Cinética de produção de anticorpos anti-ovalbumina em camundongos adultos sensibilizados com antígenos do Schistosoma mansoni na fase de amamentação

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL. IANA RAFAELA FERNANDES SALES. CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-OVALBUMINA EM CAMUNDONGOS ADULTOS SENSIBILIZADOS COM ANTÍGENOS DO Schistosoma mansoni NA FASE DE AMAMENTAÇÃO. RECIFE - PE 2011.

(2) IANA RAFAELA FERNANDES SALES. CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-OVALBUMINA EM CAMUNDONGOS ADULTOS SENSIBILIZADOS COM ANTÍGENOS DO Schistosoma mansoni NA FASE DE AMAMENTAÇÃO. Dissertação apresentada ao colegiado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de mestre em Medicina Tropical. Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias.. Orientadora: Profª. Drª. Valdênia Maria Oliveira de Souza. RECIFE-PE 2011.

(3) Sales, Iana Rafaela Fernandes Cinética de produção de anticorpos antiovalbumina em camundongos adultos sensibilizados com antígenos do Schistosoma mansoni na fase de amamentação / Iana Rafaela Fernandes Sales. – Recife: O Autor, 2011. 85 folhas: il., fig,. ; 30 cm. Orientador: Valdênia Maria Oliveira de Souza Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2011. Artigo I.. Inclui bibliografia e anexos. 1. Schistosoma mansoni. 2 Amamentação. 3. SEA. 4. Imunomodulação. 5. Ovalbumina. I. Souza, Valdênia Maria Oliveira de. II.Título.. 616.96. CDD (20.ed.). UFPE CCS2011-067.

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(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE REITOR Profº. Amaro Henrique Pessoa Lins PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Profº. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Profº. José Tadeu Pinheiro COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL Profª. Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL Profª. Heloísa Ramos Lacerda de Melo CORPO DOCENTE Profª. Ana Lúcia Coutinho Domingues Profª. Célia Maria Machado Barbosa de Castro Profº. Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto Profº. Fábio André Brayner dos Santos Profª. Heloísa Ramos Lacerda de Melo Profª. Maria Amélia Vieira Maciel Profª. Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque Profª. Maria do Amparo Andrade Profª. Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho Profª. Marli Tenório Cordeiro Profº. Ricardo Arraes de Alencar Ximenes Profª. Valdênia Maria Oliveira de Souza Profª. Vera Magalhães da Silveira Profª Vláudia Maria Assis Costa.

(6) DEDICO. Aos meus amados pais Inácio e Rosilda, e ao meu querido Humberto, por todo amor, carinho e incentivo..

(7) AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus, meu pai amado que sempre me protege e me guia em minhas decisões, além de me auxiliar nas horas mais difíceis. Sem ele, meus sonhos não se tornariam realidade. Meu muito obrigada aos meus queridos pais Inácio e Rosilda. Pessoas iluminadas e os melhores pais do mundo. Sempre me apoiaram, incentivaram e com muito amor e paciência me educaram. Abriram mão de minha companhia tão cedo para que eu pudesse trilhar meu caminho, mas, mesmo longe nunca estiveram ausentes. Aos meus irmãos Rodolfo e Rodrigo pelo amor, incentivo e apoio. Ao meu querido Humberto pelo amor e, principalmente, paciência. Sempre ao meu lado, presenciando e vivendo todas as minhas angústias e conquistas ao longo desses nove anos de convivência. À Profª Valdênia Souza, grande responsável por esse trabalho, minha muito abrigada pelos ensinamentos e pela orientação. Sempre presente me ensinando a melhor forma de escrever, analisar, pensar e, principalmente, demonstrando como um professor deve ensinar seus alunos. A Patrícia por toda dedicação, companheirismo e grande auxílio ao longo desses anos de convivência. Obrigada por todos os ensinamentos, sem os quais eu não conseguiria realizar esse trabalho. A Erica, grande amiga e excelente profissional que me auxiliou em todas as etapas desse e dos outros trabalhos desenvolvidos por nossa equipe. As minhas companheiras de laboratório, Andreza e Cássia que me forneceram grande ajuda em todos os procedimentos experimentais. A todos do setor de Imunologia do LIKA: às professoras Elizabeth, Mônica, Vlaudia e Silvana, e a todos os outros componentes: André, Renata, Thiago, Mirele, Fabiana e Wheverton. A todos do biotério do Aggeu Magalhães: Giuliana, Laurimar, Eduardo e Rodrigo, e com grande carinho a Ceça, por tanta atenção e dedicação. A todos os meus queridos e grandes amigos, primas, toda minha família, além dos meus companheiros de graduação e aos colegas de mestrado. A todos meu muito obrigada..

(8) “Penso noventa e nove vezes e nada descubro; deixo de pensar, mergulho em profundo silêncio - e eis que a verdade se revela”. Albert Einstein.

(9) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Esquema 1. Formação dos grupos experimentais para análise da potencialização da imunidade humoral.......................................................................................................... 35 Esquema 2: Formação dos grupos experimentais para análise da influência da via de administração dos componentes parasitários................................................................... 36 ARTIGO Figura 1. Cinética de produção de anticorpos IgG1 (A) e IgG2a (B) anti-OVA nos plasmas de camundongos Swiss Webster previamente amamentados ou não em mães infectadas pelo S.mansoni................................................................................................ 51. Figura 2. Títulos de anticorpos IgG1(A) e IgG2a (B) anti-OVA nos plasmas de camundongos Swiss Webster previamente sensibilizados ou não com componentes parasitários por via subcutânea e oral.............................................................................. 52.

(10) LISTA DE ABREVIATURAS ACF. Adjuvante Completo de Freund. AIF. Adjuvante Incompleto de Freund. APCs. Antigen Presenting Cells (Células apresentadoras de antígenos). BCG. Bacilo Calmette-Guérin. Cepa SLM. Cepa São Lourenço da Mata. DCs. Dendritic Cells (Células dendríticas). ELISA. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ensaio imunoenzimático). IFN-γ. Interferon γ. IL-2. Interleucina 2. IL-4. Interleucina 4. IL-5. Interleucina 5. IL-10. Interleucina 10. IL-13. Interleucina 13. IL-17. Interleucina 17. IL-23. Interleucina 23. MHC. Major Histocompatibility Complex (Moléculas de Histocompatibilidade Principal). OVA. Ovalbumina. PBS. Phosphate Buffered Saline (Solução salina tamponada com fosfato). PBS-T. Solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de Tween 20. PGE2. Prostaglandina E2. S. mansoni. Schistosoma mansoni. TCR. T Cell Receptors (Receptores das células T). Th. Linfócitos T helper ( uxiliaries). Th1. Linfócitos T helper tipo 1. Th2. Linfócitos T helper tipo 2. Tregs. Linfócitos T regulatórios. Th17. Linfócitos T helper tipo 17. TGB-β. Transforming growth factor beta (Fator de transformação do crescimento beta). SEA. “Soluble Egg Antigen” (Antígeno Solúvel do Ovo).

