UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Dissertação
Xantana como aditivo crioprotetor externo para congelamento
de sêmen ovino
GUSTAVO DESIRE ANTUNES GASTAL
GUSTAVO DESIRE ANTUNES GASTAL
XANTANA COMO ADITIVO CRIOPROTETOR EXTERNO PARA CONGELAMENTO DE SÊMEN OVINO
Orientador: Thomaz Lucia Junior Co-Orientador: Ivan Bianchi
Pelotas/RS, 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Sanidade Animal).
Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
G255x Gastal, Gustavo Desire Antunes
Xantana como aditivo crioprotetor externo para congelamento de sêmen ovino / Gustavo Desire Antunes Gastal. – Pelotas, 2012. – 36f. ; tab. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Área de concentração: Sanidade animal. Universidade Federal de Pelotas. Faculdade de Veterinária. Pelotas, 2012. - Orientador Thomaz Lucia Junior ; co-orientador Ivan Bianchi.
1.Veterinária. 2.Antioxidante. 3. Crioproteção externa. 4.Sêmem ovino. 5.Xantana. I.Lucia Junior, Thomaz. II.Bianchi, Ivan. III.Título.
Banca Examinadora
Professor Dr. Thomaz Lucia Jr., UFPel
Professor Dr. Carlos Eduardo da Rosa, FURG Professor Dr. Charles Ferreira Martins, UFPel Professora Drª. Denise Calisto Bongalhardo, UFPel
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Antonio Desire Pinto Gastal e Artemisa Helena Gomes de Pinho Antunes e a minha irmã Rafaela Antunes Gastal, por acompanharem em todos os passos da minha vida. A Camila Storch Schneider, pelo amor dedicado sempre. A eles dedico esta dissertação.
Aos meus familiares, pelo apoio investido.
A Antonio Colomby, Isabel Storch e família, por toda confiança e alegria proporcionada.
Ao amigo (irmão) Daniel Barros de Barros e seus pais Clóvis Barros e Dalvaci Barros, por todo o apoio dedicado.
A Guarda Nova Consultoria Agropecuária pelas experiências vividas.
A todos os estagiários do laboratório de reprodução animal, em especial para a Tainã Figueiredo Cardoso, Estela Fernandes e Silva e Bruna Mion, pela dedicação incansável no auxilio para execução deste trabalho, sempre de bom humor e por proporcionarem um ótimo convívio.
Aos colegas de pós-graduação, pelos momentos de descontração e ajuda. Ao professor Dr. Thomaz Lucia Junior, além de orientador um grande amigo, pelos ensinamentos, conversas e orientações oportunizadas.
Ao amigo e professor Antonio Sergio Varela Junior, pelas oportunidades de conhecimento e pela enorme dedicação em me ajudar.
Aos amigos professores que orientaram na condução do trabalho, Arnaldo Diniz Vieira, Carine Dahl Corcini, Ivan Bianchi, Rafael Gianella Mondadori.
A UFPEL e a FURG, pela disponibilização de todos os meios necessários para execução do trabalho.
Resumo
GASTAL, Gustavo Desire Antunes. Xantana como aditivo crioprotetor externo
para congelamento de sêmen ovino. 2012. 36f. Dissertação (Mestrado) -
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A goma xantana pode contribuir para reduzir a formação de cristais de gelo no meio usado para congelamento de sêmen, favorecendo a preservação da viabilidade espermática pós-descongelamento. Como não existem informações acerca do uso da goma xantana como aditivo crioprotetor para sêmen ovino, este trabalho objetivou determinar o efeito de três diferentes concentrações de xantana (0,15%, 0,20% e 0,25%) sobre a qualidade espermática pós-descongelamento. Testes in
vitro de qualidade seminal, avaliando a motilidade e vigor, integridade de membrana
e do acrossoma e a função mitocondrial foram realizados pré-congelamento e pós-descongelamento. Foram realizados testes bioquímicos para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e capacidade antioxidante total (TOSC) através da utilização de um fluorímetro e a sonda fluorescente H2DCF-DA. A adição de xantana não trouxe benefícios para a integridade da membrana e do acrossoma, nem para a funcionalidade mitocondrial (p>0.05), mas a motilidade espermática pós-descongelamento foi reduzida (p<0.05) nos tratamentos com 0,20 e 0,25% de xantana (22,2% ± 4,1 e 20,8% ± 4,1, respectivamente), em comparação com o controle sem inclusão de xantana (32,2% ± 4,1) (p<0.05). Por outro lado, a xantana mostrou características antioxidantes, pois a produção de EROs foi reduzida conforme aumentou a concentração da xantana (p<0.05). Assim, a xantana apresentou capacidade antioxidante extracelular, sendo eficiente na diminuição das espécies reativas de oxigênio geradas no processo de congelamento.
