAÇÃOMÉDIADOPESOCORPORALDOSMURGANHOSFÊMEA ... 41

42 FIGURA13-VARIAÇÃODOCONSUMOMÉDIODEBEBIDANOSMACHOS ... 42

FIGURA14-VARIAÇÃODOCONSUMOMÉDIODEBEBIDANASFÊMEAS ... 42

FIGURA15-VARIAÇÃODOCONSUMOMÉDIODECOMIDADOSMURGANHOSMACHO ... 43

FIGURA16-VARIAÇÃODOCONSUMOMÉDIODECOMIDADOSMURGANHOSFÊMEA ... 43

FIGURA17-UROTÉLIONORMAL(H&E,200X) ... 48

FIGURA18-HIPERPLASIASIMPLES(H&E,200X) ... 49

FIGURA19-DISPLASIA(H&E,200X) ... 49

FIGURA20-PAPILOMA(H&E,200) ... 50

FIGURA21-METAPLASIAEPIDERMÓIDEQUERATINIZADA(H&E,200X) ... 50

FIGURA22-GRÁFICORELATIVOÀRECTADECALIBRAÇÃODADETERMINAÇÃODOSFENÓIS TOTAIS ... 52

FIGURA23-GRÁFICORELATIVOÀDETERMINAÇÃODOSFENÓISTOTAIS ... 52

FIGURA24-GRÁFICORELATIVOÀRECTADECALIBRAÇÃODADETERMINAÇÃODE FLAVONÓIDES ... 53

FIGURA25-GRÁFICORELATIVOÀDETERMINAÇÃODEFLAVONÓIDES ... 53

FIGURA26-GRÁFICORELATIVOÀRECTADECALIBRAÇÃODADETERMINAÇÃODA CAPACIDADEANTIOXIDANTE ... 54

FIGURA27-GRÁFICORELATIVOÀDETERMINAÇÃODACAPACIDADEANTOXIDANTE ... 55

FIGURA29-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAA,TEMPODEEXTRACÇÃO2MINUTOS ... 59

FIGURA30-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAA,TEMPODEEXTRACÇÃODOS4 MINUTOS ... 59

FIGURA33-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAB,TEMPODEEXTRACÇÃO2MINUTOS ... 61

(22)

XX FIGURA34-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAB,TEMPODEEXTRACÇÃO4MINUTOS

... 61 FIGURA35-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAB,TEMPODEEXTRACÇÃO6MINUTOS ... 62

FIGURA 36-CROMATOGRAMAS REFERENTEÀAMOSTRAB,TEMPODEEXTRACÇÃO8MINUTOS

... 62 FIGURA37-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAC,TEMPODEEXTRACÇÃO2

MINUTOS ... 63 FIGURA38-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAC,TEMPODEEXTRACÇÃO4

MINUTOS ... 64 FIGURA40-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAC,TEMPODEEXTRACÇÃO8MINUTOS ... 64 FIGURA 41-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAD,TEMPODEEXTRACÇÃODE2

MINUTOS ... 65 FIGURA42-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAD,TEMPODEEXTRACÇÃODE4

MINUTOS ... 66 FIGURA45-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAA,TEMPODEEXTRACÇÃO2

MINUTOS. ... 67 FIGURA46-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAA,TEMPODEEXTRACÇÃO4

MINUTOS ... 69 FIGURA49-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAB,TEMPODEEXTRACÇÃO2

MINUTOS ... 73 FIGURA56-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAC,TEMPODEEXTRACÇÃO8MINUTOS ... 73 FIGURA57-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAD,TEMPODEEXTRACÇÃO2MINUTOS ... 74 FIGURA58-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAD,TEMPODEEXTRACÇÃO4MINUTOS ... 74

(23)

XXI FIGURA59-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAD,TEMPODEEXTRACÇÃO6MINUTOS

... 75 FIGURA60-CROMATOGRAMAREFERENTEÀAMOSTRAD,TEMPODEEXTRACÇÃO8

MINUTOS ... 75 FIGURA61–ESPECTROSUVREFERENTESAALGUNSDOSCOMPOSTOSIDENTIFICADOS

NOSCHÁSVERDESA280NM,ATRAVÉSDOMÉTODOHPLC. ... 78 FIGURA 62 – ESPECTROS UV REFERENTES A ALGUNS DOS COMPOSTOS IDENTIFICADOS

(24)

XXII

ÍNDICE DE TABELAS

TABELA1-PARÂMETROSCONTROLADOSNUMBIOTÉRIOEASUAIMPORTÂNCIA ... 17 TABELA 2-ESTUDOS QUIMIOPREVENTIVOS REALIZADOS EM MODELOS DE INDUÇÃO

ATRAVÉSDABBN ... 22 TABELA3-CONDIÇÕESCROMATOGRÁFICAS ... 37 TABELA4-ÍNDICEDEHOMOGENEIDADEPONDERAL ... 39 TABELA5-GANHOPONDERAL ... 40 TABELA6-VARIAÇÃODOPESOMÉDIOINICIALEDOPESOMÉDIOFINALDOSMURGANHOSE

DOSÓRGÃOSRECOLHIDOS( ±DESVPAD) ... 45 TABELA 7 - PESOS RELATIVOS DOS DIFERENTES ÓRGÃOS ENTRE OS MURGANHOS DOS

DIFERENTESGRUPOS( ±DESVPAD)SEGUNDOAFÓRMULA(PESOMÉDIODOSÓRGÃOS PORGRUPO/PESOMÉDIOFINALDOSANIMAISPORGRUPO) ... 46 TABELA8-CLASSIFICAÇÃOHISTOPATOLÓGICADOUROTÉLIODOSDIFERENTESGRUPOS . 48 TABELA9-ANÁLISEBIOQUÍMICADOPERFILHEPÁTICO ... 51 TABELA10-IDENTIFICAÇÃODOSCOMPOSTOSPRESENTESNOCHÁVERDEÀS0E24HORAS