(11) RESUMO Gestantes cronicamente infectadas pelo Schistosoma mansoni são comuns em áreas endêmicas. Exposição aos componentes parasitários in utero e através da amamentação altera a resposta imune a antígenos homólogos (do parasito) em descendentes adultos. Com relação à modulação para antígenos heterólogos, estudos experimentais relatam que descendentes adultos, previamente amamentados em fêmeas infectadas apresentaram uma potencialização da produção de anticorpos anti-ovalbumina (OVA), no 8º dia, pós-imunização com este antígeno. Neste estudo, avaliamos a longevidade desta potencialização e se a mesma é dependente da via de administração dos componentes parasitários (oral ou subcutânea). Para isto, fêmeas Swiss webster não-infectadas (30 dias) ou infectadas (20 cercárias S. mansoni), no 60º dia, tiveram seus estros sincronizados e foram acasaladas. Após o nascimento, parte dos filhotes de mães não infectadas foi amamentada em mães esquistossomóticas. Assim, foram obtidos os seguintes grupos para análise da longevidade da potencialização: Amamentados em mães Infectadas (AI); Nascidos/amamentados em mães infectadas (MIAI) e Nascidos/amamentados em mães não infectadas (Controle). Para análise da influencia da via de administração, adicionamos dois grupos experimentais: Nascidos/amamentados em mães não infectadas e imunizados com antígeno solúvel dos ovos do S. mansoni (SEA), s.c, quando recém nascidos, na dose de 0,12µg/animal (SEA.1) ou 1,2 µg/animal (SEA.2). No 45º dia, todos os animais foram imunizados (s.c) com OVA, emulsificada em adjuvante e submetidos a sangrias no 8º, 14º, 21º, 28º, 35º e 68º dia pós-imunização. Os níveis de IgG1 e IgG2a antiOVA foram dosados por ELISA. Foi observado que a produção de IgG1 e IgG2a anti-OVA no grupo controle foi mais evidente a partir do 28º dia após a imunização. Contudo, nos animais que receberam leite materno de mães-infectadas (AI e MIAI) foram detectados 4 vezes mais IgG1 já no 8º dia, sendo estes níveis mantidos no 14º dia e com um aumento aproximado de 2 vezes no 21º e 28º dias. Para os animais sensibilizados com componentes parasitários, por via s.c., também houve uma potencialização, entre 14º e 28º dia pósimunização, nos camundongos que receberam a menor dose antigênica (SEA.1). Não houve diferença nos níveis de IgG1 no 35º e 68º dias entre os grupos estudados. Em relação aos títulos de IgG2a anti-OVA, o incremento na produção dessa imunoglobulina foi observado apenas nos lactentes de mães infectadas. Contudo, não foi duradoura, sendo detectada apenas no 8º dia pós-imunização. Sendo assim, antígenos do S. mansoni, administrados por via oral ou subcutânea, na fase de lactação, antecipa o pico de produção de anticorpos e leva a uma potencialização sustentada da síntese de IgG1 para um antígeno heterólogo, nos descendentes adultos.. Palavras-Chaves: Schistosoma mansoni; Esquistossomose experimental; Amamentação; SEA; Imunomodulação; Ovalbumina..

(12) ABSTRACT Schistosoma mansoni infected pregnant women are very common in endemic areas. Expositions to the parasitic component in uterus and through breastfeeding alter the immune response to homologous antigens (from the parasite) in adult offspring. Regarding the modulation for heterologous antigen, experimental studies in adult offspring breastfed in infected females there was enhancement as to the production of anti-ovalbumin (OVA) antibodies, on the 8th day, post-immunization with this antigen. In this study, we have assessed the longevity of this enhancement and whether it is dependent on the administration route of parasitic components (oral or subcutaneous). For that, non-infected Swiss webster (30 days) or infected (20 cercariae S. mansoni), on the 60th day had their estrus synchronized and were mated. After birth, part of the offspring from non-infected mothers were breastfeed in schistossomotic mothers. Thus, the following groups were obtained for the analyses of the enhancement: suckled in infected mothers (SIM); born/suckled in infected mothers (BSIM) and, born/breastfed in non-infected mothers (Control). For analyzing of the administration route interference, two groups were added: born/breastfed in non-infected mothers and immunized, s.c, with soluble eggs antigen from the S. mansoni (SEA), when new-born, in two concentrations: 0.12µg (SEA.1) or 1.2 µg (SEA.2). On the 45th day, all animals were immunized with OVA, emulsified in adjuvant and bled on the 8th, 14th, 21th, 28th, 35th and 68th days post-immunization. The IgG1 e IgG2a anti-OVA levels were measured by ELISA. It was observed that the IgG1 e IgG2a anti-OVA production in the control group was more evident from the 28th day post-immunization. However, for the animals which had received milk from infected mothers (AI e MIAI), a four-fold IgG1 level was detected yet on the 8th day and it kept on the 14th day with a two-fold rising on the 21st and 28th day. For the animals sensitized with SEA (0.12µg), via s.c., there was also an enhancement between the 14th and the 28th days post-immunization. There was no difference in the IgG1 levels on the 35th and 68th days amongst the studied groups. Regarding the titles of IgG2a anti-OVA, the increment in the production of this immunoglobulin was observed only in the offspring nursed by infected mothers and on the 8th day after-immunization. Thus, antigens of S. mansoni by oral or subcutaneous route, in the lactation phase, induced an early production of antibodies and leaded to a sustained enhancement of the IgG1 synthesis for a heterologous antigen, in the adult offspring.. Key Words: Schistosoma mansoni; Schistosomiasis experimental; Breastfeeding; SEA; Immunomodulation; Ovalbumin..

(13) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................... 14. 2. REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 17 2.1 Esquistossomose ........................................................................................................ 18. 2.2 A resposta imune adaptativa e a esquistossomose..................................................... 20 2.3 As helmintíases e a imunomodulação aos antígenos heterólogos.............................. 23. 2.4 A esquistossomose e a relação materno-fetal............................................................. 25. 3. OBJETIVOS........................................................................................................................... 30. 3.1 Objetivo geral............................................................................................................. 31. 3.2 Objetivos específicos.................................................................................................. 31. 4. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................. 32. 4.1 Desenho do estudo...................................................................................................... 33. 4.2 Local do estudo.......................................................................................................... 33 4.3 Animais...................................................................................................................... 33 4.4 Operacionalização do estudo e grupos experimentais................................................ 34. 4.5 Confirmação da infecção e regulação de estro........................................................... 37. 4.6 Imunização subcutânea com SEA.............................................................................. 37. 4.7 Imunização com ovalbumina...................................................................................... 37. 4.8 Sangria parcial para obtenção do plasma................................................................... 37 4.9 Dosagem de imunoglobulinas................................................................................... 38. 4.10 Categorização das variáveis..................................................................................... 39 4.10.1 Variáveis independentes................................................................................... 39. 4.10.2 Variáveis dependentes...................................................................................... 39. 4.11 Análise estatística..................................................................................................... 39. 5. ARTIGO.................................................................................................................................. 40. CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-OVALBUMINA EM CAMUNDONGOS ADULTOS SENSIBILIZADOS COM ANTÍGENOS DO 41 Schistosoma mansoni NA FASE DE AMAMENTAÇÃO...................................................... Abstract........................................................................................................................................ 42 Introdução.................................................................................................................................... 43 Materiais e métodos..................................................................................................................... 45 Resultados.................................................................................................................................... 48 Figuras.......................................................................................................................................... 51.

(14) Discussão...................................................................................................................................... 53. Referências................................................................................................................................... 58. 6. CONCLUSÕES...................................................................................................................... 62 REFERENCIAS......................................................................................................................... 64. ANEXOS..................................................................................................................................... 73 ANEXO 1 - Aprovação pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pernambuco (CEEA/UFPE)....................................................................................... 74. ANEXO 2 - Normas para publicação na revista Experimental Parasitology.............................. 75.

(15) 14. 1. INTRODUÇÃO.