ABSTRACT
GASTAL, Gustavo Desire Antunes. Xanthan as an additive external
cryoprotectant for frozen ram semen. 2012. 36f. Dissertação (Mestrado) -
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
The xanthan gum can contribute to reduce the formation of ice crystals in the sperm freezing solution, facilitating the preservation of sperm viability after thawing. However, there is no information about the use of xanthan gum as an additive for cryoprotection of ram sperm. This study aimed to determine the effect of three different concentrations of xanthan (0.15%, 0.20% and 0.25%) on post-thawing ram sperm quality. In vitro tests, evaluating sperm motility and vigor, membrane and acrossome integrity and mitochondrial functionality were conducted before freezing and after thawing. Biochemical tests were performed to evaluate reactive oxygen species (ROS) and total antioxidant capacity (TOSC) by using a fluorometer and the fluorescent probe H2DCF-DA. The addition of xanthan did not benefit sperm membrane and acrossome integrity and mitochondrial functionality (p>0.05), but the post-thawing sperm motility was lower (p<0.05) in treatments with 0.20 and 0.25% xanthan (22.2% ± 4.1 and 20.8% ± 4.1, respectively) than in the control without xanthan (32.2% ± 4.1). On the other hand, xanthan showed antioxidant characteristics, since the concentration of ROS decreased with increasing xanthan production (p<0.05). Thus, xanthan showed extracellular antioxidant capacity, being efficient on reducting the ROS generated during the freezing process.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Efeito da adição de xantana em diluente para congelamento de sêmen ovino sobre a capacidade antioxidante contra radicais peróxidos após o descongelamento. ... 27
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composição do diluente utilizado: ... 20 Tabela 2 Motilidade espermática, integridade da membrana e do acrossoma,
antes do congelamento de sêmen ovino com diluente incluindo diferentes concentrações de xantana (médias ± EPM)* ... 25 Tabela 3 Motilidade espermática, queda na motilidade espermática (diferença
entre a motilidade espermática pré e pós congelamento), integridade da membrana e do acrossoma e função mitocondrial, após o descongelamento de sêmen ovino com diluente incluindo diferentes concentrações de xantana (médias ± EPM)* ... 25 Tabela 4 Produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e capacidade
antioxidante total (TOSC), expressas pela área por unidade de fluorescência, após o descongelamento de sêmen ovino com diluente incluindo diferentes concentrações de xantana (médias ± EPM)* ... 26
SUMÁRIO RESUMO... 6 ABSTRACT ... 7 LISTA DE FIGURAS ... 8 LISTA DE TABELAS ... 9 1. INTRODUÇÃO ... 10 1.1.ESTRESSE OXIDATIVO ... 13 1.2. GOMA XANTANA ... 14 2. OBJETIVOS ... 17 2.1. OBJETIVO GERAL ... 17 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17
3. ARTIGO - XANTANA COMO ADITIVO CRIOPROTETOR EXTERNO PARA CONGELAMENTO DE SÊMEN OVINO ... 18
3.1. RESUMO ... 18 3.2. INTRODUÇÃO ... 19 3.3. METODOLOGIA ... 20 3.3.1. ANIMAIS ... 20 3.3.2. DILUENTE ... 20 3.3.4. AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS ... 23 3.3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 24 3.4. RESULTADOS ... 25 3.5. DISCUSSÃO ... 27 3.6. CONCLUSÃO ... 30 3.7. REFERÊNCIAS ... 31
1 INTRODUÇÃO
Os primeiros registros sobre congelamento bem sucedido de sêmen ovino são de Bernstein & Petropavlovsky em 1937 (SALAMON & MAXWELL, 1994) que usaram uma solução de glicerol (1M, 9,2%) para preservar espermatozoides de mamíferos (coelhos, cobaias, ovinos, bovinos, suínos, eqüinos) e de aves domésticas a -21°C. Apesar disso, até a atualidade, não há uma metodologia de criopreservação de sêmen ovino que permita seu uso em larga escala em programas de inseminação artificial (IA) em rebanhos comerciais, permitindo a introdução de material genético superior em larga escala nesses rebanhos, como ocorre na espécie bovina (EVANS & MAXWELL, 1987; BASPINAR et al., 2011). Além dos fatores inerentes ao sêmen, existem outros fatores limitantes para o uso da IA em larga escala, tais como: a anatomia da cérvice ovina que dificulta a passagem de cateteres (HOLT, 2000); a ausência de uma técnica de IA eficaz, simples e de baixo custo (WATSON, 2000); e a limitação dos métodos de avaliação da qualidade de sêmen para estimar a capacidade fecundante das células espermáticas criopreservadas (LUZ et al., 2000; TSAKMAKIDIS, 2010).
Dentro das limitações de utilização da IA em ovinos com sêmen congelado encontra-se o fato do sêmen ovino não possuir uma capacidade antioxidante adequada, em relação a outras espécies (AISEN et al., 2000), apresentando também diferenças na composição da membrana dos espermatozóides como uma alta concentração de ácidos graxos poliinsaturados susceptíveis a oxidação (BUCAK et al., 2007), o que dificulta o sucesso do processo de criopreservação. Além disso, os processos de congelamento e descongelamento de sêmen, em qualquer espécie animal, causam danos estruturais, bioquímicos e funcionais irreversíveis em grande parte das células espermáticas. Os danos ocorridos durante o resfriamento, congelamento e descongelamento são causados pela formação de gelo intracelular e pela desidratação da célula, o que expõe os espermatozoides a uma alta concentração de soluto (SALAMON & MAXWELL, 1995; WATSON, 2000). No processo de congelamento de sêmen ovino a escolha de um sistema tampão, de crioprotetores e aditivos como açúcares, quelantes de cálcio, antioxidantes e proteínas de leite ou gema de ovo apresentam uma grande influência na sobrevivência espermática (HOLT, 2000).
Aos diluentes, devem ser adicionadas macromoléculas, como lipoproteínas e fosfolipídios, que atuem como estabilizadores da membrana plasmática e como crioprotetores (PARKS & GRAHAM, 1992). Também devem ser fornecidas fontes de nutrientes para o metabolismo espermático e substâncias que atuem como tampão para a manutenção do pH. O diluente TRIS-glicose, sugerido por SALAMON & VISSER (1972), é uma das formulações mais usadas na criopreservação de sêmen ovino (EVANS & MAXWELL, 1987), na qual o Tris hidroximethil aminometano (TRIS) (HAHN, 1972) atua como tampão e a glicose como fonte energética.
A gema de ovo é um constituinte comum de diluentes para criopreservação de sêmen, protegendo a membrana plasmática dos espermatozoides contra o choque térmico decorrente do congelamento e do descongelamento (SALAMON & MAXWELL, 2000). Um dos fatores de proteção associados à gema de ovo é seu alto conteúdo de lecitina, que parece proteger a membrana celular por restituir os fosfolipídios perdidos pelos espermatozoides durante o choque térmico (WATSON, 1995). O efeito crioprotetor da gema de ovo também é atribuído a presença em sua composição de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (AMIRAT et al., 2004), que compete com os peptídeos catiônicos presentes no plasma seminal, os quais são prejudiciais à membrana espermática, além de formar um complexo com as proteínas do plasma seminal (BERGERON & MANJUNATH, 2006).
Como crioprotetor interno, geralmente, a substância de escolha para congelamento de sêmen ovino é o glicerol ou, ocasionalmente, dimetilsulfóxido e etilenoglicol, os quais apesar do efeito crioprotetor, induzem o estresse osmótico e são citotóxicos (WATSON, 2000).
O glicerol é usado como crioprotetor interno no congelamento de sêmen de diferentes espécies domésticas, em função de sua capacidade de penetração na célula através de difusão passiva pela membrana celular (PARKS & GRAHAM, 1992). A concentração de glicerol incluída nos diluentes para congelamento de sêmen é limitada por sua toxicidade (SALAMON & MAXWELL, 2000), a qual depende do tempo de exposição, da curva de resfriamento e congelamento, da composição do diluente e do método de adição do glicerol.
