UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
EXPERIMENTAL
THAIS COSTA DOS SANTOS
ESTUDO DA ATRATIVIDADE A CURTA DISTÂNCIA DE Anopheles darlingi (DIPTERA: CULICIDAE) E SUA RELAÇÃO
COM O ODOR HUMANO
PORTO VELHO 2015
THAIS COSTA DOS SANTOS
ESTUDO DA ATRATIVIDADE A CURTA DISTÂNCIA DE Anopheles darlingi (DIPTERA: CULICIDAE) E SUA RELAÇÃO
COM O ODOR HUMANO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental da Universidade Federal de Rondônia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Área de concentração: Relação Parasito-Hospedeiro. Linha de pesquisa: Biologia, Biodiversidade, Ecologia e Controle de Vetores de Interesse Médico
Orientador: Dr. Alexandre de Almeida e Silva
PORTO VELHO 2015
Thais Costa dos Santos
Estudo da atratividade a curta distância de Anopheles darlingi (Diptera Culicidae) e sua relação com o odor humano
Dissertação final apresentada a Universidade Federal de Rondônia como parte das exigências para a obtenção do título de mestre em Biologia Experimental
Membros titulares da Banca Examinadora:
1. Presidente e orientador: Dr (a): Alexandre de Almeida e Silva Vinculado ao (à) UNIR/DEPT BIOLOGIA
2. Dr.(a): Genimar Rebouças Julião Vinculado ao (à) FIOCRUZ-RO
3. Dr.(a): Maria Aurea Pinheiro de Almeida Silveira Vinculado ao (à) DBIO/UNIR
Universo eterno e infinito que por si se move, que cria e recria sempre estrelas e planetas.
Como agiu para formar a Terra com mares, montes e vales e tudo mais?
As forças atrativas são universais. Unindo partículas, prótons e elétrons, formaram moléculas de que o mundo é feito,
e juntaram aquelas que geraram a vida. Protocélulas, bactérias e fungos
desenvolveram a vida e ordenaram os genes, que, por fusão, mutação e reprodução, criaram as espécies todas que povoam a Terra.
A evolução fez campos, florestas e flores e animais que nadam, correm ou voam,
que sabem contar e cuidar da prole ou pensam – como nós, os homens.
(...) Somos apenas parte desse grande mundo e da humanidade sã, que vive solidária; onde nós, com filhos, parentes e amigos,
estamos ligados por um amor profundo. (Luis Rey)
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, familiares e amigos por todo incentivo durante esta empreitada.
Ao professor Alexandre pela oportunidade de enveredar pelos caminhos da entomologia médica.
Ao Moreno pela fundamental contribuição com as análises estatísticas.
A professora Maria Goreti Rosa de Freitas pelas contribuições na metodologia deste trabalho. Além disso, agradeço as palavras de incentivo e carinho que me foram ditas.
Aos colegas da equipe do Laboratório de Bioecologia de Insetos (Labein) da Unir por toda colaboração nas coletas e criação de mosquitos assim como nas contribuições e discussão sobre este trabalho.
Ao Laboratório de Ecologia Química de insetos vetores da Universidade Federal de Minas Gerais pela parceria nos estudos de olfatometria.
A FIOCRUZ-RONDÔNIA e aos colaboradores do Laboratório de Entomologia da Fiocruz Rondônia pelo apoio logístico e físico. Ao CNPQ pela bolsa.
E por fim a todos que direta e indiretamente estão envolvidos neste projeto.
RESUMO
Fêmeas de mosquito usam odores emanados de vertebrados como cairomônios para localizar fonte de alimentação sanguínea. As fases dessa busca são: apetite de busca (intenção), ativação (orientação) e atração (localização do hospedeiro). Estudos de potenciais cairomônios presentes no odor humano podem contribuir com as metodologias de coleta e controle vetorial de mosquitos com comportamento antropofílico, como Anopheles darlingi, o principal vetor da malária no Brasil, cujo método de captura mais eficiente ainda é a atração humana protegida. O trabalho propôs investigar o comportamento de An. darlingi, oriundo de campo e de criação em laboratório (F1) diante da exposição de odores humanos de pés, mãos e de meias impregnadas com odor do pé. Em olfatômetro vertical foi testada a difusão passiva de odores de pés e de meias impregnadas com odores de pés. Um olfatômetro de dupla escolha foi usado para observar a resposta a mão e as meias impregnadas de odor de pé. A proporção de mosquitos atraídos aos estímulos testados difere entre F1 (2%) e campo (15%). Os pés de humanos atraíram significativamente mais mosquitos de campo (23%) que o controle (ausência estímulo) (8%), mas o mesmo não ocorreu em relação a F1 quando testado o pé (3%) e o controle (1%). Observou-se que quando testados os estímulos pés, meias impregnadas com odor do pé e controle a proporção de atração de mosquitos de campo aos estímulos é 10% maior que F1. Na comparação os diferentes estímulos, a meia impregnada com odor do pé atraiu de maneira semelhante ao pé. Isso confirma a atratividade do An. darlingi ao odor de pés impregnados em meias. A atratividade de mosquitos de campo a meias impregnadas tendeu a ser maior que o controle mas a diferença não foi significativa. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos quando utilizados mosquitos F1. O índice de preferência mostrou que apenas os mosquitos de campo são significativamente mais responsivos as mãos e meias impregnadas com odor de pé. Apesar de quaisquer diferenças intrínsecas no perfil de odores, o odor de pé impregnado na meia atraiu mosquitos da mesma forma que a mão. Os resultados em geral sugerem que há um padrão de comportamento distinto devido a condição de inseminação das fêmeas de campo de An. darlingi.
