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Sistemas compósitos de PU/ZnO para entrega de fármacos

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Academic year: 2021

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2012

Ana Lúcia Mota Pires

Sistemas compósitos de PU/ZnO para entrega de

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2012

Ana Lúcia Mota Pires

Sistemas compósitos de PU/ZnO para entrega de

fármacos

Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Materiais e Dispositivos Biomédicos, realizada sob a orientação científica da Doutora Maria Elizabete Jorge Vieira Da Costa, Professora auxiliar e co-orientação da Doutora Maria Helena Figueira Vaz Fernandes, Professora associada do Departamento de Engenharia de Materiais e Cerâmica (DEMaC) da Universidade de Aveiro.

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o júri

Presidente Prof. Doutor Francisco Manuel Lemos Amado

Professor Associado da Universidade de Aveiro

Vogais Prof. Doutor Tito da Silva Trindade

Professor Associado C/ Agregação da Universidade de Aveiro

Prof. Doutora Maria Elizabete Jorge Vieira da Costa

Professora Auxiliar da Universidade de Aveiro

Prof. Doutora Maria Helena Figueira Vaz Fernandes

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Agradecimentos Ao longo da realização desta dissertação tive o privilégio de poder contar com a colaboração de um conjunto de pessoas, às quais gostaria de expressar toda a minha gratidão.

Gostaria de agradecer em primeiro lugar às minhas orientadoras: Prof. Doutora Maria Elizabete Jorge Vieira da Costa e Prof. Doutora Maria Helena Figueira Vaz Fernandes pelo apoio ao longo deste trabalho, pelo empenho na interpretação dos resultados bem como na correção criteriosa e minuciosa desta dissertação.

Aos Colegas do BioLab, pela permanente disponibilidade e apoio, pela ajuda em alturas difíceis, pelos conhecimentos que me transmitiram e pelas palavras sempre amigas que dirigiram. À Erika Davim pela paciência e pelo apoio incondicional em todos os momentos, inclusive os mais difíceis e pelo acolhimento e amizade demonstrada. À Nathalie Barroca pelo carinho, atenção e amizade ao longo de todo o trabalho. E, finalmente ao Jorge Luís pela ajuda e sugestões durante a realização do trabalho.

Gostaria de agradecer à Doutora Ana Luísa pelo fornecimento das membranas de diálise bem como pela disponibilidade demonstrada. Ao Prof. Doutor José Maria Ferreira pela pronta disponibilização da estufa que foi indispensável para concluir os testes de libertação.

Aos técnicos do Departamento de Engenharia de Materiais e Cerâmica pelo imenso apoio durante a realização desta dissertação.

Queria agradecer aos meus pais e irmãos pelo constante apoio, carinho e compreensão demonstrados.

E por último mas não menos importante, queria agradecer de uma forma muito especial a todos os meus amigos pelo constante apoio, momentos de descontração e diversão bem passados ao longo de toda a dissertação que foram úteis para recuperar energias e acreditar que existe sempre um novo amanhecer.

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palavras-chave Compósitos, óxido de zinco, nanopartículas, poliuretano, ibuprofeno, gentamicina, libertação de fármacos

resumo A produção de sistemas para libertação de fármacos que integrem materiais nanométricos poderá trazer vantagens significativas no uso clínico devido ao facto de as suas reduzidas dimensões permitirem a entrega do fármaco em locais não acessíveis a transportadores com dimensão superior. Nestes sistemas é extremamente importante controlar a velocidade de libertação do fármaco. A incorporação de nanopartículas numa matriz polimérica poderá ser uma estratégia adequada para manipular a velocidade a que o fármaco é localmente entregue. O presente trabalho teve como objetivo o estudo da libertação de dois fármacos modelos, a gentamicina e o ibuprofeno, a partir de dois sistemas distintos: (i) partículas nanoestruturadas de ZnO e (ii) compósitos de (poliuretano (PU)/ZnO) produzidos por incorporação de partículas nanoestruturadas de ZnO numa matriz de PU.

Do ponto de vista experimental, o presente trabalho envolveu as seguintes etapas: (1) síntese e caracterização de partículas de ZnO, (2) incorporação de fármacos nas partículas de ZnO, (3) produção e caracterização de compósitos PU/ZnO usando as partículas carregadas com o fármaco e (4) monitorização da libertação dos fármacos nos dois sistemas, ou seja, a partir das partículas de ZnO e a partir dos compósitos PU/ZnO correspondentes, bem como da respetiva degradação no meio de libertação.

As partículas de ZnO foram produzidas por um método de precipitação química em que se seguiram os efeitos da variação da velocidade de adição de reagentes. Para esse efeito utilizou-se uma bureta e um dispersor como dispositivos alternativos para mistura dos reagentes necessários à precipitação dos pós, i.e. uma solução de um sal de zinco (ZnCl2) e uma solução básica

(NaOH). Os pós obtidos, ZnOA e ZnOP respetivamente, foram caraterizados por microscopia eletrónica de varrimento (SEM) quanto à morfologia (forma e tamanho), por adsorção de gás (BET) para avaliação de área superficial especifica e porosidade, e por espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier para avaliação das suas características químicas de superfície. Utilizou-se como termo de comparação nanopartículas de ZnO comerciais (ZnOC). Os resultados obtidos evidenciaram que os diferentes caudais de adição de reagentes, associados aos dois dispositivos usados, se refletiram em variações significativas de área superficial das partículas obtidas que se apresentaram como partículas nanoestruturadas de elevada área específica. Os fármacos modelos, o ibuprofeno e a gentamicina, foram incorporados nas nanoestruturas por um processo de adsorção. A sua incorporação foi avaliada por espectroscopia de infravermelhos, e de ultravioleta (UV) (ao comprimento de onda de 264 nm para o ibuprofeno e de 332 nm para a gentamicina) bem como por análise térmica, observando-se uma variação da quantidade de fármaco adsorvido consoante o tipo de pó e do próprio fármaco. As nanoestruturas carregadas de fármaco foram usadas na produção de compósitos PU/ ZnO com uma percentagem mássica de 50% de ZnO.

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palavras-chave Compósitos, óxido de zinco, nanopartículas, poliuretano, ibuprofeno, gentamicina, libertação de fármacos

Resumo A preparação dos compósitos consistiu em adicionar as nanoestruturas de

ZnO carregadas com o fármaco modelo a uma solução do polímero. Por evaporação do solvente obtiveram-se assim discos de compósitos de ZnO de matriz polimérica. A libertação dos fármacos a partir dos dois sistemas em análise (nanoestruturas de ZnO e compósitos PU/ZnO) foi conduzida em solução tampão de fosfatos (PBS) à temperatura de 37ºC e a pH =7,4 Os resultados obtidos revelaram que ambos os sistemas, nanoestruturas de ZnO e compósitos PU/ZnO, apresentam perfis de libertação do fármaco em três estágios: um estágio inicial, com elevada velocidade de libertação, seguido de um estágio intermédio de velocidade mais lenta e por fim o último estágio com velocidade muito reduzida ou quase nula. Apesar desta semelhança observa-se também que os perfis são fortemente afetados pela incorporação das nanoestruturas na matriz polimérica dado que esta inibe fortemente a libertação do fármaco. A matriz comporta-se como uma barreira que se opõe ao transporte do fármaco, pelo que as quantidades libertadas a partir dos compósitos são significativamente inferiores às observadas no caso das nanoestruturas. Por outro lado observou-se também uma variação das quantidades de fármaco libertadas com os vários tipos de nanoestruturas em análise bem como com os respetivos compósitos. Os ensaios de degradação dos compósitos, permitiram concluir que inicialmente ocorre degradação superficial da matriz polimérica que expõe as nanopartículas mais superficiais ao fluido de libertação. No entanto após esta fase, a degradação é mais lenta e ocorre formação de precipitados de fosfatos de sódio e zinco que também dificultam a libertação uma vez que formam uma camada superficial que conjuntamente com o polímero ainda não degradado aprisiona as nanoestruturas de ZnO no interior da matriz, inibindo o posterior transporte do fármaco para o meio de libertação. Este resultado sugere que deverá ser possível controlar a quantidade de fármaco libertado mediante a manipulação da estrutura química do poliuretano por forma a torna-lo mais degradável. Estudos anteriores já haviam demonstrado que os compósitos PU/ZnO (50% de ZnO) são modelos potencialmente interessantes para terapias que em que se pretenda travar a proliferação celular, como é o caso do tratamento do cancro. Os presentes resultados demonstram que a associação da própria gentamicina a estes sistemas pode ser útil em aplicações como o tratamento de tumores ósseos como osteossarcomas pois poderá ter um efeito local inibitório de micro-organismos. O ibuprofeno poderá ser aplicado em terapias em que se pretenda minimizar o processo inflamatório. Em conclusão, os resultados obtidos sugerem a viabilidade da aplicação dos compósitos de PU/ZnO como sistemas de libertação sustentada de fármacos.

