Organização do DNA nos cromossomas Organização dos genes nos cromosssomas Estrutura dos genes. e ainda: DNA repetitivo (DNA extracromossómico)

(1)

(2)

Genomas procariótico e eucariótico

• Organização do DNA nos cromossomas

• Organização dos genes nos cromosssomas

• Estrutura dos genes

e ainda:

• DNA repetitivo

(3)

Genomas

(generalidades)

Eucariotas

Célula- compartimentos celulares delimitados por membranas

Genoma- 2 ou mais moléculas de DNA lineares - DNA mitocondrial e plastidial

. menores dimensões . circular

- 1x102 _{Mb- 1x10}5 _MB_{(o mais pequeno = 10 Mb)}

Procariotas

Célula- não compartimentalização interna

Genoma- 1 molécula DNA circular - haplóides

- 1- 10 Mb

- plasmídios (1 kb-250 kb), profagos e elementos móveis - informação genética mais compacta

- grande diversidade de organização

Ex: Borrelia burgdorferi

cromossoma linear: 911 kb (835 genes)

(4)

Genoma = DNA cromossómico

Genoma = DNA cromossómico + DNA plasmídico

O que se considera “Genoma”?

Genoma = DNA cromossómico + DNA plasmídico

Vibrio cholerae: 2 moléculas de DNA circulares

- 2, 96 MB (3885 genes); 71% genoma - 1,07 MB (caract. plasmídio)

(5)

Dimensões de Genomas

(6)

(7)

Relação complexidade dos organismos com dimensão

do genoma

1) Organismos mais complexos Genoma de maiores dimensões

ex. Homo sapiens (3 Gb) vs Drosophila melanogaster (180 Mb)

2) Paradoxo C

(8)

Relação do número de genes com dimensão do

genoma

S. cerevisae - 12 Mb

0,004 do genoma humano (3 Gb)

Genoma humano – 35 000 genes x 0,004 = 140 genes para S. cerevisae

Genoma de levedura contém aprox.

5 800 genes

(9)

Relação de complexidade do organismo com o número de

genes e com dimensão do genoma

ARROZ

MILHO

Mesmo número de genes

0,43 Gb

2,5 Gb

Organismos semelhantes diferem na dimensão do genoma,

mantendo o mesmo número de genes aproximadamente

(10)

DNA supercoiling

“sobrenrolamento” ou “subenrolamento”

DNA within the cells adopts several forms of ordered

tertiary structures

begining with the formation of coiled

and supercoiled helical DNA under the control of enzymes

(11)

A dupla hélice do DNA é uma hélice

αααα

o que significa que tem enrolamento

right-handed

, ie, no sentido dos ponteiros do relógio

O

supercoliling

é consequência de:

demasiadas rotações (“super-rotação”-

overwound

)

da hélice sob si própria

(positive supercoiling)

,

ou perda de rotações (“sub-rotação”-

underrotating

)

sob si

própria (negative supercoiling)

sob si

própria (negative supercoiling)

Neste caso a direcção do enrolamento é oposta à do

right-handed

da dupla hélice

O

supercoling

só ocorre quando as duas cadeias de DNA não conseguem rodar livremente uma sobre a outra, ie,

quando as extremidades estão fixas e as superrotações ou subrotações

(12)

Superhelical tension in DNA

causes

DNA supercoiling

-an excess of helical turns

to accumulate in the DNA helix ahead of the protein

- a deficit of helical turns to arise in the DNA behind the protein The movement of the protein causes :

(13)

Positive and negative

supercoiling

Forma relaxada

- 10 pb/rotação na conformação B

Alteração da forma relaxada

- mais ou menos de 10 pb/rotação

₊

-- mais ou menos de 10 pb/rotação

na conformação B

+

-Negative supercoil

Ocorre quando o DNA está underrotated Enrolamento no sentido contrário do enrolamento da dupla hélice

Positive supercoil

Ocorre quando o DNA está overrotated

Enrolamento no mesmo sentido do enrolamento da dupla hélice

(14)

Topoisomerases

Enzimas que adicionam ou removem rotações da dupla hélice de DNA, quebrando temporariamente a dupla hélice, permitindo a rotação de uma cadeia em volta da outra, e depois ligando-a de novo.

