Análise molecular das populações de Potimirim brasiliana Villalobos, 1959 (Decapoda, Caridea, Atyidae)

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Análise molecular das populações de Potimirim brasiliana Villalobos,

1959 (Decapoda, Caridea, Atyidae)”

Bárbara Matos do Prado

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Análise molecular das populações de Potimirim brasiliana Villalobos,

1959 (Decapoda, Caridea, Atyidae)”

Bárbara Matos do Prado

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

Orientador: Dr. Leonardo Antonio Gomes Pileggi

Co-orientador: Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto

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Prado, B. M.

“Análise molecular das populações de Potimirim brasiliana Villalobos, 1959 (Decapoda, Caridea, Atyidae)”

v+45 p.

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

Orientador: Pileggi, L.A.G.; Co-orientador: Mantelatto, F.L.M.

1.Potimirim brasiliana 2.Atyidae 3.Camarão 4.Sistemática molecular 5.Relações evolutivas

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ii

“Uso a palavra para compor meus silêncios. Não gosto das palavras fatigadas de informar. Dou mais respeito às que vivem de barriga no chão tipo água pedra sapo. Entendo bem o sotaque das águas. Dou respeito às coisas desimportantes e aos seres desimportantes. Prezo insetos mais que aviões. Prezo a velocidade das tartarugas mais que as dos mísseis. Tenho em mim esse atraso de nascença. Eu fui aparelhado para gostar de passarinhos. Tenho abundância de ser feliz por isso. Meu quintal é maior do que o mundo. Sou um apanhador de desperdícios: Amo os restos como as boas moscas. Queria que a minha voz tivesse um formato de canto. Porque eu não sou da informática: eu sou da invencionática. Só uso a palavra para compor os meus silêncios.”

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iii A todos que participaram de alguma forma e à minha família, especialmente aos meus pais.

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iv

Agradecimentos

Em primeiro lugar, agradeço ao Prof. Dr. Fernando L. M. Mantelatto pela oportunidade em conhecer um pouco do meio acadêmico por meio do Laboratório de Bioecologia e Sistemática de Crustáceo (LBSC). Agradeço também a todas as sugestões e conversas que tivemos durante o andamento deste projeto, que contribuíram não só a este trabalho, mas também para meu futuro como bióloga.

Agradeço ao meu orientador, Dr. Leonardo A. G. Pileggi, por toda dedicação e paciência durante esses dois anos e pouco de trabalho juntos. Agradeço ainda por ter me ensinado e acompanhado em todos os processos no Laboratório de Molecular. E também por todas as conversas e emails (às vezes com um pouco de desespero), que me acrescentaram muito no trabalho.

Agradeço à Universidade de São Paulo pelo auxílio financeiro concedidos a mim para o desenvolvimento deste trabalho (Bolsa Institucional RUSP – processos 2012/2741 e 2013/1803). Agradeço também aos projetos que diretamente e indiretamente auxiliaram financeiramente e logisticamente para a realização deste ao LBSC, todos concedidos ao Prof. Dr. Fernando L. M. Mantelatto: FAPESP - projeto temático BIOTA-FAPESP (2010/50188-8), CNPq (Edital Universal 471011/2011-8 e PQ 302748/2015-5), Coleções Científicas (504322/2012-5), e CAPES (Ciências do Mar II Proc. 2005/2014 - 23038.004308/201414)

Agradeço à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP), especialmente ao Departamento de Biologia, pela formação que tive durante estes quatro anos, e pela disponibilidade de infra-estrutura para a realização deste projeto. Agradeço também ao Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jabuticabal (FCAV/UNESP) pela realização de parte do sequenciamento.

Agradeço a todos do LBSC, que me ajudaram nestes quase três anos de permanência no laboratório: Rafa, Mari, Mateus, Tati, Kana, Raquel, Kelps, Vanda, Fabrício, Nati, Caio, Ju, Ana, Mayara, Abner. Agradeço também aos que não estão mais no laboratório, mas que me ajudaram no início, Isa e Camila. Agradeço à Vandinha por toda ajuda e paciência em me ensinar a trabalhar com a Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB) do LBSC. Agradeço as meninas, Kana, Raquel, Nati, Tati e Kelps, por me ajudarem na molecular, tanto à respeito do meu projeto quanto à respeito de manutenção do laboratório de molecular. Agradeço aos companheiros

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v de iniciação científica, Ju, Ana e Caio, pelas conversar e desesperos compartilhados durante este período. Agradeço ao Rafa pelas conversas, que sempre me ajudaram e ajudam a refletir, não só sobre assuntos referentes a este trabalho e ao laboratório, mas também a pensar o que quero fazer como bióloga daqui pra frente. Estas conversas podem não ter sido em grande quantidade, mas me fez pensar muita coisa a meu respeito quanto ao futuro na carreira de bióloga. Um sincero agradecimento especial a todos!

Agradeço a todos os colegas e amigos que me deram apoio durante este período, em especial, Livia, Layara, Jabu, Well, Bastardo, Soldada, Tolima, Ju, Ana Luiza, Palito e Yoshi. Agradeço também toda a Bio 48 por fazer os dias e aulas se tornarem mais agradáveis e divertidos durante todo o curso.

E por fim, agradeço à minha família, em especial aos meus pais, Maria Lúcia e José Olímpio, por todo apoio e carinho dedicados a mim. Agradeço também pela paciência em me ouvir sempre que preciso falar, tanto em momentos de desesperos quanto em momentos que só preciso compartilhar a alegria e animação por algum motivo. Muitíssimo obrigada por estarem sempre comigo!