(16) 15. Existem aproximadamente 10 milhões de gestantes e 40 milhões de mulheres em idade fértil, cronicamente infectadas pelo Schistosoma, em áreas endêmicas (FRIEDMAN et al., 2007; HILLIER et al., 2008). Nestas regiões, a maioria dos indivíduos parasitados apresenta uma forma clínica intermediária ou assintomática (CALDAS et al., 2008). Alguns estudos tentam explicar esse fenômeno propondo a hipótese de que a imunidade protetora pode estar relacionada com a prévia exposição a componentes parasitários in utero e através da amamentação, visto que a exposição contínua pode resultar em um estado de ativação imune anti-parasito (MALHOTRA et al., 1997; BUTTERWORTH e THOMAS, 1999; ATTALLAH et al., 2003; LEBEAUD et al., 2009). A influência da infecção materna sobre o sistema imune do descendente, para antígenos homólogos, tem sido verificada por alguns autores. Estudos experimentais revelam que os descendentes de mães esquistossomóticas quando submetidos a uma infecção pós-natal tem sua resposta imune modulada, ou seja, esses animais apresentam menor reposta granulomatosa, além de uma diminuição dos níveis de IgG e menor recuperação de vermes (ATTALLAH et al., 2006; OTHMAN et al., 2010). Esses achados são verificados ainda por outros autores que reforçam a idéia da passagem de anticorpos maternos parasita-específicos (LENZI et al., 1987), bem como antígenos do Schistosoma (ATTALLAH et al., 2003) como reguladores desse processo. Em relação aos antígenos heterólogos, por exemplo, as vacinas, tem sido proposto que o prévio contato com componentes parasitários maternos podem influenciar a reposta imune a esses antígenos, nos descendentes analisados durante a infância (LEBEAUD et al., 2009). Contudo, poucos estudos verificaram a importância, separadamente da gestação e amamentação em mães infectadas. Um potencialização da resposta imune nos descendentes foi observada, em estudos com humanos, e associada com a prévia amamentação em mães esquistossomóticas. Eissa et al. (1989), demonstraram um aumento da hipersensibilidade celular aos antígenos de S. mansoni em 56% dos filhos normais que foram amamentados em mulheres infectadas. Uma correlação positiva foi observada entre os níveis de IgE específica para antígeno de S. mansoni e as manifestações de alergia gastrointestinais, em crianças que receberam leite de mães infectadas (NOURELDIN et al., 1998). O leite materno representa um importante elemento para proteção do recém-nascido, uma vez que, possui componentes importantes para estimular a imunidade do neonato amamentado (FERREIRA et al,. 1998; BLEWETT et al., 2008; PENTILA, 2010). Em relação ao leite de mães esquistossomóticas, é sabido do seu potencial em alterar o grau de.

(17) 16. competência imune dos seus descendentes. Colley et al. (1999) observaram que camundongos que receberam, no período de amamentação, anticorpo específico para os antígenos solúveis dos ovos de Schistosoma (SEA) e foram, na vida adulta, infectados, apresentaram um incremento na produção de anticorpos anti-SEA. Outro aspecto interessante é o estudo desses próprios antígenos solúveis, como ativadores de células imunes. Alguns estudos destacam os carboidratos na superfície dos ovos do Schistosoma, com ênfase para o pentassacarídeo Lacto-N-Fucopentose III (LNFPIII) (THOMAS; HARN, 2004) que promove a produção de mediadores relacionados com a resposta Th2. De modo interessante, este açúcar também está presente no leite materno humano e na urina de mulheres grávidas (ERNEY et al., 2001; KELDER et al., 2001; PFENNINGER et al., 2001) Devido. à. menor. capacidade. digestiva. do. recém-nascido,. componentes. imunomodulatórios intactos podem ultrapassar a mucosa e atuar ao nível sistêmico (BLEWETT et al., 2008). Assim, é possível que devido à esquistossomose materna, o leite contendo anticorpos (anti-SEA) e açucares imunomodulatórios (LNFP-III), além de citocinas, possa atuar nos linfócitos B e em outras células apresentadoras de antígenos esplênicas imaturas e, como conseqüência, desviar a resposta imune para um favorecimento da produção de anticorpos nos descendentes, quando na vida adulta. A análise da influência da gestação e da amamentação, separadamente, em mães infectadas pelo S. mansoni na resposta imune dos seus descendentes, frente ao antígeno heterólogo, ovalbumina (OVA), tem sido foco de estudo em nosso laboratório. Com relação ao efeito da amamentação, experimentalmente, foi observado que os descendentes adultos, previamente amamentados em mães esquistossomóticas, apresentaram uma potencialização da produção de anticorpos anti-OVA verificada no 8º dia após a imunização (SANTOS et al, 2010). Contudo, a longevidade desse incremento da produção de anticorpos e sua relação com as diferentes vias de contato com antígenos parasitários, durante a lactação, não estão estabelecidos. Assim, o presente trabalho se propôs a estabelecer uma cinética de produção de anticorpos, para um antígeno heterólogo, em descendentes adultos previamente amamentados em mães esquistossomóticas. Além de estabelecer se a potencialização é dependente da via de administração dos antígenos parasitários (oral ou subcutânea), em associação com amamentação. Os achados do presente estudo fornecerão um melhor entendimento sobre a influência do contato com componentes parasitários, durante a infância e por diferentes vias de administração, na resposta imune na vida adulta..

(18) 17. 2. REVISÃO DA LITERATURA.

(19) 18. 2.1 Esquistossomose A esquistossomose está classificada entre as doenças tropicais negligenciadas e é considerada uma das mais importantes doenças parasitárias, constituindo um dos principais problemas de saúde pública mundial e sendo responsável pela terceira causa de mortalidade por doenças endêmicas rurais (ENGELS et al., 2002). Existem cinco espécies capazes de parasitar o ser humano, que são o Schistosoma haematobium, Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi e Schistosoma intercalatum, sendo os três primeiros os mais difundidos pelo mundo (GRYSEELS et al., 2006). Estatísticas globais demonstram que aproximadamente 207 milhões de indivíduos estão infectados por alguma das espécies do gênero Schistosoma e, destes, 120 milhões apresentam os sintomas clínicos e 20 milhões a doença grave. Esta helmintíase é endêmica em 76 países e em média 800 milhões de pessoas estão sobre risco de adquirir a infecção, sendo a maioria desses pacientes crianças (STEINMANN et al., 2006; TALLIMA et al., 2009; UTZINGER et al., 2010). A única espécie que causa a doença no Brasil é o S.mansoni (NEVES et al., 2007) e sua transmissão ocorre em uma vasta área endêmica que está localizada principalmente na região Nordeste e Sudeste. No entanto, focos isolados têm sido identificados em vários estados brasileiros e casos da doença foram detectados em todo país (PEREIRA et al., 2010). Pernambuco é um dos estados que exibem uma das mais altas taxas de prevalência (COURA; AMARAL, 2004) e onde tem sido verificado uma mudança no perfil epidemiológico da esquistossomose. Além da infecção persistente em muitos municípios rurais da zona da mata, os locais de transmissão e os casos de infecção aguda têm sido verificados na zona costeira, especialmente em localidade de praias turísticas (PEREIRA et al., 2010). O ciclo biológico do S. mansoni é do tipo heteroxênico. O homem é o hospedeiro vertebrado definitivo, onde ocorre a fase sexuada do ciclo, no qual os vermes adultos são encontrados quando acasalados em cópula, no sistema porta hepático. Centenas de ovos são postos diariamente por cada fêmea nas veias mesentéricas inferiores, a maioria atravessa a parede intestinal, sendo encontrados ao longo do intestino e eliminados nas fezes. Em contato com a água e notavelmente influenciados pela temperatura, esses ovos eclodem e liberam os miracídios, que infectam os caramujos do gênero Biomphalaria (hospedeiros intermediários), transformam-se em esporocistos que assexuadamente dão origem a numerosas larvas (as cercárias). Devido à alta motilidade, estas cercárias penetram através.

