Protocolos para produção de cogumelo "Shutake" : produção em toras de eucalipto

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PRODUÇÃO

DE

COGUMELO

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PRODUÇÃO

EM

TORAS

DE

EUCALIPTO

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Florianópolis

Santa Catarina - _Brasil

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Protocolos para produção de cogumelo “Shiitake". _{Produção em toras de eucalipto.} - _{Pritsch, L. V.} - ₁₉₉₇

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LINDOMAR

VANDERLEI PRITSCH

PRoTocoLos

PARA

PRODUÇÃO

DE

coGUMELo

"SHIITAKE"

PRODUÇÃO

EM

TORAS

DE EUCALIPTO

Trabalho apresentado à Universidade Federal de Santa Catarina

Como

parte

dos requisitos para a obtenção do

Grau

de Engenheiro

Agrônomo.

Comissão

Examin

ora:

4,//Z

,

JW/

Dr. Paulo Emílio Lovato Dra. _Margarida

_Matos

_{de Men/c¶‹›nça}

__: _Orientador

Supervisora

Eng. Agr.

Admir

José Giachini

¡W€33§

Protocolos para produção de cogumelo "Shiitake". Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L. V.} - _l997

ê~

O

presente trabalho é parte de minhas atividades desenvolvidas

como

estagiário na divisão de

Microbiologia do Solo, do Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Centro de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Santa Catarina, no periodo de 1 a 31 de agosto de 1997, sob a orientação

do

_Prof.

Paulo Emílio Lovato, e supervisão da Prof. Margarida

Matos

de Mendonça. Seu contexto aborda todas as etapas relacionadas ao processo de produção de cogumelos comestíveis da espécie Lentinula edodes, desde a

produção de inóculo e avaliação de sua qualidade até a fase de incubação

em

toras de eucalipto.

As

fases subsequentes até a produção das fiutificações serão desenvolvidas e acompanhadas por mim, na qualidade de

bolsista de iniciação científica, até julho de 1998.

O

trabalho sugere ainda

um

modelo protocolado de produção baseado nas obsen/ações realizadas.

Protocolos para produção de cogumelo “Shiit.'.\ke". _Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L. V.} › ₁₉₉₇

!Í'l fl'Z€!7'I()I`lCI7'l

Siegfredo

Adalberto

Pritsch

Protocolos para produção de cogumelo "Shiitake". _{Produção em} toras de eucalipto. - Pritsch, L. V. - ₁₉₉₇

r

im

nt

À

minha

mãe

pelo apoio e confiança depositados.

À

PhD

Margarida Matos

de

Mendonça,

pelos inúmeros ensinamentos e ai forma

humana

com

que

tem

me

orientado

Ao

Dr. Paulo Emílio Lovato, pela orientação prestada no desenvolvimento deste trabalho e a amizade

manifestada,

Ao

amigo Eng. Agr.

Admir

José Giachini pelo parceirismo e valorosa contribuição no

desenvolvimento deste.

À

Dr,

Vetúria

Lopes

de Oliveira, pela orientação, compreensão e estímulo

em

meus

primeiros passos

no

mundo

científico.

Aos

professores Dr. Alexandre Verzani Nogueira e Mest.

Germano Nunes

Silva Filho pelo apoio.

Ao

corpo docente do Centro de Ciências Agrárias, pelos conhecimentos passados,

sem

os quais não

me

seria possivel a execução deste.

Aos meus

colegas do curso pelo apoio

em

todas as etapas da vida acadêmica.

A

estes

com quem

sempre pude contar

com

0 apoio e auxilio: Analia,

André,

Gabriela, Gilson, Jackeline, João, J osé

Renato

(zeca), Juliano, Luiz,

Mônica,

Mauricio,

Rodrigo

e

Samara

Enfim,

a todos que direta

ou

indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

Protocolos para produção de cogumelo "Shiitake“. Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L. V.} - _l.997

Em

muitos países o cultivo de fungos comestíveis ocupa lugar de destaque, sendo estes vistos

como

importante fonte de alimento de alto valor nutritivo e de baixo custo.

O

cultivo de estirpes da espécie Lentinuía

edodes é o segundo no

mundo

em

Volume de produção sendo este cogumelo muito apreciado por suas qualidades medicinais.

No

Brasil, não existem trabalhos científicos sobre as condições de cultivo dessa espécie.

Algumas

estirpes , entretanto, apresentam adaptabilidade às condições ambientais de algumas regiões brasileiras.

O

estudo do desempenho dessas estirpes

em

determinadas condições regionais específicas,

bem como

a utilização de materiais nelas disponíveis, toma-se essencial para a viabilização da produção comercial.

O

presente trabalho visa à avaliação desse desempenho de duas estirpes de L. edodes (#01 proveniente dos

EUA,

e

#15

japonesa)

em

suas várias etapas de produção, utilizando-se materiais disponiveis

no

estado de Santa Catarina. Inicialmente foi avaliado a taxa de crescimento micelial das duas estirpes in vitro através da medida do

crescimento radial do micélio

em

meio Maite - _{agar a partir de}

um

_{disco de inóculo.}

Em

_{seguida foi avaliado o} crescimento micelial do inoculante

em

substrato composto por serragem (80%), farelo de trigo

(10%)

e milho picado (10%), através da medida de peso seco do substrato e taxa de crescimento a partir do ponto de

inoculação.

A

estirpe #01 apresentou,

em

ambas

as etapas, maior taxa de crescimento.

Os

protocolos de

Protocolos para produção de cogumelo “ShiitaIce". Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L} V ₁₉₉₇

§umá

rig

INTRODUÇÃO

... ..s

MATERIAL

E

MÉTODOS

... .. 12

2. 1

MATRIZ

MIÇELIÃL: ... ,. 12

2.2

PRODUÇÃO DO

INÓCULO PRIMÁRIO

... _. 12 2.3

PRODUÇÃO DO

INOCULÃNIE

... .. 12

2.4

PROCESSO DE [NOCULÃÇÃO

... .. 15

2. 5

INÇUBAÇÃO

OU

CORRIDA

DO

MICÉLIO ... .. 16

RESULTADOS

E DISCUSSÃO

... ..17

3.1

MATRIZ

MICELIÃI ... .. 17

3 .2

PRODUÇÃO

DE INÓCULO PRIMÁRIO

... .. 17

3.3

PRODUÇÃO DO

INOCULÃNTE

... .. 18

3.4

INOCULAÇÃO

... ..2O 3.5

INCUBAÇÃO

... ..2O

CONSIDERAÇÕES

FINAIS

... ..z2

ANEXOS

... ..23

5.1

ANEXO

OI.”