Diversos glicídos têm sido incluídos nos diluentes para criopreservação de sêmen, servindo como substratos de energia, componentes osmóticos ou crioprotetores, em função de seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico por atuarem como substitutos de eletrólitos (HOLT, 2000), como exemplo a
glicose (EVANS & MAXWELL, 1987). Os glicídios atuam na desidratação celular através da pressão osmótica, reduzindo o volume de água passível de ser congelada no interior da célula, de modo a reduzir as injúrias causadas pela formação de cristais de gelo (AISEN et al., 2005). O efeito crioprotetor dos glicídios é devido ao efeito osmótico e à interações específicas com os fosfolipídios presentes na membrana (BAKÁS & DISALVO, 1991). Desta forma, os glicídios conferem maior flexibilidade à membrana espermática, tornando-a mais resistente aos danos causados pelo choque térmico (AISEN et al., 2005). Além disso, os glicídios atuam como antioxidantes, protegendo a membrana contra o ataque de radicais livres produzidos pelas espécies reativas de oxigênio (ERO) (BUCAK et al., 2007). Em ovinos, o uso de alguns glicídios, como os dissacarídeos sacarose e trealose, em diluentes para sêmen criopreservado é associado com incremento nos parâmetros de qualidade seminal in vitro (BERLINGUER et al., 2007) e in vivo (AISEN et al., 2002).
Outros glicídios, como os polissacarídeos, vêm sendo utilizados no auxílio da criopreservação de gametas (HU et al., 2009), buscando a formulação de diluentes mais eficientes na preservação da motilidade e da integridade das células espermáticas pós-descongelamento (TONIETO et al., 2010). Compostos polissacarídeos derivados de plantas, quando adicionados ao diluente, parecem exercer função antioxidante e proteção da membrana espermática no processo de congelamento de sêmen suíno (HU et al., 2009).
Outros agentes têm sido estudados por atuarem como crioprotetores com diferentes efeitos sobre as células espermáticas. SCHMEHL et al. (1986), estudaram o efeito de diferentes polímeros com efeitos crioprotetores externos nas células espermáticas de sêmen ovino, observando maior efeito protetor nas combinações de agentes penetrantes com não penetrantes, dependendo da concentração destes compostos. Outro agente estudado foi a goma arábica, por Platov em 1977, associada com um diluente a base de lactose (SALAMON & MAXWELL, 1994). A goma arábica é um polissacarídeo de alto peso molecular, solúvel em água e secretado pela acácia (Acacia senegal). Em concentrações variando entre 1,5 e 15,0%, sua inclusão no diluente é bem tolerada pelos espermatozoides. Conforme pode ser observado, informações sobre a adição de polissacarídeos como aditivos ao meio de criopreservação de sêmen são escassas e apresentam resultados bastante variados.
1.1. ESTRESSE OXIDATIVO
Durante o processo de congelamento do sêmen, as células espermáticas são expostas ao oxigênio. O maior paradoxo da respiração aeróbica é que o oxigênio, essencial para produção de energia, pode também ser prejudicial, pois leva a produção de EROs (SALEH & AGARWAL, 2002). Todos os componentes celulares incluindo lipídios, proteínas, ácidos nucleicos e açúcares são potenciais alvos do estresse oxidativo (AGARWAL et al., 2008). Além disso, a membrana plasmática do espermatozoide contém lipídios na forma de ácidos graxos poliinsaturados, que são vulneráveis a ação das EROs, pois essas substâncias disparam uma cadeia de reação química chamada peroxidação lipídica (LPO) (ZALATA et al., 2004). As EROs são radicais livres e peróxidos (VALKO et al., 2005) que exercem funções relevantes em vários processos da fisiologia espermática, tais como a capacitação, a hiperativação e a fusão com o ovócito (AITKEN et al, 2004). Entretanto, as EROs também exercem efeitos patológicos no sistema reprodutivo do macho, envolvidos em casos de câncer de bexiga e próstata, bem como na infertilidade do macho (SALEH & AGARWAL, 2002). Dentre várias causas, o estresse oxidativo é atribuído por afetar a fertilidade e a fisiologia do espermatozoide (AGARWAL et al., 2008; FOOTE & HARE, 2000; BILODEAU et al., 2001).
O desequilíbrio entre a produção de ERO e o sistema biológico de proteção antioxidante, cuja função é detoxificar os intermediários da reação ou simplesmente reparar os resultados dos danos causados, é conhecido como estresse oxidativo (AGARWAL et al., 2003). Os espermatozoides são mais sensíveis a esse fenômeno que as células somáticas pela escassez de defesas citoplasmáticas (SALEH E AGARWAL, 2002). No entanto, a célula possui um sistema de defesa antioxidante enzimático (superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutadiona reduzida e glutationa redutase) e também não enzimático (vitamina C, vitamina E, albumina, taurina, hipotaurina, ácido úrico, ácido lipóico, coenzima Q) (NORDBERG & ARNÉR, 2001). Dentre os antioxidantes enzimáticos, a glutationa peroxidase (GSH-Px), a catalase (CAT) e o superóxido dismutase (SOD) são descritos como defesas contra os intermediários que causam a LPO, com ação importante na manutenção da motilidade e viabilidade espermática (BILODEAU et al., 2001; AITKEN E BAKER, 2004). Entretanto, os espermatozoides de mamíferos eliminam grande parte do citoplasma durante o processo terminal de maturação espermática e
a capacidade antioxidante pode ser insuficiente para a prevenção da LPO durante o processo de congelamento e descongelamento, devido à falta dos componentes citoplasmáticos, os quais poderiam neutralizar os danos causados pelas EROs e conseqüente geração de LPO (AURICH et al., 1997), necessitando com isso a inclusão de componentes com capacidade antioxidante que visam a redução dos danos causados pelo processo de congelamento (BUCAK et al., 2008).
No processo de congelamento as células espermáticas sofrem estresse oxidativo e diminuição da eficiência do sistema de proteção antioxidante (AGARWAL et al., 2003). Com o objetivo de reduzir os danos oxidativos causados pela concentração elevada de ERO e aumentar a viabilidade espermática, pesquisas têm avaliado a adição de substâncias antioxidantes (trolox, vitamina E, glutationa, vitamina C, catalase, cisteína, superóxido dismutase, taurina) como componentes de diluidores para sêmen ovino (BUCAK et al., 2008), bovino (BILODEAU et al., 2002), eqüino (SILVA et al., 2009) e suíno (GADEA et al., 2005).