(20) 19. da pele do hospedeiro definitivo, perdem a cauda e adquirem a forma de esquistossômulos (verme imaturos), estes migram pelo tecido cutâneo, ganham o sistema sangüíneo ou linfático e chegam aos pulmões. Posteriormente migram para o sistema porta hepático, e dentro de 28 a 30 dias após a penetração tornam-se vermes adultos e copulam, reiniciando o ciclo (BATISTA, et al., 2001; BLANCHARD, 2004; SCHRAMM; HAAS, 2010). Duas condições clínicas principais podem ser observadas – a esquistossomose aguda e crônica (CALDAS et al., 2008). A fase aguda da doença é na maioria das vezes assintomática, principalmente nos indivíduos de áreas endêmicas. Porém, algumas espécies do gênero Schistosoma podem produzir uma forma aguda de esquistossomose conhecida como dermatite cercariana e síndrome de Katayama (BLANCHARD, 2004). A dermatite cercariana é uma reação de hipersensibilidade mediada por anticorpos IgE e direcionada contra a penetração das cercarias no hospedeiro recém infectado. É caracterizada por um quadro clínico de dermatite urticariforme, com erupção papular, eritema, edema e prurido que se manifesta algumas horas após o contato e pode persistir por vários dias. A síndrome de Katayama também ocorre nos pacientes recém infectados e consiste em reação de hipersensibilidade mediada por imunocomplexos em resposta à migração dos esquistossômulos e ao início da deposição dos ovos e é caracterizada por uma forte reação febril, freqüentemente associada à urticária e eosinofilia (PEARCE, 2002; BLANCHARD, 2004; GRYSEELS et al., 2006; BURKE et al., 2009). Em áreas endêmicas, muitos indivíduos infectados pelo S. mansoni apresentam a doença crônica e assintomática (CALDAS et al., 2008), as complicações são eventos relativamente incomuns em humanos, só afetando aproximadamente 10% dos indivíduos infectados (BLANCHARD, 2004). Baseados nos critérios clínicos, os pacientes podem ser classificados como portadores de esquistossomose intestinal, hepatointestinal ou hepatoesplênica (ANDRADE, 2004). A esquistossomose gastrointestinal é caracterizada por desconforto e dor abdominal, perda de apetite e diarréia que usualmente apresenta sangue oculto. Esses sintomas são causados pela resposta granulomatosa aos ovos, na mucosa intestinal, que leva a formação de pseudopólipos, microulcerações e sangramentos superficiais (KING, 2001; ROSS et al., 2002). O evento patogênico mais significante da fase crônica é o granuloma, o qual é caracterizado por uma reação inflamatória e fibrótica que pode ser desenvolvida nos tecidos hepáticos e intestinais em decorrência do acúmulo dos ovos liberados pelas fêmeas (BLANCHARD, 2004). O fígado é o principal órgão afetado e a fibrose, decorrente da deposição de colágenos e de outros componentes da matriz extracelular, pode evoluir para.

(21) 20. fibrose periportal e oclusão progressiva dos ramos intra-hepáticos, com hipertensão portal, varizes gastroesofágicas, hiperesplenismo e episódios de hemorragia digestiva alta (HAGAN et al., 1998; GRYSEELS et al., 2006; BURKE et al., 2009). 2.2 – A resposta imune adaptativa e a esquistossomose Os linfócitos são as principais células das respostas imunes adaptativas e se subdividem em duas grandes populações principais: os linfócitos B, células produtoras de anticorpos, e os linfócitos T, mediadores da imunidade celular. Os linfócitos T são divididos em linfócitos T auxiliares (Th) ou CD4+, e linfócitos T citotóxicos ou CD8+. As células TCD4+ são as reguladoras centrais e são classicamente subdivididas em Th1 e Th2 (MOSMANN et al., 1986). Contudo, novos perfis têm sido descritos e esses incluem as células T regulatórias e Th17 (MOSER; LEO, 2010; REINER, 2007; REINHARDT et al., 2006). O perfil de resposta modulado pelas células Th1 é caracterizado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, IFN-γ e TNF-α. Estas citocinas aumentam a expressão das moléculas de MHC (Major Histocompatibility Complex), e estão envolvidos na ativação de macrófagos, proteção contra bactérias intracelulares e eliminação de vírus. Sendo, portanto, capazes de promover uma resposta imune direcionada para patógenos intracelulares. As células Th2 estão associadas com a secreção de IL4, IL-5 e IL-13, citocinas que auxiliam na produção de IgE por células B (e de IgG1 em camundongos) e participam da maturação e ativação de eosinófilos e mastócitos. Dessa forma, são importantes na resposta imune para parasitos extracelulares, bem como no desenvolvimento de alergias (ABBAS; LICHTMAN, 2005; MOSER; LEO, 2010). Existem diferentes tipos de células T regulatórias que variam no seu mecanismo de ação e na sua origem. Essas células são categorizadas em dois subtipos, as naturais e as adaptativas. As Tregs naturais expressam constitutivamente CD25+, são originadas no timo e tem sido extensivamente estudadas em modelos murinos. Ensaios in vitro demonstram que as Tregs naturais necessitam da ativação do TCR e, uma vez ativadas, sua atividade supressiva parece ser mediada pelo contato direto célula-célula com os linfócitos T efetores e independente da atuação das citocinas. Além disso, as Tregs naturais expressam o FoxP3 (“Forkhead Box P3” - um fator de transcrição que controla o desenvolvimento e a função das células Tregs) (NIZAR et al., 2010). Por outro lado, as células Tregs adaptativas (Th3,.

(22) 21. Tr1 e iTregs) podem ou não expressar o FoxP3, são derivadas de linfócitos T CD25- da periferia, previamente estimulados (por antígenos e citocinas) e produzem IL-10 e TGF-β (VIEIRA et al., 2004; RONCAROLO et al., 2006; NIZAR et al., 2010). Recentemente, foi descrito um novo perfil de resposta imune pró-inflamatório relacionado com a produção de IL-17 e IL-23, denominado Th17 (PARK et al., 2005), o qual possui diferenciação regulada pelo TGF-β em conjunto com a IL-6 (BETTELLI et al., 2006; MANGAN et al., 2006), embora outros autores tenham sugerido a participação da IL23 (LANGRISH et al., 2005; HARRINGTON et al., 2005). Esse perfil de células T CD4+ tem sido associado com doenças auto-imunes (KIMURA; KISHIMOTO, 2010; MOSER; LEO, 2010), bem como, a repostas contra bactérias extracelulares, por mecanismos dependentes da produção de anticorpos. Camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-17 ou IL-23 tiveram a sua produção de anticorpos drasticamente prejudicada (NAKAE et al., 2002; GHILARDI et al., 2004). Além disso, o TGF-β e a IL-6, que são importantes para diferenciação das células Th17, também favorecem a troca isotípica para IgA e IgG2b (na superfície epiteliais de mucosa) e a maturação das células B, respectivamente (WEAVER et al, 2006). Os helmintos são capazes de induzir diferentes tipos de resposta de células TCD4+ no hospedeiro. Esta imunomodulação favorece a permanência do parasito por longo período e a manutenção da transmissão do mesmo. Em humanos, a infecção pelo S. mansoni está associada a um predomínio da resposta imunológica de perfil Th2 onde os antígenos dos ovos são os principais indutores (ZACCONE et al., 2010). Muitos estudos têm traçado um esboço da importância das citocinas na resposta imune à infecção esquistossomótica, e têm especulado sobre os diferentes perfis dos linfócitos T helper, tanto em humanos, quanto em modelos experimentais. Estudos com camundongos demonstram que durante as primeiras semanas pósinfecção, uma resposta Th1 é desencadeada para as formas infectantes e para os vermes imaturos. Essa resposta é caracterizada por um aumento na secreção de citocinas próinflamatórias, por exemplo, o TNF-α, IL-1, IL-6 e IFN-γ. Após 5 a 6 semanas, com o início da deposição dos ovos, uma resposta Th2 com secreção de IL-4, IL-13, síntese de IgE, bem como eosinofilia é verificada. À medida que a infecção torna-se crônica, a liberação dos ovos pelas fêmeas permanece e é observada uma diminuição da resposta Th2 com menor número e tamanho dos granulomas recém formados (PEARCE et al., 1991; PEARCE; MACDONALD, 2002; WILSON et al., 2007; BURKE et al., 2009). O perfil de resposta.