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Keywords Composite, zinc oxide, nanoparticles, polyurethane, ibuprofen, gentamicin, drug delivery

Abstract The production of drug delivery systems that integrate nanoscale materials could bring significant advantages in clinical use since their reduced dimensions may allow to deliver the drug at locations not accessible to carriers with higher dimension. In these systems it is extremely important to control the rate of drug release. The incorporation of nanoparticles in a polymer matrix may be a suitable strategy for manipulating the rate at which the drug is locally delivered. The present study was aimed at the study of the release of two drug models, gentamycin and ibuprofen, from two distinct systems: (i) ZnO nanostructured particles and (ii) (Polyurethane (PU)/ZnO) composite produced by incorporation of nanostructured ZnO particles in a PU matrix. From the experimental point of view, this work involved the following steps: (1) synthesis and characterization of ZnO particles, (2) loading ZnO particles with the drug models, (3) production and characterization of PU / ZnO composites using the drug loaded particles and (4) monitoring the drug release in both systems, ie from ZnO particles and from the PU / ZnO composite, and its degradation in the release medium. The ZnO particles were produced by a chemical precipitation method in which the effects of varying the rate of reagents addition were followed. For this purpose a burette and a nozle were used as alternative devices for mixing the reactants required for ZnO powders precipitation, ie a a zinc salt solution (ZnCl2) and a basic solution (NaOH) .The obtained powders,

ZnOA and ZnOP respectively, were characterized by scanning electron microscopy (SEM) for morphology evaluation(size and shape), by gas adsorption (BET) for assessing the specific surface area and porosity, and by infrared spectroscopy for evaluation of their surface chemistry. Commercial ZnO nanoparticles (ZnOC) were also used for comparative purposes. The obtained results showed that the different rates of reagents addition of, associated with the two used devices were reflected in significant variations of the particles surface area which were seen to be nanostructured particles of high specific area. The drugs models, ibuprofen and gentamicin were incorporated into the nanostructures by an adsorption process. The drug loading was evaluated by IR spectroscopy and by ultraviolet (UV) spectroscopy (at the wavelengths of 264 nm and 332 nm for ibuprofen and gentamicin, respectively) as well as by thermal analysis. It was observed that the amount drug adsorbed was conditioned by the type of powder and by the drug itself. The drug loaded nanostructures were used in the production of PU/ZnO composites with a ZnO weight percentage of 50%.The preparation of the composites consisted on the addition of ZnO nanostructures loaded with the drug model to a polymer solution.

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Keywords Composite, zinc oxide, nanoparticles, polyurethane, ibuprofen, gentamicin, drug delivery

Abstract The evaporation of the solvent allowed PU/ZnO composites discs to be

obtained. The drug release from these two systems (ZnO nanostructures and PU/ZnO composites) was conducted in a phosphate buffer solution (PBS) at 37°C and pH=7.4 The results showed that both systems, ZnO nanostructures and PU/ZnO composites exhibit a drug release profile comprising three stages: an initial stage with high release rate followed by an intermediate stage of slower rate and finally the last stage with a very low or nearly nil rate. Despite this similarity it is also observed that the profiles are strongly affected by the incorporation of the nanostructures into the polymer matrix since this inhibits the drug release. The matrix acts as a barrier which prevents the transport of the drug, so that the quantities released from the composites are significantly lower than those observed in the case of nanostructures. Moreover a variation on the drug released quantities is also observed for the various types of nanostructure under analysis as well as for their composites. The degradation tests of the composites showed that degradation occurs first at the surface of the polymeric matrix, exposing the more superficial nanoparticles to release medium. However, after this stage, the polymer degradation becomes slower and sodium and zinc phosphates precipitation also occurs thus forming a surface layer which, together with the polymer not yet degraded, trap ZnO nanostructures within the matrix inhibiting further the drug transport into the release medium. This result suggests that it should be possible to control the amount of released drug by manipulating the chemical structure of the polyurethane in order to make it more degradable. Previous studies have shown that the composite PU/ZnO (50% ZnO) are potentially interesting models for therapies aimed at to stop cell proliferation, such as in cancer treatment. The present results demonstrate that the association of gentamicin to these systems may be useful in applications such as the treatment of bone tumors (osteosarcomas) where they may have a local effect of microorganisms inhibition. Ibuprofen may be applied in therapies where it is desired to minimize the inflammatory process. In conclusion, the results suggest the usefullness of the develloped PU/ZnO composites as drugs sustained release systems.

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Índice

Lista de Abreviaturas e Símbolos ... iii

Índice de Figuras ... v Índice de Tabelas ... ix Capítulo I ... 1 1. Introdução ... 3 1.1. Motivação ... 3 1.2. Objetivos ... 4 1.3. Estrutura da dissertação ... 5 Capítulo II... 7 2. Revisão Bibliográfica ... 9

2.1. Sistemas de libertação de fármacos... 9

2.2. Óxido de zinco...12

2.2.1. Espécies reativas de oxigénio ...15

2.2.2. Nanopartículas de ZnO para libertação de fármaco ...17

2.3. Poliuretano ...19

2.3.1. Química dos poliuretanos ...19

2.3.2. O Poliuretano como biomaterial ...22

2.4. Compósito PU/ZnO ...24 2.5. Fármaco ...26 2.5.1. Ibuprofeno ...26 2.5.2. Gentamicina ...29 Capítulo III ...35 3. Procedimento Experimental ...37

3.1. Materiais e reagentes utilizados ...37

3.2. Síntese de pós de ZnO ...38

3.3. Carregamento das nanopartículas com fármaco ...42

3.4. Produção dos compósitos PU/ZnO ...43

3.5. Ensaios de libertação in vitro ...44

3.5.1. Libertação dos fármacos a partir das NPsZnO ...44

3.5.2. Libertação dos fármacos a partir dos compósitos de PU/ZnO ...45

3.6. Técnicas de caracterização ...46

(10)

3.6.2. Isotérmicas de adsorção...47

3.6.3. Espetroscopia de absorção atómica (AAS) ...50

3.6.4. Microscopia eletrónica de varrimento (SEM) ...50

3.6.5. Análise térmica diferencial e termogravimétrica (ATD/TG) ...51

3.6.6. Espetroscopia de infravermelhos por transformada de Fourier (FTIR)...51

3.6.7. Espetroscopia de UV ...52

Capítulo IV ...55

4. Resultados e Discussão ...57

4.1. Caracterização dos materiais ...57

4.1.1. Nanopartículas de ZnO ...57

4.1.2. Poliuretano ...63

4.1.3. Fármacos ...65

4.1.3.1. Ibuprofeno ...65

4.1.3.2. Gentamicina ...68

4.2. Carregamento e caracterização das nanopartículas ...69

4.2.1. Caracterização das nanopartículas com ibuprofeno ...73

4.2.2. Caracterização das nanopartículas com gentamicina ...74

4.3. Caracterização dos compósitos de PU/ZnO ...76

4.4. Estudo da libertação de fármacos in vitro ...79

4.4.1. Libertação do Ibuprofeno ...79

4.4.2. Libertação da gentamicina ...84

Capítulo V ...95

5. Conclusões e Trabalho Futuro ...97

Bibliografia ... 101

(11)

Lista de Abreviaturas e Símbolos

Símbolo/

Abreviatura

Descrição

AAS Espetroscopia de Absorção Atómica (do inglês Atomic Absorption Spectroscopy)

ACT Acetato de Dexametasona

AINE Anti-Inflamatório Não Esteroide

ASE Área Superficial Especifica

ATD Análise Térmica Diferencial

BDO 1,4 – Butanodiol

BET Isotérmica de Braunauer-Emmett-Teller

CEF Cefamandole Nafate

Cit Ácido Cítrico

DEE Diâmetro esférico equivalente

DNA Ácido Desoxirribonucleico (do inglês Deoxyribonucleic acid)

DNR Daunorubicina

DOX Doxorubicina

DRX Difração de raio-X

ED 1,4 – Etilenodiamina

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês Ethylenediamine tetraacetic acid)

FDA Food and Drug Administration

FTIR Espetroscopia de Infra Vermelhos com Transformadas de Fourier (do inglês Fourier Transformer Infrared Spectroscopy)