UYSAL et al. (2007), estudando os efeitos de vários antioxidantes (glutationa reduzida 5mM, glutationa oxidada 5mM, cisteína 5mM, taurina 50mM, trealose 50mM, hipo-taurina 25mM, hialuronidase 1000μg/mL, albumina sérica bovina 5mg/mL) sobre a viabilidade de espermatozoides bovinos criopreservados, observaram efeito positivo da glutationa reduzida sobre a motilidade progressiva e a integridade de membrana plasmática. Entretanto, hialuronidase e taurina apresentaram resultados mais efetivos sobre a integridade do acrossoma e a morfologia espermática, respectivamente.
Dentre os compostos naturais, HU et al. (2009) utilizou um polissacarídeo originário de uma planta que apresenta efeitos anti-tumorais e de proteção cardíaca, para o congelamento de sêmen suíno. Dentre os tratamentos utilizados, a concentração de 0,5 mg/mL de polissacarídeo de Gynostemma pentaphyllum (GPP) apresentou benefícios para a motilidade espermática, a integridade da membrana e do acrossoma e a função mitocondrial e maiores níveis de SOD, sendo assim esta concentração apresentou um efeito crioprotetor benéfico na qualidade de sêmen suíno congelado.
1.2. GOMA XANTANA
A goma xantana (C35H49O29) é um polissacarídeo aniônico composto de um β-(1→4)-D-glicopiranose glucano como suporte principal, com cadeias laterais de (1
→ 3)-α-D-manopiranose-(2 → 1) ácido-ß-D-glucurónico - (4 → 1)-ß-D-manopiranose alternando resíduos. Cerca de metade dos resíduos de manose terminais são 4,6-pirúvicos enquanto a maioria dos resíduos de manose são 6-acetilado no seu interior.Aproximadamente a metade ou um terço da cadeia lateral possuem substitutos de piruvato, dependendo das condições de cultura
A goma xantana é um polissacarídeo de alto peso molecular, produzida por fermentação de cultura pura da bactérica Xanthomonas campestris, que sintetiza a goma para evitar sua desidratação, purificada por recuperação com etanol ou propanol, seco e liofilizado (GARCÍA-OCHOA et al., 2000). O biopolímero derivado da goma xantana vem sendo utilizado na indústria de alimentos, cosméticos e petrolíferos. Na indústria de alimentos, ela ganha destaque para os alimentos congelados (PAPAGIANNI & ANASTASIADOU, 2009), pois diminui os danos causados pela formação dos cristais de gelo no processo de congelamento e descongelamento (FERNÁNDEZ et al., 2007). Estudos toxicológicos e de segurança mostraram que a goma xantana não causa toxicidade aguda em animais de laboratório quando administrada de forma parenteral (WEBER et al., 2008).
Dentre as propriedades da xantana, destaca-se a viscosidade, sendo pouco afetada na presença de sais e permanecendo estável em ampla faixa de temperatura (10 °C a 90 °C) (GARCÍA-OCHOA et al., 2000). Além disso, a xantana possui estabilidade em ampla faixa de pH, sendo afetada apenas com valores de pH >11 e < 2,5 (PETTITT, 1982).
A goma xantana possui características pseudoplásticas, ou seja, a sua viscosidade diminui com o aumento da taxa de deformação do fluído. A viscosidade da xantana nas soluções praticamente não se altera com temperaturas entre 4 e 93 °C e pH entre 3 e 11 (BUENO & GARCIA-CRUZ, 2001; MAUGERI FILHO, 2001).
SHIMADA et al. (1992) investigou a relação entre a habilidade de ligação do Fe+2 a estrutura da xantana, sendo conteudo de piruvato e a atividade de ligação do Fe+2 mensurado através de diferentes tipos de xantana, onde encontrou que residuos de piruvato na xantana foram relacionados com a antioxidação do óleo de soja através da quelação dos ions de ferro.
Até o momento, não existem trabalhos sobre a utilização do biopolímero Xantana na criopreservação de células espermáticas de ovinos. Na busca por novas alternativas de crioprotetores de origem natural, que não sejam tóxicos para os espermatozoides e que permitam melhorar a qualidade seminal
pós-descongelamento, a goma xantana pode ser uma alternativa na composição de diluentes para o congelamento de sêmen ovino.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Determinar o efeito da adição da goma xantana na criopreservação de sêmen ovino.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito da adição da goma xantana em diferentes concentrações em um diluente para congelamento de sêmen ovino sobre a qualidade seminal; Avaliar a produção de espécies reativas de oxigênio e a capacidade
3 ARTIGO - XANTANA COMO ADITIVO CRIOPROTETOR EXTERNO PARA CONGELAMENTO DE SÊMEN OVINO
3.1 RESUMO
A goma xantana pode contribuir para reduzir a formação de cristais de gelo no meio usado para congelamento de sêmen, favorecendo a preservação da viabilidade espermática pós-descongelamento. Como não existem informações acerca do uso da goma xantana como aditivo crioprotetor para sêmen ovino, este trabalho objetivou determinar o efeito de três diferentes concentrações de xantana (0,15%, 0,20% e 0,25%) sobre a qualidade espermática pós-descongelamento. Testes in
vitro de qualidade seminal, avaliando a motilidade e vigor, integridade de membrana
e do acrossoma e a função mitocondrial foram realizados pré-congelamento e pós-descongelamento. Foram realizados testes bioquímicos para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e capacidade antioxidante total (TOSC) através da utilização de um fluorímetro e a sonda fluorescente H2DCF-DA. A adição de xantana não trouxe benefícios para a integridade da membrana e do acrossoma, nem para a funcionalidade mitocondrial (p>0.05), mas a motilidade espermática pós-descongelamento foi reduzida (p<0.05) nos tratamentos com 0,20 e 0,25% de xantana (22,2% ± 4,1 e 20,8% ± 4,1, respectivamente), em comparação com o controle sem inclusão de xantana (32,2% ± 4,1) (p<0.05). Por outro lado, a xantana mostrou características antioxidantes, pois a concentração de ERO foi reduzida conforme aumentou a concentração da xantana (p<0.05). Assim, a xantana apresentou capacidade antioxidante extracelular, sendo eficiente na diminuição das espécies reativas de oxigênio geradas no processo de congelamento.