FÓRMULA

COMERCIAL

MEIO

1\/IAIÍIE-AG-AR ... ..23

5.2

ANEXO

02I

PROTOCOLO

PARA PRODUÇÃO

COMERCIAL

DE

COGUMELOS

COMESTÍVFIS

EM

TORAS

... . . 23

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

... ..27

Õ. 1 BIBLIOGRAFIA

CITADA

... ..27

Protocolos para produção de cogumelo "Shiitake". Produção em toras de eucalipto, - _{Pritsch, L. V,} - ₁₉₉₇

À

1.

Introcluçao

O

cultivo de cogumelos comestíveis no Brasil é

uma

atividade de pouca expressão e praticamente inexistente no estado de Santa Catarina.

O

hábito de utilizar fungos na alimentação, introduzido por europeus e

asiáticos,

nem

sempre está associado a

uma

importante fonte nutritiva, e sim

como uma

forma de culinária diferente e sofisticada.

Em

outros países, a cultura

do

cogumelo é considerada

como

importante fonte de alimento de alto

valor nutritivo e dietético, e

como

forma de aproveitamento e valorização de resíduos de origem agro-industrial (Chang, 1984).

Os

vários tipos de cogumelos comestíveis

têm

reconhecido valor econômico no hemisfério norte, e só nos Estados Unidos a cultura movimenta cifras anuais da

ordem

de 700 milhões de dólares.

Em

1991 a

produção mundial de cogumelos foi da

ordem

de 4,27 milhões de toneladas (Miles

&

Chang, 1997).

A

cultura de cogumelos comestíveis no Brasil foi iniciada

em

1.953 por agricultores japoneses,

em

Mogi

das Cnizes SP, sem, contudo, alcançar destaque devido a limitações técnicas e de infra-estrutura (Molena, 1975).

A

produtividade brasileira continua baixa apesar dos avanços alcançados

com

a melhoria de técnicas e instalações nos últimos anos.

Um

dos principais motivos

pode

estar ligado a escolha de espécies fúngicas não

adaptadas a climas tropicais,

como

é o caso de Agaricus bisporus, espécie mais cultivada no Brasil, e cuja produtividade não chega a 'Á _{da produtividade holandesa ou da americana (Fidalgo}

&

_{Guimarães, 1985).}

No

entanto,

em

decorrência da imensa amplitude climática e do grande

número

de resíduos agro- industñais que apresentam potencial

como

substratos para o cultivo, o Brasil apresenta

um

quadro propício à

produção de outras espécies fiíngicas, dentre as quais o Lentinula edodes (Berk.) Pegler, mais conhecido

como

shiitake.

L. edodes é conhecido pelos japoneses há milênios e teve seu cultivo iniciado na China (960 - _1127).

Em

1313, o chinês

Wang

Cheng

descreveu

em

seu “Livro da Agricultura” a técnica de cultura desse fungo, que

foi introduzida no Japão por fazendeiros chineses entre os anos de 1500 a 1600 (Przybylowicz

&

Donoghue,

1990).

O

shiitake ocorre naturalmente

em

florestas quentes e úmidas do leste Asiático.

O

Japão é o principal produtor,

com uma

produção anual de 13.000 t _{(Przybylowicz}

&

Donoghue, 1990; Bononi et al., 1995). Esta espécie ocupa a segunda posição no

mundo

em

volume de produção.

O

preço obtido na maioria das capitais do ocidente varia de

U$

10 a 14 por

kg

do produto fresco. Porém, a forma mais

comum

de comercialização éo cogumelo desidratado, cujo valor no mercado é de cerca de

U$

40 - _{80/Kg (Olivier et al.,1991; Bononi et al.,}

1995).

Na

Europa e nos Estados Unidos, L. edodes representa importante fator de diversificação agrícola (Fair,

1983, citado por

Badham,

1991).

O

consumo

do "shiitake"

tem

aumentado significativamente nos últimos anos obrigando certos países

da Europa e os Estados Unidos a suprir a

demanda

através de importações.

No

Brasil, ha

um

mercado

Protocolos para produção de cogumelo "Shiirake". Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L. V.} - ₁₉₉₇

pela imprensa nos últimos anos.

No

entanto, o cultivo está ainda limitado a pequenos produtores (Bononi et al.,

1995).

A

ampla aceitação desse cogumelo está ligada às suas qualidades organolépticas e às propriedades terapêuticas comprovadas.

Algumas

estirpes de L. edodes

possuem

princípios anti-virais, anti-bacterianos, anti-

fiíngicos e anti-tumorígenos. Possuem, ainda, princípios capazes de reduzir os nives de colesterol no sangue e a pressão sangüínea. Resultados experimentais demonstraram que o sistema imune de animais foi ativado e o

desenvolvimento de tumores reduzido (Flegg, 1984; Royse, 1985; Mori, 1986, Przybylowicz

&

Donoghue,

1990; Jong

&

Birmingham, 1990; Bononi et al., 1995).

O

cultivo deste fungo xilófago pode ser feito de duas maneira.

Em

toras ou

em

substratos

com

diferentes composições, sempre fornecendo celulose e carboidratos.

O

cultivo tradicional é feito sobre toras de

madeiras duras,

em

geral da família Fagaceae, sendo

comum

a inoculação de toras dos gêneros Quercus, Fagus,

Castenea, Carpinus e Catanopopsis. Essa técnica é muito utilizada na Ásia e principalmente no Japão (Przybylowicz

&

.Donoghue, 1990, Raska

&

Matilla-Sandnholm, 1991).

No

Brasil, a produção geralmente é feita

sobre toras _do gênero Eucalyptus, da família Myrtaceae.

A

espécie preferida dos produtores é a E. saligna,

embora não existam relatos cientificos sobre resultados

com

outras espécies ou gêneros.