ABSTRACT
Female mosquitoes use emanated odours from vertebrates to locate blood meal. The steps of mosquitoes host seeking are: appetitive search, activation (orientation) and attraction (host locating). Research on candidate kairomones from human odour might improve capture methods for sampling anthropophilic mosquitoes such as Anopheles darlingi, the main malaria vector in Brazil, mostly collected using human landing catches. The aim of this research was to investigate the behavior of field collected and laboratory raised An. darlingi exposed to different sources human odour: foot, hand and human foot odour impregnated socks. A vertical olfactometer and also a dual choice olfactometer were used to test passive difusion of foot odour and human foot odour impregnated socks in the mosquito behaviour. The mosquito attraction proportions differed between F1 (2%) and field (15%). Human feet were more attractive (23%) than control (no stimuli)(8%) for field mosquitoes and attracted only 3% of F1 mosquitoes. Generally, a attractiveness of foot, human foot odour impregnated socks was 10% higher for field collected mosquitoes and attraction of human foot odour impregnated socks was similar to foot odour. This finding confirms attractiveness of An. darlingi to human foot odour impregnated in socks. The attractiveness of field mosquitoes to human foot odour impregnated socks tends to be higher than control (no stimuli) but there was not significant difference. No significant differences were observed in experiments using F1 mosquitoes. Preference index showed that only field mosquitoes are significantly more responsive to hand and socks odours. .Despite any intrinsic difference in the odour profile, odour impregnated socks and hands attracted field mosquitoes in the same way. Present data suggests a distinct behavioral pattern due inseminated status of field females of Anopheles darlingi.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Alguns anofelinos de importância médica em diversas regiões do mundo
13
Tabela 2: Proporção de Anopheles darlingi de oriundos de campo e F1 atraídos por diferentes fontes de odor humano utilizando olfatometria vertical.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Anopheles darlingi 15
Figura 2 Principais características de identificação da
espécie Anopheles darlingi 16
Figura 3 Ciclo de vida mosquitos: Anopheles sp 17
Figura 4 Interação dos estímulos químicos e físicos na busca
do mosquito por fonte de sangue 19
Figura 5 Órgão sensorial olfativo de mosquitos 19
Figura 6 Classificação dos principais cairomônios para
captura de mosquitos antropofílicos. 21
Figura 7 Olfatômetro vertical e seus constituintes 23 Figura 8 Ilustração do olfatômetro de dupla escolha 24 Figura 9 Pontos de coleta de Anopheles darlingi 25
Figura 10 Métodos captura de anofelinos 26
Figura 11 Etapas da criação de An. darlingi 27
Figura 12 Olfatômetro vertical 29
Figura 13 Olfatômetro vertical em uso 30
Figura 14 Estrutura olfatometria dupla escolha 31
Figura 15 Olfatometro de dupla escolha em uso 32
Figura 16 Atratividade a curta distância de Anopheles darlingi 35 Figura 17 Proporção de Anopheles darlingi de campo e F1
atraídos por pé, meia impregnada e controle 36 Figura 18 Porcentagem de mosquitos F1 (laboratório)
ativados e atraídos com a exposição de meias impregnadas de odor dos pés de quatro indivíduos
38 Figura 19 Porcentagem de mosquitos F1 (laboratório)
mãos e meias impregnadas de odor dos pés de voluntários em olfatometria dupla escolha.
Figura 20 Porcentagem de mosquitos de diferentes origens no braço com e sem odor (meia usada) em testes de olfatometria dupla escolha
39 Figura 21 Índice de Preferência (IP) de Anopheles darlingi
oriundos de campo e F1 41
Figura 22 Comportamentos exibidos por Anopheles darlingi oriundos de campo e F1 a diferentes estímulos 41
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 13
1.1 Importância médica dos mosquitos: alguns aspectos da
biologia de Anopheles darlingi 13
1.2 Contato entre vetor e hospedeiro 17
1.3 Ecologia química da busca dos mosquitos por
hospedeiro 20
1.4 A olfatometria em estudos de comportamento de
insetos 22
2 OBJETIVO GERAL 24
2.1 Objetivos específicos 24
3 METODOLOGIA 25
3.1 Obtenção dos mosquitos
25
3.1.1 Coleta de Anopheles darlingi 25
3.1.2 Criação de Anopheles darlingi para obtenção de
geração F1 26
3.1.3 Manutenção de Anopheles darlingi de campo
(selvagem) 27
3.2 Seleção de voluntários 27
3.3 Avaliação da resposta de atratividade a curta distância de
Anopheles darlingi a odores humanos 28
3.3.1 Ensaios em olfatômetro vertical 28
3.3.2 Exposição de pés e meias impregnadas com odor de
pés como estímulos teste 29
3.4 Avaliação do comportamento de busca de An. darlingi
diante da exposição de odores humanos 30
3.4.1 Ensaios em olfatometria de dupla escolha 30
3.4.2 Exposição das mãos e meias impregnadas de odor de
3.5 Análises estatísticas 33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 34
4.1 Atratividade a curta distância de Anopheles darlingi a
odores humanos 34
4.2 Comportamento de Anopheles darlingi a exposição de
odores humanos 37
4.3 Comparação das respostas comportamentais de
mosquitos de origem campo e F1 39
5 CONCLUSÕES 44
REFERENCIAS 45
ANEXO
1 INTRODUÇÃO
1.1 Importância médica dos mosquitos: alguns aspectos da biologia de Anopheles darlingi
Mosquitos são insetos da ordem Diptera, uma das maiores ordens de insetos em termos de abundância no mundo (Borror e Delong, 2005).
Eles pertencem a família Culicidae e têm como características principais o corpo delgado, pernas compridas, probóscide longa pontiaguda e um par de asas em forma de alteres (Clements, 1999). Além disso possuem ampla distribuição geográfica, podendo ocorrer em regiões tropical e temperada em altitude variada (Service, 2008).
Apesar das mais de 3400 espécies de mosquitos conhecidas (Service, 2008) apenas algumas são consideradas de importância médica, devido envolvimento na transmissão de doenças.
Dentre os principais gêneros de importância médica estão: Anopheles (malária e filarioses), Culex (filarioses), Aedes (dengue, febre amarela, chikungunya), Haemagogus e Sabethes (febre amarela e outras arboviroses) (Service, 2008).
Em relação à malária, dentre as cerca de 450 espécies do gênero Anopheles (Sallum, 2015), apenas algumas são responsáveis pela transmissão de plasmódios a répteis, aves e mamíferos (Rey, 2011) (Tabela 1).
Tabela 1: Alguns anofelinos de importância médica em diversas regiões do mundo.
África Subsariana An.gambiae, An.funestus,
An. melas, An.merus Europa, Norte da África e Oriente
Médio An.maculipennis, An.atroparvus, An.labranchiae, An.pharoensis, An. stephensis, An.sergentii
Índia An. annularis, An. culicifacies,
An. fluviatilis, An. stephensi, An. minimus
Sul da Ásia ocidental An. aconitus, An. balabacensis, An. campestris, An. dirus,
An. minimus, An. anthropophagus México e América Central An. albimanus, An. albitarsis,
An. aquasalis, An. darlingi, An. pseudopunctipennis, An. punctimaculata
América do Sul An. darlingi, An. albitarsis,
An. aquasalis, An. bellator, An. nuneztovari, An. cruzii, An. deaneorum
Austrália An. farauti, An. koliensis,
An. punctulatus Fonte: Service, 2008.