FWHM Largura a meia altura do pico de difração (do inglês full width at half maximum)

Genta Gentamicina

GRAS Geralmente reconhecido como seguro (do inglês Generally Recognized as Safe)

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (do inglês Human immunodeficiency virus)

HMDI Difenilmetano-diisocianato Hidrogenado (do inglês Hydrogenated diphenylmethane-diisocyanate)

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IARC Agência Internacional de Investigação do Cancro (do inglês International Agency for Research on Cancer)

IBU Ibuprofeno

ISO International Standardization Organization

IUPAC Internacional Union of Pure and Applied Chemistry

IV Infravermelho

JCPDS/ICDD Joint Commitee on Powder Diffraction Standards/ International Centre for Diffaction Data

MDI 4,4’ – Diisocianato de difenilmetano (do inglês Diphenylmethane-diisocyanate)

NPsZnO Nanopartículas de óxido de zinco

OMS Organização Mundial de Saúde

OPA O-ftalaldeído ou orto- ftalaldeído

PBS Tampão de solução salina de fosfato

PTMEG Éter glicol de politetrametileno (do inglês Polytetramethylene ether glycol)

PU Poliuretano

ROS Espécies Reativas de Oxigénio (do inglês Reactive oxygen species)

Rpm Rotações por minuto

SEM Microscopia Eletrónica de Varrimento (do inglês Scanning electron microscope)

SLC Sistema de libertação controlada

SNC Sistema Nervoso Central

TG Análise Termogravimétrica

TPmédio Tamanho médio de poro UA Unidade Arbitraria

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Índice de Figuras

Figura 1 - Incidência e mortalidade de vários tipos de cancros a) no homem e b) na mulher. Adaptado de [2]... 3 Figura 2 – Perfil de concentração de fármaco quando administrado por via convencional a) e quando assegurado por um sistema de libertação controlada de fármacos b). Adaptado de [7]. .... 9 Figura 3 - Esquema ilustrativo da difusão de nanopartículas e micropartículas em tecidos com pH diferentes. Adaptado de [11]. ... 10 Figura 4 – Estrutura cristalina do ZnO: a) Blenda de Zinco; e b) Wurtzite. Em preto estão representados os átomos de oxigénio e a cinza os átomos de zinco. Adaptado de [16]. ... 13 Figura 5 - Estrutura wurtzite do ZnO com ilustrando a coordenação tetraédrica dos iões Zn2+ e O2-. Adaptado de [4]... 13 Figura 6 - Exemplos de nanopartículas de ZnO com diferentes morfologias: a) nanofitas [17], b) nanofios [17], c) Pontos quânticos [22] e d) nanobastonetes [23] obtidas por diferentes técnicas de síntese designadamente a) sublimação, b) método de vapor-líquido- sólido (VLS), c) hidrólise química e d) precipitação química. ... 14 Figura 7 – Esquema da formação de espécies reativas de oxigénio. Retirado de [24]. ... 15 Figura 8 – Mecanismo de produção de ROS em presença de ZnO: sob radiação UV são produzidos buracos (h+) na banda de valência e eletrões (e-) na banda de condução, resultando pares e-/h+ que originam espécies reativas de oxigénio. Retirado de [23]. ... 16 Figura 9 – Esquema ilustrativo do possível processo de transporte de DNR por nanobastonetes de ZnO para dentro de uma célula, levando à morte celular devido a produção de ROS. Adaptado de [23]. ... 17 Figura 10 – Parâmetros que influenciam o perfil de libertação- influência do pH: a) perfil de libertação da Doxorubicina (DOX) em pontos quânticos de ZnO [28]; b) perfil de libertação da DOX em nanoaglomerados mesoporosos de ZnO [29]; c) libertação do DRN em nanobastonetes de ZnO [23]; e influência da exposição a ultrassons: d) perfil de libertação em nanoaglomerados mesoporosos de ZnO [29]. ... 18 Figura 11 – Ilustração da formação de PU através de reação química entre um poliól (OH-R-OH) e um diisocianato (O=C=R’=C=O). Retirado de [35]. ... 20 Figura 12 – Estruturas moleculares de ressonância do grupo isocianato. Retirado de [32]. ... 21 Figura 13 – Degradação do PU em sistemas de libertação de fármaco a) por hidrólise do polímero de forma uniforme e visível ao longo de toda a matriz e b) por degradação superficial do polímero. Retirado de [51]. ... 24 Figura 14 – a) Constituição de um neurónio e b) Lesão do SNC e consequente produção de fatores inibidores da regeneração deste sistema. Retirado de [55]. ... 25 Figura 15 – Estrutura química do ibuprofeno. Retirado de [61]. ... 27

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Figura 16 – Estrutura química do: a) R (-) ibuprofeno e b) S (+) ibuprofeno. Retirado de [59]. ... 28

Figura 17- a) Curvas de libertação do ibuprofeno em nanopartículas de sílica em meios de libertação com diferentes valores de pH e b) imagem de TEM das nanopartículas. Adaptado de [69]. ... 29

Figura 18 – a) Estrutura molecular da gentamicina e b) constituição dos vários grupos R1, R2 e R3 que identificam os diferentes tipos de gentamicina (C1, C2, C1a, C2a e C2b). Retirado de [71]. ... 30

Figura 19 – a) Curva de libertação da gentamicina num cimento ósseo comercial e b) percentagem de gentamicina libertada em micropartículas de BSA com diferentes razões de BSA/G. Adaptado de [78, 79]. ... 33

Figura 20 – Estrutura química do poliuretano Tecoflex® [34]. ... 38

Figura 21 – a) Fotografia do pulverizador utilizado na produção de NPsZnO e b) esquema ilustrativo do pulverizador. ... 39

Figura 22 – Representação dos dois métodos de adição da solução básica: a) método A e b) método P. ... 39

Figura 23 – Esquema ilustrativo do procedimento adotado para a produção de nanopartículas de ZnO. ... 41

Figura 24 – Esquema do processo de produção dos discos PU/NPsZnO. ... 43

Figura 25 – Esquema experimental adotado para a libertação de fármacos a partir das nanopartículas de ZnO. ... 45

Figura 26 – Classificação da IUPAC para as isotérmicas de adsorção de gases. Adaptado de [81]. . 47

Figura 27 – Classificação dos ciclos de histerese (processos de adsorção/dessorção irreversíveis) segundo as classificações da IUPAC. Adaptado de [81]. ... 48

Figura 28 - Difratograma de raios-X dos pós de ZnO adquiridos comercialmente (―ZnOC) e dos pós precipitadas (― ZnOP e ― ZnOA). ... 57

Figura 29 – Micrografias de SEM do ZnO adquirido comercialmente (ZnOC) com diferentes ampliações. ... 58

Figura 30 – Micrografias de SEM das amostras de a) ZnOP e b) ZnOA com diferentes ampliações. A distância entre as setes corresponde a 42 nm. ... 59

Figura 31 – Isotérmicas de adsorção/dessorção dos pós de ZnOC, ZnOP e ZnOA. ... 60

Figura 32 – Distribuição do tamanho de poros dos pós de ZnO em análise: (―) ZnOC, (―) ZnOP e (―) ZnOA. ... 60

Figura 33 – Espetro de infravermelhos das amostras de (―) ZnOC, (―) ZnOP e (―) ZnOA. ... 63