Topoisomerase I

quebra de uma cadeia, e reduz o supercoiling devido a

remoção de rotações

Topoisomerase II

quebra de ambas as cadeias, adicionando ou removendo rotações

(15)

Organização do DNA cromossómico

em E. coli

(16)

Chromosome is condensed in one part of the cell

(17)

Cromossoma de

Cromossoma de E.coli

E.coli

- Molécula de DNA circular-fechada, negativamente enrolada

- 4 600 kb

- 99-100% codificante - aproxi. 4280 genes

Nick allows this loop

-Nucleóide (estrutura condensada): . 40-50 domínios independentes ou “loops” de 10-100 kb

. Topoisomerases

. Proteínas de ligação ao DNA

- HU

- H-NS (H1) - Fis

- IHF

-Divisão celular: “attachment point”

(versão desactualizada)

Nick allows this loop to become relaxed

(18)

Organização do DNA cromossómico

em eucariotas

(19)

2 3

(20)

(21)

Structure of a nucleosome

H3and H4 are among the most conserved proteins.

H2Aand H2Ban be recognized in all eukaryotes, but show species-specific variationin sequence.

The nucleosome core particle consists of 146 bp of DNA wrapped 1.65 turns

around a histone octamer consisting of two molecules each of H2A, H2B, H3, and H4.

A nucleosome(chromatosome)contains two full turns of DNA locked in place by one molecule of H1.

show species-specific variationin sequence.

H1, closely related proteins that show appreciable

variation between tissues and species

(22)

Octâmero de histonas

Dímero: H2A Dímero: H2A Dímero: H2A Dímero: H2A Tetrâmero: 2H3, 2H4 Tetrâmero: 2H3, 2H4 Tetrâmero: 2H3, 2H4 Tetrâmero: 2H3, 2H4 Dímero: H2B Dímero: H2B Dímero: H2B Dímero: H2B

(23)

(24)

Nuclease protection assays of chromatin

from human nuclei

(25)

Higher-level of packaging

Electron micrographs contrasting the 100 Å fiber with the 300 Å fiber (30 nm) 100 Å fiber with the 300 Å fiber (30 nm)

(26)

Diferentes níveis de organização das fibras de cromatina

(27)

Outras proteínas não-histonas presentes no

cromossoma

• No cinetocóro

• Nos telómeros

• No scaffold

• Proteína da maquinaria da replicação

–

DNA polimerases

–

DNA polimerases

–

Helicases

–

Primases

• HMP (high-mobility-group proteins)

–

RNA polimerases

–

Acetilases

–

Factores de transcrição

E ainda proteínas importantes na alteração do empacotamento e enrolamento da cromatina durante a transcrição

(28)

Proteins scaffold

Papel importante na estrutura do cromossoma

(29)

Estruturas particulares dos

cromossomas lineares

Centrómeros

Telómeros

(30)

Principais estruturas do cromossoma

(31)

Classificação dos cromossomas em função da

localização do centrómero

(32)

Estrutura do centrómero de levedura

Point mutantions in the central CCG of CDE3, completely inactivate the centromere

Mutations in CDE1 or CDE2 reduce

(33)

Proteins bind to yeast CDE elements Proteins bind to yeast CDE elements

The centromere is identified by a

DNA sequence that binds specific proteins. These proteins do not themselves bind to microtubules but establish the site at which the microtubule-binding proteins bind in turn.

(34)

Telomeres

Telomeres are required for the stability of the chromosome end

(35)

(36)

Heterocromatina e eucromatina

Heterocromatina- geralmente mantém estado de condensação durante o ciclo celular. Heterocromatina facultativa vs constituitiva

Eucromatina- geralmente sofre condensação e descondensação durante o ciclo celular.

(37)

Position-effect variegation in Drosophila is a phenotypic effect

of facultative heterochromatin

A chromosomal rearrangement (inversion or translocation) silence w+ _{in some cells}

and not others, produces a position-effect variegation

The heterochromatin can spread into de euchromatic regions, shutting off gene expression of euchromatic genes localized in the vicinity of heterochromatin,

(38)

Técnicas de coloração para produzir padrões de bandas

cromossómicos

Técnica Padrão de bandas

G-banding Bandas escuras são ricas em AT Bandas claras em GC

Q-banding Bandas escuras são ricas em GC

Bandas claras em AT

C-banding Bandas escuras contêm

heterocromatina constituitiva

(39)

Estrutura dos genes

e

Organização dos genes

Procariotas

Eucariotas

(40)

O que é um gene?