... 57 TABELA 11-IDENTIFICAÇÃODOSDIFERENTESCOMPOSTOSPRESENTESNASINFUSÕESDE

CHÁVERDEA280 NM ... 77

TABELA 12–IDENTIFICAÇÃODOSDIFERENTESCOMPOSTOSPRESENTESNO CHÁVERDEA 325 NM ... 78

(25)

1 EFEITO DO CHÁ VERDE NO MODELO CANCRO DA BEXIGA EM MURGANHO

(26)

1.1 HISTÓRIA E MERCADO DO CHÁ (CAMELLIA SINENSIS (L.))

A cultura do chá é primordial da China e remonta de há 3000 anos. Na actualidade encontra-se propagada quer nos países orientais quer nos ocidentais, sendo deste modo, a segunda bebida mais consumida em todo o mundo, estimando-se um consumo de chá em cerca de 2.5 biliões de chávenas, correspondente a metade da população, ultrapassando o café e qualquer tipo de refrigerante ou bebida alcoólica (Rosa,2004; Béliveau, 2005).

A planta do chá é oriunda das regiões montanhosas do Sul da China (província de Yunan) e do sopé dos Himalaias onde nos dias que decorrem ainda cresce de forma espontânea nos bosques verdes do Nordeste da índia (região de Assam) e da Birmânia, até altitudes de 2000 metros. Pensa-se que poderá ter-se expandido até ao sudeste da China atingindo assim o Japão (Baptista et al., 1999; Rosa, 2004).

Esta planta foi descrita por Lineu o qual a incluiu no género Thea (por originar o chá (Thea)) derivando assim o nome da família Theaceae. No século XIX o botânico Karl Otto Kuntze alterou a sua classificação para género Camellia sinensis (L.) (Rego, 2012).

No princípio do século XVII o chá foi introduzido na Europa, no entanto a mais comum a Camellia sinensis (L.) Kuntze apenas foi testada posteriormente. Inicialmente foi cultivada com a finalidade medicinal, contudo ocorreu a popularização do sub-produto chá, devido ao seu agradável e estimulante flavour bem como características aromáticas. Os seus efeitos na saúde devem-se essencialmente à sua constituição rica em cafeina, compostos fenólicos e antocianinas, principais constituintes, entretanto o chá apresenta uma composição extremamente complexa onde outros compostos como minerais, vitaminas poderão ter um efeito igualmente benéfico em outras perspectivas apesar de existirem em menores quantidades. Estas proporções encontram-se dependentes da idade da folha e dos métodos utilizados para o seu processamento. De diferentes processamentos surgem diferentes tipos de chá, nomeadamente o Chá verde e Branco, o Oolong, o chá preto (ou chá vermelho na China) e o chá absoluto (óleo essencial destilado a partir do chá preto) (El-Shahawi et al., 2012; Rosa, 2004).

Os líderes da produção de chá no mundo são a China e Japão bem como a Índia e Sri Lanka, produtores de chá verde e preto, respectivamente. Durante os anos 80 do século XX a produção destes quatro países atingiu aproximadamente um milhão e trezentos mil toneladas, das quais mais de metade foi para consumo interno nos países. Após estes os

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que se destacam são os países árabes uma vez que as bebidas alcoólicas se encontram vetadas religiosamente (El-Shahawi et al., 2012).

Em Portugal, as primeiras referências de existência da planta do chá referem-se a Angra do Heroísmo, datadas no século XIX. Proveniente do Brasil, foram introduzidas no princípio do mesmo século provavelmente durante as invasões francesas, altura em que D. João III foi para o Brasil levando consigo diversas plantas oferendas do imperador Chinês. Do Brasil a cultura chegou ao Continente onde a cultura não teve grande sucesso. No entanto algumas das sementes trazidas por Pereira de Castro do Brasil foram enviadas para os Açores. É assim na Região Autónoma dos Açores, especificamente na Ilha de São Miguel, mais conhecida por ilha verde, que a cultura e produção de chá encontra-se enraizada entrando para a história no início do século XXI como o único país europeu produtor de chá (Rego,2012; Rosa, 2004).

O crescimento do chá em são Miguel foi promovido com o decréscimo da exportação da laranja para o mercado inglês, 1872, devido a doenças dos laranjais e envelhecimento das plantações (Rego,2012; Rosa, 2004; Sousa, 1999).

Através da Sociedade Promotora d’Agricultura Micaelense, em 1875 foram chamados a São Miguel dois macaenses de forma a ensinar as técnicas do fabrico do chá sendo avaliadas em 1883 e consideradas de excelente qualidade (Rego,2012; Rosa, 2004; Sousa, 1999).

1.2. CAMELLIA SINENSIS (L.)

Nos nossos dias o termo chá encontra-se banalizado e associado a qualquer preparação em que seja adicionado uma porção de água em estado de ebulição. O termo chá, utilizado em Portugal provem de vocábulos do cantonês que foram integrados na língua portuguesa. Assim, “Tchá” foi o nome atribuído por chineses do cantão a uma infusão em que da sua preparação fazia parte folhas de um arbusto. A palavra generalizou-se, a todas as poções medicinais preparadas da mesma forma, devido ao facto de se recorrer como prática comum a remédios vegetais diluídos em água a ferver (Rego, 2012; Rosa, 2004).

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1.2.1. CARACTERÍSTICAS DA PLANTA

A verdadeira planta do chá pertence a uma família de plantas, as Theaceae, que não apresenta nenhum representante entre a flora autóctone portuguesa. Família, esta que se encontra distribuída por regiões tropicais e subtropicais. Pertencem ao género Camellia, espécie Camellia sinensis e poderão pertencer ainda a variedades Sinensis (denominado chá da china devido à sua origem), Assâmica (India) e ainda Cambodjensis (Cambodja ou Indochina) (El-Shahawi et al., 2012; Rego, 2012; Rosa, 2004).