Figura 34 – Difratograma de raio-X do filme de Poliuretano. ... 64

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Figura 36 – ATD/TG do ibuprofeno a uma taxa de aquecimento de 10ºC/min em atmosfera de árgon. ... 66 Figura 37 – Espetro de infravermelhos do pó de Ibuprofeno. ... 67 Figura 38 – Curvas de ATD/TG da Gentamicina obtidas a uma taxa de aquecimento de 10ºC/min em atmosfera de árgon. ... 68 Figura 39 – Espetro de infravermelhos do pó de gentamicina comercial. ... 69 Figura 40 – Eficiência de carregamento de fármaco ao longo do tempo. ... 70 Figura 41 – Micrografias obtidas por SEM dos pós: a) ZnOC/Ibu, b) ZnOP/Ibu, c) ZnOA/Ibu, d) ZnOC/Genta, e) ZnOP/Genta e f) ZnOA/Genta com diferentes ampliações. ... 72 Figura 42 – Curva de TG a) dos pós (―) ZnOC/Ibu, (―) ZnOP/Ibu e (―) ZnOA/Ibu e b) do ibuprofeno. Os pós ZnOC são os que adsorvem maior quantidade de IBU por unidade de área (curva azul). ... 73 Figura 43 – Espetros de infravermelhos dos pós (―) ZnOC, (―) ZnOP e (―) ZnOA e dos pós com ibuprofeno (―) ZnOC/Ibu, (―) ZnOP/Ibu e (―) ZnOA/Ibu. ... 74 Figura 44 – Curva de TG dos pós de a) (―) ZnOC/Genta, (―) ZnOP/Genta e (―) ZnOA/Genta e b) de gentamicina. Os pós ZnOP são os que adsorvem maior quantidade de gentamicina por unidade de área (curva vermelha). ... 75 Figura 45 – Espetros de infravermelhos dos pós (―) ZnOC, (―) ZnOP e (―) ZnOA e dos pós com ibuprofeno (―) ZnOC/Genta, (―) ZnOP/Genta e (―) ZnOA/Genta. ... 75 Figura 46 – Micrografias de vistas de topo dos compósitos a) PU/ZnOC/Ibu, b) PU/ZnOP/Ibu, c) PU/ZnOA/Ibu, d) PU/ZnOC/Genta, e) PU/ZnOP/Genta e f) PU/ZnOA/Genta com diferentes ampliações. ... 77 Figura 47 - Espetro de infravermelhos dos compósitos (―) PU/ZnOC/Ibu, (―) PU/ZnOP/Ibu, (―) PU/ZnOA/Ibu, (―) PU/ZnOC/Genta, (―) PU/ZnOP/Genta, (―) PU/ZnOA/Genta e (―) PU puro. ... 78 Figura 48 - Perfis de libertação de ibuprofeno (% de fármaco libertado) a partir das diferentes partículas de ZnO (ZnOC, ZnOP e ZnOA). ... 81 Figura 49 – Perfis de libertação de ibuprofeno (% de fármaco libertado) a partir dos diferentes compósitos (PU/ZnOC, PU/ZnOP e PU/ZnOA). ... 82 Figura 50 - Quantidade absoluta de ibuprofeno libertado a partir de nanopartículas de ZnO e dos respetivos compósitos ao longo do tempo. ... 82 Figura 51 - Perfis de libertação da gentamicina (% de fármaco libertado) a partir das diferentes partículas de ZnO (ZnOC, ZnOP e ZnOA). ... 84 Figura 52 - Perfis de libertação da gentamicina (% de fármaco libertado) a partir dos diferentes compósitos (PU/ZnOC, PU/ZnOP e PU/ZnOA). ... 85 Figura 53 - Quantidade absoluta de gentamicina libertada a partir de nanopartículas de ZnO e dos respetivos compósitos ao longo do tempo. ... 85

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Figura 54 – Evolução da microestrutura do compósito PU/ZnOP com o tempo de libertação do ibuprofeno: após 2 dias (a), 5 dias (b), 15 dias (c) e 31 dias (d). As micrografias foram obtidas em superfícies de topo e em superfícies de corte (secção reta). ... 88 Figura 55 - Difratograma de raio-X dos compósitos (―) PU/ZnOC/Ibu, (―) PU/ZnOP/Ibu e (―) PU/ZnOA/Ibu depois da libertação de IBU, ao fim de 31 dias. Legenda: ∆ – ZnO; • – Na6(ZnPO4)6.8H2O e *– NaZn(PO4)(H2O) . ... 90 Figura 56 - Difratograma de raio-X dos compósitos (―) PU/ZnOC/Genta e (―) PU/ZnOP/Genta e (―) PU/ZnOA/Genta depois da libertação de gentamicina, ao fim de 31 dias. Legenda: ∆ – ZnO; • – Na6(ZnPO4)6.8H2O e *– NaZn(PO4)(H2O) . ... 90 Figura 57 – Espetro de infravermelho das amostras (―) PU/ZnOC/Ibu, (―) PU/ZnOP/Ibu (―) PU/ZnOA/Ibu, (―) PU/ZnOC/Genta, (―) PU/ZnOP/Genta e (―) PU/ZnOA/Genta após libertação (ao fim de 31 dias) e do (―) PU puro. ... 91 Figura 58 – Micrografias obtidas do SEM dos compósitos: a) PU/ZnOC/Ibu, b) PU/ZnOC/Genta, c)PU/ZnOP/Ibu, d)PU/ZnOP/Genta, e)PU/ZnOP/Ibu e f)PU/ZnOA/Genta. ... 93

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Índice de Tabelas

Tabela 1 – Características de nanopartículas usadas para libertação de fármacos: tipo, dimensão,

agente terapêutico e possível aplicação. Adaptado de [11]. ... 11

Tabela 2 – Nanopartículas atualmente comercializadas para tratamento de cancro. Adaptado de [12]. ... 12

Tabela 3 – Solubilidade do ibuprofeno à temperatura ambiente (25ºC). Adaptado de [62]. ... 27

Tabela 4 – Propriedades físico-químicas da gentamicina ... 31

Tabela 5 – Materiais e regentes utilizados com respetiva empresa fornecedora e pureza. ... 37

Tabela 6 – Designação das amostras preparadas ... 44

Tabela 7 – Condições das análises de ATD/TG realizadas aos diferentes materiais. ... 51

Tabela 8 – Características dos pós de ZnO: comercial (ZnOC) e dos pós precipitados (ZnOP e ZnOA). ... 62

Tabela 9 – Bandas de absorção, no infravermelho, indicadas na Figura 33. ... 63

Tabela 10 – Bandas de absorção, no infravermelho, indicadas na Figura 35. ... 65

Tabela 11 – Bandas de absorção, no infravermelho, indicadas na Figura 37. ... 67

Tabela 12 – Bandas de absorção, no infravermelho, indicadas na Figura 39. ... 69

Tabela 13 – Resultados do carregamento do fármaco nos vários tipos de nanopartículas em estudo neste trabalho, após seis dias de contacto com a solução do fármaco. ... 70

Tabela 14- Identificação de bandas de absorção no infravermelho observadas nos espectros apresentados na Figura 47. ... 79

Tabela 15 – Observações referentes às curvas de libertação do ibuprofeno a partir de nanopartículas de ZnO e dos respetivos compósitos. ... 83

Tabela 16 - Observações para as curvas de libertação da gentamicina em nanopartículas de ZnO e dos respetivos compósitos. ... 86

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(19)
(20)
(21)

1. Introdução

1.1. Motivação

O cancro é uma doença multifatorial que deriva de uma mistura complexa de fatores genéticos e ambientais [1].

De acordo com a Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC), registaram-se, em 2008, 12,7 milhões de novos casos de cancro e 7,6 milhões de mortes resultantes desta doença. Segundo esta mesma agência, estima-se que até 2030 os valores de novos casos de cancro por ano dupliquem [2].

Em Portugal, no caso do sexo masculino, verifica-se uma maior incidência do cancro da próstata, do cólon e do pulmão, estando a mortalidade maioritariamente associada ao cancro do pulmão (Figura 1a). Quanto ao sexo feminino verifica-se que o cancro da mama, do cólon e do colo do útero são os que tem maior incidência, sendo o cancro da mama o que induz maior taxa de mortalidade neste grupo (Figura 1b). Estes resultados demonstram que há necessidade de inovar para se conseguirem formas de tratamento do cancro mais eficientes.

O sucesso das terapias anticancerígenas está associado a um diagnóstico precoce bem como a elevada eficiência terapêutica. A cirurgia, radioterapia e quimioterapia são as três principais terapias atualmente adotadas no tratamento de cancro.

a) b)

Figura 1 - Incidência e mortalidade de vários tipos de cancros a) no homem e b) na mulher. Adaptado de [2].

(22)

No caso da quimioterapia, a mais utilizada das três terapias, muitos dos fármacos anticancerígenos possuem uma eficiência baixa devido à sua incapacidade de alcançar o local alvo em concentrações suficientes e sem causar efeitos nefastos nos tecidos e/ou células saudáveis [1]. Estes fármacos não possuem seletividade e especificidade levando à morte de células saudáveis no organismo. Existe ainda a possibilidade de se desenvolver resistência aos medicamentos levando à reincidência do cancro.

Um dos grandes desafios atuais reside no desenvolvimento de um sistema de libertação capaz de entregar o fármaco com sucesso nos alvos específicos e sem danos colaterais. Este sistema de libertação ideal, comparado com os sistemas convencionais, será altamente específico e eficiente. A produção de sistemas para libertação de fármacos que integrem materiais nanoestruturados poderá trazer vantagem significativa no uso clínico devido ao seu reduzido tamanho que permitirá assim a entrega de fármacos em sítios não acessíveis a outras escalas [3].