(23) 22. Th2 foi associado com a proteção e a geração da cronicidade das infecções esquistossomóticas por controlar a resposta granulomatosa ao redor dos ovos (FINKELMAN et al., 1991). Contudo, esta imunomodulação parece ser mediada pela IL-10 que é liberada não só pelos clones Th2, mas também pelas células T regulatórias (WILSON et al., 2007). Estudos sobre os mecanismos de modulação do granuloma na esquistossomose murina mostraram que animais IL-10-/- desenvolveram um perfil misto Th1/Th2, havendo aumento de IFN-γ/IL-5, acompanhado de níveis maiores ou não alterados de IL-4 (WYNN et al., 1997). Nesse contexto, estudos de Hoffmann et al. (2000), também utilizando animais IL-10-/-, verificaram que essa citocina é essencial para prevenir o excesso da polarização da resposta Th1 e Th2 durante a infecção. Em humanos, outros autores também associam a participação da IL-10 e a diminuição da resposta de citocinas Th1 (MONTENEGRO et al., 1999). A ação supressora da IL-10 se deve, principalmente, à sua capacidade de inibir a ativação de macrófagos, diminuir a expressão de moléculas co-estimulatórias e do MHC nas células apresentadoras de antígenos (Antigen Presenting Cells – APC’s) (STADECKER; FLORES VILLANUEVA, 1994; MOORE et al., 2001). A participação dos linfócitos Th17 na esquistossomose tem sido associada com o desenvolvimento da doença grave, em animais polarizados para o perfil Th1. (RUTITZKY; STADECKER, 2006). Rutitzky et al., (2005) em seu estudo que verificou a exacerbação de patologia granulomatosa e a grave morbidade na infecção pelo S. mansoni, demonstraram que a neutralização da IL-17 (com anticorpos monoclonais anti-IL-17) controla o tamanho do granuloma, restaurando-o ao tamanho encontrado na fase crônica, indicando que apesar da capacidade dos antígenos parasitários de induzir clones de linfócitos Th17, a proliferação destas células deve ser controlada negativamente na fase crônica da doença. Devido ao importante papel dos antígenos dos ovos do Schistosoma (SEA) na regulação imune e na, subseqüente, imunopatologia da esquistossomose, o estudo dos seus componentes e de suas funções tem despertado interesse. Esses antígenos são compostos por centenas de proteínas e glicoconjugados, aproximadamente 30 elementos, que variam em seu peso molecular (10 a 200 kDa) e incluem aqueles que são secretados ativamente pelos ovos ou os produtos de sua desintegração (STEINFELDER et al., 2009). Semelhantes aos ovos do parasito, o SEA induz uma resposta Th2 quando injetado em animais. Além disso, análogo a outros produtos ou extratos de helmintos, pode ser descrito como um adjuvante devido sua habilidade em induzir efetiva resposta imune (PEARCE, 2005). Okano et al. (1999) demonstraram que os antígenos solúveis do S.mansoni são capazes de desempenhar.

(24) 23. importante papel na estimulação da imunidade humoral e celular. Esses autores observaram que a imunização intranasal de camundongos com o SEA favorece elevada produção de IgE total e específica, além de citocinas Th2 e associaram essa capacidade aos açúcares (glicanos) presentes nesse antígeno, uma vez que sua ausência prejudicou a resposta imune Th2, mas não alterou a resposta Th1. Uma das proteínas mais abundantes do SEA é o polipeptídio 40kDa (Sm-p40) que representa aproximadamente 10% da constituição desse antígeno. Está presente nos granulomas e tem sido associado a uma resposta Th1. Uma mistura complexa de glicoconjugados, por exemplo, glicoproteínas e glicolipídios são responsáveis pela ativação do sistema imune (VAN LIEMPT et al., 2007). Alguns estudos destacam os oligossacarídeos na superfície dos ovos do Schistosoma, com ênfase para o Lacto-N-Fucopentose III (LNFPIII) (THOMAS; HARN, 2004), o qual parece ativar diretamente células imunes para produzir mediadores relacionados com a resposta Th2, incluindo a proliferação de células B e a síntese de IL-10 e PGE2. Appelmelk et al. (2003), observaram que glicanos, contendo fucose ou manose, que estão presente nos antígenos de S. mansoni se ligam em receptores de lectina tipo C (DC-SIGN- CD209), em células dendríticas (Dentritic Cells – DC’s). Estes autores sugeriram que a polarização da resposta para o perfil Th2 induzida pelo S. mansoni, pode ser decorrente dessa ligação. Estudos mais recentes relatam a presença de glicoproteínas secretórias denominadas alfa-1, peroxirredoxin e ômega-1. A primeira e a segunda induzem, respectivamente, a liberação de IL-4 e, conseqüente, desgranulação de basófilos, através de sua ligação à imunoglobulina E na superfície dessas células e o desenvolvimento de macrófagos alternativamente. ativados.. O. ômega-1. é. uma. ribonuclease. excretada/secretada. abundantemente pelos ovos vivos, a qual tem sido associada com indução direta de uma resposta Th2 (HEWITSON et al., 2009). Steinfelder et al. (2009) demonstraram que essa proteína modifica a morfologia das células dendríticas e sua interação com os linfócitos T CD4+. Baseados nessas evidências, os autores propuseram que o SEA e esse seu componente bioativo promove a polarização da resposta Th2 através de modificações na ativação das DC’s. Contudo, esses mecanismos não são completamente estabelecidos. 2.3 – As helmintíases e a imunomodulação aos antígenos heterólogos Durante a década de 80, uma série de estudos apontou a capacidade da infecção por helmintos ou a imunização com seus antígenos de interferir na imunidade simultânea a.