A

preferência possivelmente se dê pela disponibilidade desta madeira e seu baixo custo quando comparado

com

as espécies

normalmente utilizadas por produtores asiáticos

como

os japoneses. Atualmente

pouco

se conhece sobre o cultivo de L. edodes

em

climas tropicais e sob diferentes espécies vegetais (Raska

&

Matilla-Sandholm, 1991).

A

preparação das toras envolve vários estágios.

A

tora,

uma

vez cortada, deve permanecer na floresta por cerca de 20 a 30 dias para diminuir a umidade e para que substâncias,

como

as fitoalexinas, nocivas ao

desenvolvimento do micélio,

possam

ser reduzidas na madeira.

Após

esse periodo as toras

podem

ser cortadas

nos tamanhos desejados (Przybylowicz

&

Donoghue, 1990; Bononi et al., 1995).

É

importante observar a estação de corte das árvores.

O

período ideal é o outono, quando as reservas nutricionais das plantas

costumam

estar elevadas. Assim, essas reservas que seriam aproveitadas pelas plantas no invemo, poderão fornecer nutrientes para que o micélio colonize a madeira, permitindo que ocorra, posteriormente,

uma

maior e melhor frutificação (Przybylowicz

&

Donoghue, 1990).

As

toras a ser inoculadas

devem

estar limpas, livres de liquens e galhos protuberantes.

A

superficie da

casca deve estar seca e

sem

ferimentos.

O

conteúdo de umidade deve estar preferencialmente entre 35 -

55%

(Przybylowicz

&

Donoghue, 1990).

Um

dos principais pontos de estrangulamento nessa técnica de produção refere-se a qualidade do

inoculante (Przybylowicz

&

Donoghue, 1990,

Royse

&

Bahler, 1986; Miller

&

Jong, 1978, citados por

Raska

&

Matilla-Sandnholm, 1991). Vários problemas

podem

afetar a fase de produção deste.

Um

desses está relacionado

com

a forma de conservação da matriz. Esta normalmente e' mantida _{in vitro}

em

meio de cultura que

pode apresentar diferentes formulações. Durante a multiplicação dessa matriz, ocorre

uma

rápida divisão celular

que pode ocasionar mutações. Essas mutações resultam

em

adaptações aos nutrientes e seus níveis nos meios de

cultura, o que conduz a rápida colonização do meio. Entretanto este inóculo ao ser submetido as condições de

colonização das toras pode não ser tão eficiente

bem como

pode apresentar modificações morfológicas a nível

de frutificação (Przybylowicz

&

Donoghue, 1990).

Protocolos para produção de cogumelo "ShiiLalce". Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L. V.} - ₁₉₉₇

É

portanto importante o estabelecimento de condições de

armazenagem

adequadas dessa matriz, assim

como

o

acompanhamento

do crescimento dessas culturas para a detecção de mutações.

Outro fator que pode afetar a qualidade do inoculante ainda na fase in vitro está ligado a degeneração da estirpe pela presença de virus

ou

sucessivas repicagens.

Também

a

armazenagem

inadequada da matriz miceliana pode degenerar o vigor de

uma

cepa. Já na fase de multiplicação

em

substratos, a presença de

contaminantes

ou

o armazenamento inadequado

ou

por longos períodos

podem

causar consideráveis prejuizos nas fases subsequentes (Przybylowicz

&

Donoghue, 1990; Bononi el al., 1995).

O

inoculante para uso no processo de inoculação

em

toras pode ser produzido

em

diversas formulações, de acordo

com

as condições de cultivo, disponibilidade de material, e custo de produção.

Em

geral,

é constituído por serragem suplementada

com

grãos e farelo de cereais, ou blocos de madeira colonizados (Przybylowicz

&

Donoghue, 1990; Bononi et al., 1995).

.Pesquisas

têm

sido desenvolvidas no sentido de se definirem as condições ideais de desenvolvimento micelial de L. edodes.

Na

fase de produção deinoculante,

em

1985, Olaf avaliou diferentes estirpes e verificou

que as condições ideais foram:

pH

entre 4,1 e 5,5 e umidade relativa do ar

em

torno de 65 a

68%,

com

temperatura variando de 25 a 28°C.

Com

relação às exigências nutricionais, as condições adequadas ao

crescimento micelial são alcançadas adicionando-se, a serragem, suplementos que otimizem o nível de nutrientes. Estes suplementos

podem

ser desde resíduos de grãos de cereais, até sais minerais,

como

carbonato de cálcio e sulfato de cálcio, e sua adição depende do tipo de substrato empregado.

O

objetivo dessa suplementação é propiciar

um

teor de carboidratos facilmente hidrolizáveis e

um

teor de nitrogênio de cerca de

0,5%

na mistura

(Campbell

&

Slee, 1986; Przybylowicz

&

Donoghue, 1990).

Inóculos produzidos

em

substratos contendo altos teores de suplementação apresentam crescimento mais acelerado e conseqüente redução do

tempo

do processo produtivo, contudo,

têm

um

custo mais elevado e

maior suscetibilidade a contaminantes (Przybylowicz

&

Donoghue, 1990).

A

inoculação dos troncos é feita mediante perfuração das toras e introdução do inoculante.

Comumente,

os furos são efetuados,

com

o auxílio de furadeira elétrica, distribuidos de forma helicoidal, na

densidade de 2 orificios a cada 10 cmi,

com

profundidade e espessura variando de acordo

com

o modelo do

inoculador.

Em

climas mais quentes

em

que a pressão de inoculação é alta, mais orificios

devem

ser efetuados de

forma a conseguir colonização mais rápida.

Os

orificios são preenchidos

com

a matriz (inoculante) e recobertos

com

parafina fundida

_(80%)

e breu (20%).

A

vedação é essencial para evitar o ataque de pragas e contaminantes, além de manter a umidade do inoculante.

No

Brasil, é

comum

o ataque de formigas ao

inoculante, fato que reforça a necessidade de vedação (Bononi et al., 1995).

No

processo de perfuração é interessante que sejam observados alguns detalhes.

A

furadeira deve ter

rotação alta, superior a 6.000rpm, de forma a diminuir rebarbas e aumentar a velocidade do processo.