Estudos recentes referem os compósitos de poliuretano e nanopartículas de óxido de zinco como possíveis candidatos para sistemas de entrega de fármacos [4].

O poliuretano (PU) e o óxido de zinco (ZnO) integram a lista de materiais aprovados pela FDA sendo considerados como substâncias GRAS (Generally Recognized as Safe). Assim, são candidatos naturais para o desenvolvimento de um sistema compósito para entrega de fármacos.

1.2. Objetivos

O presente trabalho visa dar continuidade a estudos anteriormente conduzidos na Universidade de Aveiro sob o tema “compósitos PU/ZnO para aplicações biomédicas” [4]. O referido estudo evidenciou que através da manipulação da razão (polímero/ nanoestruturas de ZnO) na formulação do compósito PU/ZnO se podiam direcionar os compósitos para aplicações diferentes, nomeadamente para aplicações ortopédicas e para aplicações em que se pretende travar a proliferação celular, como por exemplo no tratamento do cancro [4].

Dando continuidade à exploração das potencialidades do compósito PU/ZnO, e tendo em consideração a elevada área superficial das nanoestruturas de ZnO, pretende-se neste trabalho estudar o comportamento de compósitos PU/ZnO enquanto sistemas de libertação controlada de fármacos. Nesse contexto, o presente estudo focará a produção de nanoestruturas de ZnO com diferentes características, a sua utilização como veículos de transporte de um fármaco modelo e o seu desempenho na libertação do mesmo fármaco quer enquanto estrutura isolada quer quando incorporada numa matriz polimérica. Serão usados no presente estudo dois fármacos modelo: um anti-inflamatório - o ibuprofeno, e um antibiótico – a gentamicina.

(23)

1.3. Estrutura da dissertação

A presente dissertação é constituída por cinco capítulos:

-No Capítulo I, denominado “Introdução”, é referida a motivação e os principais objetivos que orientam o presente trabalho bem como a estrutura da respetiva dissertação.

-No Capítulo II, intitulado “Revisão bibliográfica” são referidos os desenvolvimentos mais recentes em sistemas de libertação controlada de fármacos baseados em nanopartículas de ZnO. Descrevem-se ainda as principais propriedades e bioaplicações do ZnO nanoestruturado e do poliuretano, e as características dos fármacos utilizados neste trabalho.

-No Capítulo III denominado “Procedimento Experimental”, inclui-se uma descrição detalhada do procedimento experimental seguido na síntese, preparação e caracterização dos vários materiais (partículas de ZnO e compósitos PU/ZnO), bem como do procedimento usado para o respetivo carregamento com os fármacos modelos e monitorização do perfil de libertação dos mesmos. Descrevem-se ainda as técnicas de caracterização utilizadas no presente trabalho.

-No Capítulo IV, intitulado “Resultados e Discussão” apresentam-se e discutem-se os resultados experimentais obtidos, nomeadamente os resultados referentes à caracterização dos materiais em estudo, ao carregamento dos fármacos e ao perfil de libertação dos mesmos.

-No Capítulo V, o capítulo final, intitulado “Conclusão e Trabalho Futuro”, é feita uma síntese do trabalho realizado e apresentam-se algumas sugestões para estudos futuros.

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(25)
(26)
(27)

2. Revisão Bibliográfica

2.1. Sistemas de libertação de fármacos

Os sistemas de libertação de fármacos existem desde os anos 30, altura em que se desenvolveram. Inicialmente estes foram pensados com o único objetivo de aumentar o nível de fármaco na corrente sanguínea [5, 6].

O objetivo da libertação controlada de fármaco é manter o agente terapêutico no local desejado por um longo período de tempo, aumentando assim a sua eficácia terapêutica, e eliminando ao mesmo tempo a sobredosagem que muitas vezes é necessário usar na administração convencional de fármacos [7]. Assim, os sistemas de libertação controlada de fármacos (SLC) devem permitir eliminar os consecutivos máximos e mínimos observados na administração por vias convencionais (Figura 2a). Esta é uma clara vantagem dos SLC face aos métodos tradicionais pois apresentam maioritariamente um comportamento semelhante ao ilustrado na Figura 2b, ou seja, inicialmente é libertada uma grande quantidade de fármaco seguido de uma diminuição da taxa de libertação até atingir um nível estável que se prolonga durante um tempo mais ou menos longo [7].

Cada fármaco possui a sua faixa de ação terapêutica, que deve situar-se abaixo da faixa considerada tóxica e acima da faixa onde o fármaco não produz qualquer efeito no organismo [5].

Figura 2 – Perfil de concentração de fármaco quando administrado por via convencional a) e quando assegurado por um sistema de libertação controlada de fármacos b). Adaptado de [7].

Um sistema de libertação controlada de fármaco é normalmente composto por uma matriz ou suporte, o transportador, e um fármaco, a substância ativa [8].

(28)

Para aumentar a eficiência terapêutica dos sistemas de libertação de fármacos utilizam-se, normalmente, transportadores que obedecem a alguns requisitos para poderem ser aplicados no organismo, nomeadamente: 1) devem ser não tóxicos, não cancerígenos e não provocar reações indesejadas no organismo como inflamação; 2) no caso em que o transportador é biodegradável, os produtos resultantes da degradação devem ser facilmente expelidos pelo organismo; 3) o transportador deve ser esterilizável 4) e os SLC devem apresentar um perfil de libertação adequado ao efeito pretendido [5, 9].

A utilização de transportadores com reduzidas dimensões em SLC poderá ser vantajosa devido ao facto de permitir o acesso a partes do corpo que a outra escala não seria possível. A utilização de materiais nanométricos permite a entrega de agentes terapêuticos nos núcleos celulares e possibilita a travessia da barreira hematoencefálica e a entrega do agente terapêutico de forma eficiente [10].

O reduzido tamanho das partículas nanométricas, se conjugado com a libertação de fármacos direcionados para alvos específicos, poderá acrescentar vantagens na medida em que a libertação do fármaco nos referidos locais de difícil acesso pode ser desencadeada como resposta a certos estímulos, tais como o pH e a temperatura. O pH extracelular num tumor sólido é normalmente mais ácido (6,5) do que o pH do sangue (7,4) à mesma temperatura, 37°C [11]. Neste sentido, podem usar-se sistemas nanopartículados que sejam sensíveis ao pH para direcionar a entrega de fármacos para locais específicos (Figura 3).

Figura 3 - Esquema ilustrativo da difusão de nanopartículas e micropartículas em tecidos com pH diferentes. Adaptado de [11].

(29)

Podem do mesmo modo ser produzidas nanopartículas que apenas libertem o agente terapêutico em sítios cuja temperatura seja superior a 37ºC [11].

Nos últimos anos, a utilização de nanopartículas na libertação de fármaco em terapias anticancerígenas tem sido um foco de intensa investigação. Assim, têm sido utilizados vários tipos de nanoestruturas como transportadores, designadamente: lipossomas, micelas poliméricas, dendrímeros, colóides, pontos quânticos, entre outros. Seguidamente, na Tabela 1 estão referidos exemplos de nanopartículas utilizadas na libertação controlada de fármaco. A seleção do tipo de material é ditada pelo objetivo terapêutico final desejado e consoante o perfil de segurança do material e via de administração [11].

Tabela 1 – Características de nanopartículas usadas para libertação de fármacos: tipo, dimensão, agente terapêutico e possível aplicação. Adaptado de [11].

Material Tamanho

(nm) Agente terapêutico Indicação

Nanopartículas de

sílica <100

Proteínas, DNA, agentes anticancerígenos Terapia fotodinâmica Terapia do fígado e diabetes Nanopartículas metálicas <50 Agentes anticancerígenos,

proteínas, DNA Terapias anticancerígenas Micelas poliméricas <100 Agentes anticancerígenos, proteínas, DNA Terapias anticancerígenas, tratamento antifúngico Lipossomas 50-100 Agentes anticancerígenos,

proteínas, DNA

Terapias anticancerígenas, HIV

Dendrímeros <10

DNA, agentes terapêuticos anticancerígenos, antibacteriais, antivirais

Terapias anticancerígenas, infeções bacterianas, HIV

Atualmente já estão no mercado farmacêutico vários destes nanomateriais, aprovados pela FDA, e que são uma alternativa à quimioterapia. Na Tabela 2 estão discriminadas algumas dessas nanopartículas e respetivo fármaco.

(30)

Tabela 2 – Nanopartículas atualmente comercializadas para tratamento de cancro. Adaptado de [12].