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Sumário

Resumo ...2 Abstract ...4 Introdução ...6 Objetivos ...11 Material e Métodos ...13

Obtenção dos espécimes ...14

Obtenção de dados moleculares ...14

Extração de DNA ...15

Amplificação do DNA ...16

Purificação dos produtos de PCR ...17

Amplificação dos produtos de PCR e sequenciamento do DNA ...17

Edição das sequências ...17

Análise dos dados ...24

Resultados ...27

Gene nuclear 28S ...28

Gene mitocondrial COI ...29

Discussão ...32

Conclusão ...37

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Prado, B. M. (2014)

Resumo

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Potimirim é um gênero de pequenos camarões de água doce, que vivem em rios e riachos

litorâneos da região Neotropical. Este possui uma sistemática que foi bastante controversa, porém algumas questões foram elucidadas recentemente com alguns trabalhos filogenéticos moleculares. No entanto, não existem trabalhos específicos utilizando-se de ferramentas moleculares sobre as populações da espécie Potimirim brasiliana, que resolvam a politomia encontrada em seu clado. Este projeto tem como objetivo uma análise filogenética com base em dados moleculares, visando à resolução das relações interespecíficas e intraespecíficas. Os marcadores moleculares que foram usados nas análises filogenéticas são os genes mitocondrial Citocromo oxidase I (COI) e o nuclear 28S. Foram sequenciadas amostras de P. brasiliana provenientes de populações dos estados de Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro e Bahia, além de espécimes de Potimirim

glabra, Potimirim potimirim e Potimirim sp. As sequências foram editadas no programa

computacional BioEdit versão 7.0.9, assim como a construção da sequência consenso de ambas as fitas. As sequências nucleotídicas editadas foram alinhadas pelo método de distância no programa ClustalW (implementado no BioEdit). Para se buscar o modelo de substituição mais adequado para os dados em questão, foi utilizado o programa JModeltest 2.1.4. Posteriormente, os alinhamentos foram analisados por máxima verossimilhança no programa Mega 6.A filogenia do 28S não elucidou as relações evolutivas entre as populações de P. brasiliana, mostrando apenas a separação entre dois grupos: um subgrupo formado por P. potimirim e um subgrupo formado pela espécie P. brasiliana e P. sp. Na filogenia do COI nota-se a separação entre o clado de P.

brasiliana e as demais espécies, revelando que este seja um grupo monofilético. Entre os

espécimes de P. brasiliana foram encontradas algumas separações de grupos, porém sem um padrão geográfico de distribuição.

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Abstract

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Potimirim is a genus of small fresh water shrimps, that live in rivers and coastal streams of

the Neotropical region. It has a very controversial systematic, but some issues were recently elucidated by some molecular phylogenetic works. However, there are no specific studies using molecular tools to Potimirim brasiliana populations that solve the polytomy found on its clade. This project aims a phylogenetic analysis based on molecular data, order the resolution of interspecific and intraspecific relations. The molecular markers used in phylogenetic analyzes are the mitochondrial gene Cytochrome oxidase I (COI) and the nuclear 28S. It were sequenced P.

brasiliana individuals from populations in Santa Catarina, Parana, Sao Paulo, Rio de Janeiro and

Bahia, and also specimens of Potimirim glabra, Potimirim potimirim and Potimirim sp. The sequences were edited in software BioEdit version 7.0.9., as well as the construction of consensus sequence of both tapes. The nucleotide sequences edited were aligned by distance method in the program ClustalW (implemented in BioEdit). To find the replacement model more appropriate for the data in question, was used the program JModeltest 2.1.4. Subsequently, the alignments were analyzed by Maximum Likelihood in the program Mega 6. The 28S phylogeny don´t brought the evolutionary relationships between the populations of P. brasiliana, showing only the separation between two groups: a subgroup formed by P. potimirim and a subgroup formed by the species P.

brasiliana and P. sp. In the phylogeny of the COI is possible to note the separation between the

clade of P. brasiliana and the other species, revealing that this is a monophyletic group. Among the specimens of P. brasiliana were found some separations of groups, but without a geographic pattern of distribution.

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Prado, B. M. (2014)

Introdução

7 A família Atyidae De Haan, 1849, que está inserida na superfamília Atyoidea De Haan, 1849, e na subordem Caridea Dana, 1852, apresenta importância ecológica em ecossistemas subtropicais e tropicais dulcícolas, tanto pelo processo de renovação de sedimentos (Moulton et

al., 2004; Souza & Moulton, 2005), quanto pelo papel fundamental na cadeia trófica de ambientes

límnicos (Benzie, 1982).

Os camarões de água doce da família Atyidae encontram-se distribuídos em rios e riachos litorâneos da região Neotropical, sob vegetação marginal submersa ou escondidos sob rochas e cascalho (Chace & Hobbs, 1969; Ramos-Porto & Palácios, 1981; Lima et al., 2006; Torati, 2009), e locais com correnteza (Chace & Hobbs, 1969; Ramos-Porto & Palácios, 1981). A ocorrência apenas em regiões litorâneas deve-se a dependência de água salobra para o desenvolvimento das larvas dos atídeos (Molina, 1987). Alguns fatores abióticos influenciam a estrutura populacional, como a temperatura que, por exemplo, é um fator que atua sobre a velocidade do desenvolvimento larval (Hoffmann & Negreiros-Fransozo, 2010), além de afetar também alguns padrões de reprodução (Barros & Fontoura, 1996b). Flutuações de densidade populacional podem ocorrer devido às variações de disponibilidade de alimento, em razão das correntes dos cursos d’água (Covich et al., 1991).

Este táxon envolveu muitas dúvidas e posições controversas em sua taxonomia ao longo do tempo. Uma delas foi a necessidade de se criar um novo gênero para separar espécies de

Ortmannia Rathbun, 1901 que eram diferentes de Atya Leach, 1816 (Torati, 2009). O gênero

Potimirim foi proposto por Holthuis em 1954, com este intuito. Já em 1961, Hart propôs o gênero Jonga Hart, 1961 para a espécie Potimirim serrei Bouvier, 1909, pois este possui uma fileira de

pequenos espinhos na margem supra-orbital do rostro, o que é ausente em Potimirim (Torati, 2009).