3.2 INTRODUÇÃO
Durante o processo de congelamento e descongelamento do sêmen ovino ocorrem danos estruturais, bioquímicos e funcionais em grande parte das células espermáticas (SALAMON & MAXWELL, 1995). Estes danos são determinados em parte por efeitos tóxicos e osmóticos gerados pela ação dos crioprotetores utilizados (SALAMON & MAXWELL, 2000) e por danos estruturais e funcionais, em função da formação de cristais de gelo durante o processo de congelação (EVANS & MAXWELL, 1987).
Adicionalmente, agentes oxidantes produzidos pelo metabolismo celular provocam danos às membranas e ao material genético das células. Desta forma, para que seja possível criopreservar espermatozoides ovinos com eficiência, é necessário minimizar tais problemas. Diferentes aditivos crioprotetores têm sido utilizados para preservar a integridade e a funcionalidade espermática pós-descongelamento (SALAMON & MAXWELL, 1994). Dentre os aditivos testados, observou-se que açúcares como a sacarose e a rafinose (JAFAROGHLI et al., 2011) e a trealose (TONIETO et al., 2010) atuam como protetores da membrana espermática. Outros agentes como a gelatina (VANNI et al., 2008; CORCINI et al., 2011) e a goma-arábica (PLATOV, 1977 apud SALAMON & MAXWELL, 1994; SCHMEHL et al., 1986) também demonstraram efeito benéfico na preservação de sêmen mas não tiveram seu uso difundido, apesar dos seus potenciais benefícios. Com base neste princípio, existe a hipótese de que a goma xantana, normalmente empregada no congelamento de alimentos, possa atuar como aditivo crioprotetor espermático, quando associada a diluentes para criopreservação de sêmen. A goma xantana é um biopolímero produzido pela Xanthomonas campestris e apresenta como principais propriedades a manutenção da viscosidade na presença de sais e estabilidade em uma ampla faixa de temperatura (GARCÍA-OCHOA et al., 2000). Seu alto peso molecular pode contribuir na dinâmica de formação de cristais de gelo no meio diluidor, favorecendo a preservação da viabilidade espermática pós-descongelamento. Em função da ausência de informações sobre o uso da goma xantana como aditivo crioprotetor para sêmen ovino, este trabalho objetivou determinar o efeito de sua inclusão sobre a qualidade espermática pós-descongelamento e seus efeitos antioxidantes.
3.3. METODOLOGIA 3.3.1. ANIMAIS
Foram utilizados como doadores de sêmen sete carneiros sexualmente maduros e clinicamente saudáveis, alojados em instalações do Biotério Central da UFPel, sob as mesmas condições de manejo e alimentação. As coletas de sêmen foram realizadas duas vezes por semana através de vagina artificial, em tubo plástico graduado (EVANS & MAXWELL, 1987), tendo sido realizadas 8 coletas de sêmen para cada carneiro. Foram utilizados apenas ejaculados que, após a coleta, apresentassem motilidade ≥ 70%, vigor ≥ 3 (em escala de 0 a 5) e concentração ≥ 2,0x109 espermatozoides móveis/ml, obtido através de leitura pelo método da câmara de Neubauer (EVANS & MAXWELL, 1987; CBRA, 1998).
3.3.2. DILUENTE
A constituição do diluente base utilizada para a criopreservação do sêmen foi a descrita por EVANS & MAXWELL (1987) com base em tris-gema-glicerol (TGG), conforme consta na Tabela 1. Antes da adição do glicerol o diluente base apresentou pH de 6,9 e osmolaridade de 660 mOsmol/kg. A goma xantana (G1253-100G, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) foi adicionada ao meio base para obtenção de uma concentrações finais de 0,15%, 0,20% e 0,25%.
Tabela 1: Composição do diluente utilizado como base para os tratamentos TGC,
TGCX15, TGCX20 e TGCX25. Componente Quantidade Tris (g) 3,634 Glicose (g) 0,500 Ácido cítrico (g) 1,990 Gema de ovo (ml) 15,0 Glicerol (ml) 5,0 Penicilina (UI) 100.000 Estreptomicina (mg) 100 Água destilada q.s.p. (ml) 100,0
Fonte: EVANS & MAXWELL (1987).
TGC: Tris-gema-glicerol, controle sem adição de xantana; TGCX15: Tris-gema-glicerol com 0,15% de xantana; TGCX20: Tris-gema-glicerol com 0,20% de xantana; TGCX25: Tris-gema-glicerol com 0,25% de goma xantana.
As amostras de sêmen que atingiram os padrões mínimos foram diluídas no diluente base (1:1, v/v). Desta primeira diluição, foi obtida uma alíquota com 1,2x109 espermatozoides móveis de cada carneiro, a qual foi acrescentado diluente base para completar o volume 0,5ml. Ao volume de 0,5ml, foram adicionados 2,5 ml do meio diluidor de cada tratamento, obtendo-se um volume final de 3 ml, para posterior envase em palhetas de 0,25ml (IMV® Technologies, L’Aigle, France) com uma concentração final de 0,1x109 espermatozoides móveis/palheta. Os tratamentos foram: Tris-gema-glicerol (TGC), controle sem adição de xantana (G1253-100g, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA); Tris-gema-glicerol com 0,15% de xantana (TGCX15); gema-glicerol com 0,20% de xantana (TGCX20); e Tris-gema-glicerol com 0,25% de goma xantana (TGCX25). Para cada tratamento foram congeladas 8 palhetas.
Dez minutos após a diluição final, antes do início da curva de congelamento, foram analisados os seguintes parâmetros: motilidade e vigor espermáticos; integridade da membrana plasmática e do acrossoma; e funcionalidade da mitocôndria. O congelamento foi realizado em equipamento automatizado (TK 3000®, Uberaba, MG, Brasil). Para o resfriamento foi utilizada a taxa de 0,25°C/minuto até atingir 5°C. Posteriormente, deu-se início a curva de congelamento, com a taxa de resfriamento de 20°C/minuto, até atingir a temperatura de 120°C. Após, as palhetas foram imersas em nitrogênio líquido a temperatura de -196°C.