Produto Tipo de nanomateriaisl Indicação terapêutica

Abraxane Paclitaxel - nanopartículas

de Albumina Cancro da mama e do pulmão

Myocet DOX/lipossoma Cancro da mama

Doxil DOX/lipossoma Cancro do colo do útero, múltiplos melanomas e sarcoma de Kaposi associado ao VIH

DaunoXome DNR/lipossoma Cancro

Resovist Nanopartículas de Ferro Imagiologia de cancro da mama

Os fármacos utilizados no carregamento de nanopartículas são muito diversos: analgésicos, antibióticos, anti-inflamatórios, proteínas, agentes quimioterapéuticos e antipiréticos, entre outros.

A adsorção do fármaco na superfície das nanopartículas é umas das metodologias frequentemente usadas para carregamento do fármaco, sendo por conseguinte uma etapa importante em estudos de libertação. Trata-se de um processo físico-químico em que as moléculas ou os iões presentes numa fase se condensam e concentram à superfície da outra fase. Existem vários fatores que podem condicionar a adsorção do fármaco, nomeadamente as características das partículas como área superficial, tamanho e distribuição de poros. Áreas superficiais elevadas favorecem uma maior adsorção. Dentro de certos limites, quanto maior o tempo de carregamento mais extensa será a adsorção [13].

O fármaco pode ser libertado por interação direta com o ambiente fisiológico: por dessorção do fármaco ligado à superfície do transportador ou, no caso de materiais poliméricos, por difusão através da matriz ou erosão da mesma [11]. Os sistemas de libertação apresentam perfis de libertação muito diversos, ou seja, tempos e quantidades de libertação de fármaco variáveis.

2.2. Óxido de zinco

O óxido de zinco (ZnO) é um óxido metálico semicondutor, do grupo II-IV, utilizado para diversos fins, sendo necessário conhecer as suas propriedades como estrutura cristalina, propriedades óticas, elétricas e magnéticas para compreender muitas das suas aplicações [14].

Este material inorgânico apresenta-se sob a forma de um pó branco praticamente insolúvel em água. Aparece na crosta terreste na forma de um mineral denominado zincite [15].

(31)

Figura 4 – Estrutura cristalina do ZnO: a) Blenda de Zinco; e b) Wurtzite. Em preto estão representados os átomos de oxigénio e a cinza os átomos de zinco. Adaptado de [16]. A blenda de zinco apresenta uma estrutura cúbica. A Wurtzite é a forma cristalina termodinamicamente mais estável do ZnO sob condições normais de pressão e temperatura. Apresenta uma célula unitária hexagonal com parâmetros de rede a=3,25 Å e c=5,12, pertence ao grupo espacial P63mc e classe cristalográfica 6mm. Este tipo de estrutura é composto por duas sub-redes hexagonais compactas, onde as camadas ocupadas pelos átomos de zinco alternam com as camadas ocupadas por átomos de oxigénio em torno do eixo C (Figura 5). A coordenação tetraédrica dos iões Zn2+ e O2- sugere uma estrutura não centro-simétrica, por isso o material apresenta piezoeletricidade. O efeito piezoelétrico consiste na capacidade de converter energia mecânica em energia elétrica e vice-versa, ou seja, o material adquire uma diferença de potencial elétrico sob a ação de um estímulo mecânico externo e, vice-versa, apresenta uma deformação sob a ação de um campo elétrico externo [17]. O ZnO apresenta uma densidade de 5,6 g/cm3 e um ponto de fusão que ronda os 1975ºC [16, 18].

Figura 5 - Estrutura wurtzite do ZnO com ilustrando a coordenação tetraédrica dos iões Zn2+ e O2-. Adaptado de [4].

Oxigénio Zinco

(32)

A produção de ZnO com características nanométricas tem permitido demonstrar a melhoria das propriedades químicas e físicas deste material quando considerado à nanoescala. Nos últimos anos têm sido usados vários métodos para produzir nanopartículas de ZnO como o sol-gel [19], a deposição química em fase de vapor (CVD), a precipitação química [20, 21], sublimação e método de vapor-líquido- sólido (VLS) [22]. No caso do ZnO, o método de precipitação química apresenta vantagens em relação aos restantes métodos pois tem baixo custo devido ao facto da precipitação poder ter lugar a baixas temperatura (temperatura ambiente) e não exigir reagentes caros nem equipamentos sofisticados ou dispendiosos.

Várias são as morfologias de partícula de ZnO que têm sido obtidas através dos métodos anteriormente referidos, como por exemplo nanofitas, nanofios, nanofolhas, nanobastonetes, nanoflores, pontos quânticos, nanotubos, etc. [17]. Algumas destas estruturas estão ilustradas na Figura 6.

Figura 6 - Exemplos de nanopartículas de ZnO com diferentes morfologias: a) nanofitas [17], b) nanofios [17], c) Pontos quânticos [22] e d) nanobastonetes [23] obtidas por diferentes técnicas de síntese designadamente a) sublimação, b) método de vapor-líquido- sólido (VLS), c) hidrólise

química e d) precipitação química.

As nanopartículas de ZnO são atualmente utilizadas na produção de tintas, corantes, produtos farmacêuticos, plásticos, borracha e produtos para eletrónica.

No campo da aplicação médica, encontra-se em fase de estudo o uso de nanopartículas de ZnO no tratamento de leucemia, tumores malignos [15] e sistemas de libertação controlada de fármacos [12].

(33)

2.2.1.

Espécies reativas de oxigénio

Os radicais livres são espécies químicas que possuem um ou mais eletrões desemparelhados. São responsáveis por induzirem o stress oxidativo, ou seja, a perda de homeostasia celular em células vivas [24].

Entre todos os radicais livres produzidos pelo organismo as espécies reativas de oxigénio (ROS) são as mais importantes e podem ser produzidas em grande quantidade durante o stess oxidativo [24]. Por exemplo, o oxigénio resultante do processo de respiração poderá formar ROS. As ROS originam reações de oxidação nos componentes celulares e levam consequentemente à morte celular [12].

O oxigénio molecular é uma espécie pouco reativa. Quando entra no corpo humano pode ser transformado por processos de redução formando espécies muito reativas. Segundo Ramarathnam et al [24], estas reações envolvem 4 eletrões e têm como produto final a água (ver esquema ilustrativo da Figura 7). Desta transformação resultam as espécies reativas de oxigénio como o radical superóxido (O2-), o radical hidroxilo (OH-), o peróxido de hidrogénio (H2O2) e outras espécies reativas [24].

Figura 7 – Esquema da formação de espécies reativas de oxigénio. Retirado de [24]. A formação das ROS pode ser induzida por nanopartículas de ZnO. A formação das ROS está geralmente associada a defeitos cristalinosdas nanopartículas de ZnO e a reações entre espécies de oxigénio adsorvidas na superfície do material e pares eletrão/buraco (e-/h+) [23].

A produção de radicais livres também pode ser provocada por irradiação de UV. A irradiação UV vai provocar o aumento de defeitos cristalinos das nanopartículas de ZnO e

(34)

consequentemente aumentar a produção de ROS [23]. Na Figura 8 está ilustrado o mecanismo de formação de ROS em presença de nanopartículas de ZnO.

Figura 8 – Mecanismo de produção de ROS em presença de ZnO: sob radiação UV são produzidos buracos (h+) na banda de valência e eletrões (e-) na banda de condução, resultando pares e-/h+

que originam espécies reativas de oxigénio. Retirado de [23].

Estudos recentes revelam a existência de citotoxicidade das nanopartículas de ZnO em relação a determinado tipo de células, nomeadamente células cancerígenas. Por exemplo, nanopartículas de ZnO foram utilizadas com um fármaco quimioterapêutico (daunomicina) para destruição de células de leucemia. Os mecanismos de citotoxicidade das nanopartículas de ZnO não estão inteiramente esclarecidos, no entanto, a produção de ROS apresenta-se como umas das principais causas. As ROS formadas devido às nanopartículas de ZnO induziram a destruição da membrana celular contribuindo para a penetração do fármaco aumentando assim a eficiência terapêutica [25]. Os nanobastonetes de ZnO foram utilizados como transportadores de daunorubicina (DNR) para o interior das células através de processos de endocitose, nomeadamente por fagocitose [23]. Na Figura 9 apresenta-se o modelo representativo deste transporte. A morte celular resulta do processo de radiação UV nos nanobastonetes de ZnO que induzem consequentemente a formação de ROS e promovem a destruição da membrana celular por apoptose.

(35)

Figura 9 – Esquema ilustrativo do possível processo de transporte de DNR por nanobastonetes de ZnO para dentro de uma célula, levando à morte celular devido a produção de ROS. Adaptado de

[23].