-Unidade de informação genéticacontida num segmento de DNA, logo é uma sequência de nucleótidos. O produto final pode ser uma proteínaou um transcrito (ex. tRNA)

-Pode variar entre 75 pb e 2 300 000 pb

- A informação biológica está contida na sequência de nucleótidos e é

tornada disponível através da expressão genética, que é altamente REGULADA

Quaisquer 6 nts podem originar 4096 sequências diferentes (46₎

Os genes estão organizados de diferentes modos

nos diferentes organismos

(41)

Operões: possível organização dos genes em

procariotas

• Alguns genes de procariotas estão organizados linearmente

sob o controlo da mesma região reguladora da transcrição

formando um OPERÃO

Regulação da expressão é coordenada

• Genes com funções relacionadas

• Ocorre em bactérias

DNA

lacZ lacY lacA

Região reguladora

(42)

Estrutura de um gene eucariótico

(43)

Organização geral dos genes

Topografia dos genes em 4 organismos diferentes

13

11 11

8

(44)

Feature Yeast Fruit fly Human

Compactamento do genoma em organismos diferentes

Gene density (average number per Mb) 479 76 11 Introns per gene (average) 0.04 3 9 Amount of the genome that is taken up

by genome-wide repeats

(45)

(46)

Exemplos de organização, pouco usual, de genes

Genes que se sobrepõem

-Alguns vírus (ex, fago X174 de E. coli)

-Tradução dos mRNAs em diferentes grelhas abertas de leitura

-Muito raro nos organismos superiores, mas -Muito raro nos organismos superiores, mas há exemplos nos genomas mitocondriaisde alguns animaise no Homem

Genes dentro de genes

- Frequente nos genomas nucleares

- Genes dentro de intrõesde genes Ex. no genoma humano o gene da

neurofibratose de tipo I, que contém três pequenos genes (OGMP, EVI2B, EVI2A), dentro do intrão 27

- Muitos snoRNAs são codificados por genesMuitos snoRNAs são codificados por genes dentro de intrões

(47)

DNA repetitivo

(48)

Equilibrium density gradient centrifugation of DNA

is also analytical useful , since the precise buoyant density of the DNA (p) is a linear function of its G+C content

(49)

DNA satélite no genoma humano

DNA fraccionado em gradiente

% G/C muito diferente nas bandas satélites, em relação à encontrada na banda principal

DNA repetitivo

Nota: existem outras sequências repetitivas para além das observadas no DNA satélite

em gradiente de densidade

(50)

Renaturação dos ácidos nucleicos

Renaturação dos ácidos nucleicos-- C

C

_o_o

tt

Co_t- Concentração em moles (C_o) de nucleótidos, por litro, de determinada molécula de DNA, e o tempo (t) de reacção.

(51)

Set of Cot curves for various DNA samples

O componente que renatura mais rapidamente no genoma

eucariótico é o DNA altamente repetitivo

Influência do tipo de

Influência do tipo de sequência de nucleótidossequência de nucleótidos, no tempo de renaturação do DNA, no tempo de renaturação do DNA

A cinética de reassociação identifica dois tipos de sequências genómicas:

-DNA NÃO REPETITIVO (únicas) e DNA repetitivo (mais do que uma cópia), este subdividido em MODERADAMENTE REPETITIVO e ALTAMENTE REPETITIVO

(52)

• DNA altamente repetitivo

–

até 10

5

_{cópias/genoma}

Ex. DNA satélite centromérico, SINEs, LINEs etc

DNA repetitivo

(DNA altamente e moderadamente repetitivo)

vs

DNA cópia única

• DNA moderadamente repetitivo

–

10 a 1000 cópias/genoma

Ex. famílias de genes relacionados (rRNAS, tRNAs, histonas, cinases

etc.),alguns transposões, mini e microsatélites etc.