Esta família apresenta 40 gêneros, sendo Potimirim Holthuis, 1954 um deles (De Grave & Fransen, 2011). Algumas características reúnem os camarões do gênero: rostro curto com dentes somente na margem inferior; espinhos supraorbitais ausentes e com espinhos antenais e pterigostomiamos; córnea dos olhos não expandida; ausência de exopoditos na base dos pereópodos; presença de epipodito na base dos primeiros três ou quatro pares de pereópodos; presença de quelas delgadas; mesmo que pequenas, as palmas nos quelípodos estão presentes; diferenciação do apêndice do primeiro par de pleópodo, em machos (Holthuis, 1954).

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Prado, B. M. (2014)

Introdução

8 É notório a grande dificuldade na identificação das espécies de Potimirim (Page et al., 2008), a qual deve-se pela grande variabilidade existente dentro das espécies (Muller, 1892; Villalobos, 1959; Smalley, 1963) que possuem morfologias similares e ocupam, as vezes, ambientes semelhantes. Porém trabalhos filogenéticos moleculares, suportados por morfologia alfa (Page et al., 2008; Torati & Mantelatto, 2012) proporcionaram a resolução de algumas questões. Ainda, a biologia molecular tem se tornado uma importante ferramenta para a resolução de relações filogenéticas, uma vez que existem casos no qual a morfologia não é suficiente (Hillis, 1987; Meyer, 1997). Como exemplo tem-se a separação da espécie Potimirim glabra Kingsley, 1878 em três espécies (Potimirim glabra – encontrada na parte pacífica da América Central e Norte; Potimirim sp 2 – encontrada na parte atlântica da América Central e Norte; Potimirim

brasiliana Villalobos, 1959 – encontrada somente no Brasil), status este concluído pelo trabalho

de Torati & Mantelatto (2012).

Atualmente o gênero Potimirim é composto por cinco espécies descritas de camarões de água doce (Torati & Mantelatto, 2012): Potimirim americana Guérin-Méneville, 1855, Potimirim

mexicana De Saussure, 1857, Potimirim potimirim Muller, 1881, Potimirim glabra e Potimirim brasiliana. Além desta, existem duas espécies novas em processo de descrição por Torati &

Mantelatto: Potimirim sp 1 e Potimirim sp 2.

Potimirim brasiliana (Figura 1) é uma espécie endêmica do Brasil, com ocorrências

registradas nos estados da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná e Santa Catarina (Villalobos, 1959; Barros & Fontoura, 1996a; Torati, 2009; Torati & Mantelatto, 2012). De acordo com Torati (2009), algumas características reúnem estes atídeos na espécie Potimirim

brasiliana: margem superior do rostro bastante curvada; epipoditos presentes na base do quarto

par de pereópodos; pleurobrânquias presentes no oitavo somito torácico dos machos; dátilo do terceiro e quarto pares de pereópodos não muito espessos, apresentando margem superior não muito convexa e, com 6-8 espinhos grandes e curvos em sua margem inferior; camada espessa de cerdas do tipo “pits” na superfície interna do mero do terceiro e quarto pereópodos; parte inferior da margem anterior da quinta pleura praticamente reta; apêndice masculino estreito, com um entalhe em sua margem distal, apresentando três lobos bem definidos; margem superior do lobo posterior do apêndice masculino convexa.

De acordo com Grilli et al. (2014), P. brasiliana, da mesma forma que P. potimirim, é uma espécie gonocórica (sexos separados). Chegou-se a esta conclusão neste trabalho por meio da

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Prado, B. M. (2014)

Introdução

9 realização de uma descrição, com base em estudos morfológicos, do sistema sexual de ambas as espécies, na qual não se encontrou indivíduos em transição ou que apresentassem, simultaneamente, caracteres masculinos e femininos. O dimorfismo sexual nesta espécie é bem evidente, como se observa pela presença de apêndice masculino (Figura 2) encontrados nos machos, além da diferença no tamanho entre indivíduos de ambos os sexos. A fêmea geralmente atinge maior tamanho, maximizando o potencial reprodutivo da espécie (Parker, 1992). Em 2013, Rocha et al. realizaram um trabalho com um grupo de espécimes de Potimirim brasiliana coletado na Estação Ecológica Juréia-Itatins, em Peruíbe, estado de São Paulo e mediu a fecundidade média das fêmeas, que resultou em 361 ovos por fêmea. Estes ovos ficam aderidos às cerdas dos pleópodos por meio de filamentos, dando condições adequadas de areação e limpeza (Barros & Fontoura,1996a). Além disso, no trabalho de Rocha et al. (2013) foram observadas variações de atividade reprodutiva e fecundidade tanto pela época do ano, quanto pela localização das populações (populações mais ao sul do Brasil possuem uma menor atividade reprodutiva), sofrendo, assim, influencia de fatores ambientais e da latitude.

Figura 1: Potimirim brasiliana, exemplar de uma fêmea coletada na Ilha de São Sebastião em Ilhabela (SP) (CCDB 2205) (1: Carapaça; 2: Somitos Abdominais; 3: Télson; 4: Pereópodos; 5: Pleópodos; 6: Urópode).

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Prado, B. M. (2014)

Introdução

10 A maioria dos trabalhos que envolvem a espécie P. brasiliana é de caráter morfológico e ecológico. Não há um estudo conclusivo sobre as relações existentes entre as populações de P.

brasiliana ao longo de sua distribuição geográfica, que pode ser observada na politomia

encontrada em seu clado na filogenia molecular do gene mitocondrial 16S (Torati & Mantelatto, 2012). Em razão desta problemática, é de grande importância a realização de uma análise filogenética, com base em dados moleculares mais variáveis (e.g. COI), visando avaliar as relações entre as populações da espécie P. brasiliana, e as relações dentro do gênero.

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Prado, B. M. (2014)

Objetivos

12 O presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo filogenético do gênero

Potimirim com base em dados moleculares, visando entender as relações evolutivas entre as

populações de Potimirim brasiliana, e em relação a outras espécies do gênero, utilizando como marcadores moleculares o gene mitocondrial COI e o gene nuclear 28S.