A

parafina

deve ser liqüefeita a temperatura de aproximadamente 127°C, ponto

em

que proporciona

uma

vedação

transparente e não permite a redução da umidade do inoculante, o que pode inviabilizar o micélio.

Caso

a

vedação seja aplicada a temperaturas muito baixas, será formada

uma

película opaca e quebradiça, que a curto prazo se destacará da tora.

A

assepsia durante o processo todo deve ser rigorosamente aplicada sob risco da

Protocolos para produção de cogumelo "Shiitake". Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L. V.} - ₁₉₉₇

Após

a etapa de inoculação inicia-se o periodo de incubação das toras, quando ocorre a corrida do

micélio de L. edodes e a colonização da tora. Nesta fase,

um

manejo cuidadoso é essencial para evitar problemas

com

contaminantes (Nutalaya e Pataragetvit, 1981 ; Shinkoosha, 1981, citados por Przybylowicz

&

Donoghue,

1990).

O

controle da umidade, luminosidade e circulação do ar é essencial para favorecer o crescimento micelial

do shiitake

em

detrimento aos contaminantes.

A

incubação

pode

se dar

em

ambiente aberto ou

em

estruturas especialmente constmídas para o controle dos fatores mencionados.

As

condições ambientais e a quantidade de

toras a ser processadas determinam a área a ser utilizada e a necessidade

ou

não de estruturas especiais.

O

arranjo dos troncos para a incubação

pode

obedecer a diferentes formas, sendo a mais

comum em

forma de

fogueira (Przybylowicz

&

Donoghue, 1990; Bononi et al., 1995).

Uma

perda de

10%

dos troncos por contaminações é considerada economicamente viável.

As

toras que

apresentarem contaminação

devem

ser eliminadas ou isoladas dos demais (Bononi et al., 1995).

A

incubação dura

em

media 12 a 18 meses, quando a etapa seguinte deve ocorrer. Para que ocorra a

formação dos carpóforos (frutificações) é necessário

uma

redução na temperatura ambiental (12-20°C).

Em

função disto, nos paises de clima temperado a produção ocorre no outono e na primavera.

No

Brasil a produção

está restrita ao final do outono até o

começo

da primavera (Bononi et al., 1995).

O

pico da produção se dá nos 2° _e 3° _{anos de colheita, sendo que o ciclo total pode durar até 7 anos.} Colhe-se

em

média

20%

do peso inicial da madeira

em

cogumelos.

Os

cogumelos

devem

ser colhidos após 4

ou

5 dias do aparecimento dos botões (Bononi et al., 1995).

Em

conseqüência da ampla distribuição natural do shiitake, muitas linhagens

têm

sido descritas e identificadas

com

características especificas e adaptadas às regiões onde ocorrem (Campbell

&

Slee, 1986).

Algumas

linhagens estão sendo melhoradas geneticamente objetivando

uma

maior produtividade, maior

tolerância a contaminantes, a diferentes temperaturas, e redução do ciclo de frutificação (Stamets, 1993; Bononi et al., 1995).

O

Estado de Santa Catarina, pela própria característica essencialmente agrícola, apresenta disponibilidade de vários substratos que

podem

ser aproveitados para a produção comercial de cogumelos.

Uma

importante fonte de matéria prima é a serragem, que constitui

8%

de todo material processado pelas indústrias madeireiras. Existem cerca de 4.000 dessas indústrias no Estado,

com

processamento anual de aproximadamente 800.000

m3

de toras.

Além

disso, o estado apresenta condições ótimas para o cultivo de espécies silvícolas

passíveis de ser utilizadas na produção de L. edodes assim

como

condições climáticas,

em

determinadas regiões,

próximas às ideais.

O

presente trabalho visa o desenvolvimento de protocolos para produção do cogumelo comestível, L. edodes, nas condições ambientais de Florianópolis,

bem como

o desenvolvimento e a avaliação da qualidade do

inoculante deste fungo.

Protocolos para produção de cogumelo "Shiit21l‹e". Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L. V,} - ₁₉₉₇

1 I

2.

Material

e

Metodos

O

material e métodos apresentados referem-se a inoculação de 100 toras.

Todo

o desenvolvimento do

processo de produção pode ser visualizado no organograma apresentado na Figura 01.

2.1

MATR|z

M|cELiAL:

Utilizaram-se duas estirpes de Lentínula edodes (estirpes #01 americana e #15 proveniente do Japão), selecionadas por suas carateristicas de fmtificação

em

altas temperaturas (i25°C).

Duas

culturas de cada estirpe

em

meio Malte-Agarl foram preparadas e inoculadas

em

condições assépticas de câmara de

fluxo

laminar, e incubadas

em

estufas

BOD

durante 10 dias a 25°C i-2.

Após

este período,

um

tubo de cada cultura foi devolvido a micoteca para manutenção da matriz, e outro foi repicado para produção do inóculo primário.

2.2

PRoDuçÃo

oo

INÓcuLo

PR|wiÁR|o

Foram

preparadas 3 placas de Petri contendo meio Malte-Agar e inoculadas

com

o micélio de cada

estirpe.

Após

novo período de 10 dias de incubação, estas culturas foram repicadas para 16 placas para cada

estirpe,

com

o

mesmo

meio. Incubou-se durante 10 dias

em

câmara

BOD

a 25°C (i2), e a taxa de crescimento micelial in vitro foi avaliada, medindo-se o crescimento radial do micélio, a partir do ponto de inoculação (disco

com

ø

= 9mm),

de 10 placas para cada estirpe.

A

avaliação foi efetuada a cada dois dias, por

um

período de 10

dias a partir da data de inoculação.

2.3

PRODUÇÃO

DO

ÍNOCULANTE

O

cálculo da quantidade de inoculante a ser produzido baseou-se na estimativa de que 12,5 litros de

inóculo são suficientes para inocular 100 toras (Stamets, 1993).

Além

das 100 toras a ser inoculadas tínhamos

necessidade de mais 12 litros para avaliações do crescimento periódico (a cada 8 dias). Considerando-se

uma

perda de

20%,

chegou-se a necessidade de 30 litros de substrato que foi preparado segundo a seguinte composição:

80%

Serragem

10%

Farelo de trigo

O

10 Ai milho picado.

O

substrato foi distribuído

em

frascos de 1 litro contendo 800 ml de substrato, e foram esterilizados

em

autoclave a 121°C por dois períodos de 60 minutos,

com

um

intervalo de 24 horas entre cada esterilização.