No Brasil, An. darlingi, An. albitarsis e An. aquasalis são considerados principais vetores de malária na Amazônia, onde ocorre a maior parte dos casos (Pimenta et al, 2015).
Dentre as espécies citadas, o Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root 1926, é considerado principal vetor de plasmódios humanos no Brasil (Figura 1).
De modo geral as características morfológicas que diferenciam O An. darlingi de outros anofelinos estão, entre outras, na asa, pernas e abdome (Figura 2).
Com relação ao seu papel do An. darlingi na transmissão da malária, Tadei e Dutary (2000) realizaram inquérito entomológico e mostraram que das 33 espécies coletadas em localidades diferentes na Amazônia, apenas 8 espécies estavam infectados com plasmódios humanos, dentre elas An. darlingi. Em outro estudo conduzido por Gil et al (2007) no estado de Rondônia apenas An. darlingi albergava esporozoítos confirmando a importância epidemiológica dessa espécie.
O An. darlingi está amplamente distribuído pela América do Sul em países situados na Amazônia, embora a importância epidemiológica seja diferente entre regiões (Hiwat, 2011). Em Rondônia ela é a espécie de vetor dominante e está presente praticamente o ano inteiro (Tadei et al, 1988; Gil, 2003; Gil, 2007; Gama, 2012).
Figura 1: Anopheles darlingi. Fonte: Phil Lounibos, Florida University, 2015. Essa espécie, no Brasil, tem se mostrado bem adaptada às modificações introduzidas pelo homem no ambiente natural ao longo do tempo (Rosa-Freitas, 1998; Gil et al, 2003, 2007).
Lourenço de Oliveira (1989) relaciona a migração, o aumento da população e o extensivo desmatamento como fatores que contribuíram para a modificação do comportamento dos mosquitos o que contribuiu para aproximá-lo do homem.
Inquéritos entomológicos mostraram que o An. darlingi é encontrado picando dentro (endofilia), fora (exofilia) ou nas imediações de habitações humanas (Deane et al, 1948; Tadei et al, 1988; Oliveira et al, 1989; Charlwood, 1996; Gil, 2007; Gama, 2012).
Relatos acerca da diversidade genética de Anopheles darlingi podem explicar a plasticidade do comportamento dessa espécie (Moutinho et al, 2011). A exemplo, têm sido relatados diferentes horários de atividade de alimentação sanguínea para mosquitos dessa espécie em localidades distintas (Lourenço de Oliveira et al,1989; Charlwood, 1996; Tadei et al,1998; Gil et al 2003; Gama, 2009).
Rios amazônicos (Foratini, 2002) parecem reunir condições ideais para desenvolvimento de larvas de An. darlingi. Deane et al (1948) descreveu que criadouros de larvas de An. darlingi tinham coleções de águas limpas, parcialmente sombreadas, com certa profundidade e presença de vegetação aquática. Além disso as
larvas também podem se adaptar a condições mais modestas como criadouros temporários formados pelas chuvas.
As características morfológicas que diferenciam essa espécie de outros anofelinos estão, entre outras, nas asas, pernas e abdome (Figura 2).
A partir do ovo as larvas eclodem e passam por quatro instares seguido de um período breve de pupação até que emerja o adulto (Figura 3) (Borror e Delong, 2005).
Figura 2: Principais características de identificação da espécie An. darlingi. a) asa: veia anal predominantemente clara, com uma mancha negra perto de cada extremidade. Primeira mancha escura da veia costa (pré-umeral escura) maior que a mancha clara seguinte (umeral clara). b) tarsos posteriores com os três últimos artículos (III – V) inteiramente brancos. c) abdome: tergitos abdominais com escamas amareladas. Fonte: Consoli e Lourenço de Oliveira, 1994.
As larvas alimentam-se de microorganismos aquáticos e partículas de detritos presentes na superfície da água (Clements, 1999). Essa reserva nutricional enquanto larva é determinante na metamorfose do adulto que ocorre quando atingirem estádio de pupas (Forattini, 1996).
Ao atingirem a fase adulta se alimentam de néctar e outros fluidos de plantas (Forattini, 2002). Somente as fêmeas realizam alimentação sanguínea devido processos de maturação de ovos (Clements, 1955).
Figura 3: Ciclo de vida mosquitos: Anopheles sp. a) Fase de imaturo ocorre em meio aquático b) após emersão o adulto coloniza o ambiente terrestre. Fonte: RTI International, 2012.
1.2 Contato entre vetor e hospedeiro
A ingestão de sangue fez dos mosquitos um importante elo do ciclo de vida de alguns parasitos.
Lehane (2005) sugere que a história evolutiva da relação entre insetos sugadores de sangue e seus hospedeiros se iniciou com a proximidade dos insetos aos ninhos de vertebrados, trazendo mais tarde uma vantagem reprodutiva aos mosquitos (Takken, Verhulst, 2012; Takken, Knols, 2010) e resultando na coevolução de parasitos e hospedeiros (Forattini, 2002).
As proteínas do sangue desencadeiam a liberação de hormônios que atuam no controle do desenvolvimento ovariano (Klowden, Lea, 1979; Klowden, 1997).
A receptividade do mosquito para a alimentação sanguínea está relacionada ao ciclo circadiano e a necessidade nutricional (fome) (Sutcliffe, 1987).
Alguns mosquitos não necessitam de sangue para completar o primeiro ciclo gonotrófico autógeno (Lea, 1975), outros como anofelinos são ditos anautógenos porque se alimentam de sangue para dar continuidade ao desenvolvimento dos ovários.
De acordo com Forattini (2002) fêmeas de An. darlingi estão aptas a alimentar-se de sangue em torno de 24 horas após emersão. Dantas et al (2012) mostraram que fêmeas dessa espécie podem
b
realizar mais que um repasto no primeiro ciclo gonotrófico, inclusive devido a carências nutricionais enquanto larvas.
Ao picar o hospedeiro mosquitos podem ingerir entre 2 a 5 mg de sangue (Forattini, 2002) (Figura 1) e a digestão pode levar até 72 horas (Clements, 1956). Muitas vezes podem picar mais de uma pessoa caso não consigam a quantidade necessária de sangue.
Para obter sangue mosquitos utilizam o odor do hospedeiro para localizá-lo no ambiente (Knols, et al,1995, Takken, Knols, 1999). Isso ocorre porque voláteis emanados de vertebrados são seguidos como um rastro pelos mosquitos.
A medida que mosquitos se aproximam do alvo a ser picado, outros estímulos como calor e umidade passam a ser importantes para a busca (Figura 4).