A Camellia sinensis (L.) é considerada a mais importante e com um valor económico superior dando assim origem ao chá comercial. Este estatuto deve-se ao facto desta planta possuir folhas ricas em compostos aromáticos, contrariamente às restantes Camellia. Destacam-se na Camellia sinensis (L.) as variedades China e índia, no entanto ambas possuem características distintas, sendo a variedade china um chá mais montanhoso, mais aromático, mais robusto, contudo menos produtivo comparativamente ao índia (Rego, 2012; Rosa, 2004; Sousa, 1999). A longevidade das plantas é distinta considerando-se que as do grupo “China” apresentam uma maior durabilidade que as “Assam”, podendo atingir os 50 anos (Almeida, 1893).

1.2.2. CARACTERÍSTICAS EDAFO-CLIMÁTICAS EXIGIDAS

Para se obter chá de qualidade estas plantas exigem características edafo-climáticas especificas. Os solos têm que ser bem drenados e profundos, devem ser ácidos tolerando pH de 4-6,5. Relativamente à pluviosidade este tipo de planta possui uma vegetação óptima em regiões de elevada e bem distribuída precipitação ao longo do ano, sendo pelo menos de 1140-1270 mm anuais. Necessita de temperatura entre os 18 e 20ºC com amplitudes térmicas baixas e locais onde a humidade relativa seja entre os 70-100% ao longo do ano (Rego, 2012; Almeida, 1893). A colheita é uma etapa crítica que requer especial atenção uma vez que vai influenciar drasticamente a qualidade e tipo de produto que se vai obter. Deste modo é necessário ter em conta que esta é influenciada pela época do ano no sentido em que a colheita de Maio (1ª colheita) fornece folhas mais finas e tenras, enquanto a de Verão fornece um chá mais forte, porém com teores de cafeina mais baixos comparativamente com o chá colhido na primavera (Béliveau,2005).

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1.3. COMPOSIÇÃO DO CHÁ VERDE

A planta do chá (Camellia sinensis (L.)) na sua constituição possui uma composição química complexa, da qual fazem parte os polifenóis, alcalóides (cafeína, teofilina, teobromina), aminoácidos, glúcidos, proteínas, clorofila, compostos voláteis, fluoretos, minerais e vestígios de elementos e de outros compostos não definidos (Cabrera et al., 2003; El-Shahawi et al., 2012).

1.3.1. POLIFENÓIS

Na sua constituição em polifenóis a composição é diversificada sendo particularmente profilicos. Este grupo de compostos é o grupo de maior interesse, representando uma maior porção de ingredientes solúveis no chá verde (Lu et al.,2009). As classes com maior prevalência são os flavonóides e os ácidos fenólicos. Na classe dos flavonóides enquadram-se as catequinas as quais se classificam como flavanóis e representam 75 a 80% dos compostos solúveis (Yang, 2001; Pelillo et al., 2002; Koo et al., 2004; Moon, 2006; Lu et al., 2009).

1.3.1.1. BIOSSÍNTESE DOS CONSTITUINTES POLIFENÓIS

Tal como referido anteriormente as catequinas fazem parte do grupo conhecido como flavonóides que apresenta uma estrutura carbónica C6-C3-C6 e ainda na sua constituição apresentam dois anéis aromáticos A e B (Ashihara et al., 2010; Andersen and Markham, 2006, Cheong et al., 2005).

Até ao momento sabe-se que a planta do chá é constituída por 7 sub-classes de catequinas e traços de diversos derivados de catequinas. As catequinas dividem-se em dois grandes grupos, as denominadas catequinas livres e as esterificadas. Assim sendo, do primeiro grupo fazem parte as (+)-catequina, (+)-galocatequina, (-)-epicatequina, (-) epigalocatequina e do segundo grupo as (-)-epicatequina galato, (-)- epigalocatequina galato, (-)-galocatequina galato (Andersen and Markham, 2006; Cheong et al., 2005).

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As catequinas encontram-se distribuídas por toda a planta de chá, onde 15 a 30 % se encontra nos rebentos e ainda na primeira, segunda e terceira folha (Rego, 2012; Rosa, 2004).

A biossíntese das catequinas nas folhas da Camellia sinensis (L.) L é complexa e ocorre pelas vias Ácido acético-malónico e Ácido shikimic-cinnamic (Andersen and Markham, 2004; Szultka et al., 2013).

O conteúdo em constituintes encontra-se dependente da variedade da Camellia. O seu elevado teor também se encontra dependente da luz solar o que faz com que em Agosto seja a altura do ano em que se obtém maior teor de catequinas na planta enquanto, que com a sombra/pouca luminosidade os teores diminuem. Este fenómeno está relacionado com a actividade da fenilalanina-amonialase, chave da biossíntese do anel B das catequinas, que diminui rapidamente na ausência de luz. Para além da luminosidade, a temperatura também é um factor importante na biossíntese das catequinas provocando uma indução deste processo (Almeida, 1893;Rosa, 2004; Sousa, 1999).

Após a síntese destes produtos, o seu armazenamento é feito no vacúolo da célula o que faz com que dificilmente sofra qualquer metabolização ou decomposição.

1.3.1.2. PROPRIEDADES DOS POLIFENÓIS

Os efeitos benéficos do chá encontram-se maioritariamente relacionados com o grupo flavan 3-ol baseando-se na sua capacidade antioxidante, carcinogénica, anti-alergénica, anti-inflamatória, vasodilatadora e antimicrobiana (2001; Koo et al. 2004; Cabrera et al., 2006; Punyasiri et al., 2004).

Algumas destas propriedades irão ser exploradas ao longo do trabalho uma vez que o tema diz respeito a uma das aplicabilidades do chá na Biomedicina do Cancro.