2.2.2.

Nanopartículas de ZnO para libertação de fármaco

A produção de nanopartículas com o objetivo de serem utilizadas em entrega de fármacos existe há mais de 30 anos e muitas vezes tem tido como finalidade a aplicação em terapias anticancerígenas [26, 27].

A libertação de fármacos a partir de nanopartículas de ZnO é usualmente afetada pelo pH do meio de libertação. Este afeta os mecanismos de libertação do fármaco, tendo este efeito sido estudado em ensaios in vitro com pontos quânticos de ZnO carregados com doxorubicina (DOX) [28]. Na Figura 10a observa-se que não ocorre libertação significativa para pH=7,0 mesmo ao fim de 12h. No entanto, quando se reduz o pH para 6 e para 5 a libertação inicial do fármaco aumenta significativamente, alcançando ao fim de 2 horas o valor de 95% da quantidade de fármaco carregado para o caso de pH=5. O efeito do pH também foi estudado com nanoaglomerados mesoporosos de ZnO carregados com DOX [29]. Observou-se a libertação de 90% da DOX para uma solução tampão com pH=4 (Figura 10b) e a libertação de apenas 65% para uma solução com pH=5 (resultados obtidos ao fim de 33h).

Os nanobastonetes de ZnO carregados com Daunorubicina (DNR) [23] apresentaram resultados idênticos aos anteriores. A libertação da DNR num meio com pH de 7,4 mostrou uma taxa de libertação de apenas 19% (Figura 10c). Contudo, para menores valores de pH a taxa de

(36)

libertação revelou-se mais elevada atingindo ao fim de 36h o valor de 71% para pH=6,0 e 87% para pH=5,0.

Uma outra condição que pode influenciar significativamente a taxa de libertação é a exposição a ultrassons que foi estudada em nanoaglomerados mesoporosos carregados com doxorubicina (DOX) [29]. Neste caso verificou-se uma libertação de 26% sob a ação contínua de ultrassons (durante 30 min) e uma libertação de 42,5% sob ação intermitente (Figura 10d). Estes resultados documentam uma taxa de libertação superior quando comparados com a curva de libertação registada na ausência de ultrassons mostrando a elevada estabilidade do complexo ZnO-DOX. A utilização de ultrassons induz um aumento da libertação por potenciar mecanismos de convecção que criam condições favoráveis à difusão [29].

Figura 10 – Parâmetros que influenciam o perfil de libertação- influência do pH: a) perfil de libertação da Doxorubicina (DOX) em pontos quânticos de ZnO [28]; b) perfil de libertação da DOX em nanoaglomerados mesoporosos de ZnO [29]; c) libertação do DRN em nanobastonetes de ZnO

[23]; e influência da exposição a ultrassons: d) perfil de libertação em nanoaglomerados mesoporosos de ZnO [29].

Em suma, as nanopartículas de ZnO, como veículos para entrega de fármacos, encontram-se associadas à utilização de agentes quimioterapêuticos nas atuais frentes de combate ao cancro. Quanto maior a razão superfície/volume maior a área superficial especifica, o que poderá

(37)

proporcionar uma maior eficiência de carregamento ou seja, uma capacidade de adsorção de maior quantidade de fármaco [23]. Todavia, a eficiência de carregamento também depende da concentração de fármaco na solução utilizada na operação de carregamento. Os perfis de libertação evidenciam uma maior taxa de dessorção do fármaco a pHs mais baixos. Esta característica é desejável no tratamento do cancro uma vez que poderá ser possível estimular especificamente a libertação do fármaco em pH mais baixos. Os transportadores mostram habitualmente uma libertação muito reduzida de fármaco para pH =7,4 (pH do sangue) podendo ser introduzidos no organismo e serem utilizados para libertar o fármaco quando ocorre uma variação de pH nomeadamente pH=6,5 (pH de tumores) [23]. A maior taxa de libertação de fármaco a pHs mais baixos também pode refletir um contributo da maior solubilidade do ZnO a esses pHs o que facilita a libertação [23, 29].

2.3. Poliuretano

Os poliuretanos (PUs) são polímeros que estão presentes no nosso quotidiano devido à sua enorme versatilidade para utilizações em diversas aplicações [30]. Otto Bayer, em 1937, foi o pioneiro na síntese de PU a partir da poli adição de diisocianatos e polióis [31] Nos anos 40 o PU foi introduzido comercialmente e assume hoje em dia uma forte posição no mercado mundial, regitando-se entre 1980 e 2004 um aumento no seu consumo de 2 para 10 milhões de toneladas [32].

Atualmente os PUs podem ser aplicados em diversas áreas nomeadamente, na construção civil (isolamento térmico, elétrico e acústico), na indústria do calçado, do automóvel, nos eletrodomésticos, na indústria aeroespacial, em material desportivo e mais recentemente na área biomédica, não só em instrumentação médica como também em dispositivos biomédicos como válvulas cardíacas artificiais, em enxertos vasculares e adesivos biológicos [32, 33].

2.3.1.

Química dos poliuretanos

Quimicamente, o PU é caracterizado por um grupo uretano (―NH―COO―) que pode aparecer repetido várias vezes ao longo da cadeia. Para além deste, outros grupos podem fazer parte da macromolécula deste polímero, como grupos éster, éter, ureia, amida, entre outros [34].

O PU forma-se por reação de um isocianato com um poliól tal como se ilustra, de forma esquemática, na Figura 11.

(38)

Figura 11 – Ilustração da formação de PU através de reação química entre um poliól (OH-R-OH) e um diisocianato (O=C=R’=C=O). Retirado de [35].

A reação direta entre um poliól e um diisocianato resulta num PU de baixa resistência mecânica. No sentido de melhorar a resistência mecânica do poliuretano utiliza-se um extensor de cadeia. O extensor de cadeia é geralmente uma pequena molécula cujos grupos terminais podem ser hidroxilo ou amina. Neste contexto, o PU pode ser representado por três componentes básicos: poliól (P), diisocianato (D) e extensor de cadeia (C) tal como se indica na seguinte fórmula [34, 36]: n n

P

CD

D

P

(

(

)

)

O diisocianato e o extensor de cadeia irão formar o segmento rígido do polímero e o poliól o segmento flexível.

A. Isocianatos

Os isocianatos são moléculas orgânicas representadas pela seguinte fórmula:

n

O

C

N

R

(

)

em que R corresponde a um radical aromático ou alifático e n à funcionalidade que geralmente é igual a 2 no caso de diisocianatos ou superior no caso de poli-isocianatos [34].

Esta molécula é descrita pelas suas estruturas de ressonância (Figura 12) que são responsáveis pela sua elevada reatividade em relação a compostos como água, aminas, ácidos carboxílicos, amidas, entre outros. A estrutura química do grupo isocianato apresenta uma densidade eletrónica maior no átomo de oxigénio, intermédia no átomo de azoto e menor no átomo de carbono. Assim, o átomo de carbono pode sofrer um ataque nucleofílico de grupos com elevada densidade eletrónica [32].

(39)

Figura 12 – Estruturas moleculares de ressonância do grupo isocianato. Retirado de [32]. A estrutura do isocianato influencia a reatividade do grupo NCO na medida em que grupos que aceitam eletrões, ligados ao grupo NCO, aumentam a sua reatividade e grupos que cedem eletrões diminuem a sua reatividade. Ou seja, os isocianatos alifáticos que não têm o grupo NCO ligado diretamente a um anel aromático são por isso menos reativos do que os isocianatos aromáticos [34].

São exemplos de isocianatos aromáticos o diisocianato de tolueno (TDI) e o 4,4’ – diisocianato de difenilmetano (MDI). Entre os isocianatos alifáticos podem citar-se como exemplos o diisocianato de isoforona (IPDI), o diisocianato de metrametilxilileno (TMXDI) e o difenilmetano-diisocianato Hidrogenado (HMDI) [34].

Os isocianatos reagem com compostos que apresentam na sua constituição átomos de hidrogénio ativos, como é o caso da reação com os álcoois para formar ligações uretano. Apresentam também a capacidade de reagir com aminas formando ureias. A reação com água forma um intermediário que depois se decompõe numa amina e CO2. Por reação com ácidos orgânicos formam uma amida e também libertam CO2. Em determinadas condições de síntese, o grupo isocianato tem a capacidade de reagir com o grupo uretano formando alofanatos e com os grupos ureia formando biuretos [37].