Por isso a mistura de odor, calor e correntes de convecção úmidas que se formam a partir do hospedeiro marcam a presença dele no ambiente (Khan et al 1968; Lehane, 2005).
A base fisiológica e sensorial do comportamento de busca dos mosquitos por repasto sanguíneo é conhecida. Fatores intrínsecos ao mosquito (condições fisiológicas e genéticas) e a fatores extrínsecos (odorantes, pistas visuais, calor do corpo, temperatura, umidade) contribuem para a necessidade fisiológica do mosquito (Takken, Knows, 1999; Takken e Verhust, 2012).
Para perceber os estímulos no ambiente os culicídeos usam órgãos de sentido chamados de sensilas que estão localizados na parede do corpo (Borror e Delong, 2005).
Nas sensilas olfativas (figura 6), ocorre a transdução do odor em padrões neurais que desencadeiam um comportamento variado (Zwiebel e Takken, 2004; Takken e Knols, 2010) (Figura 5).
Além das sensilas olfativas, há sensores que captam umidade e calor (Borror, Delong, 2005) o que sugere a importância desses estímulos a curta distância.
Figura 4: Interação dos estímulos químicos e físicos na busca do mosquito por fonte de sangue. Fonte: Guilles, 1988 apud Olanga, 2010.
Figura 5: Órgão sensorial olfativo de mosquitos. a. apêndices envolvidos na percepção olfativa. b. estrutura de uma sensila olfativa com suas principais estruturas. O odor penetra pelo poro, atravessa a linfa e no contato com os dendritos é conduzido até o neurônio receptor odorante onde será transduzido em padrões de comportamento. c. micrografia eletrônica da cabeça. Fonte: Takken e Knols, 2012; Pits e Zwiebel, 2006.
a b
1.3 Ecologia química da busca dos mosquitos por hospedeiro
A ecologia química visa como ciência compreender a interação entre organismos vivos mediado por compostos químicos.
Ainda sob a ótica da comunicação entre insetos por sinais químicos Vilela e Della Lucia (2001) definiram que odores envolvidos na troca de informação entre organismos são denominados como infoquímicos.
De acordo com definição de Correia et al (2007) infoquímicos da comunicação intraespecífica são chamados de feromônios e os aleloquímicos estão envolvidos nas relações interespecíficas.
Os feromônios estão envolvidos na cópula, oviposição e alimentação de insetos (Forattini, 2002). São amplamente estudados principalmente no combate a pestes agrícolas (Zevallos, Zarbin, 2013).
Os aleloquímicos distinguem-se de acordo com benefício ou prejuízo decorrente da comunicação (Correia et al.2007). Nos alomônios, o receptor do sinal tem prejuízo em relação ao emissor; sinomônios, ambos se beneficiam; cairômonios, o receptor do sinal se beneficia em detrimento do emissor.
Os cairomônios são moléculas químicas que provocam uma resposta comportamental ou fisiológica em quem recebe o sinal (Vilela e Della Lucia, 2001). Mosquitos usam como cairomônios, os odores dos hospedeiros para chegar a fonte de alimentação sanguínea (Forattini, 2002).
Os cairomônios ativam quimiosensores nos mosquitos desencadeando o inicio da busca por sangue (Takken e Knols, 2010), sendo os principais conhecidos atualmente: dióxido de carbono, amônia, ácido lático, octenol, ácido hexanóico, suor entre
outros (Eiras e Jepson, 1994; Braks et al, 1999; Geier, Boeckh, 1999; Dekker et al, 2002; Muphy et al, 2001; Smallagange et al, 2013; Braks et al, 2001; Verhulst et al, 2011).
Vários cairomônios podem ser empregados em capturas de mosquitos antropofílicos (Figura 6). Apesar de estarem presentes no odor humano possuem eficiência de captura variável.
Figura 6: Classificação dos principais cairomônios para captura de mosquitos antropofílicos. Fonte: adaptado Lima et al, 2014.
Embora haja esforços no aprimoramento de atraentes sintéticos (Okumu et al, 2010), a captura de mosquitos antropofílicos ainda é melhor sucedida quando empregado atraente biológico ao invés de armadilhas (Lima et al, 2014).
Apesar disso o risco é grande a integridade de pesquisadores e profissionais que auxiliam pesquisa em campo que podem contrair doenças ao realizar a captura por atração humana protegida. Questões éticas têm restringido cada vez mais a prática da atração humana protegida em pesquisa. Por isso a pesquisa com atraentes alternativos poderiam contribuir na captura de mosquitos (Okumu, 2010) substituindo a atração humana protegida.
Uma das metodologias utilizadas para avaliar cairomônios em laboratório são os ensaios em olfatometria. (Eiras e Neto, 2001; Takken e Verhulst, 1999). Assim, o interesse em compreender os mecanismos envolvidos na olfação dos insetos tem impulsionado as pesquisas com cairomônios há pelo menos 50 anos com o objetivo de melhorar metodologias de captura de mosquitos.
1.4 A olfatometria em estudos de comportamento de insetos
Diversos autores têm utilizado a olfatometria para estudos comportamentais de insetos, principalmente de mosquitos de importância médica (Khan, 1968; Braks e Takken, 1999; Murphy et al, 2001; Dekker et al, 2002; Allan et al, 2005). Eles buscam identificar compostos que pareçam atrativos aos mosquitos testando-os em condições controladas.
Com essa metodologia é possível observar aspectos, como ativação, tempo de voo, tipo de percurso que são envolvidos na orientação de insetos pela fonte de odor (Vilela, 2001).
Vilela (2001) explica que o formato do olfatômetro é variado estando relacionado com a questão a ser estuda e cita alguns exemplos como: túnel de vento horizontal, discriminante, quatro braços, dupla escolha e vertical. Os dois últimos foram detalhados por se tratar de objeto deste estudo.
O olfatômetro vertical foi detalhado por Feinsod and Spielman (1979) tem sido usado para observar resposta de mosquitos a curta distância da fonte de estímulo. O princípio de funcionamento é que o estímulo é transportado por difusão passiva pois os mosquitos são expostos acima do estímulo teste.
Com relação a atração de insetos o modelo vertical (Feinsod e Spielman, 1979; Figura 7) permite avaliar interação entre estímulos físicos e químicos. Além deles, Eiras e Jepson (1994) utilizaram este modelo em seus estudos com cairomônios de mosquitos Aedes aegypti. E ainda Batista et al (2014) publicou estudo de atratividade de An. darlingi utilizando modelo vertical.