3.3.3. AVALIAÇÕES in vitro DE QUALIDADE ESPERMÁTICA
Além da avaliação prévia, após o congelamento, duas palhetas de cada tratamento e de cada carneiro foram descongeladas em banho-maria a 36°C, durante 30 s, para avaliação dos parâmetros de qualidade seminal citados acima. Nas avaliações de integridade da membrana e do acrossoma e da funcionalidade mitocondrial foram avaliadas 200 células espermáticas por lâmina.
A motilidade e o vigor foram avaliados com visualização em microscopia óptica em aumento de 200x, de uma alíquota de 5µl em uma lâmina coberta por lamínula, ambas previamente aquecidas a 37°C (BEARDEN & FUQUAY, 1997; CBRA, 1998). Após as avaliações de motilidade espermática do sêmen fresco e do sêmen descongelado, foi considerada uma variável da queda na motilidade, onde foi avaliada pela diminuição da motilidade pós-descongelamento pela motilidade
pré-congelamento, assim consideramos a influencia da xantana sobre a motilidade espermática.
A integridade de membrana plasmática foi avaliada através das sondas fluorescentes diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) (C4916-25mg, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) e Iodeto de Propídio (IP) (P4170-1g, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), conforme descrito por HARRISON & VICKERS (1990). Esta avaliação foi feita em aumento de 400x em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América INC, São Paulo, SP), utilizando filtro WU com excitações de 450-490nm e emissão de 516 (CFDA) e 617nm (IP). As células que apresentavam fluorescência verde foram consideradas íntegras, enquanto as células com fluorescência vermelha e verde/vermelha foram consideradas danificadas.
Para a avaliação da integridade de acrossoma, inicialmente, amostras de 20μL foram centrifugadas a 300 G por 10min, sendo o sobrenadante desprezado. Após, o pellet era re-suspenso em 80μL de PBS (Phosphate Buffer Saline), sendo a amostra agitada e centrifugada novamente a 300 G por 10min. O sobrenadante era novamente desprezado e o pellet resultante re-suspenso em 20μL de PBS. A partir dessas amostras, foram confeccionados esfregaços em lâminas. Depois de secas, as lâminas foram submersas em álcool etílico absoluto (459844-1L, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) por 5min, sendo novamente lavadas em PBS. Em uma sala escura, adicionaram-se às amostras, por 10min, 20μL do Conjugado de Lectina de Arachis hypogaea FITC (20 mg/mL) (L7381-1mg, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Posteriormente, as lâminas foram lavadas em água deionizada e drenadas. Após esse procedimento, adicionaram-se 10μL de solução de Glicerol (G6279-1L, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) com PBS (9:1 v/v). As lâminas foram avaliadas em aumento de 1000 x, em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América INC, São Paulo, SP), em filtro WU com excitações de 450-490nm e emissão de 520nm. Foram consideradas células com acrossomas íntegros aquelas que apresentavam fluorescência verde no acrossoma e com morfologia normal. Quando toda a célula não era corada e a coloração verde não era aparente ou quando a morfologia acrossômica estava anormal, foi considerado danificado (KAWAMOTO et al., 1999).
A integridade mitocondrial foi avaliada com o uso de uma sonda específica, Rodamina 123 (Rh123) (R8004-5mg, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO,
USA), juntamente com IP para a discriminação entre os espermatozoides vivos e mortos (GRASA et al., 2004). Uma alíquota de 100 μL do sêmen descongelado foi adicionado em um microtubo de 1,5 mL, em seguida adionado 5 μL de formaldeído (1,7mM), 5 μL de IP (7,3mM) e 5 μL de Rh123 (0,2mM) e incubado a 37ºC por 30 min no escuro. As células foram avaliadas em aumento de 400x em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América INC, São Paulo, SP), em filtro WU com excitações de 450-490 nm e emissão de 516 – 617 nm. As células que apresentavam a peça intermediária com uma intensa fluorescência verde foram consideradas com mitocôndrias integras (funcionalmente ativas), enquanto as células sem intensa fluorescência verde na peça intermediária foram consideradas não funcionais. Foi realizada a avaliação de 200 células espermáticas por lâmina nas avaliações de integridade de membrana, integridade de acrossoma e funcionalidade mitocondrial.
3.3.4. AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS
A quantificação de espécies reativas de oxigênio (ERO) no sêmen descongelado foi realizada por teste de cinética ERO, modificado de MYHRE E FONNUM (2001), através de um fluorímetro (Victor 2, Perkin Elmer). Após o descongelamento do sêmen em banho-maria a 36°C durante 30 s, este foi depositado em microtubos de 1,5 ml onde foi centrifugado por duas vezes a 800 G por 10 min com descarte do sobrenadante e ressuspensão do pellet com 1 ml de PBS livre de cálcio e magnésio. Foram retirados 400 μl do volume e congelado para a análise da capacidade antioxidante total (TOSC). Foram adicionadas 600 μl do preparo da sonda fluorescente 2’7’Diacetato de Diclorofluoresceina H2DCF-DA (40μM em PBS) (35845-1g, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) para ressuspensão do pellet, 5 s em vórtex, permanecendo em incubação com a sonda por 30 min a 36°C. Logo foi realizada a última centrifugação e lavagem com 600μl de PBS para retirada do excesso da sonda H2DCF-DA e posterior leitura no fluorímetro. Foram colocadas 160μl das amostras, em triplicatas, em placas brancas de 96 poços. A leitura foi realizada em 12 ciclos com intervalo de 4 min e agitação de 2 s antes e depois de cada ciclo em uma temperatura de 36°C.
O princípio deste método é baseado na incubação das células pela sonda H2DCF-DA, a qual atravessa passivamente através da membrana onde o acetato é clivado pelas esterases intracelulares. Em seguida, o composto não fluorescente
H2DCF é oxidado pelas ERO, para o composto fluorescente DCF. A fluorescência é mensurada através do fluorímetro usando comprimentos de onda de excitação de 488nm e um comprimento de onda de emissão de 529nm. A geração de EROs foi determinada através da integração da área da curva de fluorescência pelo tempo, sendo os resultados expressos por UFx107.