B. Polióis

Os polióis são compostos que contém mais do que dois grupos hidróxilo (OH) [32]. Os polióis formam a parte flexível do PU sendo os mais usados os polióis poliésteres (―R―COO―R’―) e os polióis poliéteres (―R―O―R’) [34].

Os poliéteres obtêm-se através de reação de adição de éteres cíclicos (óxido de etileno, óxido de propileno ou tetrahidrofurano) na presença de um iniciador (etilenoglicol, propilenoglicol, glicerol, entre outros) e de um catalisador, habitualmente uma base forte. No caso dos poliésteres podem ser produzidos a partir da reação de policondensação entre ácidos dicarboxílicos e diois [32, 34].

(40)

C. Extensor de Cadeia

Os extensores de cadeia têm como função melhorar a resistência mecânica do poliuretano. Os extensores de cadeia reagem com o diisocianato formando o segmento rígido do PU. O etilenoglicol, a glicerina e o butanodiol são exemplos de álcoois e a hidrazina, etilenodiamina e a isoforonadiamina são exemplos de diaminas, todos eles usados como extensores de cadeia [34].

2.3.2.

O Poliuretano como biomaterial

Atualmente o poliuretano é um polímero com aplicações no campo médico sendo considerado uma substância GRAS (Generally Recognized as Safe), pela FDA. Apresenta propriedades interessantes como resistência variável à biodegradação e boa compatibilidade celular e sanguínea [38]. Para fins médicos é comercializado como: AbioCor®, Cardiothene®, Chronoflex®, Hemothane®, Mitrathane®, Surethane® e Tecoflex® [34].

Segundo a literatura, o Poliuretano Tecoflex® EG80A degrada-se em PBS com pH= 7,3 a 37ºC. O tempo de envelhecimento (evolução da estrutura molecular do polímero em direção ao equilíbrio termodinâmico, a qual acarreta alterações nas propriedades mecânicas ao longo do tempo) é de 180 dias e durante este período verifica-se diminuição da ductilidade, mantendo-se inalterável a resistência à tração. O Tecoflex® EG60D degrada-se em H2O2 a 25% e a uma temperatura de 100ºC. O tempo de envelhecimento é de apenas um 1 dia e observa-se uma diminuição quer da ductilidade quer da resistência à tração neste período [34].

Os PUs podem ser classificados como não degradáveis, como é o caso dos aplicados em válvulas cardíacas, sacos de sangue, membranas de diálise, próteses, adesivos ósseos e stents e como biodegradáveis como é o caso dos utilizados em scaffolds para engenharia de tecidos, órgãos artificiais, fios de sutura e sistemas de libertação de fármacos [39].

Apesar de muito utilizado, o PU apresenta uma baixa estabilidade térmica e resistência mecânica. Estas propriedades podem ser melhoradas através da modificação química da sua estrutura molecular e/ou por incorporação de materiais orgânicos e inorgânicos na matriz polimérica. Alguns estudos reportaram que a incorporação de partículas nanoestruturadas de ZnO (2% p/p) numa matriz polimérica de PU melhoram significativamente o seu módulo de young e resistência à tração [40].

O PU tem sido bastante utilizado no campo da entrega de fármacos, quer individualmente quer combinado com outros materiais. Fármacos como 5-Flourouracil [41], o cefamandole nafate (CEF) [42, 43], a ceftazidima [44], o acetato de dexametasona (ACT) [45, 46] e fatores de

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crescimento como bFGF [47], rhBMP-2 [48] e PDGF [49] são exemplos de substâncias cuja libertação a partir de sistemas à base de PU já foi estudada. No caso do fármaco cefamandole nafate, o transportador usado foram nanopartículas de albumina [42]. Comparando o perfil de libertação a partir de matrizes de poliuretano carregadas com as nanopartículas com o perfil de libertação a partir das nanopartículas isoladas, concluiu-se que a matriz polimérica atua como uma barreira que retarda a difusão do fármaco e prolonga assim a sua atividade antimicrobiana até aos 8 dias [42].

Os compósitos de PU com nanopartículas de montmorilonite (silicato de alumínio) carregadas com o fármaco acetato dexametasona (ACT) são um outro exemplo da utilização de compósitos de PU em libertação de fármacos [45]. Estudou-se a libertação da ACT em dois sistemas: no PU isolado e nos compósitos de PU com nanopartículas de montmorilonite. Demonstrou-se que a taxa de libertação do fármaco na presença de nanopartículas aumentou devido ao facto destas partículas possuírem uma superfície hidrofílica que favorece a absorção de água e acelera a hidrólise do polímero. Os estudos de biocompatibilidade in vivo em ratos, nos dois sistemas anteriormente referidos, demonstraram uma interação interfacial adequada entre o polímero e os tecidos subcutâneos e uma libertação do fármaco que se prolongou por 14 dias [45].

Quando a degradação do PU influencia a libertação do fármaco, distinguem-se duas vias de degradação: a) hidrólise do polímero de forma uniforme e visível ao longo de toda a matriz e em que a velocidade de difusão do fluido através da matriz é superior à degradação da sua superfície (Figura 13a) e b) degradação superficial do polímero em que a taxa de libertação é proporcional à área superficial das partículas (Figura 13b), ou seja, só a parte externa da matriz é afetada [50]. A degradação em toda a matriz ocorre preferencialmente em polímeros com grande capacidade de absorção de água, como por exemplo os polissacarídeos. A degradação superficial ocorre normalmente em polímeros hidrofóbicos, que não propiciam a entrada de água no seu interior [50].

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Figura 13 – Degradação do PU em sistemas de libertação de fármaco a) por hidrólise do polímero de forma uniforme e visível ao longo de toda a matriz e b) por degradação superficial do polímero.

Retirado de [51].

2.4. Compósito PU/ZnO

Os compósitos são frequentemente constituídos por duas fases: uma fase contínua, denominada matriz, que envolve a denominada fase dispersa. As propriedades dos compósitos são assim determinadas pelas propriedades das fases constituintes, pelas suas proporções e pela morfologia da fase dispersa (forma, tamanho e distribuição) [52].

Para a preparação de compósitos de matriz polimérica com nanopartículas inorgânicas existem fundamentalmente três métodos: 1) Método de solução baseado na evaporação dos solventes resultantes da mistura de uma solução do polímero com uma suspensão das partículas; 2) Método de polimerização in situ em que as partículas inorgânicas são dispersas num monómero apropriado, sendo a polimerização induzida através de calor, radiação ou de um iniciador e 3) Método de estado fundido em que o polímero é fundido e misturado como o material de enchimento (as partículas) e posteriormente homogeneizado e conformado [53].

Os compósitos de PU/ZnO são utilizados como cateteres, em estratégias osteocondutoras e canais de células neuronais. Nos últimos anos, os compósitos de PU/ZnO têm suscitado interesse para aplicações em engenharia de tecidos, mais especificamente no campo neuronal. Estes compósitos podem diminuir a adesão e proliferação de astrócitos, um dos principais fatores que impede a regeneração do sistema nervoso central (SNC). Como qualquer outro componente, o

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sistema nervoso está sujeito a sofrer lesões mais ou menos graves. Contudo, ao nível do SNC as lesões apresentam maior gravidade devido à incapacidade deste sistema de regenerar as lesões nele ocorridas, ao contrário do sistema nervoso periférico que tem a capacidade de se regenerar [54]. Quando a medula espinal (componente da SNC) é lesada, existe a possibilidade de ocorrer morte celular e rutura no axónio (Figura 14a). Esse facto poderá impedir a transmissão dos impulsos elétricos de neurónio para neurónio. Os oligodendrócitos são as células responsáveis por produzirem a bainha de mielina no SNC. Apesar de estimularem a produção dos astrócitos, os oligodendrócitos também produzirem moléculas que inibem o crescimento do axónio. Como consequência, o cérebro deixará de passar informação (de neurónio para neurónio) e irá ocorrer lesão numa determinada parte do organismo, consoante a parte lesada (Figura 14b) [54].

Figura 14 – a) Constituição de um neurónio e b) Lesão do SNC e consequente produção de fatores inibidores da regeneração deste sistema. Retirado de [55].

A substituição de partículas de ZnO por nanopartículas como carga da matriz polimérica induzirá mudanças nas propriedades do compósito PU/ZnO. No entanto essas mudanças estão escassamente documentadas na literatura, desconhecendo-se também as respostas biológicas que daí advenham.A piezoeletricidade do ZnO é um fator que poderá beneficiar as aplicações no campo neuronal, uma vez que a estimulação elétrica promove o desenvolvimento e proliferação

b) a) Te m p o

Referências

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