1.3.2. ALCALÓIDES

Após os compostos fenólicos os alcalóides são os compostos com maior impacto no chá verde. A cafeína pode ser encontrada em diversas bebidas nomeadamente café, chá e

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alguns refrigerantes. Este composto foi descoberto no chá (Camellia sinensis (L.)) e café

(Coffea arábica) em 1820s, tal como com outros metilxantinas, nomeadamente teobromina

(3,7-dimetilxantina), paraxantina (1,7-dimetilxantina) e ácidos metiluricos, a cafeína é membro do grupo de compostos purinas alcalóides (Ashihara et al., 2001).

1.3.2.1 BIOSSÍNTESE DA CAFEÍNA

As vias de biossíntese e catabólica da cafeína nos vacúolos das células apenas têm vindo a ser elucidadas desde 1997. As purinas alcalóides possuem uma distribuição limitada no Reino das Plantas. Na Camellia sinensis (L.) L. a cafeína encontra-se em elevadas concentrações nas folhas jovens dos primeiros rebentos representando cerca de 2,8% da matéria seca (Rego, 2012; Rosa, 2004).

A cafeína é uma 1,3,7-trimetilxantina no qual o esqueleto xantina é derivado secundário dos nucleóticos de purina que são convertidos para xantosina, o missionário da via de biossíntese da cafeína. São conhecidas pelo menos quatro vias de síntese dos nucleótidos de purina em xantosina, no entanto a de maior relevância é a da inosina 5’-monofosfato. A biossíntese através desta via encontra-se grandemente relacionada com o ciclo SAM (S-adenosina-L-metionina). Esta via tem capacidade para ser fonte exclusiva de modo a fornecer esqueletos de purina e grupos de metil requeridos para a biossíntese da cafeína nas folhas jovens (Ito and Ashihara, 1999; Koshiishi et al., 2001).

A xantosina é o primeiro composto purina na via biossíntese da cafeína, actuando como substracto para o grupo metil doado por SAM. A via principal da cafeína é pela xantosina que é metilada com SAM formando o 7-metilxantosina. Após a remoção da ribose, o 7-metilxantina é posteriormente metilado duas vezes por via SAM originando a cafeína pela via teobromina. Apesar da via principal ser a descrita anteriormente a xantosina é também convertida em xantina que posteriormente é degradada por CO2 e NH3 pela via

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Cultura Colheita Desidratação Enrolagem Steaming Secagem Embalamento

1.3.2.2. PROPRIEDADES DOS ALCALÓIDES

Tal como os compostos fenólicos as metilxantinas (cafeína, teobromina e teofilina) apresentam propriedades interessantes do ponto de vista farmacológico e fisiológico, actuando em sistemas corporais, nomeadamente o sistema nervoso central, cardiovascular, gastrointestinal, respiratório e renal. No sistema nervoso central a cafeína actua como estimulante, aumentando a rapidez de resposta relativamente à vigilância, aumenta o processamento de informação visual e diminui a fadiga. Contudo também se encontra descrito alguns efeitos controversos relativos a estas substâncias, tais como calor, frio, agitação, irritabilidade, perda de apetite, fraqueza e tremor quando consumido em elevadas doses (Horzic et al., 2009; Suteerapataranon et al., 2009).

1.4. TECNOLOGIA DO CHÁ VERDE

Para a preparação de chá é necessário efectuar uma condução das plantações de chá, desde as podas à fase de colheitas, de modo a que se obtenha e se desenvolva o máximo do potencial aromático do chá e qualidade final do produto (Figura 1) (Almeida, 1893; Rego, 2012).

A colheita consiste em escolher os rebentos verdes claros, local da planta onde se encontram a maior quantidade dos compostos aromáticos e taninos presentes no chá. A colheita deve consistir assim no botão e nas três primeiras folhas, sendo de todo até à segunda folha onde se encontra presente a maioria dos compostos. Em são Miguel (Açores), a colheita ocorre entre Abril e Setembro com intervalos de duas a 3 semanas entre elas dependendo das condições climatéricas tal como referido anteriormente. Isto deve-se ao facto de a chuva possuir vantagens e desvantagens nesta altura. Com a sua ausência, a planta não cresce e não é produzida a seiva nas folhas, com a sua presença torna-se

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impossível levar as máquinas para a terra para efectuar a sua apanha. Se as folhas não forem colhidas na altura certa vão crescer demasiado e perde-se o chá de primeira qualidade obtido pelo botão e primeira folha (Almeida, 1893; Sousa, 1999; Rego, 2012).

As folhas colhidas (Figura 2) são desidratadas, em local arejado, durante este processo as folhas perdem cerca de 30 a 75 % do seu conteúdo hídrico. A técnica utilizada para este fim consiste em estender-se camadas finas utilizando para o efeito tabuleiros constituídos por redes metálicas através das quais se faz passar corrente de ar quente forçada por ventiladores durante 16 a 24h, utilizando uma temperatura controlada, esta fase do processo denomina-se de murchamento (Almeida, 1893; Sousa, 1999).

Posteriormente são despejadas por um buraco para o andar de baixo. O passo seguinte consiste em enrolar as folhas, esta fase vai provocar o estalar parcial provocando a destruição das membranas celulares permitindo assim o contacto dos vários componentes químicos com as enzimas. Antigamente era realizado manualmente, nos dias que decorrem recorre-se a máquinas, com a seguinte composição: uma mesa, um tabuleiro onde são colocadas as folhas e uma tampa que vai exercer pressão sobre as folhas. Através de um movimento de rotação a mesa gira e o tabuleiro movimenta-se no sentido contrário (Almeida, 1893; Sousa, 1999).

Daqui as folhas vão para um crivo com o intuito de desfazer os aglomerados de folhas e ainda efectuar a separação das mais finas das mais grossas que de uma forma geral voltam a sofrer um processo de enrolagem, representado na figura 3 (Almeida, 1893; Sousa, 1999).