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Material e

Métodos

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Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

14 Obtenção dos espécimes

Os espécimes de Potimirim brasiliana e de outras espécies do gênero Potimirim utilizados para este estudo foram obtidos da Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB) do Laboratório de Bioecologia e Sistemática de Crustáceos (LBSC), Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FFCLRP/USP). Os espécimes foram coletados manualmente com o uso de peneiras nos estados de Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo e Bahia. Os novos exemplares coletados foram devidamente identificados, etiquetados e armazenados em álcool etílico 80% e incorporados à CCDB/FFCLRP/USP. A confirmação da identificação das espécies foi realizada baseada nos trabalhos de Holthuis (1954), Villalobos (1959), Chace & Hobbs (1969), Chace (1972), Melo (2003), Torati (2009) e Torati & Mantelatto (2012), levando em conta características morfológicas como: forma do apêndice masculino, morfologia do rostro e do dátilo dos terceiro e quarto pares de pereópodos. A obtenção e manipulação do material genético estão em conformidade com a licença do SISBIO para coleta e análise genética de decápodes (nº 11777-1 Data da Emissão: 16/09/2007).

Obtenção de dados moleculares

Os dados foram obtidos com base em protocolos, seguindo a metodologia de Pileggi & Mantelatto (2010) e Torati & Mantelatto (2012), com algumas modificações que visaram à adequação ao material.

Os genes escolhidos para atuarem como marcadores moleculares deste trabalho foram os genes mitocondrial Citocromo oxidase I (COI) e nuclear 28S. Esta escolha foi devido ao gene COI ser reconhecido como bastante informativo para uma variedade de níveis filogenéticos (Crandall

et al., 2000; Schubart et al., 2000; Porter et al., 2005; Mantelatto et al., 2006; Page et al., 2008;

Pileggi & Mantelatto, 2010; Vergamini et al., 2011; Rossi & Mantelatto, 2013), uma vez que genes mitocondriais apresentam uma maior taxa de mutação em relação aos genes nucleares, possuindo sinal filogenético em um período de tempo mais curto. O 28S foi testado também, apesar de ser um gene nuclear, pois é mais usado na separação de espécies, tendo neste caso o objetivo de posicionar Potimirim brasiliana na filogenia do gênero. A escolha de um gene mitocondrial e um nuclear se deve ao fato de que o primeiro apresenta um padrão linear da

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Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

15 evolução por ser uma herança uniparental, enquanto o outro apresenta um padrão reticulado por ser uma herança biparental (Neigel & Avise, 1986).

Para a extração de DNA procurou-se, sempre que possível, selecionar animais de maior tamanho, machos e adultos, facilitando assim a precisão na identificação destes com base nos apêndices masculinos antes de se iniciar a extração. Estes espécimes, cujo tecido muscular foi extraído, foram separados e etiquetados dentro de seu lote e designados como voucher genético.

Extração de DNA

A extração foi realizada em três etapas. Na primeira etapa foi extraído tecido muscular abdominal, e algumas vezes até mesmo um pleópodo, dos espécimes escolhidos. O pleópodo foi extraído quando o indivíduo era muito pequeno e havia pouco tecido muscular abdominal, garantindo que se conseguisse uma concentração maior de DNA. Neste caso, não se extraía o par de pleópodo no qual se encontra o apêndice masculino, pois não se deve retirar uma estrutura que seja muito utilizada em sua identificação. O tecido extraído foi incubado em banho-seco por 12-24h em 600µl de tampão de lise e 200µl de proteinase K (500µg/ml) a 55°C. Na segunda etapa, primeiramente os tubos com o material ficaram 10 minutos no gelo, para que a atividade da proteinase K fosse inativada. Em seguida, adicionou-se 200µl de acetato de amônio (7,5 M), para que houvesse a separação das proteínas, seguido por uma centrifugação. O sobrenadante foi retirado do tubo e transferido para outro contendo 600µl isopropanol, que possui a função de decantar o DNA que ali se encontra. Os sobrenadantes com isopropanol ficaram 24h descansando a -20°C. Na terceira etapa, após uma centrifugação, descartou-se o isopropanol e adicionou-se 15µl de etanol 70% para lavar o restante de isopropanol que tenha ficado junto ao DNA. O etanol, depois de passar 10 minutos na geladeira e ser centrifugado, foi descartado. Em seguida, liofilizou-se e ressuspendeu-se os pellets em 20µl de tampão TE.

Foram realizadas extrações de DNA de 72 indivíduos do gênero Potimirim, no qual 49 indivíduos são da espécie P. brasiliana, alvo deste projeto. Estes indivíduos representam populações dos estados de Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro e Bahia. Além destes, alguns espécimes de P. potimirim foram usados, sendo que estes já possuíam material extraído (Tabela I).

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Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

16 A concentração de DNA extraído foi medida pelo Nanodrop 2000 Spectrophotometer®, a fim de se possibilitar a adequação da concentração do DNA extraído à concentração necessária para se realizar a amplificação dos genes de interesse pela técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) (Sambrook et al., 1989).

Tabela I: Relação dos espécimes de Potimirim potimirim que já possuíam material extraído (CCDB: Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia).

CCDB Localidade Número de indivíduos

sequenciados

2634 Ilhéus (BA), Brasil 1

2399 Isla Colon, Bocas del Toro, Panama 6 1893 Caieira do Norte (SC), Brasil 1 Amplificação do DNA

O gene mitocondrial COI foi amplificado por meio de técnica de PCR fazendo uso dos primers LCO1490 (5´ - GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G - 3´) e HCO2198 (5´ - TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA - 3´) (Folmer et al., 1994), e o gene nuclear 28S pelos primes 28S Rd1a (5’ - CCC SCG TAA YTT AAG CAT AT - 3’) e 28S Rd4b (5’ - CCT TGG TCC GTG TTT CAA GAC - 3’) (Edgecombe & Giribet, 2006). Os produtos de PCR foram obtidos a partir de uma reação de volume total 25µl contendo água destilada e deionizada, Taq Buffer, MgCl2 (25 mM), betaína (5 M), DNTPs, primers, Taq polimerase e DNA extraído.