Figura 7: Olfatômetro vertical e seus constituintes: (a) cone superior, (b) cone inferior, (c) cilindro de alumínio, (d) caixa de alumínio. b dispositivo montado para teste. Consiste em dois cones unidos por suas extremidades mais estreitas na posição vertical, sendo o cone inferior inserido em um caixa de alumínio e o cone superior acima com os mosquitos a serem testados. Fonte: Vilela e Della Lucia, 2001; Santos, 2013.
O olfatômetro de dupla escolha tem formato semelhante a um Y e é operado na horizontal.
Espera-se observar a resposta do mosquito diante do rastro de odor que foi produzido pelo fluxo de ar e a exposição de um estímulo teste.
Nos braços ficam duas gaiolas, uma com estímulo (tratamento) e a outra sem estímulo (controle). Um fluxo de ar é produzido por um motor, filtrado, aquecido, umidificado e enviado para as arenas (Figura 8) (Geier,1999). Ao final do tempo a proporção de mosquitos em cada gaiola é contabilizada.
Outra metodologia bastante utilizada para experimentos de semi-campo é adaptar o olfatômetro à uma escala maior transformando os braços em grandes barracas. Isso permitiu testar atratividade de indivíduos diferentes com anofelinos africanos (Knols, 1995; Lacroix et al, 2005, Murphy et al 2005).
Figura 8: Ilustração do olfatômetro de dupla escolha: uma pluma de ar é criada e distribuída entre os dois braços em direção aos mosquitos na gaiola de liberação. Ao colocar o estímulo em um dos braços será criada uma pluma de odor. Quando a gaiola de liberação é aberta os mosquitos têm a oportunidade seguir ou não as plumas formadas. Fonte ilustração: Obermayr, 2012.
2 OBJETIVO
Avaliar a resposta de atração de An. darlingi a exposição de odores humanos.
2.1 Objetivos específicos
Avaliar a atratividade a curta distância de An. darlingi utilizando diferentes fontes de odor humano.
Avaliar o comportamento de busca de An. darlingi a diferentes fontes de odor humano.
Comparar respostas comportamentais a odores humanos de mosquitos de campo (selvagem) e F1 (laboratório).
3 METODOLOGIA
3.1 Obtenção dos mosquitos
3.1.1 Coleta de Anopheles darlingi
Coletas de anofelinos foram realizadas entre o período de novembro de 2013 a fevereiro de 2015 (CEP n° 41977315200000011).
As localidades foram: Candeias do Jamari (Latitude: 8°47'31.93"S / Longitude: 63°42'39.79"O), Nova Mutum (Latitude: 9°18'55.51"S / Longitude: 64°32'44.96"O), BR 364km 9(: 8°49'22.81"S / Longitude: 63°55'42.57"O)(Figura 9).
Utilizou-se armadilhas do tipo BG modificada conforme metodologia de Gama e et al (2013) (Figura 10a).
Figura 9: Pontos de coleta de Anopheles darlingi. Fonte: Google Earth, 2014. Também foi utilizado método de atração humana protegida (Figura 10b). Nele mosquitos são capturados com um sugador manual ao se aproximarem do indivíduo.
Os mosquitos coletados foram identificados com chave de identificação taxonômica (Consoli e Lorenço de Oliveira, 1994).
O repasto sanguíneo foi realizado em camundongos (CEUA/FIOCRUZ-RO n°2014/15), ainda no campo para obtenção de mosquitos de geração F1 em laboratório.
Figura 10: métodos captura de anofelinos. a. armadilha BG modificada iscada com gelo seco. b. atração humana protegida. Fonte: Santos, 2014.
3.1.2 Criação de An. darlingi para obtenção de geração F1
As condições do insetário foram: temperatura ambiente 28°C, temperatura da água 27°±1, umidade 80%±5, fotoperíodo de 12 horas.
As fêmeas capturadas foram levadas ao Laboratório de Bioecologia de Insetos (LABEIN) da Universidade Federal de Rondônia (Figura 12).
Decorridas 72 horas do repasto sanguíneo a oviposição foi induzida pela remoção de uma das asas do mosquito anestesiado com acetato de etila conforme metodologia de Lanzaro et al (1988). Os mosquitos foram colocados em copos telados forrados com papel filtro umedecido para a postura dos ovos (Figura 11a).
Depois de 2 dias o papel filtro com os ovos foi transferido para bacias com 1 litro de água de poço sem cloro (Figura 11b).
Após a eclosão as larvas foram mantidas com ração de peixe (TetraMin Tropical Flakes-Spectrum Brands, Inc.) triturada e peneirada.
Para larvas de instar 1 e 2 foi oferecida uma pincelada de ração e larvas de 3 e 4 instares 2 a 3 pinceladas por dia.
Pupas foram recolhidas diariamente e mantidas em gaiolas entomológicas até a emersão (Figura 11c). Depois adultos ofereceu-se algodões embebidos de sacaroofereceu-se (10%) e finalmente, para os experimentos escolheu-se mosquitos com idades entre 3 e 10 dias sem repasto sanguíneo (Figura 11d).
Figura 11: Etapas da criação de An. darlingi. a. oviposição de mosquitos; b. bacias de criação de larvas; c. pupas; d. mosquitos recém emergidos. Fonte: Santos, 2013.
3.1.3 Manutenção de Anopheles darlingi de campo
Fêmeas de An. darlingi de campo foram mantidas no insetário com sacarose a 10 % por doze horas decorridas da captura.
A sacarose foi retirada 24 horas precedentes aos testes. Além disso não foi oferecida alimentação sanguínea para as fêmeas de campo.
3.2 Seleção de voluntários
A pesquisa foi aprovada pelo Conselho de Ética em pesquisa com seres humanos do Centro de Medicina Tropical de Rondônia (n. 41977315.2.0000.0011).
Foram selecionados 2 homens e 2 mulheres, caucasianos, com idade entre 20 e 40 anos. Todos tomaram conhecimento da pesquisa e concordaram em participar (anexo 1).
Solicitou-se que suspendessem o uso de loções, perfumes e talco antisséptico quatro dias antes dos testes.
3.3 Avaliação da resposta de atratividade a curta distância a de Anopheles darlingi a odores humanos.
3.3.1 Ensaios em olfatômetro vertical
Dois olfatômetros verticais (Figura 12) idênticos foram usados para testar a atratividade dos mosquitos ao odor do pé e da meia impregnada com odor de pé.