1

Protocolos para produção de cogumelo “Shiitake", _{Produção em} toras de eucalipto, - _{Pritsch, L. V.} - ₁₉₉₇

A

inoculação do substrato foi realizada

em

câmara de

fluxo

laminar a partir do inóculo primário.

Em

cada frasco foram inoculados três porções de meio Malte-Agar

tomado

pelo micélio, retiradas da placa de acordo

com

0

esquema

apresentado na Figura 02.

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Figura

01

:Organograma de

Material

e

Métodos.

Protocolos para produção de cogumelo "Shiitakc". Produção cm toras de eucalipto. - _{Prilsch, l.. V.} - ₁₉₉₇

Figura

02:

Representação

do

sistema de

seleção

das

porções

de

micélio

a

ser

utilizados

na

produção do

inoculante.

A

massa micelial produzida no substrato selecionado para produção de inoculante foi determinada

através de avaliações do peso seco, e de medidas lineares do crescimento do micélio desde o ponto de

inoculação até à base do substrato.

Uma

amostra de

10%

do peso seco do substrato foi retirada a cada 8 dias, dividido

em

parcelas de 5 _g

de peso úmido, seca

em

estufa, e seu peso seco determinado.

Para avaliação da taxa de crescimento micelial, foi medida, visualmente

(em

cm), o percurso do

substrato pelo micélio a partir da parte superior

do

frasco (ponto de deposição do inóculo). Esta medida foi

iniciada ao l9° dia de incubação, repetindo-se a partir de então a cada 5 dias.

A

tomada do

substrato pelo micélio ocorreu sob condições ambientais controladas

em

câmara de

crescimento climatizada.

2.4

PROCESSO

DE

|NOCULAÇÃO

As

toras utilizadas foram provenientes do municipio de Antônio Carlos, estado de Santa Catarina, da

espécie Eucalyptus saligna,

com

um

diâmetro variando entre 8 a 15

cm

e comprimento médio de l m.

A

umidade inicial estava entre 45 e

50%.

Foi efetuado

uma

seleção eliminando toras que apresentavam

danificações na casca, rachaduras ou outros ferimentos que expusessem seu albume. Procedeu-se

também

uma

limpeza para eliminação de sujeiras e liquens.

Foi preparada

uma

tora referência não inoculada para cada 50 toras inoculadas.

As

toras referência serviram para monitoramento da umidade relativa que requer a manutenção entre 35 e 55%.

As

toras foram perfiiradas

com

o uso de

uma

fiiradeira, sendo os orificios distanciados

aproximadamente 5

cm

entre si.

O

diâmetro dos orificios foi de

12mm,

com uma

profundidade de

20mm.

Este

dimensionamento objetivou a compatibilidade

com

o inoculador usado. Regiões da tora

em

que ocorriam nós

tiveram a densidade de fiiros aumentada, fato que se repetiu nas bordas ou perto de pequenos ferimentos no

córtex.

Para 0 processo de inoculação, utilizou-se

um

inoculador comercial.

O

inoculante foi retirado dos

frascos e depositado

em um

recipiente desinfetado

com

álcool onde foi homogeneizado e compactado.

O

15

Protocolos para produção de cogumelo "Shiilul‹c". Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, I.. V.} - _I997

inoculador foi abastecido (após desinfecção) socando-se este sobre o inoculante compactado, para então depositar no interior dos orificios das toras.

Na

sequência o inóculo foi compactado e nivelado na tora.

Para vedar os pontos de inoculação, utilizou-se

uma

mistura contendo

80%

de parafina e

20%

de breu.

Os

dois ingredientes foram aquecidos a l27°C, homogeneizados e aplicados sobre os pontos de inoculação

com

o auxílio de

um

pincel. '

2.5

ÍNCUBAÇÃO

OU

CORRIDA

DO

MICÉLIO

A

incubação das toras deu-se

em

casa de vegetação climatizada,

com

temperatura mantida

aproximadamente a 25°C (i5).

As

toras foram distribuidas

em

pilhas (fogueira) sob

uma

armação de ferro que

sustentava

um

malha de sombrite.

A

umidade relativa do ar e a temperatura foram monitoradas diariamente

com

termohigrógrafo e a umidade relativa das toras detemiinadas a partir das toras referência pesadas a cada semana.

As

pilhas das toras foram irrigadas sempre que a umidade das toras apresentava baixas de 2 a

3%.

A

umidade relativa do ar foi elevada

com

o auxílio de

um

umidificador sempre que

Pmtoeolos para produção dc cogumelo "Shiilakc". Produção cm toras de eucalipto. - _{Pritsch, l.. V.} ~ _I997

I

É

3.

Resultados

e

Discussao

3.1

MATRIZ

MICELIAL

Os

quatro tubos repicados apresentaram crescimento satisfatório

sem

mutação morfológica aparente.

Um

tubo de cada estirpe retomou à micoteca para manutenção das mesmas.

3.2

PRoouçÃo

DE Inócuto

PR||viÁR|o

As

curvas de crescimento micelial in vitro das duas estirpes (#01 e #15) estão apresentadas na Figura 03.

390

.,.a-,a....-_.c___...f._¬....,_..--.-....t.W..._.__.

W

7,09. . -;..- ....

M.

... -.«_.~.___-. crescimontoridialmm ._-1 19 .W 3- sl'

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8

'8

8

8

'8

iam

_ins

--Log.

(#01)

~--Leg.

(#15) ,._._.___._.._.._.__ 0¡00 2. _

A

_{9. a} 1o Tefrlpio, dias

Figura

03:

Taxa de

crescimento

radial

do

micélio

(em cm)

in

vitro,

de duas

estirpes

de

L.

edodes

(#01

e

#15)

em

meio

MaIteIAgar,

a

25°C.

O

crescimento radial da estirpe #01 foi superior ao da estirpe #15 a partir do sexto dia de avaliação

(com

diferença estatística significativas segundo

ANOVA

a

95%

de inferência).