O DNA foi amplificado no Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) com os seguintes ciclos termais: COI - desnaturação inicial por 2 min a 94°C; anelamento por 35 ciclos (30s a 94°C; 30s a 48°C e 1 min a 72°C); extensão final por 2 min a 72°C; 28S – desnaturação

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Material e Métodos

17 inicial por 5 min a 95°C; anelamento por 40 ciclos (45s a 95°C; 45s a 52°C e 1 min a 72°C); extensão final por 3 min a 72°C.

Purificação dos produtos de PCR

A purificação foi realizada utilizando-se kit SureClean®. Aos produtos de PCR foram adicionados 20µl de SureClean, seguido por centrifugação de 30min. O sobrenadante foi removido, e o pellet lavado com 40µl de etanol 70%. Após outra centrifugação de 30min e a retirada do etanol, as amostras foram liofilizadas e, os pellets foram ressuspendidos em 22µl de Água Milli-Q Autoclavada. Para que se seguisse para a próxima etapa, foi medida a concentração do material, sendo necessário no mínimo 10 ng/µl para cada fita do DNA a ser sequenciada.

Amplificação dos produtos de PCR e sequenciamento do DNA

Ambas as etapas foram realizadas pelo Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal (FCAV) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP). O sequenciamento foi realizado em um sequenciador automatizado ABI Prism 3100 Genetic Analyzer® (Applied Biosystems automated sequencer).

A Tabela II apresenta um resumo dos espécimes que foram sequenciados, com suas respectivas localidades de coleta.

Edição das sequências

As sequências foram editadas no programa computacional BioEdit versão 7.0.9. (Hall, 2005), assim como a construção da sequência consenso de ambas as fitas. Após esta etapa, as sequências consenso foram comparadas com outras sequências depositadas em banco de dados genéticos utilizando-se o programa de pesquisa BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.shtml).

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Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

18 Tabela II: Continua. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção (CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).

Espécie Localidade CCDB Número de acesso no

GenBank COI/28S

Potimirim brasiliana Ilhabela, São Paulo, Brasil

1991 KP202785/ KP202724

Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo, Brasil

2006 KP202787/ KP202726

2006 KP202806/ KP202747

2006 ─ / KP202748

2006 KP202815/ KP202749

2006 KP202816/ KP202750

2006 ─ / KP202740

2006 KP202817/ KP202741

2006 KP202781/ KP202751

Potimirim brasiliana Mangaratiba, São Paulo, Brasil

2142 KP202811/ KP202736

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Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

GenBank COI/28S

2142 KP202819/ KP202743

2142 KP202813/ KP202744

2142 KP202820/ KP202745

2142 KP202814/ ─

2142 ─ / KP202759

2142 ─ / KP202760

2142 ─ / KP202761

Potimirim brasiliana Iguapé, São Paulo, Brasil

2386 KP202808/ ─

Potimirim brasiliana Iguapé, São Paulo, Brasil

2386 ─ / KP202752

Potimirim brasiliana Paraty, Rio de Janeiro, Brasil

2005 KP202786/ KP202725

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Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

GenBank COI/28S

2005 KP202803/ KP202737

2005 ─ / KP202738

2005 KP202804/ KP202746

2005 KP202805/ KP202739

Potimirim brasiliana Matinhos, Paraná, Brasil

2115 KP202788/ ─

2115 KP202818/ ─

2115 KP202807/ ─

Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia, Brasil

1585 KP202789/ KP202727

1585 KP202790/ KP202728

1585 KP202791/ KP202729

(28)

Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

GenBank COI/28S

1585 KP202793/ KP202731

1585 ─ / KP202753

1585 ─ / KP202754

1585 ─ / KP202755

1585 ─ /KP202756

Potimirim brasiliana Ilhéus, Bahia, Brasil

2633 KP202794/ ─

2633 KP202821/ ─

2633 KP202795/ ─

(29)

Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

GenBank COI/28S

2633 KP202797/ ─

2633 ─ / KP202757

2633 ─ / KP202758

Potimirim brasiliana BR 376, Santa Catarina, Brasil

2116 KP202798/ KP202733

2116 KP202799/ KP202734

2116 KP202809/ KP202742

2116 KP202810/ KP202735

Potimirim potimirim Itapitangui, São Paulo, Brasil

3721 ─ / KP202763

Potimirim potimirim Itapitangui, São Paulo, Brasil

3720 ─ / KP202773

Potimirim potimirim Ariri, São Paulo, Brasil

3741 KP202800/ KP202774

Potimirim potimirim Cananéia, São Paulo, Brasil

(30)

Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

GenBank COI/28S

Potimirim potimirim Ilhabela, São Paulo, Brasil

3942 ─ / KP202775

Potimirim potimirim Ilhéus, Bahia, Brasil

2634 ─ / KP202765

Potimirim potimirim Canavieiras, Bahia, Brasil

3037 ─ / KP202772

Potimirim potimirim Piuma, Espírito Santo, Brasil

4069 KP202825/ ─

Potimirim potimirim Piuma, Espírito Santo, Brasil

4069 KP202826/ ─

Potimirim potimirim Iconha, Espírito Santo, Brasil

4066 KP202823/ KP202766

4066 ─ / KP202767

4066 ─ / KP202768

4066 KP202822/ KP202769

4066 KP202824/ KP202770

(31)

Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

24 Tabela II: Conclusão. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção (CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).

GenBank COI/28S

Potimirim potimirim Isla Colon, Bocas del Toro, Panamá

2399 KP202827/ KP202780

2399 KP202828/ ─

2399 KP202829/ KP202779

2399 ─ / KP202777

2399 ─ / KP202778

2399 KP202783/ KP202764

Potimirim potimirim Caieira do Norte, Santa Catarina, Brasil

1893 ─ / KP202776

Potimirim glabra Costa Rica - costa do Pacífico

3341 KP202782/ ─

Análise dos dados

As sequências nucleotídicas editadas foram alinhadas pelo método de distância no programa ClustalW (implementado no BioEdit) utilizando os parâmetros do “default” do programa.