(53)

Mini and microsatellites

• Minisatellites

usually few tens of nucleotides in length repeated in tandem

(repeating unit from 10 to 100 nts).

Also called VNTR (variable

number of tandem repeats).

Ex. telomeric DNA

• Microsatellites

usually, di- tri- or tetranucleotides repeated 10-20 x in tandem

(repeating unit <10 pb).

(54)

DNA repetitivo agrupado e disperso

Repetições agrupadas: micro- e minisatélites

(55)

Localização (mapeamento) de algumas sequências de DNA

(repetitivo agrupado) no cromossoma 1 humano

(56)

What is a genetic marker or DNA marker?

A distinctive feature of a genome map

ex.

- Any polymorphic mendelian character that can be used

to follow a chromosomal segment through a pedigree.

Genetic markers are usually

DNA polymorphisms

Genetic markers are usually

DNA polymorphisms

-

A gene carried by a cloning vector, that codes a distinctive protein and/or phenotype and so can be used to determine if a cell contains a copy of the cloning vector (we can follow plasmid transference)

(57)

DNA polymorphisms

• DNA polymorphisms

are sequence variations at specific sites (loci), in

non-coding regions of the genome. The precise sequence of DNA tends to

differ in unrelated individuals

• These polymorphisms when found in genes, accounting for the differences

in phenotype, are usually referred as

mutations

or

variants

• DNA polymorphisms of a specific locus, as well as variants of a gene, are

(58)

VNTR detection by PCR

I

(59)

VNTR detection by PCR

II

(60)

VNTR detection by PCR using multiple primers

Multiplex reaction

(61)

(62)

Gene families

Famílias Multigénicas Simples

ex. genes de rRNAs

Gene de rRNA 5S

1)

No Homem há 2000 cópias do gene que codifica rRNA 5S,em tandem no cromossoma 1

DNA intergénico

2)

Cromossomas 13, 14, 15, 21, 22 28 S 5.8 S 18 S X 50 – 70

/

cromossoma 28 S 5.8 S 18 S 28 S 5.8 S 18 S Gene de 45 S (28 S, 5.8 S, 18 S)

(63)

Gene families

Famílias Multigénicas Complexas

Gene clusters de αααα- e ββββ-globulina humana

Cromossoma 16

Agrupadas (

Agrupadas (clustered

clustered or

or tandem

tandem))

Cromossoma 16

Cromossoma 11

Ex: genes da aldolase que se localizam nos cromossomas 2, 9, 10, 16, 17

Dispersas

(64)

Famílias Multigénicas

- Simples e Agrupadas- várias cópias em tandem, de um mesmo gene, no mesmo cromossoma (ex. rRNA 5S)

- Simples e Dispersas- várias cópias de um mesmo gene em cromossomas diferentes (ex. gene do RNA 45S (rRNA 15S, 23S, 5.8S))

- Complexas e Agrupadas- diferentes cópias de genes que codificam proteínas com função - Complexas e Agrupadas- diferentes cópias de genes que codificam proteínas com função

semelhante,mas com algumas diferenças na sua sequência de aminoácidos, localizando-se todos no memsmo cromossoma e com alguma proximidade (ex. α−e β−globulina)

- Complexas e Dispersas- diferentes cópias de genes que codificam proteínas com função semelhante,mas com algumas diferenças na sua sequência de aminoácidos,, que se encontram em cromossomas diferentes (ex. gene da aldolase)

(65)

Grande parte do DNA moderadamente repetitivo pertence a uma classe de elementos ELEMENTOS MÓVEIS

São sequências de DNA móveis que se encontram no genoma de todos os organismos Transpõem-se deixando cópias (daí o repetirem-se)

Podem já estar fixas ou ainda terem a capacidade de se transpôr

Sequências de Inserção (IS) e transposões

Podem já estar fixas ou ainda terem a capacidade de se transpôr MECANISMO DE TRANSPOSIÇÃO

Não utiliza a maquinaria de recombinação homóloga da célula e

Podem transpôr-se através de

intermediário deDNA (é o caso da maioria dos procariotas) ou RNA (é o caso da maioria dos eucariotas)

inserindo-se em

sequências preferenciais ou sem sequência alvo