(25) 24. antígenos protéicos não-relacionados (BARRIGA, 1984). Pacientes infectados pelo Onchocerca volvulus apresentaram uma redução na proliferação celular aos antígenos do Mycobaterium tuberculosis (PPD –Purified protein derivative) (COOPER et al., 1997). Do mesmo modo, camundongos inoculados com microfilárias vivas de Brugia malay ou imunizações com antígenos solúveis parasitários, apresentaram a resposta Th1 alterada para vacinação com PPD (PEARLMAN et al., 1993). Marshall et al. (2005) caracterizaram a capacidade imunomodulatória de uma molécula derivada do nematódeo de roedores Acanthocheilonema viteae, ES-62, (homóloga à glicoproteína encontrada no nematódeo filarial de humanos) sobre a resposta imune ao antígeno ovalbumina. Estes autores observaram, em camundongos, que a exposição ao ES-62 in vivo foi capaz de reduzir a proliferação de linfócitos T, a migração folicular, alteração no perfil de citocinas e indução de polarização na resposta de anticorpos, com elevada produção de IgG1 anti-OVA e supressão de IgG2a anti-OVA. Extratos solúveis de vermes adultos, ovos, ou glicoproteínas de alto peso molecular de Ascaris suum suprimem a resposta imune específica a ovalbumina em camundongos, de maneira IL-10 e IL-4 dependente (SOUZA et al, 2002; 2004). Em um modelo de asma experimental, foi observado que o extrato de A. suum levou a diminuição das reações de hipersensibilidade e a produção de anticorpos anafiláticos específicos para OVA, em animais previamente sensibilizados com este antígeno (LIMA et al, 2002). Em humanos, a infecção pelo Ascaris lumbricoides foi capaz de atenuar a gravidade da malária cerebral em indivíduos co-infectados com o Plasmodium falciparum (NACHER et al., 2000). Cooper et al. (2001) relataram um aumento da produção de IFN-γ e IL-2, frente à vacinação com toxina colérica recombinante, em indivíduos infectados que foram submetidos ao tratamento com droga anti-helmíntica. Estudos experimentais demonstraram que durante a infecção pelo S. mansoni, o perfil Th2, no período da deposição dos ovos (PEARCE et al., 1991), modifica a resposta imune à mioglobina, com supressão da resposta imune Th1 e aumento da produção de IL-4 (KULLBERG et al., 1992). Foi também constatada a supressão de linfócitos Th1 e citotóxicos para antígenos virais (ACTOR et al, 1993; 1994) em camundongos esquistossomóticos. Em estudos com humanos e em modelos experimentais, os relatos descrevem uma atenuação da resposta Th1 à vacinação com antígenos vacinais, como o toxóide tetânico ou PPD (SABIN et al, 1996; ELIAS et al., 2005). Uma relação inversa entre as infecções por S. mansoni e a presença de reações alérgicas tem sido observada. Primeiramente, foi relatada a atenuação do quadro clínico da.

(26) 25. asma e da resposta de hipersensibilidade para aeroalérgenos (ARAÚJO et al., 2000; MEDEIROS et al.,2003) nos indivíduos asmáticos e infectados pelo S. mansoni. Da mesma forma, camundongos parasitados ou tratados com antígenos dos ovos do S. mansoni adquiriram uma maior resistência ao desenvolvimento da resposta alérgica pulmonar antiovalbumina, sendo evidenciado menores níveis de citocinas Th2, eosinófilos, anticorpos IgE anti-OVA e maior indução de células T CD4+CD25+ (SMITS et al., 2007; PACÍFICO et al., 2009). A presença de ovos do S. mansoni foi capaz de prevenir a resposta inflamatória autoimune experimental. Sewell et al. (2003), relataram uma redução na progressão da resposta imune específica para proteína básica da mielina e, conseqüente melhora da encefalomielite autoimune experimental (semelhante à esclerose múltipla humana). Este fenômeno foi associado com uma redução nos níveis do IFN-γ e produção de IL-4. Neste mesmo ano, Zaccone et al. (2003) observaram a prevenção do diabetes tipo 1, devido ao prévio contato com SEA. 2.4 – A esquistossomose e a relação materno-fetal Em áreas endêmicas é comum observar gestantes e mulheres em idade fértil cronicamente infectadas pelo Schistosoma (FRIEDMAN et al., 2007; HILLIER et al., 2008). Quando estes pacientes não são tratados, a infecção crônica persistirá durante todo o período de gestação e amamentação (LEBEAUD et al., 2009) e como conseqüência, os produtos solúveis derivados do parasito podem sensilibilizar a criança por meio de sua passagem transplacentária e/ou através do leite materno. De fato, Lees e Jordan (1968) já demonstravam a transferência de anticorpos específicos para o S .mansoni, através da placenta, e sua permanência nas crianças por até seis meses após o nascimento. Nesse contexto, Carlier et al. (1980), utilizando anticorpos policlonais, observaram uma correlação positiva entre os níveis de antígenos solúveis do S. mansoni no soro proveniente de mães infectadas e do cordão umbilical de seus filhos, indicando a transferência desse componente parasitário. Outros autores detectaram antígenos de S. mansoni, por ELISA de captura, em 66% de amostras de urina de crianças nascidas de mulheres parasitadas (HASSAN et al., 1997). Em relação ao leite de mães infectadas, foi observada a presença de produtos solúveis do S.mansoni (antígeno “M” e antígeno “4”) (SANTORO et al., 1977), bem como de antígeno parasitários (ATTALLAH et a., 2003)..

(27) 26. Baseados nesses achados, outros estudos foram desenvolvidos com o intuito de elucidar as alterações na resposta imune para antígenos homólogos, no recém-nascido previamente exposto aos componentes parasitários. Lenzi et al. (1987) estudando camundongos recém-nascidos e lactentes de mães infectadas pelo S. mansoni, verificaram a transferência de anticorpos específicos para antígenos de cercárias, de ovos e de vermes adulto, através da placenta e pelo leite materno. Estes autores observaram que esses animais, quando submetidos à infecção pós-natal, apresentavam. diminuição. da. reação. granulomatosa. hepática,. indicando. uma. hiporresponsividade aos ovos do Schistosoma e associando que a melhor proteção é adquirida após o período de lactação. Attallah et al. (2006) também demonstraram que a exposição pré-natal dos recém-nascidos aos antígenos ou anticorpos anti-S. mansoni pode atenuar a patogênese da esquistossomose numa infecção subseqüente. Eles observaram a persistência de antígenos parasitários maternos nos filhos de mães infectadas por até 8 semanas após o parto, com a presença de antígenos maternos nos tecidos hepático e renais dos filhos. Após 8 semanas, os filhotes foram infectados e foi observado que os níveis de IgG, tamanho e número de granulomas hepáticos, bem como recuperação de vermes foram significantemente reduzidos nos animais nascidos de mães infectadas, quando comparados aos nascidos de mães não-infectadas. Recentemente, Othman et al. (2010) estudando a progressão da esquistossomose mansônica em camundongos provenientes ou não de mães infectadas, observaram que a intensidade da infecção (número de granulomas e fibrose hepática) foi significativamente menor em descendentes de mães esquistossomóticas. Esses autores demonstraram também que os níveis de expressão do gene da IL-12 e do TGF-β, citocinas reguladoras, foram maiores nos animais nascidos e amamentados em mães infectadas. Com relação à resposta dos recém-nascidos aos antígenos heterólogos, após exposição in útero e/ou através da amamentação às infecções helmínticas maternas, os estudos ainda são poucos. Malhotra et al. (1999) realizaram um estudo com humanos infectados pelo Schistosoma haematobium e demonstraram que a infecção materna por este trematódeo, durante a gravidez, sensibiliza aproximadamente 50% dos recém-nascidos in utero, e que esta imunidade pré-natal favorece a formação de uma memória imunológica que persiste na criança (resposta de células T antígeno-específica persistente por até 14 meses) e influencia a resposta para antígenos heterólogos, diminuindo a eficácia da vacinação ao BCG. Eles observaram que as células T das crianças nascidas de mães não-infectadas,.