Os experimentos foram realizados em uma sala do Laboratório de Entomologia Médica da Fiocruz Rondônia de aproximadamente 8m2, com as luzes apagadas, porta fechada após as 18 horas.
Cada teste iniciou quando os mosquitos foram colocados no cone superior onde ficam confinados. Os primeiros cinco minutos de teste foram para adaptação dos mosquitos (adaptado de Batista, 2014). Após isso o estímulo foi colocado dentro da caixa de alumínio e os mosquitos liberados por cinco minutos. Decorrido o tempo ambos os cones superior e inferior foram fechados para contabilizar a proporção em cada um deles.
Para evitar contaminação durante os experimentos utilizou-se luvas e placa de petri onde os estímulos ficaram apoiados. Eventualmente algodões com álcool 70% para remover resíduos da superfície.
Após o uso as peças foram lavadas com uma solução de detergente neutro (dextran) em água e posteriormente secadas com fluxo de ar quente a 70°C (adaptado Verhulst et al, 2011).
Figura 12: Olfatômetro vertical adaptado de Feinsod e Spielman, 1979. Fonte Santos, 2013.
3.3.2 Exposição de pés e meias impregnadas com odor de pés como estímulos teste.
Os voluntários (2) colocaram um dos pés dentro da caixa de alumínio conforme tempo determinado no item anterior (Figura 13a).
Para cada repetição utilizou-se grupos independentes de 10 mosquitos totalizando 50 mosquitos de campo e 50 mosquitos F1 para tratamento (pé) e a mesma quantidade para grupo controle.
Para cada voluntário realizou-se 5 repetições de exposição do pé e controle.
O controle representou olfatômetro sem estímulo e durante os experimentos houve alternância entre os dois olfatômetros.
Os mesmos voluntários dos experimentos de atratividade ao pé participaram dos experimentos com meia usada. Como controle utilizou-se ausência de odor.
O odor dos pés deles foi coletado com uso de meias de poliamida por uma noite e um dia. Para isso as meias foram higienizadas com detergente neutro e secadas com fluxo de ar a 70°C antes da coleta de odor
a b c Figura 13: a. Olfatômetro vertical em uso. b. coleta de odor do pé nas e meias de poliamida c. olfatômetro preparado para testar meias impregnadas com odor do pé. Fonte: Santos, 2013.
Após uso as meias foram recolhidas 30 minutos antes dos testes e armazenadas em saco zip até inicio dos experimentos (Figura 13b). A meia foi dobrada e apoiada sobre uma placa de petri, devidamente higienizada, logo abaixo do cone inferior (Figura 13c). Utilizou-se mosquitos de campo e F1 nos experimentos. Para cada voluntário realizou-se 5 repetições com 10 mosquitos cada. A mesma também foi utilizada para o controle (ausência de estímulo). 3.4. Avaliação do comportamento de busca de An. darlingi diante da exposição odores humanos
3.4.1 Ensaios em olfatometria de dupla escolha
Essa metodologia foi utilizada para observar etapas do comportamento de An. darlingi diante da exposição dos estímulos teste: mãos e meias impregnadas com odor do pé dos voluntários.
O olfatômetro foi instalado na Universidade de Federal de Rondônia em uma sala com aproximadamente 4m2. Ele é composto
por três arenas idênticas e que permitem testar várias situações Ele consiste em um exaustor que puxa o ar do ambiente externo que foi filtrado em uma manta de carvão ativado, aquecido em um banho-maria (27° C ±1) e distribuído nas três arenas a uma velocidade de aproximadamente 0,30 m/s (Figura 14a).
Uma pluma de odor é criada quando o fluxo de ar passa pelo estímulo em direção aos mosquitos que estão na gaiola de liberação (Figura 14b). Quando liberados é dada a oportunidade de seguir o rastro do braço com estímulo ou o controle que está sem estímulo. O teste se iniciou com aclimatação dos mosquitos por 10 minutos dentro da gaiola de liberação (Figura 14c). Então foram liberados após a introdução do estímulo em um dos braços por 3 minutos.
Figura 14: Olfatômetro de dupla escolha. a. exaustor, banho maria e arenas de testes. b. visão frontal dos braços em uma das arenas, com abertura por onde o estimulo é inserido. c. gaiola de liberação dos mosquitos. Fonte: Santos, 2015.
O resultado do teste é expresso pela proporção de mosquitos atraídos, ativados, não responsivos ao final das repetições.
Os parâmetros observados durante o teste foram: a) atratividade: mosquitos que chegam na gaiola com estímulo; b) ativação: mosquitos que deixam a gaiola de liberação mas não entram na gaiola de estímulo c) não responsivos: aqueles que permaneceram nas gaiolas de liberação.
Durante testes luvas são usadas para evitar contaminação. O mesmo cuidado é tomado para a higienização das peças.
Após os testes as peças são lavadas com solução de detergente dextran e água e secas ao ar livre. Além disso, guardanapo de papel embebido com álcool 70% e secadas com fluxo de ar quente (70°C) adaptado Verhulst et al (2011).
3.4.2 Exposição das mãos e meias impregnadas de odor de pés à mosquitos An. darlingi
As mãos e meias impregnadas com odor dos pés de quatro voluntários foram usadas como estímulos teste.
Com olfatômetro já em funcionamento e após período de aclimatação descrito em item anterior os dedos ou meias usadas foram inseridos na gaiola de estímulo durante o tempo de teste. Ao final o ele é desligado para contabilizar a proporção de mosquitos em cada compartimento.
O lado do braço estímulo foi alternado sempre e o controle correspondeu ao braço vazio.
Cada estímulo foi testado num total de 7 repetições com 10 grupos independente de mosquito (campo e F1) por repetição. A mesma quantidade foi usada para grupo controle.
Em duas arenas foram testados estímulos do mesmo voluntário) e a terceira funcionou como controle sem qualquer estímulo (Figura 15a). Os estímulos foram inserido conforme figura 15b.
Figura 15: Olfatometria dupla escolha uso. a. utilizando estimulo mão. b. detalhe da abertura da gaiola para inserção do estímulo teste. Fonte: Santos, 2015.
b a
3.5 Análises estatísticas
Para avaliar a diferença na proporção de mosquitos que responderam ao estímulo em olfatômetro vertical foram utilizados modelos lineares generalizados onde a variável resposta (y) foi a proporção de mosquitos coletados no cone inferior e a variável explicativa foi o tipo de estímulo utilizado, nesse caso odor do pé e meia impregnada por odor e olfatômetro sem estímulo (controle).