No

oitavo dia as placas

contendo a estirpe #01 foram acondicionadas

em

geladeira (i4°C) para sustar o crescimento,

uma

vez que a

melhor fase para transferência foi atingida.

A

utilização de placas onde o meio esteja totalmente

tomado

pelo micélio, pode facilitar a inclusão de contaminantes nas fases subsequentes (Stamets, l993).

A

medida de crescimento radial é

um bom

indicativo para avaliar o crescimento do micélio, entretantoé interessante associa-la a outras fonnas de avaliação.

A

possibilidade de erro reside no fato de que esta avalia

somente

um

sentido de crescimento

do

micélio, não tendo inferência sobre produção de massa

em

profundidade, por exemplo.

Protocolos para produçao de cogumelo "Shiilakc"i Produção em toras dc eucalipto. - _{Pritsch, I.. V.} - ₁₉₉₇

3.3

PRoouçÃo

Do

INocuLAN'rE

A

análise

do

peso seco

do

inoculante nos permite inferir comparativamente qual das duas estirpes apresentou crescimento mais acentuado, e

como

este crescimento se comportou ao longo de detenninado periodo.

A

afirmativa se baseia no fato de ser o fungo tratado

um

organismo não autotrófico, portanto, somente

irá transformar o material contido no fi'asco, não incorporando massa ao

mesmo.

Sabe-se que o L. edodes ao

degradar os componentes

do

substrato, libera COz, o que ocasiona

uma

redução gradativa no peso seco do

inoculante. Esta diferença foi avaliada. Tal

método

de inferência foi proposto por Miles

&

Chang

(1997) ao

descrever métodos de análise para determinar o crescimento de fungos.

A

variação do peso seco entre o 8° _{e o} 40° dias apresentou-se conforme a Figura 04.

Verificou-se

uma

linha de tendência negativa para o peso seco do substrato colonizado pelas duas

estirpes de I,. edodes.

Os

dados foram submetidos a

uma

_análise de _{variância a}

95%

de _{inferência, apresentando}

diferenças estatisticamente significativas entre as duas estirpes, a partir do 24° dia. Observa-se

também

que,

embora não linear, o peso seco da testemunha apresentou-se superior

em

todas as avaliações, ocorrendo

um

aumento gradativo nas diferenças a medida que aumentava o período de colonização.

Outro fator a ser observado é

um

pequeno aumento

do

peso seco a partir

do

32° dia para as amostras colonizadas, e do 16° dia para a testemunha. Este aumento pode estar relacionado

com

a perda gradual de umidade sofrida pelo substrato.

Como

a amostragem era feita

com

peso úmido, a medida que esta umidade

diminuia¬ aumentava o peso seco amostrado. Este incremento de massa na amostragem perrnaneceu imperceptivel nas amostras colonizadas até

uma

sensível diminuição no crescimento micelial, enquanto que na

testemunha foi detectado de imediato.

2,30 '~~-~----~-f-~----›~¬'---~¬-¬f~ ---~~ ~~ _3,00

í#01

-#15

-&-Testenunha

_

--Log.

(#01)

ítog.

(#15) _ 19,50

_

W

Í

í

aos

_ . . . . ,~o,oo QG' 4.5' '33 4° _ .. Peso soco medio em

9

Q) N

N

ij' g

É

É

bl

.- ' _»

8

8

Peso :ooo medio em gramas datestemunha - _2,00 _1 .Sil

Figura

04:

Peso

seco

médio,

em

gramas,

do

substrato

(80%

serragem;

10%

farelo

de

trigo

e

10%

milho

picado),

a

partir

de amostras de

5

_{g de peso}

fresco,

sendo

duas

análises

com

substrato

colonizados por

duas

ostirpes

de

L

edodes

(#01

e

#15),

mais

uma

testemunha

não

inoculada.

Protocolos para produção de cogumelo "Shiilakc". Produção em toras de eucalipto, - _{Pritsch. I.. V.} - ₁₉₉₇

Com

relação a análise visual

do

crescimento das hifas, esta não constitui parâmetro seguro para afinnar que

uma

estirpe tem crescimento superior na fase de produção de inóculo à. outra,

uma

vez que não leva

em

conta a consistência da massa micelial. Contudo, toma-se interessante ferramenta para destacar a agressividade

com

que

uma

estirpe coloniza o substrato. Aliada

com

outros métodos de avaliação, constitui-se importante fator de caracterização de determinada estirpe (Miles

&

Chang, 1997).

As

avaliações ilustradas na Figura 05, sugerem

um

melhor desempenho para a estirpe #01, que

apresentou crescimento superior

em

todas as avaliações,

com

diferenças significativas segundo análise de

variância a 95

%

de inferência.

Protocolos para produção dc cogumelo "Shiit:il‹c". _Produção em toras de eucalipto. - _Pritsch, l.. V. - 1997 Taxa de crescimento, cm t‹à~fif»:;.‹'# ;~f› '«‹› 6*

'I

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-#01

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15 ..` "

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_(#01)

I

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--Log.(#15)

_- ¬'e"__'_1s 1e

23

za

_

__`.-`-_;

_magweaaa

_{_}

Figura

05:

Taxa média de

crescimento

micellal

em

frascos

(substrato:

80%

serragem;

10%

farelo

de

trigo

e

10%

milho

picado)

de

duas

estirpes

de

L.

edodes

(#01

e

#15)

a

¬:25°C.

3.4

ÍNOCULAÇÃO

Foram

inoculadas 50 toras, gastando-se

em

média 50 minutos para executar todo o processo de

inoculação

em

cada tora.

O

tempo gasto está

bem

acima do que se recomenda para

uma

produção comercial. Nesta condição,

uma

pessoa deve ser capaz de inocular 80 toras

em

4h.

A

morosidade

do

processo

em

nosso

experimento foi resultante da falta de pratica por parte dos executores.

Foram

realizados

em

média 98 firros por tora, e eram inoculadas

em

média 2,6 toras

com

cada frasco de

inoculante (800ml).

A

vedação das toras foi executada

sem

problemas, e apresentou-se muito eficiente na etapa

de incubação.