FIGURA 2-A)PLANTAÇÃO DE CAMELLIA SINENSIS .L DE PORTO FORMOSO (ILHA DE SÃO MIGUEL, AÇORES); B)FOLHAS DE CAMELLIA SINENSIS .L (ILHA DE SÃO MIGUEL, AÇORES)

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As que passam do crivo (figura 4) podem ser sujeitas a diversos tratamentos, poderão ser secas ao sol durante 1 ou 2 horas, serem secas de forma mais artesanal, poderão sofrer um processo de torrefacção e por último o mais utilizado normalmente são sujeitas a um processo de “steaming” que consiste na aplicação de vapor de água com intuito de inactivar as enzimas (polifenoloxidase) impedindo que a oxidação se desenvolva permitindo a coloração verde-escura e não a acastanhada (Almeida, 1893).

A secagem, última fase do processo de obtenção de chá, faz-se normalmente recorrendo a correntes de ar quente que atravessam os tabuleiros e tem como principal objectivo por fim à oxidação que no caso do chá verde se desencadeia naturalmente após a colheita. Este passo encontra-se dependente da humidade presente na folha, contudo tem uma durabilidade de cerca de 20 minutos a uma temperatura de 90 ºC (Figura 5) (Almeida, 1893; Sousa, 1999).

FIGURA 3 - ENROLADOR DE CHÁ

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1.5. APLICABILIDADE NA BIOMEDICINA: UM MODELO NA INVESTIGAÇÃO DO CANCRO

Apesar de a sensibilização para o cancro ter vindo a aumentar nos tempos que decorrem, não é uma doença moderna. Foi descrito pela primeira vez por Hippocrates como “karkinos” e no século II Galeno introduziu o termo neoplasia, definindo-a como o crescimento excessivo de uma determinada área do corpo. O desenvolvimento do cancro nos humanos e nos animais é um processo que ocorre em várias etapas. A complexidade de alterações moleculares e celulares que participam no desenvolvimento do cancro é mediada por uma diversidade de estímulos endógenos e exógenos (Valko et al, 2004; Oliveira et al, 2007). Os estímulos exógenos correspondem a hábitos nutricionais, estilo de vida, agentes físicos, compostos químicos e agentes biológicos, enquanto os endógenos estão relacionados com alterações a nível do sistema imunitário e danos causados por eventual inflamação etiológica, promovendo alterações genéticas. O cancro é uma doença que pode afectar pessoas de qualquer idade e etnia (Oliveira et al, 2007; Mitra et al, 2009).

O cancro da bexiga é uma das neoplasias com maior taxa de incidência do sistema urinário, sendo mais comum, nos homens do que nas mulheres e em caucasianos do que em africanos, americanos, hispânicos e asiáticos. Na maioria dos casos é diagnosticado em indivíduos entre os 65 e 84 anos de idade. O sintoma clínico mais comum deste tipo de carcinoma é a presença abundante de hematúria indolor e ocorre em cerca de 85% dos pacientes. A sua incidência tem vindo a ser atribuída ao estilo de vida, ocupação, ambiente e dieta, características sexuais inatas, polimorfismo genético e factores hormonais, patologias urinárias e histórico familiar (Friedrich et al, 2002;Oliveira et al, 2006; Nezos et al, 2008; Taylor et al, 2008, Al-Bazzaz, 2009; Kivrak et al, 2009; Mitra et al, 2009). A relação entre este tipo de neoplasia e a carcinogénese química é confirmada através de estudos que comprovaram que a exposição a carcinogénicos químicos industriais e o consumo de tabaco são considerados mecanismos de patogenicidade no desenvolvimento deste tipo de neoplasias, devido à sua composição em compostos orgânicos aromáticos (Elkin et al, 1998; Oliveira et al, 2007; Williams et al, 2008; Mitra et al, 2009).

O modelo animal com roedores tem-se demonstrado uma ferramenta essencial para a carcinogénese química no estudo do cancro da bexiga, nomeadamente na promoção, prevenção e tratamento através de diferentes compostos. Devido à consciencialização, tem-se vindo a apostar cada vez mais na prevenção deste tipo de doença, recorrendo a dietas, químicos e/ou produtos naturais que se considera ter algum beneficio na saúde.

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1.5.1. BIOMEDICINA EXPERIMENTAL: MODELO ANIMAL E INDUÇÃO QUÍMICA

1.5.1.1. CARCINOGÉNESE QUÍMICA

Vários factores, incluindo a exposição a vírus, a químicos e a radiação, contribuem para o desenvolvimento de cancro (King et al, 1995; Yuspa, 2000).

Um carcinogénico químico é definido como a capacidade que um composto detém para desencadear um processo de desenvolvimento de cancro, em condições apropriadas, no homem e no animal, actuando num órgão ou tecido específico. Para que um composto seja considerado carcinogénico, experimentalmente, tem que ser administrado em animais de laboratório e induzir um ou mais tipos de neoplasias histológicas comparativamente com o grupo controlo, que não foi exposto à substância, o tipo de neoplasia histológica têm de ser estatisticamente significativas (Oliveira et al, 2007).

A carcinogénese química experimental tem vindo a ser utilizada com a finalidade de compreender melhor os mecanismos de indução de diversos carcinogénicos, através da monitorização de respostas por aplicação de diversas técnicas químicas, bioquímicas e biológicas em modelos animais (King et al, 1995).

A carcinogénese química é um processo que envolve alterações genéticas e epigenéticas, onde as células normais são convertidas em pré-cancerosas ou cancerosas resultando num tumor maligno. Estas alterações podem ocorrer através de mecanismos de mutação de genes que controlam o crescimento, alterações na metilação, inserções, supressões ou duplicações do material genético (Dybing et al, 1999; Butterworth et al, 2006).