(28) 27. durante a gestação, produzem muito mais IFN-γ em resposta a proteínas purificadas da micobactéria do que as crianças nascidas de mães infectadas. Contudo, uma potencialização da resposta imune nos descendentes foi observada e associada com prévia amamentação em mães infectadas pelo S.mansoni. Eissa et al. (1989) ao estudarem a imunidade mediada por células, para antígenos parasitários, e correlacionar esses. resultados. com. a. prévia. amamentação,. demonstraram. um. aumento. da. hipersensibilidade celular aos antígenos do helminto em 56% dos filhos normais previamente amamentados em mulheres infectadas (por no mínimo até o 1º mês de vida). Esta mesma relação não foi observada nas crianças que receberam o leite de vaca e/ou cabra. Uma correlação positiva foi observada entre os níveis de IgE contra antígeno de S. mansoni e as manifestações de alergias gastrointestinais em crianças que receberam leite de mães esquistossomóticas (NOURELDIN et al., 1998). De fato, o leite materno é de grande importância para proteção do recém-nascido, visto que contêm substâncias antimicrobianas e fatores imunomodulatórios como citocinas, oligossacarídeos, anticorpos, fatores de crescimento, bem como vários tipos celulares, por exemplo, macrófago, neutrófilos, linfócitos e células epiteliais (FIELD, 2005; BLEWETT et al., 2008). A amamentação não é unicamente uma fonte de nutrição, mas, ao mesmo tempo propicia os mecanismos reguladores que favorecem a manutenção da homeostase (PENTTILA, 2010). Então, nos recém nascidos, o trato gastrointestinal é exposto a alimentos, bactérias e antígenos ambientais, ao mesmo tempo em que o seu sistema imune de mucosa está sendo desenvolvido. Dentre os fatores solúveis, como as citocinas, destacam-se a IL-1, TNF-α, IFN-γ, IL6, IL-10 e TGF-β. A IL-6, junto com IL-10 e TGF-β, estão envolvidas com diferenciação e maturação de células produtoras de IgA e maturação de células intestinais. Enquanto, a IL10 e TGF-β, são também conhecidas por suas funções imunossupressoras e tolerogênicas (WEINER, 2001; BLEWETT et al., 2008). Sendo assim, estes fatores imunomodulatórios conferem ao leite materno um caráter dicotômico. Durante a tenra infância, o neonato deve desenvolver tolerância (dependente de células T) a moléculas não-patogênicas (como antígenos alimentares) e sensibilização aos patógenos (com a maturação do sistema imune e estimulação da produção de anticorpos). Sabe-se também que os anticorpos IgG maternos, passados ao recém-nascido através do leite, são importantes para desenvolvimento da linhagem de células B e formação dos anticorpos no neonato. De fato, Malanchère et al. (1997), quando utilizaram camundongos nascidos de mães geneticamente deficientes na.

(29) 28. produção de anticorpos ou mães normais, verificaram que a progênie nascida de mães normais continha 2 a 3 vezes mais células pré-B e células B, comparadas com camundongos nascidos de mães deficientes. Entretanto, tem sido demonstrado que a exposição materna aos alérgenos, citocinas ou aos processos infecciosos, durante o período de amamentação, podem alterar o grau de competência imune dos seus descendentes (LIMA et al, 2005; LEME et al, 2006; RODRIGUES et al., 2006; FUSARO et al, 2007).. Em relação ao leite de mães esquistossomóticas, Attallah et al. (2003) verificaram que os recém nascidos amamentados por essas mães, apresentam o antígeno 63 Kd por até 24 meses após o parto, enquanto os não-amamentados tiveram o antígeno detectado na urina apenas até 28 dias após o parto, demonstrando a influência da amamentação para transferência e manutenção dos níveis do antígeno. Para os anticorpos anti-Schistosoma, Colley et al. (1999) observaram que camundongos que receberam, no período de amamentação, anticorpo específico para os antígenos solúveis dos ovos de Schistosoma (SEA) e foram, na vida adulta, infectados, apresentaram um incremento na produção de anticorpos anti-SEA e diminuição da reação granulomatosa. Além disso, um açúcar imunomodulador (LFNP-III) presente nos ovos desse parasito, também é encontrado no leite materno humano e na urina de mulheres grávidas e é capaz de estimular a proliferação de linfócitos B (ERNEY et al., 2001; KELDER et al., 2001; PFENNINGER et al., 2001). O estudo da influência da gestação e da amamentação, separadamente, em mães infectadas pelo S. mansoni na resposta imune dos seus descendentes adultos, frente ao antígeno heterólogo, ovalbumina (OVA), tem sido foco do nosso grupo de estudo. Com relação ao efeito da amamentação, experimentalmente, foi observado que os descendentes adultos previamente amamentados em mães esquistossomóticas (amamentação adotiva) ou nascidos e amamentados apresentaram uma potencialização da produção de anticorpos anti-OVA, verificada no 8º dia pós imunização com OVA (SANTOS et al, 2010). Antígenos ou anticorpos anti-parasita da infecção materna parece interferir na produção de anticorpos anti-OVA junto com leite, visto que descendentes que tiveram contato com leite de mães não-infectadas não produziram níveis de anticorpos anti-OVA tão elevados quando comparado aos que foram amamentados em mães infectadas. Além disso, foi relatado que a amamentação ameniza o potencial imunossupressivo anti-OVA adquirido durante a gestação (SANTOS, et al 2010). Descendentes adultos que nasceram de mães infectadas e não foram amamentados por estas mães apresentam alta produção de IL-10 e baixa produção de anticorpos anti-OVA. Entretanto, foi observado que.

(30) 29. quando os camundongos nascidos de mães infectadas são também amamentados em mães infectadas ocorre uma reversão da supressão de anticorpos anti-OVA, acompanhada do aumento da produção de IL-2 e diminuição de IL-10. Estes últimos resultados corroboram o efeito estimulador da imunidade adaptativa através da amamentação em mães esquistossomóticas. Assim, a relação materno/descendente pode contribuir para o estabelecimento de uma posterior imunidade em longo prazo (vida adulta) e a participação do leite materno, como modulador da resposta imune do descendente, merece destaque. Assim, o presente trabalho se propôs a estabelecer uma cinética de produção de anticorpos, para um antígeno heterólogo, em descendentes adultos previamente amamentados em mães esquistossomóticas. Além de estabelecer se a potencialização é dependente da via de administração dos antígenos parasitários (oral ou subcutânea), em associação com amamentação..

(31) 30. 3. OBJETIVOS.

(32) 31. 3.1 - OBJETIVOS GERAIS. • Analisar a longevidade da potencialização da imunidade humoral, através do perfil da cinética de produção de anticorpos, específicos para ovalbumina, nos descendentes adultos previamente amamentados ou não em fêmeas infectadas pelo S.mansoni. • Avaliar a potencialização da resposta imune humoral, específica para ovalbumina, entre os descendentes adultos que recebem antígenos parasitários. por. diferentes. vias. de. administração:. leite. de. mães. esquistossomóticas e antígeno solúvel do ovo do S. mansoni, por via subcutânea, durante a amamentação em mães não infectadas.. 3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Comparar os títulos de IgG1 e IgG2a séricos anti-OVA no 8º, 14º, 21º, 28º e 35º dias após a imunização com OVA em adjuvante, entre os descendentes adultos previamente amamentados e não amamentados em mães infectadas com S. mansoni. • Avaliar a potencialização de IgG1 e IgG2a séricos anti-OVA no 8º, 14º, 21º, 28º, 35º e 68º dias após a imunização com OVA em adjuvante, entre os descentes adultos que recebem antígenos parasitários por diferentes vias de administração: previamente amamentados em fêmeas infectadas pelo S.mansoni e os animais que recebem antígeno solúvel de ovo S.mansoni, em diferentes concentrações, por via subcutânea, durante o período de lactação em fêmeas não infectadas..

(33) 32. 4. MATERIAIS E MÉTODOS.