3.5

INcuBAçÃo

Durante a incubação foram registrados longos periodos

com

temperaturas acima das requeridas pelo

fungo (25°C) nesta etapa, chegando-se a registrar picos na faixa de 37°C.

_Também

a umidade manteve-se acima de

70%

por longos períodos, exigindo cuidados no sentido de se aumentar a ventilação.

A

umidade das toras,

entretanto, apresentou queda gradativa, obrigando a realização de regas aproximadamente a cada 3 dias. Estas

eram realizadas por

um

período de aproximadamente 6 h.

As

condições ambientais inadequadas foram principalmente ocasionadas pela falta de exaustão do ar na

casa de vegetação, sendo que o sistema de controle de temperatura apresentou-se ineficiente, desta forma, favorecendo a ocorrência de contaminações generalizadas

em

todas as toras.

Protocolos para produção de oogumelo "ShiiIakc". Produção em toras de cucaliplo. - Pritsch, I.. V. - I997

O

experimento ainda encontra-se

em

andamento e está sendo conduzido por

mim

na qualidade de

bolsista de iniciação científica, devendo os resultados finais serem publicados no VI] Seminário de Iniciação Científica, da

UFSC,

em

1998.

Pmtncolos para produção de cogumelo "Shiimkc". Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, lr. V.} - ₁₉₉₇

4.

Considerações

Finais

Com

base nas observaçoes realizadas durante o desenvolvimento do presente trabalho, pode-se apontar alguns tópicos de destaque:

I.O conhecimento das características biológicas,

bem como

de fatores ambientais que interferem no

desenvolvimento de determinada espécie füngica que se deseje cultivar, é essencial para o desenvolvimento de

um

protocolo eficiente que possibilite

um

escalonamento mais seguro

em

uma

produção comercial.

2.As técnicas de medida utilizadas no presente trabalho (medida de crescimento radial

em

placas, taxa

de crescimento micelial e peso seco do substrato) constituem ferramentas confiáveis para determinação de

características de crescimento de determinada espécie fúngica na produção de inóculo.

3.Em

todas as inferências métricas feitas nos dois estágios de produção de inoculo, a estirpe #01 apresentou desenvolvimento mais acelerado

em

relação a estirpe #15.

4.0 processo de inoculação

em

toras,

embora

aparentemente pouco complexo, exige dominio de

uma

série de conceitos de microbiologia e de técnicas relacionadas ao manejo das toras após inoculação, para que

resultados economicamente viáveis sejam obtidos.

5.Há necessidade de maiores estudos no sentido de aprimoramento das técnicas de produção

disponiveis para nossas condições ambientais, de maneira que se aperfeiçoe o protocolo desenvolvido neste trabalho,

bem como

o desenvolvimento de novos estudos relacionando diferentes condições.

Protocolos para produção dc cogumelo "Shiitakc". _{Produção em} toras dc eucalipto. - _Pritsch, I.. V. - ₁₉₉₇

5.

Anexos

5.1

ÀNEXO

01!

FÓRMULA

COMERCIAL MEIO

MALTE-ÀGAR

Estrato de Maite]

2%

Ágar

Bacteriológico

1,5%

Água

destilada

_6,5%

'lixtrato aquoso de cevada maltada.

5.2

ANExo

02:

PRoTocoLo PARA

PRoouçÃo

Cou|ERc|A|.

DE

Cocumetos

Comssrivsls

Em

ToRAs.

O

presente protocolo contempla todas as fases envolvidas no processo de produção, desde o

desenvolvimento do inoculante até a inoculação e incubação

em

toras.

Esta dimensionado para a inoculação de 100 toras e considera resultados experimentais a nível de

laboratório.

É

importante frisar que não se trata de

um

mecanismo estanque, sendo portanto sujeito a alterações

em

fimção

do nivel técnico

com

que for aplicado, e as variações ambientais do local de execução.

Longe

de ser

documento taxativo, constitui-se

um

roteiro sugestão para

um

processo produtivo.

As

etapas descritas não são subsequentes, devendo o executor promover seu próprio cronograma de execução de acordo

com

as condições de que dispõe.

Segue-se então o protocolo dividido

em

4 etapas:

1 -

Matriz:

Três tubos de ensaio contendo meio Malte/Agar colonizados pelo micélio da estirpe desejada (#01 ou #15).

2

-

_Cultura

_in

_vitro;

2.l - _{Multiplicação da cultura mãe:}

2.1 .l - 3 placas de Petn` contendo 25ml de meio Malte/Agar. 2.1.2 - _Esterilizar

em

_{autoclave por 2lmin. a l2l°C.}

2.1.3 - _{Inoculação asséptica}

em

_{câmara de}

_fluxo

_{laminar a partir da cultura}

mãe

_{(fragmento de meio} colonizado a ser depositado no centro da placa).

2.1.4 - _Incubação

em

BOD

_{a :t} 25°C _{por 10 dias.}

Protocolos para produção dc cogumelo "Shiitakc". _{Produção em} toras dc eucalipto. - _Pritsch, l.. V. - ₁₉₉₇

2.2 Produção do inóculo primário in vitro:

2.2.1 - _{27 placas de Petri contendo 25 ml de meio}

_M/A.

2.2.2 - _Esterilizar

em

_{autoclave por 21min,. a 12l°C.}

2.2.3 - _{Inoculação asséptica}

em

_{câmara de}

_fluxo

_{laminar a partir das culturas obtidas pelo}

procedimento do item 2.1 (discos colonizados

com i

9mm

de

ø

depositados no centro da

placa).

2.2.4 - _Incubação

em

BOD

_a J; 25°C por _{10 dias.}

3

-

_{Produção do}

_Inoculantez

3.1 - _Substrato:

3.1.1 - _{30 litros de substrato segundo a seguinte composição;}

24 litros de serragem intemperizadaz,

3 litros de farelo de trigo

3 litros de milho picado. 3.1.2 - _{Pesar o substrato (peso seco)}

3.1.3 - _{Manter o substrato imerso}

em

_{água por 24 h para hidratação.}

3.1.4 - _{Escorrer o excesso de água por 12 h.}

3.1.5 - _{Pesar o substrato novamente (peso úmido).}

3.1.6 - _{Calcular a diferença de peso verificada entre o item 3.1.2 e o item 3.1.5.}

A

_diferença

deve alcançar 8,78kg,

(65%

de umidade relativa).