Nos experimentos de olfatometria de dupla escolha calculou-se o índice de preferência (PI) como sendo: número de mosquitos no braço estímulo – número de mosquitos no braço controle dividido pelo número de mosquitos no braço estimulo + o número de mosquitos no braço controle. Esse índice varia de 0 a 1 onde 0 indica neutralidade e 1 atratividade. Posteriormente utilizou-se a seguinte transformação: arcseno (sign(x)√|x|). Por fim, comparou-se a proporção transformada de mosquitos coletados utilizando a mesma abordagem da olfatometria vertical.
Todas as análises foram realizadas no software estatístico livre R 3.2.1 (R Development Core Team). A hipótese nula foi sempre aceita quando o valor de p > 0,05.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Atratividade a curta distância de Anopheles darlingi a odores humanos
De forma geral, a proporção de mosquitos atraídos (presentes no cone inferior do olfatômetro vertical) difere significativamente (t=3.97, p<0.05) entre F1 (2%; IC 0.3 - 4%) e campo (15%; IC 10 - 15%).
Os pés dos voluntários, utilizado como estímulo, atraíram quase três vezes mais mosquitos de campo (23%, IC 15% – 31%) comparado a proporção obtida no controle (olfatômetro vazio) (8%, IC3% – 14%) (t=3.42, p<0.05). Quando o mesmo experimento que usou o pé como estímulo foi testado com mosquitos F1 não houve diferença significativa na proporção que desceu no cone inferior com (3%, IC 0.1% – 7%) e sem (controle) (1%, IC 0.7% – 4%) (P>0.05) o pé de voluntários (Figura 16). Se considerarmos a resposta basal de mosquitos de campo sem estímulo (linha verde) (Figura 16) a respostas para mosquito F1 caíram significativamente (seta roxa). Isso pode estar relacionado a diferenças no odor de pessoas utilizadas como voluntários no presente trabalho, visto que Batista et al (2014) observaram maiores proporções de atratividade de An. darlingi F1 ao pé de voluntários utilizando o mesmo olfatômetro vertical.
Os resultados com mosquitos de campo sugerem que a difusão passiva dos odores emanados dos pés ativou os mosquitos para buscar o odor. Devido comportamento antropofílico é esperada a resposta de atração do An. darlingi aos estímulos de odor humano. Deane (1945) já havia relatado a relação próxima entre o An. darlingi e humanos.
A região dos pés é conhecida pelo odor forte que exala. Isso ocorre devido voláteis liberados de alguns gêneros de bactérias residentes no pé, i.e. Staphylococcus ssp. (Verhulst et al, 2011).
Figura 16: Atratividade a curta distância de Anopheles darlingi origem campo e F1 ao estímulo pés de voluntários. Controle: olfatômetro vazio, pé: pé dos voluntários inserido no olfatômetro como estímulo. Proporção de mosquitos coletados: mosquitos observados no cone inferior do olfatômetro vertical.
Além disso, há uma grande quantidade de glândulas ecrinas, responsáveis pela sudorese nos pés (SBCD, 2015). O suor, que contém basicamente água, ácido lático, amônia, uréia, pequenos aminoácidos (Wilson, 2008), foi considerado atrativo para outros anofelinos (Braks e Takken, 1999; Braks et al 2001) e também para An. darlingi (Leandro, 2014).
Ainda sobre a atratividade dos pés, Dekker et al (1998) mostraram que An. gambiae busca picar os pés de pessoas na posição sentada com maior frequência e que costuma voar na altura do solo, onde se formam correntes de convecção misturadas com o odor humano.
Novamente, ao se comparar diferentes estímulos, i.e. pés dos voluntários, meias impregnadas com odor e controle (meias limpas), a proporção de mosquitos de campo e F1 atraídos difere significativamente (t=3.42, p<0.05), sendo 10% (IC 6 - 15%) maior para mosquitos de campo (Figura 17).
A atratividade dos mosquitos de campo a meia usada manteve-se mesmo com as perdas esperadas de voláteis sugerindo que compostos podem continuar atrativos ainda fora do corpo humano.
No campo, atraentes sintéticos são utilizados em armadilhas para captura de mosquitos antropofílicos. Por isso é desejável que os voláteis do atraente sejam semelhantes ao do odor humano.
Figura 17: Proporção de Anopheles darlingi de campo e F1 atraídos por pé, meia impregnada e controle utilizando olfatometria vertical. Controle= meia limpa, meia impregnada= meia com odor impregnado do pé de voluntários, pé=pé dos voluntários inserido no olfatômetro como estímulo. Proporção de mosquitos coletados= mosquitos observados no cone inferior do olfatômetro vertical.
A meia impregnada cor odor humano atraiu mosquitos de campo de maneira similar ao pé, não havendo diferenças significativas (t=-0.74, P=0.45) mesmo na ausência de estímulos físicos, como calor do hospedeiro ou umidade presentes no pé (Tabela 2). Estímulos físicos como calor e umidade foram demonstrados importantes quando o mosquito está bastante próximo da fonte e odor (Eiras e Jepson, 19994; Olanga et al, 2012)
Isso confirma dados anteriores de que odor de pé impregnado em meias de fibra sintética é atrativo a mosquitos antropofílicos (Pates et al, 2001; Olanga, 2012; Omolo et al 2013). O tecido de natureza sintética já havia sido relatado por Okumu (2010) como eficiente na preparação de atraentes de armadilhas.
Por outro lado, a intensidade da atração de mosquitos por meias impregnadas com odor pode diferir. Olanga et al (2012) demonstraram que meias impregnadas com odor do pé podiam ser igualmente atrativas, para An. gambiae quando comparado a um indivíduo considerado pouco atrativo, mas pouco atrativas frente a um indivíduo muito atrativo.
Murphy et al (2001) concluíram em sua pesquisa em campo com An. gambiae e An. funestus que meias impregnadas com odor foram pouco atrativas e atribuíram isso a perda de voláteis ao longo do tempo e a diferenças na atratividade entre indivíduos. Alguns indivíduos parecem ter condições favoráveis que outros a desenvolver odores mais atrativos aos mosquitos (Verhulst et al, 2011).
A proporção de mosquitos atraídos pelas meias impregnadas tende a ser maior do que no controle, mas a diferença não foi significativa (t=-1,97; P=0,07), o que pode estar relacionado ao número de repetições insuficientes para o nível de significância utilizado.
Apesar de a meias impregnadas de odor humano terem funcionado como cairomônio em laboratório tão bem quanto o pé, experimentos adicionais de semi campo e campo devem avaliar se o mesmo é observado em capturas com distâncias maiores da fonte de estímulo.