(34) 33. 4.1 - DESENHO DO ESTUDO Foi realizado um estudo experimental e intervencionista, onde um grupo de animais sofreu a intervenção (infecção com S. mansoni) e o outro serviu para termos de comparação dos resultados. Foi analisado se a amamentação em mães infectadas pelo S.mansoni favorece a manutenção de elevados títulos de anticorpos específicos para um antígeno heterólogo. Além disso, se esse fenômeno é dependente da via de administração dos componentes parasitários (oral ou subcutâneo). Assim, trata-se também de um estudo analítico. 4.2 - LOCAL DO ESTUDO A obtenção dos animais, infecção dos mesmos, acasalamento, manutenção dos filhotes, imunizações e sangrias nos diferentes dias pós-imunização (8º, 14º, 21º, 28º, 35º e 68º dias) foram realizadas no Biotério do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ). Outras etapas, como a preparação dos antígenos para imunizações, dosagem de imunoglobulinas, bem como os outros procedimentos laboratoriais foram realizados no setor de Imunologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA/UFPE).. 4.3 - ANIMAIS Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss Webster. Espécie que mimetiza o desenvolvimento patológico da esquistossomose em humanos, além de ser bem susceptível à infecção e boa respondedora ao antígeno heterólogo ovalbumina (OVA), escolhido para o estudo. A estimativa do tamanho amostral foi estabelecida com base em dados da literatura e na experiência dos colaboradores do trabalho. Os camundongos foram fornecidos pelo biotério do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ). Os animais utilizados no presente estudo foram provenientes de um projeto de pesquisa maior, o qual foi autorizado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Fundação Oswaldo Cruz (CEUA/FIOCRUZ) com o número de licença: L-0063/08. A utilização desse tipo de cobaia é regulamentada pelo decreto nº 3.179, da Presidência da República, pela portaria nº 242/99 da Presidência da FIOCRUZ e pelo regimento interno da CEUA..

(35) 34. 4.4 - OPERACIONALIZAÇÃO DO ESTUDO E GRUPOS EXPERIMENTAIS Inicialmente foram utilizados 20 camundongos fêmeas com 4 semanas de idade. Destas, 10 foram infectadas por via cutânea com 20 cercárias da cepa SLM de Schistosoma mansoni e as outras 10 não foram infectadas. Em todas as fêmeas foram administrados hormônios, para regulação do estro, e posteriormente foram acasaladas, individualmente com os machos. Após o nascimento dos filhotes, procedeu-se a etapa da amamentação. Os filhotes nascidos de fêmeas infectadas permaneceram sendo amamentados em suas mães biológicas. Contudo, os filhotes das mães não infectadas foram divididos em diferentes grupos: animais que nasceram de mães não parasitadas, mas, que foram amamentados em mães esquistossomóticas (amamentação adotiva) e animais nascidos e amamentados em mães não infectadas, formando o grupo controle. Para análise da influência da via de administração, animais nascidos e lactentes de mães não infectadas receberam o antígeno solúvel do ovo do S.mansoni (em diferentes doses), por via subcutânea, durante a amamentação (em sua mãe não infectada). Sendo assim, obtivemos os seguintes grupos para a cinética da potencialização da imunidade humoral (n=10): Grupo MIAI – animais nascidos de Mães Infectadas e Amamentados em mães Infectadas; Grupo AI –animais nascidos de mães não infectadas, mas Amamentados em mães Infectadas; e Grupo CONTROLE –nascidos e amamentados em mães não infectadas (Esquema 1). Para a segunda análise, influência da via de administração, foram formados dois grupos experimentais: Grupos SEA – animais recém nascidos e amamentadas em mães não infectadas que receberam antígeno solúvel do ovo do S. mansoni em uma dose de 0,12µg/animal. (Grupo SEA.1, n=10) ou 1,2 µg/animal (Grupo SEA.2, n=10) (Esquema 2). Em ambos os experimentos foram utilizados animais machos, que após 45 dias, foram imunizados (s.c), com o antígeno heterólogo Ovalbumina (OVA) emulsificado em adjuvante..

(36) 35. Fêmeas Swiss webster. Fêmeas Swiss webster não. infectadas. infectadas. Infecção (20 cercárias) Regulação do estro e Acasalamento Parasitológico (Kato-Katz). Amamentação na Mãe biológica. Nascidos e Amamentados em Mães Infectadas (MIAI). MIAI. Amamentação Adotiva. Nascidos em Mães não infectadas e Amamentados em Mães Infectadas (AI). AI. Amamentação na Mãe biológica. Nascidos e Amamentados em Mães não- Infectadas. CONTROLE. 45º DIA DE VIDA: IMUNIZAÇÃO (s.c) OVA+ ACF. Sangrias parciais no 8º, 14º, 21º, 28º e 35º dias pós-imunização com OVA para análise da longevidade da potencialização da imunidade humoral.. Esquema 1: Formação dos grupos experimentais para análise da potencialização.

(37) 36. Fêmeas Swiss webster não infectadas. Fêmeas Swiss webster infectadas Infecção (20 cercárias). Regulação do estro e Acasalamento. Parasitológico (Kato-Katz) Amamentação na Mãe biológica. Amamentação Adotiva. Nascidos e Amamentados em Mães Infectadas (MIAI). Nascidos em Mães não infectadas e Amamentados em Mães Infectadas (AI). Amamentação na Mãe biológica. Nascidos e Amamentados em Mães não- Infectadas. Recebem Antígeno Solúvel do Ovo do S. mansoni – SEA (s.c) a partir do 3º dia de vida na concentração de 0,12 µg (SEA.1) e 1,2µg (SEA.2).. MIAI. AI. SEA.1. SEA.2. CONTROLE. 45º DIA DE VIDA: IMUNIZAÇÃO (s.c) OVA+ ACF. Sangrias parciais no 8º, 14º, 21º, 28º, 35º, 68º dias pós-imunização com OVA, para análise da influência da via de administração dos componentes parasitários na resposta imune humoral. Esquema 2: Formação dos grupos experimentais para análise da influência da via de administração dos componentes parasitários.

(38) 37. 4.5 - CONFIRMAÇÃO DA INFECÇÃO E REGULAÇÃO DO ESTRO A partir do 45º após a infecção com as cercárias do S.mansoni, foi realizado o parasitológico de fezes, através do método de Kato-Katz (KATZ; CHAVES; PELLEGRINO, 1972), onde foram processadas três lâminas/ animal para confirmação e quantificação da infecção. Após 60 dias de infecção, as 10 fêmeas infectadas tiveram seu estro sincronizado (FOWLER; EDWARDS, 1957; WANG et. al., 2001) com a administração de hormônios. No primeiro dia foi administrado 10UI (200μL) de eCG (Gonadotrofina Coriônica Eqüina) e no terceiro dia 10UI (200μL) de hCG (Gonadotrofina Coriônica Humana), posteriormente ocorreu o acasalamento individual com único macho. O mesmo procedimento foi realizado nas 10 fêmeas não-infectadas. 4.6 - IMUNIZAÇÃO SUBCUTÂNEA COM SEA Vinte (20) filhotes machos nascidos e amamentados em mães não infectadas foram selecionados no 3º dia de vida e distribuídos em dois grupos (10 animais), de acordo com a concentração do antígeno parasitário recebido. Estes animais foram imunizados por via subcutânea com 0,12µg/animal ou 1,2µg/animal de SEA, distribuídos em cinco doses (0,024µg/animal e 0,24 µg/animal ) diluídas em PBS (HANG et al., 1974). A primeira dose do antígeno (SEA) foi emulsificada em adjuvante Incompleto de Freund (AIF) na proporção de 1:1 e aplicada no 3º dia de vida (s.c). As outras foram distribuídas entre o 6º, 10º, 13º e 17º dias de vida (FUSARO et al., 2007), e administradas na ausência do AIF. Foram também utilizados animais (n=10), nascidos e amamentados em mães não infectadas, que receberam imunizações subcutâneas apenas PBS e com IFA (quando recém nascidos). 4.7 - IMUNIZAÇÃO COM OVALBUMINA Os filhotes machos adultos distribuídos de acordo com os diferentes grupos de estudo, descritos acima, foram imunizados no 45° dia após seu nascimento. Foi injetado na base da cauda (via sub-cutânea) 100μg/camundongo de Ovalbumina (OVA) 5 vezes cristalizada (Sigma Chemical, St. Louis, Mo, USA), emulsificada na proporção 1:1 (vol/vol).