Caso

isso não tenha ocorrido, acrescentar a diferença do esperado

com

o obtido

em

litros de água e homogeneizar bem.

3.2 - _{Distribuir o substrato}

_em

_{27 frascos de vidro (1 litro)}

_com

_{tampa rosqueável e dispositivo}

para trocas gasosas (500ml/frasco).

3.3 - _{Esterilizar os frascos contendo o substrato,}

_em

_{autoclave a l2l°C por dois periodos de 60}

minutos

com

um

intervalo de 24 horas entre ambos.

3.4 - _{lnocular os frascos}

com

_{o micélio produzido segundo item 2.2, obedecendo a seguinte} metodologia:

3.4.1 -

Com

_{o material asséptico}

em

_{câmara de}

_fluxo

_{laminar, traçar,}

com

_{o auxilio de}

um

bisturi,

um

triângulo equilátero no centro das placas colonizadas, contendo aproximadamente 4

cm

de arestas.

Tomar

cuidado para não atingir a borda das placasi.

A

uma

distância de aproximadamente 1,5

cm

dos vértices da base, traçar, a panir da aresta da

base duas linhas perpendiculares ligando esta aos lados, e

uma

terceira paralela à mesma, a

1,5cm do vértice oposto, de

modo

a fomiar três novos triângulos equiláteros.

3.4.2 - _{Retirar os pequenos triângulos formados e inoculá-los nos frascos (3 por frasco).}

}

Scrmgcnt inlempcrizada: Manter pilhas de sermgem por pelo menos 6 mcscs cm campo aborto para desnaluração de substâncias

que impedem o crescimento do fungo.

`

A

placa deve ter somente 70% de sua superficic colonizada, de maneira que sobre tun halo na parte cxtcma do meio, região mais

propcnsa a contaminação.

Protocolos para produção de cogumelo "Sl1iital‹c". _Produção em toras de eucalipto. - _{Pritsch, L. V.} - ₁₉₉₇

3.4.3 -

_Após

_{inoculado, fechar o frasco e promover pequena agitação}

_do

_mesmo

_de

maneira que o inóculo depositado seja encoberto pelo substrato.

3.5 -

Após

_{inoculados, acondicioná-los}

em

_{câmara de crescimento climatizada}

_(fl5°C)

_{por 45 dias} para

tomada

do substrato pelo micélio.

4

-

_lnoculação

_e

_Incubação:

4.1-S

4.2-P

eleção das árvores a ser cortadas:

4. l _] -

Uma

espécie de madeira dura

com

diâmetro variando _{entre 8 a} 15

cm

.

4.1.2 - _{Cortar as arvores preferencialmente no outono, deixado-as no local por 1 ou 2} meses.

reparação das toras:

4.2.1 - _{Cortar os troncos a distância de}

1 a 1,20

m

cada.

4.2.2 - _promover

uma

_{limpeza das toras eliminando líquens, galhos protuberantes e}

sujeiras.

4.2.3 - _{Agrupar toras de igual diâmetro.}

4.3 - _{Inoculação:}

4.3.l - _{Desinfetar equipamentos a ser utilizados nesta etapa (broca, inoculador, martelo,}

bacia, além da assepsia do próprio executor).

4.3.2 - _{Perfurar as toras}

com

_{fiiradeira elétrica (rotação}

>

_{6.000rpm), tendo os orificios}

20mm

de profundidade e

12mm

de diâmetro, distanciados a aproximadamente

Scm com

uma

distribuição helicoidal.

4.3.3 - _{Distribuir o inóculo}

em

uma

_{bacia, homogenizá-lo e compactá-Io.}

4.3.4 - _{lnocular as toras}

com

_{a matriz produzida segundo item 3 (utilizar inoculador}

comercial).

4.3.5 - _{Macerar os pontos de inoculação}

com

_{martelo, deixando estes nivelados}

com

_a

madeira e certificando-se de que os orificios estejam

bem

preenchidos. 4.4 ~ _Vedação:

4.4.1 - _{Preparar o selante}

com

_parafina

_(80%)

_{e breu (20%).}

4.4.2 - _{Fundir os componentes a 127°C e mantê-los a esta temperatura durante}

_o

_processo

de vedação.

4.4.3 - _{Aplicar o selante sobre os pontos de inoculação}

_com

_{o auxilio de}

um

_pincel.

4.5 - _{Preparação de toras de referência:}

4.5.1 - _Cortar

uma

_{fatia de}

_Scm

_{da extremidade de}

_uma

_{tora e descartar.}

4.5.2 - _{Cortar outra fatia de Som, pesar e secar}

em

_{estufa para determinação da umidade} inicial.

Umidade

inicial

(%)=

Peso

úmido

- _{Peso seco x 100}

Peso

úmido

4.6 - _Incubação:

Protocolos para produção de cogumelo "Shiilakc". Produção em toras dc eucalipto. - Pritsch, l.. V. › _I997

4.6.1 - _{Acondicionar as toras dispostas}

em

_{pilhas tipo fogueira}

em

_local

bem

_drenado,

com

ventilação

moderada

e

com

incidência de

30%

de insolação.

4.6.2 - _{Monitorar a umidade das toras pela tora referência, efetuando 0 cálculo de umidade}

relativa segundo a fómiula:

Peso atual

=

Peso secom.

1-umidadem 100

4.6.3 -

_Caso

_{a umidade das toras estiver abaixo de}

35%

_{promover regas}

_em

_{intervalos de6}

a 12 h.

4.6.4 - _{Se a umidade for superior a}

50%

_{promover maior ventilação das pilhas.}

4.6.5 -

_Caso

_{ocorram contaminações, separar as toras contaminadas das demais, de}

preferência elimina-las se os de niveis de contaminação forem elevados. Nesta condição procurar aumentar a ventilação das pilhas para diminuir a umidade do meio.

(4)

Item

4.5.2

Protocolos para produção dc cogumelo "Sl1ii1ukc". Produção cm toras de eucalipto. - Pritsch, l.. V. - ₁₉₉₇

Á

I I I Í

6.

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