A capacidade antioxidante total foi mensurada contra os radicais peróxidos, gerados pela decomposição térmica a 36°C, de 2,2’ –azobis (2-metilpropionamidina) dihidrocloreto (ABAP), segundo AMADO et al. (2009). Para a realização do protocolo, foi descongelada a alíquota de 400 μl, sonicada por 5 s e, em seguida, centrifugada a 800 G por 10 min. Em uma placa de 96 poços foi adicionado 125 μl de tampão de reação (PBS), sendo acrescido uma alíquota de 10 μl de cada amostra em 4 poços. Em dois poços foram acrescentados 7,5 μl de água Milli-Q e nos outros dois, 7,5 μl de solução de ABAP (20 μM), sendo as amostras feitas em duplicatas. Em seguida foram adicionados 10 μl de solução da sonda H2DCF-DA (16 μM) em cada poço para leitura no fluorímetro durante 30 minutos com intervalo de 5 min em temperatura controlada de 36ºC.
O resultado final, ou seja, a capacidade antioxidante da xantana contra os radicais peróxidos foi obtida pela diferença entre a área ERO com e sem ABAP relacionado à área ERO sem ABAP, calculados como descrito anteriormente para a análise de geração de EROs.
3.3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Em função de não apresentarem distribuição normal, de acordo com o teste de Shapiro-Wilk, as variáveis motilidade espermática e integridade do acrossoma foram submetidas à transformações para a escala de arco-seno, enquanto que a integridade da membrana e função mitocondrial foram transformadas para escala logarítmica. Porém, para fins de interpretação, seus resultados foram relatados na escala original.
Foi conduzida análise de variância com medidas repetidas, considerando os tratamentos e as coletas de sêmen como variáveis independentes, sendo o efeito dos machos ajustado dentro do efeito dos tratamentos. As comparações entre médias foram realizadas através do teste LSD. Todas as análises estatísticas foram conduzidas com o programa STATISTIX®9 (2008).
3.4. RESULTADOS
Não foi observada qualquer diferença em nenhum dos parâmetros espermáticos pré-congelamento (P > 0,05), em função dos tratamentos (Tabela 2).
A motilidade espermática pós-descongelamento foi maior no tratamento controle (P < 0,05) do que tratamentos com inclusão de 0,20% e 0,25% de xantana (Tabela 3). Os tratamentos não apresentaram efeitos sobre a integridade da membrana e do acrossoma e sobre a função mitocondrial (P > 0,05).
Tabela 2: Motilidade espermática, integridade da membrana e do acrossoma, antes do congelamento de sêmen ovino com diluente incluindo diferentes concentrações de xantana (médias ± EPM)*
Tratamento Motilidade fresco (%) Integridade da membrana (%) Integridade do acrossoma (%) TGC 81,4 ± 1,7 67,2 ± 2,8 49,6 ± 3,5 TGCX15 77,1 ± 2,0 64,9 ± 2,2 51,4 ± 3,5 TGCX20 76,1 ± 1,9 57,5 ± 2,7 51,5 ± 3,2 TGCX25 75,3 ± 2,0 60,7 ± 2,5 54,3 ± 3,3
*Não houve diferença estatística (P > 0,05) entre os tratamentos TGC: Tris-gema-glicerol, controle sem adição de xantana; TGCX15: Tris-gema-glicerol com 0,15% de xantana; TGCX20: Tris-gema-glicerol com 0,20% de xantana; TGCX25: Tris-gema-glicerol com 0,25% de goma xantana.
Tabela 3: Motilidade espermática, queda na motilidade espermática (diferença entre a motilidade espermática pré e pós congelamento), integridade da membrana e do acrossoma e função mitocondrial, após o descongelamento de sêmen ovino com diluente incluindo diferentes concentrações de xantana (médias ± EPM)*
Tratamento Motilidade (%) Queda na motilidade (%) Integridade da Membrana (%) Integridade do acrossoma (%) Função mitocondrial (%) TGC 32,2 ± 1,8a 49,1 ± 3,2 a 28,4 ± 2,5 a 46,4 ± 3,3 a 34,6 ± 3,3 a TGCX15 26,5 ± 1,5ab 50,6 ± 3,2 a 31,8 ± 2,6 a 47,5 ± 3,4 a 29,3 ± 4,2 a TGCX20 22,2 ± 1,6b 53,8 ± 3,2 a 31,1 ± 2,3 a 45,0 ± 3,6 a 27,7 ± 4,2 a TGCX25 20,8 ± 1,3b 54,4 ± 3,2 a 30,3 ± 2,1 a 40,7 ± 2,6 a 31,8 ± 4,2 a
*Letras diferentes sobrescritas indicam diferença estatística (P < 0,05) nas colunas. TGC: Tris-gema-glicerol, controle sem adição de xantana;
TGCX15: Tris-gema-glicerol com 0,15% de xantana; TGCX20: Tris-gema-glicerol com 0,20% de xantana; TGCX25: Tris-gema-glicerol com 0,25% de goma xantana.
Os parâmetros espermáticos avaliados quanto à produção de ERO e TOSC, em função dos tratamentos, são mostrados na tabela 4. A produção de ERO diferiu de acordo com as diferentes concentrações de xantana, com maior produção de ERO no grupo TGC, no qual não houve adição de xantana (P < 0,05) em comparação com os grupos com adição de 0,20% e 0,25% de xantana. Porém, o grupo com inclusão de 0,15% de xantana não diferiu do grupo controle (P < 0,05), no que diz respeito á produção de ERO. A capacidade antioxidante total não diferiu entre as diferentes concentrações da goma xantana (P > 0,05).
Tabela 4: Produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e capacidade antioxidante total (TOSC), expressas pela área por unidade de fluorescência, após o descongelamento de sêmen ovino com diluente incluindo diferentes concentrações de xantana (médias ± EPM)*.
Tratamento ERO TOSC
TGC 1,97 ± 0,2x107 a 2,47 ± 0,15x107 a TGCX15 1,67 ± 0,1x107 ab 2,37 ± 0,15x107 a TGCX20 1,47 ± 0,1x107 bc 2,47 ± 0,16x107 a TGCX25 1,27 ± 0,1x107 c 2,37 ± 0,15x107 a
*Letras diferentes sobrescritas nas colunas indicam diferença estatística (P<0,05) nas colunas.
TGC: Tris-gema-glicerol, controle sem adição de xantana; TGCX15: Tris-gema-glicerol com 0,15% de xantana; TGCX20: Tris-gema-glicerol com 0,20% de xantana; TGCX25: Tris-gema-glicerol com 0,25% de goma xantana.