1.5.1.1.1. CARCINOGÉNESE E AS ETAPAS DE INDUÇÃO

Vários estudos realizados até à data permitiram concluir que o processo de carcinogénese possui três fases distintas (Figura 6): iniciação, promoção e progressão. A iniciação e progressão envolvem alterações genéticas, enquanto a promoção envolve alterações na expressão génica (Trosko et al, 2001; Klaunig et al, 2004; Moggs et al, 2004; Butterworth et al, 2006; Oliveira et al, 2007).

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Agentes químicos Progressão Iniciação + Promoção

Reparação DNA Proliferação _celular _{Proliferação} celular Proliferação celular Proliferação celular Dano no DNA Apoptose

Iniciação: Esta etapa resulta de alterações genéticas irreversíveis que predispõem

células normais susceptíveis de evoluírem a malignas. Após interacção do carcinogénico com o DNA da célula com predisposição ocorre mutação, que consiste frequentemente numa alteração de base única no genoma, este processo é dose-dependente do genotóxico. A célula iniciada ainda não é considerada uma célula neoplásica, no entanto este é o primeiro passo para a sua evolução. Esta interacção ocorre por ligações covalentes formando aductos de DNA-carcinogénico. Agentes endógenos de DNA reactivo, como por exemplo espécies reactivas de oxigénio (ERO), contribuem para o dano do DNA. No entanto, os danos do DNA podem ser reparados pelo metabolismo através de mecanismos enzimáticos e da sua capacidade de activar e inactivar o carcinogénico. A divisão celular das células iniciadas passará a ser simétrica, produzindo células clones. Nem todas as células iniciadas irão originar neoplasias, algumas irão morrer por apoptose. A proliferação celular é um processo essencial nesta fase, se esta ocorrer antes da reparação do DNA vai conduzir a um processo irreversível. A iniciação caracteriza-se assim por ser um fenómeno rápido, irreversível e transmissível às células-filhas (Lutz, 1998; Trosko, 2001; Klaunig et al, 2004; Moggs et al, 2004; Oliveira et al, 2007).

Promoção: Nesta fase, ocorre expansão clonal das células iniciadas e proliferação

das células pré-neoplásicas, através de actividade mitogénica e inibição de apoptose. Assim as células novas que se originam acumulam alterações genéticas e epigenéticas que alteram o seu fenótipo. Os agentes promotores são compostos com capacidade de desenvolver cancro. Estes compostos caracterizam-se por não interagirem directamente

FIGURA 6-ETAPAS DO PROCESSO DE CARCINOGENESE (ADAPTAÇÃO DE KLAUNIG et al, 2004; OLIVEIRA et al, 2007)

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com o DNA e por não necessitarem de activação metabólica. Estes agentes por oxidação também podem conduzir ao dano no DNA. Este processo não altera a informação genética mas sim a sua expressão. É um processo reversível em que só participam as células indiferenciadas que não sofreram apoptose e que consequentemente participam no desenvolvimento de uma neoplasia maligna (Lutz, 1998; Trosko, 2001; Klaunig et al, 2004; Moggs et al, 2004; Oliveira et al, 2007).

Progressão: É a fase em que a célula pré-neoplásica é transformada em célula

maligna e consiste num conjunto de alterações genéticas e celulares. O tumor adquire capacidade de crescer rapidamente, invadir tecidos locais e metastizar. Ocorre o aumento da instabilidade genética e alterações cariotípicas. Os agentes químicos que actuam como iniciadores podem estimular a progressão, visto aumentarem a taxa de mutação nos genes chave. A progressão pode ser assim caracterizada por irreversibilidade, alterações das características bioquímicas, metabólicas e morfológicas das células, sendo a angiogénese um processo essencial na indução da progressão (Klaunig et al, 2004; Moggs et al, 2004; Oliveira et al, 2007).

1.5.2. MURGANHO UM ALIADO NA INVESTIGAÇÃO BIOMÉDICA

Ao longo da história da investigação os animais têm vindo a ser utilizados como modelos vivos, sendo considerados ferramentas úteis no estudo das causas subjacentes da carcinogénese, progressão tumoral e metástase. Na carcinogénese química experimental do urotélio, pode recorrer-se a diversos modelos tais como cães, coelhos, cobaias, ratos e murganhos. No entanto, nos dias que decorrem, os ratos e os murganhos são os mais utilizados devido às suas características intrínsecas e facilidade de manipulação (Dybing, 1999; Morimura, 2001; Oliveira, 2005; Oliveira 2006; Williams, 2008). A estrutura e função do tracto urinário dos roedores são similares à dos humanos, no entanto, o que torna este modelo animal válido para o estudo do cancro da bexiga é a semelhança histológica, propriedades bioquímicas, características genéticas e moleculares, história natural e comportamento biológico da patologia (Oliveira, 2006).

O murganho pertence ao reino Animalia, classe Mammalia, ordem Rodentia, família

Muridea e género Mus (Hrapkiewiez, 1998). O objectivo da experiência influência a escolha

da estirpe, sendo preferencial o uso de um animal convencional e de boa qualidade (Hrapkiewiez, 1998; Hau, 2003).

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1.5.2.1. HOUSING DO MURGANHO EM LABORATÓRIO

O controlo ambiental em que decorre um ensaio experimental é de extrema importância, este tem influência directa nas respostas fisiológicas e comportamentais dos animais, sendo de todo o interesse, tanto de bem-estar animal como científico, que estas respostas sejam constantes, previsíveis e afectadas por estas condições. Associado a um controlo inadequado dos factores ambientais encontram-se desvios nos resultados biológicos que advêm do ruído de fundo que consequentemente mascara a resposta biológica às variáveis experimentais e influencia a interpretação dos dados(Hau, 2003).