As análises filogenéticas foram realizadas pelo método de máxima verossimilhança com os genes mitocondrial COI e nuclear 28S. Para o COI foram analisados 57 espécimes do gênero

(32)

Prado, B. M. (2014)

Material e Métodos

25

Potimirim, sendo 36 P. brasiliana, sete P. sp 2 (obtidas do GenBank como P. glabra*), duas P.

glabra (uma obtida no GenBank), 12 P. potimirim, além de duas espécimes como grupo externo,

sendo uma Atya scabra Leach, 1816 (obtida no GenBank) e uma Micratya poeyi Guérin-Méneville, 1855 (obtida no GenBank). Para o 28S foram analisados 59 espécimes do gênero

Potimirim, sendo 37 P. brasiliana, 20 P. potimirim (uma obtida no GenBank), uma P. sp 2 (obtida

no GenBank como P. glabra*), além de cinco espécimes como grupo externo, sendo uma Jonga

serrei Bouvier, 1909 (obtida no GenBank), uma Micratya poeyi (obtida no GenBank), uma Atya ortmannioides Villalobos, 1956 (obtida no GenBank), uma Atya scabra (obtida no GenBank) e

uma Atyoida bisulcata Randall, 1840 (obtida no GenBank). Todos os espécimes que foram utilizados neste trabalho e cujas sequências foram obtidas do GenBank se encontram na Tabela III, com seus respectivos números de acesso. Para se buscar o modelo de substituição mais adequado para os dados em questão, foi utilizado o programa JModeltest 2.1.2 (Darriba et al., 2012). Posteriormente, os alinhamentos foram analisados por máxima verossimilhança no programa Mega 6 (Tamura et al., 2013) de acordo com os métodos selecionados anteriormente e, utilizando-se a metodologia de bootstrap com 1000 réplicas.

Tabela III: Continua. Lista de espécies do Genbank que foram utilizadas, localidades, número de acesso no Genbank e referência onde foi publicada a sequência.

Espécie (gene) Localidade Genbank Referência

P. glabra (COI) Panamá JF811005.1 Page et al., 2011

P. glabra* (COI) Trinidade e Tobago JF811012.1 Page et al., 2011

P. potimirim (28S) Panamá FN995614.1 Von Rintelen et al., 2012

_{Estes P. glabra encontrados no GenBank que estão marcados (*), de acordo com Torati & Mantelatto (2012),}

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Material e Métodos

26 Tabela III: Conclusão. Lista de espécies do Genbank que foram utilizadas, localidades, número de acesso no Genbank e referência onde foi publicada a sequência.

Espécie (gene) Localidade Genbank Referência

P. glabra* (28S) Trinidade e Tobago FN995613.1 Von Rintelen et al., 2012

Atya scabra (COI) Trinidade e Tobago JF810990.1 Page et al., 2013

Micratya poeyi (COI) Caribe FJ348827.1 Cook et al., 2010

Atya scabra (28S) ---- FN995550.1 Von Rintelen et al., 2012

Micratya poeyi (28S) ---- FN995595.1 Von Rintelen et al., 2012

Jonga serrei (28S) ---- FN995587.1 Von Rintelen et al., 2012

Atya ortmannioides (28S) ---- FN995549.1 Von Rintelen et al., 2012

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Resultados

28 Primeiramente, realizou-se o PCR de apenas três extrações como teste para observar o resultado, em ambos os casos, para os genes COI e 28S. Este primeiro PCR teste foi realizado com temperatura de anelamento de 50°C e 48°C para COI e 28S, respectivamente, conforme o protocolo. Os resultados dos PCRs foram observados em eletroforese com gel de agarose 1% e fotografados com uma câmera digital C-7070 Olimpus® em um transiluminador UV M20 UVP®. Porém a banda, em ambos os acasos, não foi visualizada. A aparição desta banda significa que a região do DNA necessária para este trabalho foi amplificada. Com isso, houve a necessidade de se alterar a temperatura de anelamento. As temperaturas que apresentaram resultado positivo foram 48°C para COI e 52°C para 28S. Esta adaptação da temperatura é necessária, pois as condições das reações e o material que foi extraído possuem suas particularidades, sendo distintos de trabalho para trabalho, onde a temperatura e a duração de tempo necessário para o anelamento do primer dependem da composição de bases, comprimento e concentração de primers (Innis & Gelfard, 1990).

Todos os espécimes passaram por amplificação por PCR para ambos os genes, 28S e COI, porém nem todos tiveram resultado positivo. Em alguns casos, mesmo alterando a temperatura de anelamento e a concentração de material extraído, a banda não apareceu. Já em outros casos, a fita não aparecia totalmente limpa, com a presença de bandas inespecíficas, podendo ter ocorrido um erro na extensão devido à inibição da enzima DNA polimerase. Na primeira situação, este não passou pelo processo de sequenciamento; já no segundo caso, se ambas as fitas de um espécime estivessem muito ruins, esta sequência não foi utilizada para as análises moleculares.

Gene nuclear 28S

Para o gene nuclear 28S foram obtidas sequências que variam de 734 a 756 pares de bases (bp), e as provenientes do Genbank variam de 666 a 1110 bp, com isso foram todas alinhadas pelo ClustalW com um total de 666 bp. O modelo selecionado pelo programa JModeltest que melhor se adequou a este padrão de dados, segundo o critério de informação Akaike (AIC), foi Tamura-Nei+I, o qual apresentou as seguintes frequências das bases: A = 0,2303, C = 0,2710, G = 0,3426, T = 0,1561.

Com base nas diferenças genéticas das sequências e por meio do método de máxima verossimilhança do programa Mega, foi construído um cladograma observado na Figura 3.