O efeito da capacidade antioxidante contra os radicais peróxidos (Figura 1) foi caracterizado pela diminuição dos valores da área dos gráficos formados pelo teste TOSC, menos os valores da área dos gráficos formados pelo ERO. Assim sendo: área de ERO com e sem ABAP menos área do ERO sem ABAP. Não houve diferença (P > 0,05) entre os tratamentos, pois nenhuma das concentrações de xantana mostrou-se capaz de aumentar a capacidade antioxidante das células.
Figura 1: Efeito da adição de xantana em diluente para congelamento de sêmen ovino sobre a capacidade antioxidante contra radicais peróxidos após o descongelamento.
3.5. DISCUSSÃO
Este é o primeiro estudo a avaliar o efeito da xantana como componente de diluente seminal com o objetivo de auxiliar no processo de congelamento, bem como avaliar seu potencial antioxidante. Nenhuma das concentrações de xantana testadas neste estudo trouxe vantagem para a preservação da qualidade do sêmen ovino pós-descongelamento, sendo que a adição de xantana foi associada com redução na motilidade, característica que é relevante para a deslocamento dos espermatozoides no trato reprodutivo da fêmea para alcançar o ovócito (POPWELL & FLOWERS, 2004). Esta diminuição de motilidade pode ser atribuida à ação de viscosidade que a xantana produz nas soluções, que não se altera em uma ampla faixa de temperatura (4 e 93°C) como descreve GARCÍA-OCHOA et al. (2000). Deste modo, quando incubado a 37°C, as propriedades da goma xantana foram mantidas, contribuindo para a diminuição da motilidade espermática.
Dentre os demais parâmetros de qualidade espermática avaliados in vitro, a xantana não contribuiu para diminuir os danos causados pelo processo de congelamento. Estes parâmetros podem aferir sobre aspectos fisiológicos e estruturais dos espermatozoides (LARSSON & RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, 2000), sendo que alguns estudos descreveram correlações entre estes parâmetros e a
predição da fertilidade do macho (CORREA et al., 1997; FOOTE, 2003). Já O’MEARA et al. (2008), trabalhando com aproximadamente mil ovelhas inseminadas com diferentes carneiros, observaram que nenhum parâmetro de qualidade espermática in vitro, avaliado por métodos subjetivos ou por sistemas computadorizados (CASA), conseguiu predizer a fertilidade, relatando que fatores relacionados com o ambiente uterino e o espermatozoide seriam mais apropriados para predizer a fertilidade dos carneiros. Logo, não podemos concluir efetivamente sobre o efeito da goma xantana sobre a capacidade de fertilização das células espermáticas.
HU et al. (2009) observou que altas concentrações do polissacarídeo
Gynostemma Pentaphyllum são associadas com queda na motilidade, na
integridade da membrana e do acrossoma e na atividade mitocondrial pós-descongelamento. Entretanto, concentrações mais baixas foram benéficas e apresentaram melhores médias para os parâmetros avaliados. Já CORCINI et al. (2011) avaliaram o efeito da adição de gelatina em diluente para sêmen suíno resfriado, sendo que 1,5% de inclusão de gelatina mantiveram a qualidade espermática até 96 h, com menor refluxo seminal após a inseminação, mantendo os mesmos índices reprodutivos que o tratamento sem a inclusão de gelatina.
Nossos dados demonstram que a xantana possa exercer um efeito antioxidante nas células espermáticas. Essa afirmação é corroborada com os resultados de CABRITA et al. (2001), que observaram que a adição de polissacarídeos no diluente de sêmen de truta exercia um efeito protetor superior ao observado sem a inclusão destes aditivos. Outro fato relevante é que estes carboidratos podem estabelecer pontes de hidrogênio com os grupos fosfatos dos fosfolipídeos de membrana (ANCHORDOGUY et al., 1987; RODGERS et al., 1993), reduzindo o fluxo de membrana durante o resfriamento e protegendo contra a perda das propriedades da membrana. Esta ação em diversos níveis de proteção da membrana plasmática pode fazer da xantana um candidato a ser considerado um antioxidante extracelular.
Esse é o primeiro trabalho a utilizar a metodologia ACAP para avaliação TOSC em células espermáticas. Esta técnica, descrita por AMADO et al. (2009) relata sua aplicação em células somáticas de peixe (J. multidentata - Anaplebidae), tais como o fígado, coração e músculo. A aplicação de fluorímetro com leitores de placas de 96 poços permite a determinação rápida de muitas amostras. Além disso,
um pequeno volume de amostra é suficiente, aproximadamente 60 μl para realização das triplicatas, sendo possível analisar 15 diferentes amostras com os padrões de branco com e sem ABAP ao mesmo tempo. Conforme REGOLI et al. (2002), a vantagem dessa técnica é a capacidade de estabelecer uma resposta antioxidante integrada de um organismo ou tecido contra um tipo particular de ERO, como os radicais peroxila, hidroxila e peroxinitrito. Seu uso tem sido empregado com sucesso para detectar a influência da poluição em esgotar as defesas antioxidantes em mexilhões (Mytilus galloprovincialis) transplantadas para áreas poluídas, sendo este efeito correlacionado com dano oxidativo a célula (REGOLI et al., 2004). Como os resultados da técnica ANCOMROS indicaram não ter havido diferença significativa sobre a capacidade antioxidante contra os radicais peróxidos, é possível concluir que a goma xantana não atua internamente na célula espermática influenciando sua capacidade antioxidante total, tendo ação como um antioxidante externo, evitando a oxidação dos compostos de membrana.
Os resultados deste trabalho demonstram que quanto maior for a concentração de xantana no diluente para congelamento de sêmen ovino, menor será a produção de ERO pelas células espermáticas após o descongelamento. Portanto, a xantana exerce um efeito de proteção oxidativa extracelular. Este efeito pode ser devido a sua atividade direta sobre as ERO, sobre a motilidade da célula ou sobre ambas as características. A diminuição da movimentação do flagelo espermático diminui a possibilidade de deslizamento dos diferentes pares de microtubulos, diminuindo assim a necessidade de ATP na peça intermediária. Desta forma, haveria uma menor taxa respiratória celular, diminuindo o consumo de oxigênio pela célula espermática, o que resultaria na redução na produção de ERO.
3.6. CONCLUSÃO
A adição da goma xantana a um diluente usado no congelamento de sêmen ovino não alterou a qualidade seminal pós-descongelamento. As concentrações de 0,20 e 0,25% de xantana apresentaram efeito antioxidante, devido à redução na produção de espécies reativas de oxigênio.
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