Os parâmetros que devem ser controlados num biotério são: iluminação, temperatura, humidade relativa (HR) e ventilação (Tabela 1) (Hrapkiewiez, 1998; Hau, 2003).

Apesar de serem animais sociáveis e viverem em grupo, os murganhos apresentam uma hierarquia social. Sendo mais evidente em machos que em fêmeas. Os comportamentos agressivos encontram-se associados à estirpe e ao espaço a que estes animais se encontram sujeitos (Hrapkiewiez, 1998; Hau, 2003).

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1.5.2.1. SISTEMA URINÁRIO DO MURGANHO: BEXIGA

O tracto urinário inferior consiste nos ureteres, bexiga urinária e uretra. A bexiga é um órgão impar, altamente distensível, localizada na porção posterior da cavidade abdominal e na cavidade pélvica. A sua porção abdominal, bastante desenvolvida nestes animais, relaciona-se com a parede abdominal, com o jejuno e dorsalmente com o cólon enquanto que a sua porção intrapélvica relaciona-se dorsalmente com os órgãos genitais intrapélvicos (útero nas fêmeas e ducto deferente e próstata nos machos) e ventralmente com o osso púbis e os músculos obturadores internos. Este órgão tem uma forma característica de uma pêra, sendo possível diferenciar 3 porções distintas: um vértice cranial, um corpo intermédio e um colo caudal (Firth et al, 1995; Popesku et al, 2002).

TABELA 1-PARÂMETROS CONTROLADOS NUM BIOTÉRIO E A SUA IMPORTÂNCIA

Parâmetro Referência Observações

Iluminação

12h dia /12h noite: animais de experimentação. Intensidade moderada

Comportamento e expressão fisiológica normal

Temperatura 23ºC ± 2ºC

Alterações bruscas:

Aumentam a susceptibilidade a infecções e provocam

stresse nos animais.

Ventilação Renovação de ar de 10 a

20 vezes por hora

Manter temperatura adequada; libertação de gases (CO2 e amónia), odores, poeiras, partículas e

renovação do ar.

Humidade

Relativa 55% ± 5%

Diminuição acentuada de HR: desidratação da pele, estimulação do canibalismo e ringtail.

HR > 80%: distúrbios de metabolismo, à diminuição das práticas de higienização e consequente aumento do

crescimento de microrganismos.

Influenciada: tipo de gaiola, sistema de ventilação, número de animais por gaiola e frequência da mudança

de cama da gaiola

Enriquecimento

Ambiental Rolos de papel e plástico

Ausência: graves consequências ao nível do sistema nervoso central;

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A função primária do tracto urinário inferior consiste no transporte de urina até à bexiga onde é armazenada e posteriormente eliminada (Firth, 1995).

A parede da bexiga urinária é constituída por três camadas, uma camada adventícia, uma camada muscular e uma camada mucosa composta por epitélio transicional também denominado de urotélio e lâmina própria (Firth, 1995).

1.5.2.1.1. CLASSIFICAÇÃO DAS NEOPLASIAS DO UROTÉLIO

As neoplasias da carcinogénese urotelial classificam-se segundo uma sequência de alterações morfológicas. O tipo de lesões induzidas e o estadio que se observam no murganho são similares ao do homem. Inicia-se com uma hiperplasia simples evoluindo para displasia e progressão até ao carcinoma invasivo, este modelo difere no entanto no facto dos tumores papilares serem raros, sendo o rato mais utilizado no estudo deste último tipo. Assim no murganho a tendência é para desenvolver carcinomas de bexiga não papilares, invasivos e de alto grau, enquanto no rato observam-se carcinomas múltiplos, papilares, não invasivos e de baixo grau (Ozono et al, 1990; Elkin, 1998; Ogawa et al, 1999). 1.5.2.2. REQUISITO PARA O MODELO DE CARCINOGÉNESE UROTELIAL

O estabelecimento de um modelo animal de neoplasia da bexiga similar ao encontrado no homem é de extrema importância na análise de factores associados ao desenvolvimento e progressão da patologia e obtenção de uma base de diagnóstico e tratamento clínico (Ozono et al, 1990).

O murganho é um dos modelos animal de eleição por diversas razões. O homem e o murganho possuem aproximadamente o mesmo número de genes e a sinalização patológica intracelular é bastante conservada entre ambas as espécies (Hakem, 2001; Oliveira et al, 2006).

A habilidade de induzir neoplasias em animais tem sido a base para a compreensão da patogenecidade da neoplasia. No entanto é necessário que o modelo do cancro cumpra um conjunto de requisitos. O modelo animal para a carcinogénese química do urotélio tem que histologicamente induzir tumores de origem urotelial e com diferentes estadios de

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progressão, sendo possível identificar lesões uroteliais planas e papilares. Geneticamente, a percentagem de mutações ao nível do gene p53 é similar ao encontrado no Homem (Oliveira et al, 2007; Yao et al, 2008).

O tumor deve crescer intravesicalmente podendo desta forma encontrar-se directamente exposto a compostos anticancerigenos intravesicais, o procedimento de indução deve ser simples e com uma incidência previsível e adaptável (Oliveira et al, 2006).

1.5.2.2.1 COMPOSTOS CARCINOGÉNEOS: INDUÇÃO QUÍMICA

Diversos carcinogénicos e promotores tumorais exercem um efeito específico, desenvolvendo tumores em órgãos específicos. A bexiga urinária de roedores é um alvo excelente para o estudo de carcinogénese química do urotélio (Frith, 1995). Devido ao facto de nos murganhos o aparecimento de tumores espontâneos e outras alterações epiteliais, como inflamações e hiperplasias, serem raros, estes são considerados um modelo ideal (Elkin, 1998; Frith, 1995).