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Resultados

29 Observou-se neste cladograma a existência de um grupo formado apenas pelos espécimes de P. potimirim (Figura 3 - A) que está inserido dentro de outro grupo composto pelos espécimes de P. brasiliana e um espécime de P. sp 2 (Figura 3 - B). Esta nova espécie citada neste trabalho foi proposta por Torati & Mantelatto (2012), com base em dados moleculares, no qual representa os espécimes antes chamados de P. glabra que ocorrem na região do Caribe.

Gene mitocondrial COI

Foram obtidas sequências para o gene COI com uma quantidade que varia de 640 a 700 bp, porém como as sequências provenientes do Genbank são menores (de 324 a 530 bp), o alinhamento foi realizado com apenas 530 bp para todas as sequências. O programa JModeltest selecionou o modelo Tamura-Nei + G como o mais adequado para este padrão de dados, segundo o critério de informação Akaike (AIC), apresentando as seguintes frequências das bases: A = 0,3183, C = 0,1490, G = 0,2432, T = 0,2895.

A partir do cladograma obtido (Figura 4) observou-se a separação do clado de Potimirim

brasiliana (Figura 4 - C) das outras espécies, permitindo dizer que este é um grupo monofilético.

Observa-se também que há uma relação maior entre P. glabra e P. sp 2 (Figura 4 - D), e que dentro de P. potimirim (Figura 4 - E) existe uma separação entre os espécimes do Brasil (Figura 4 - F) e os do Panamá (Figura 4 - G).

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Resultados

30 Figura 3: Cladograma de espécies de Potimirim, baseado no método de máxima verossimilhança do gene 28S. Números dos ramos referem-se aos valores de significância para 1000 réplicas de bootstraps. BA: Bahia; SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; SC: Santa Catarina; Tobago: Trinidade e Tobago; *: espécime que deveria passar por uma confirmação de sua identificação, porém sua sequência foi obtida no Genbank.

A

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Resultados

31 Figura 4: Cladograma de espécies de Potimirim, baseado no método de máxima verossimilhança do gene COI. Números dos ramos referem-se aos valores de significância para 1000 réplicas de bootstraps. BA: Bahia; SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; SC: Santa Catarina; PR: Paraná; *: espécime que deveria passar por uma confirmação de sua identificação, porém sua sequência foi obtida no Genbank.

C

D

E

G

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Discussão

33 O gene nuclear 28S não se mostrou eficiente para o estudo da relação entre as populações de P. brasiliana, uma vez que todos os espécimes ficaram reunidos em um único grupo. Esta politomia é semelhante à encontrada no trabalho de Torati & Mantelatto (2012), no qual foi utilizado o gene 16S. Os genes 28S e 16S são conservados de tal maneira, que em ambos os casos, não foi possível resolvem as relações evolutivas entre as populações de P. brasiliana. No trabalho de Hou et al. (2007) a filogenia encontrada para os genes nucleares (18S e 28S) não foram eficientes também, já que algumas politomias foram encontradas entre as espécies do gênero

Gammarus Fabricius, 1775. No cladograma proposto no presente trabalho para o gene 28S

observa-se a presença de um grupo composto apenas por P. potimirim, apontando ser este um grupo monofilético.

Genes mais conservados como os nucleares são mais utilizados em trabalhos que não precisam de marcadores moleculares tão variáveis, ou seja, na qual o gene não deve ter sofrido muitas mutações. Um exemplo é o trabalho de Gao et al. (2008), no qual foi realizado um estudo filogenético com o objetivo de analisar as relações entre grupos basais de hexápoda, na qual incluíram insetos, crustáceos, miriápodes e cheliceriformes. Para este tipo de estudo, ambos os genes utilizados, 18S e 28S, produziram resultados consistentes. Para este trabalho o gene 28S foi utilizado com o objetivo de posicionar P. brasiliana entre outras espécies do gênero, e testar se as separações das espécies são resultados de eventos recentes ou não. Este fato pode ser observado pela existência da separação entre P. brasiliana e P. potimirim, e a presença de uma politomia entre P. brasiliana e P. sp 2., que apontam como especiações resultantes de evento mais antigo no primeiro caso, e de evento mais recente no segundo caso.

A partir do cladograma obtido com COI (Figura 4) observou-se a nítida separação do clado de Potimirim brasiliana com o de Potimirim glabra juntamente com Potimirim sp 2, corroborando o trabalho de Torati & Mantelatto (2012), por meio de dados moleculares (gene 16S) e morfológicos (apêndice masculino), que propôs a separação de P. glabra em três espécies distintas (P. glabra-Pacífico, P. brasiliana-Atlântico-Brasil e P.sp 2- Atlântico-Caribe). Nota-se que há uma relação de maior proximidade entre P. glabra e P. sp 2, corroborando a semelhança morfológica entre eles (Torati & Mantelatto, 2012). No entanto, o cladograma proposto no referido trabalho não foi capaz de resolver politomias intraespecíficas devido ao conservadorismo do gene 16S.

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Discussão

34 Há neste cladograma uma separação entre a espécie P. potimirim e as demais espécies utilizadas neste estudo. Este fato pode ter relação com o desenvolvimento ontogenético do grupo, mais precisamente em relação ao desenvolvimento do apêndice masculino. De acordo com Torati & Mantelatto (2012), o estado primitivo do apêndice masculino teria sido mantido em adultos de

P. americana, sendo posteriormente modificado em um estado intermediário mantido pelas

espécies P. potimirim, P. mexicana e P. sp 1. Após este estado intermediário, teria ocorrido outra modificação, dando origem ao formato do apêndice masculino presente nas espécies P. brasiliana,

P. glabra e P. sp 2. Este desenvolvimento ontogenético corrobora com a separação do grupo de P. potimirim das demais espécies, e também com a existência de uma maior relação entre P. brasiliana, P. glabra e P. sp 2, resultados encontrados neste trabalho. Porém, esta separação em

dois grupos proposta por Torati & Mantelatto (2012), um grupo formado por P. potimirim, P.

mexicana e P. sp 1 e outro grupo formado por P. brasiliana, P. glabra e P. sp 2, não é

corroborado pelo trabalho de Grilli et al. (2014), que leva em consideração o sistema sexual das espécies. O sistema sexual das espécies não segue este padrão já que P. mexicana e P. potimirim, ambos do mesmo grupo, possuem sistemas sexuais distintos, sendo P. mexicana hermafrodita protândrico e P. potimirim gonocórico (Grilli, et al., 2014).