Desde a primeira relação entre o cancro da bexiga humano e a epidemiologia ocupacional, diversos compostos foram estudados e demonstraram actividade carcinogénica, induzindo cancro da bexiga em diversos modelos animais. Estudos realizados até à data, têm demonstrado diferenças no modo como os compostos químicos participam no processo de carcinogénese, propondo o uso de genotóxico e epigenético (não genotóxico). Os compostos genotóxicos provocam dano directamente no DNA genómico, levando consequentemente a mutações e/ou alterações clastogénicas, enquanto que os compostos epigenéticos actuam como promotores, não necessitam de activação metabólica e não reagem directamente com o DNA (Butterworth, 2006; Oliveira et al, 2007).

Os carcinogénicos genotóxicos que demonstraram maior efectividade e selectividade foram a N-[4-(5-nitro-2-furil)-2-tiazolil]formamida (FANFT), a N-metil-N-nitrosourea (MNU) e a N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN). Estes quando administrados na via, dose e estripe animal apropriada induziam 100% de tumores de bexiga (Oliveira et al, 2006).

A BBN é um composto genotóxico com uma potente e selectiva actividade carcinogénica organotrópica, induzindo lesões pré-neoplásicas e neoplásicas em diversos modelos animais. A sua carcinogenecidade foi reportada em 1964 por Drukrey e os seus

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colaboradores (Hirose et al, 1976; Fukushima et al, 1991, Oliveira et al, 2005; Oliveira et al, 2006). A BBN é um metabolito da N-nitrosodibutilamina (DBN), ambos são potentes carcinogénicos, no entanto, estudos efectuados com animais, nomeadamente coelho, rato e murganho, sugerem que a DBN para além de induzir tumores na bexiga também induz lesões neoplásicas no fígado, pulmão e esófago (Cohen, 1975; Suzuki, 1983; Oliveira, 2006). Aquando da conversão da BBN in vivo forma-se o N-butil-N-(3-carboxipropil)nitrosamina (BCPN), o seu principal metabolito urinário. Este composto foi identificado por Okada e Suzuki, em 1972, num estudo realizado em ratos. Ambos, BBN e BCPN demonstraram potente carcinogenecidade e mutagenecidade, a BBN contrariamente ao seu metabolito necessita de activação metabólica pelas enzimas do fígado, enquanto que o BCPN entra em contacto com o urotélio através da urina. Tanto na BBN como no BCPN a metabolização ocorre pela via α-hidroxilação, induzindo espécies reactivas que se vão ligar ao DNA (Okada e Suzuki, 1972; Hirose et al, 1976; Suzuki et al, 1983; Mori et al, 2001; Oliveira et al, 2006).

No sentido de avaliar as variáveis existentes na biotransformação da BBN e compostos relacionados na carcinogénese de bexiga de diferentes espécies animais, Suzuki

et al (1983) e Hirose et al (1976) utilizaram o rato, o murganho, o hamster e o

porquinho-da-índia. Após metabolização da BBN, mediante a espécie, o metabolito principal variava, no rato e no murganho o BCPN era o metabolito urinário principal, no entanto no murganho este composto encontrava-se ligado ao aminoácido glicina. Em ambos os estudos observou-se que a biotransformação da BBN foi menos efectiva no rato, associada a uma menor excreção de BCPN nas restantes espécies e consequentemente registou-se uma maior susceptibilidade de neoplasia da bexiga no rato, seguida do murganho comparativamente às restantes espécies. A metabolização dos carcinogénicos e a susceptibilidade do epitélio da bexiga de diferentes espécies a estes compostos tem influência directa no tempo de indução, na incidência e ainda no tipo de neoplasias observadas (Hirose et al, 1976; Suzuki

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1.5.2.2.2. COMPOSTOS CARCINOGÉNEOS: VIAS DE ADMINISTRAÇÃO DA BBN

No caso da BBN as vias de administração mais comuns são as vias orais, a administração na dieta, na água e a entubação gástrica (gavage). Alguns autores já administraram este composto por via subcutânea e intravesical. Na administração enterogástrica o carcinogénico é administrado em doses muito elevadas que consequentemente pode influenciar negativamente os mecanismos de defesa celular e o rendimento da toxicidade que pode não ser observado noutras vias de administração, nomeadamente por administração na água. Uma das vantagens do uso desta técnica é que conseguimos precisar a dose administrada a cada animal o que não acontece na administração na água ou comida, que apenas obtemos uma média do que cada animal ingere (Oliveira et al, 2006; Butterworth, 2006; Rodrigues-Arantes et al, 2012).

Drukrey et al, reportaram que a administração contínua de BBN através da água, durante um período de 40 semanas, induzia tumores da bexiga (Hirose et al, 1976; Fukushima et al, 1991). Em 1969, Ito et al, após um estudo de histogénese de tumores induzidos pela BBN em ratos concluíram que o tempo de exposição ao carcinogénico influenciava o número de lesões e a sua extensão (Ito, 1969).

1.5.3. QUIMIOPREVENÇÃO DO CANCRO: PREVENÇÃO OU TRATAMENTO?

Diversos compostos têm vindo a ser usadas para suprimir ou prevenir o cancro, no entanto apenas algumas foram consideradas agentes eficientes. A quimioprevenção consiste no uso de produtos dietéticos naturais e/ou de substâncias sintéticas que possuam a capacidade de bloquear, inibir, reverter ou retardar o processo de carcinogénese. Os componentes alimentares com capacidade de retardar o envelhecimento celular e inibir o crescimento de células cancerosas, sem afectar o normal crescimento celular, têm adquirido especial atenção no âmbito das novas abordagens preventivas (Okajima et al, 1997; Ashughyan et al, 2006; Cabrera et al, 2006; Ihlaseh et al; 2006; Kuno et al, 2006; Tyagi et al, 2007).

Diversos estudos epidemiológicos reportam que alguns produtos e compostos naturais manifestam uma significativa inibição do cancro da bexiga, tabela 2.