Entre os espécimes de P. brasiliana para o gene COI foram encontradas algumas separações de grupos, entretanto sem um padrão geográfico de distribuição, no qual espécimes de uma mesma população não aparecem reunidos formando um subgrupo. Este fato foi encontrado também no trabalho de Vergamini et al. (2011), na qual um dos objetivos era estabelecer as relações entre as populações de Macrobrachium amazonicum Heller, 1862, porém a análise molecular com o gene COI não revelou detalhes das relações entre as populações de alguns grupos formados. Resultado semelhante também foi encontrado em Macrobrachium olfersii Wiegmann, 1836 por Rossi & Mantelatto (2013), no qual não se encontrou um padrão geográfico nas separações das populações. Em todos os três casos, o resultado mostra que as populações não se encontram isoladas geneticamente, ocorrendo fluxo gênico entre elas. Uma espécie irá se dispersar geograficamente até encontrar uma barreira, que pode ser um acidente geográfico histórico, como por exemplo, cadeias de montanhas, desertos e oceanos (Slatkin, 1987). Um exemplo de barreira geográfica são as correntes oceânicas, uma vez que é conhecida a influência na separação genética entre populações de camarões marinhos situadas ao norte da região da ressurgência de Cabo Frio e as situadas ao sul (Maggioni et al., 2003). Porém, as correntes oceânicas também são, em alguns casos, explicações para a ocorrência de fluxo gênico, como no caso da espécie Macrobrachium

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Prado, B. M. (2014)

Discussão

35

olfersii do trabalho de Rossi & Mantelatto (2013) e, pode ser também uma explicação para este

trabalho em relação às populações de P. brasiliana. Apesar dos camarões serem de água doce, eles necessitam de água salobra para o desenvolvimento de suas larvas em ambos os casos, para P.

brasiliana (Molina, 1987) e M. olfersii (Hedgpeth, 1949; Bowles et al., 2000), momento em que

as correntes oceânicas agem permitindo o fluxo gênico.

Um exemplo de barreira geográfica que pode ter influenciado na especiação dentro do gênero Potimirim foi o fechamento do canal do Panamá (Torati, 2009). P. glabra envolvia P.

brasiliana e P. sp 2, recentemente é que foram separadas em três espécies pelo trabalho de Torati

& Mantelatto (2012). Esta especiação pode ter iniciado com o fechamento do canal do Panamá, na qual provavelmente ocorreu a separação de populações de P. glabra entre o Atlântico e o Pacífico (Torati, 2009). Após esta separação das populações, pode ter ocorrido um isolamento reprodutivo, que levou à especiação: P. glabra, encontrada na parte pacífica da América Central e Norte; e P.

brasiliana encontrada na parte atlântica. Já o aparecimento da nova espécie, P. sp 2, deve ser

devido a um evento mais recente (Torati, 2009), no qual levou a separação de populações de P.

brasiliana entre a América do Sul e América do Norte e Central. Este trabalho corrobora com esta

explicação biogeográfica, pois para ambos os genes, 28S e COI, encontra-se uma relação mais próxima entre P. brasiliana e P. sp 2. Outro fato que pode ser relação com o fechamento do canal do Panamá e a separação entre populações de P. potimirim do Brasil e do Panamá, porém necessita-se de estudos mais detalhados da espécie para se levantar qualquer hipótese.

A separação na população de P. brasiliana de grupos sem um padrão geográfico pode ser explicada também pelo marcador genético não ser sensível para as relações entre estas populações. Atualmente alguns trabalhos estão usando microssatélites como marcadores moleculares. Estes microssatélites, também chamado de sequências simples repetidas ou sequências curtas repetidas em tandem, sofrem altas taxas de mutação, apresentando um índice de mutação de 10-6 a 10-2 por geração (Schlötterer, 2000), o que os torna mais variáveis que genes mitocondriais. O trabalho de Maggioni et al. (2003) utilizou microssatélites para realizar um levantamento sobre a variabilidade genética e a estrutura populacional de Litopenaeus schmitti Burkenroad, 1936 na costa brasileira. O resultado encontrado foi uma diferenciação entre as populações de L. schmitti do norte e sul do país, que não tem relação com alguma barreira já conhecida no local onde está separação ocorre, região próxima a Santos (SP). Algumas explicações para esta diferenciação foram especuladas: uma ressurgência encontrada próxima a área, representando uma barreira, ou que esta separação

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Prado, B. M. (2014)

Discussão

36 tenha sido resultado de alguma barreira do passado, que impediu o fluxo gênico na época. Da

mesma forma que o trabalho de Maggioni et al. (2003) utilizou microssatélites, se desenvolvermos

microssatélites para Potimirim, talvez tenhamos uma visão mais detalhada da distribuição e separação populacional de P. brasiliana, e de todo o gênero.

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Conclusão

38 A filogenia do 28S não revelou as relações evolutivas entre as populações de P. brasiliana, mostrando a existência de um grupo de P. potimirim inserido dentro de um grupo formado por P.

brasiliana e P. sp 2. Já as relações reveladas com base no gene COI suportam o monofiletismo da

espécie Potimirim brasiliana, uma vez que esta espécie apresentou uma separação entre seu clado e as demais espécies presentes no cladograma. Entre os espécimes de P. brasiliana foram encontradas algumas separações de grupos, entretanto sem um padrão geográfico de distribuição, o que mostra que as populações não se encontram isoladas geneticamente, ao menos com a evidência proporcionada por este marcador.

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Prado, B. M. (2014)

Referências

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