4.2 Comportamento de Anopheles darlingi a exposição de odores humanos
A porcentagem de mosquitos ativados tende a ser maior para indivíduo 4 (75,9%) e menor para do indivíduo 1 (54,6%), mas não houve diferença estatística (F=0,62; p=0,645). No entanto, observou-se diferença significativa entre a porcentagem de ativados e a porcentagem de atraídos (F=25,28; p=0,015) (Figura 18).
A ativação foi maior (F=4,45; p=0,013) para o estímulo meia usada (48,32%) e não houve diferença na atração (p>0,05). De maneira geral a porcentagem de mosquitos ativados é maior que de mosquitos atraídos (F=80,89; p= 0,0001) (Figura 19).
Figura 18: Porcentagem de mosquitos F1 (laboratório) ativados e atraídos com a exposição de meias impregnadas de odor dos pés de quatro indivíduos. Av= mosquitos ativados, at= mosquitos atraídos.
De forma geral, a presença do odor causou resposta significativa na atração dos mosquitos (F=21,65; p<0,0001). Além disso, a reposta ao odor foi significativamente maior nos mosquitos de campo em relação a F1 (F=7,87; p=0,006) e quando testados mosquitos de campo houve diferença significativa (F=6,00; p=0,0159) entre braço com odor (30,67%) e braço sem odor (11,57%). (Figura 20).
Figura 19: Porcentagem de mosquitos F1 (laboratório) ativados (av) e atraídos (at) com a exposição de mãos e meias impregnadas de odor dos pés de voluntários em olfatometria dupla escolha. Av= mosquitos ativados, at= mosquitos atraídos.
Figura 20: Porcentagem de mosquitos de diferentes origens no braço com e sem odor (meia usada) em testes de olfatometria dupla escolha.
A atração individual tende a variar, sugerindo que diferenças na composição do odor das pessoas podem resultar em maior ou menor atratividade do mosquito por elas (Knols, 1995), diferenças metodológicas na coleta de odores podem refletir na perda de voláteis (Bernie, 1999) que são importantes para o processo de localização do hospedeiro pelo mosquito.
De maneira geral, a porcentagem de mosquitos que deixaram a gaiola de liberação (ativados) foi maior do que a de mosquitos que chegaram até o braço com estímulo (atraídos) (p=0,0152). Portanto os odores humanos impregnados em meias podem funcionar como cairomônio para Anopheles darlingi mesmo na ausência de estímulos físicos assim como demonstrado com outros anofelinos antropofílicos (Murphy, 2001).
4.3 Comparação das respostas comportamentais de mosquitos de origem campo e F1.
Não se observou diferença significativa (P>0,05) na atratividade de mosquitos F1 aos diferentes estímulos fornecidos no olfatômetro vertical, i.e., pés dos voluntários, meias impregnadas com odor e controle (tabela 2).
Tabela 2: Proporção de Anopheles darlingi oriundos de campo e F1 atraídos por diferentes fontes de odor humano utilizando olfatometria vertical.
Estímulo F1ns Campo
p(%) IC(95%) p(%) IC (95%)
Pé 3 01-7,0 23a 15 – 31
Meias impregnadas 5 1-10 15ab 8 – 22
Controle 2 0,3-6,0 5b 1 – 10
P = proporção de mosquitos no cone inferior; IC = Intervalo de confiança; NS=Não significativo (P>0,05); Letras diferentes indicam diferenças significativas nas proporções de mosquitos atraídos (P<0,05).
A utilização da técnica de olfatometria de dupla escolha, nas condições testadas, para ensaios de comportamento com An. darlingi foi adaptada daquela utilizada para outros vetores como Aedes aegypti e funcionou de forma satisfatória, embora a proporção de mosquitos atraídos seja menor (10-60%) quando comparadas com Ae. aegypti (30-70%) (Paixão et al. 2015).
O Índice de Preferência (IP) de Anopheles darlingi durante os experimentos de olfatometria de dupla escolha, assim como observado nos testes com olfatometria vertical, mostrou diferença significativa entre o comportamento de mosquitos oriundos de campo e os F1 e apenas os mosquitos de campo responderam significativamente (t=2,47; P=0,01) aos estímulos (Figura 20). Por outro lado, não houve diferença entre o comportamento observado entre os odores da mão e os odores de pé impregnados em meias para os mesmos mosquitos (t=-1,7; P=0,06) ou F1 (t=0,52; P=0,6) (Figura 21).
Dentre os diferentes comportamentos observados para os mosquitos de campo, a proporção de atraídos, i.e., coletados no braço com estímulo, foi maior para os dois estímulos estudados, mãos e meias impregnadas com odor de pé de voluntários, enquanto a proporção de mosquitos de campo inativos, i.e., que não saíram da gaiola de liberação foi menor (Figura 22).
Figura 21: Índice de Preferência (IP) de Anopheles darlingi oriundos de campo e F1 as, mão e meias impregnadas com odor de voluntários, durante experimentos de olfatometria horizontal de dupla escolha.
Figura 22: Comportamentos exibidos por Anopheles darlingi oriundos de campo e F1 a diferentes estímulos, mão e meias impregnadas com odor de voluntários, durante experimentos de olfatometria horizontal de dupla escolha. Inat=Inativos, i.e., mosquitos que permaneceram na gaiola de liberação, Ativ= Ativados, i.e, mosquitos que saíram da gaiola de liberação e permaneceram fora dos braços do olfatômetro, Contr= Controle, i.e., mosquitos que foram atraídos para o braço controle (sem estímulo), Resp= Responsivos, i.e., mosquitos que foram atraídos para o braço com estímulo.
Apesar de potencias diferenças entre o odor de pés e mãos, não houve diferença entre o uso de mãos e meias impregnadas com odor do pé durante os experimentos de olfatometria de dupla escolha. Dekker et al (1998) observaram que o comportamento de picadas de An. gambiae por diferentes partes do corpo humano era abolido quando as pessoas se encontravam deitadas e essa espécie
de mosquito picava igualmente pernas, pés, braços, cabeça e tronco, sugerindo os mosquitos picam as partes do corpo mais próximas do solo em decorrência de correntes de convecção formadas e não por diferenças qualitativas e ou quantitativas nos voláteis de diferentes partes do corpo.
Isso mostra que, apesar da complexidade de variáveis presentes na mão, ou o pé dos voluntários, os odores impregnados em meia de poliéster, mesmo com a perda de voláteis em função do tempo, como observado por Schreck et al (1981) para resíduos de mãos impregnados em esferas de vidro, continuam atraindo mosquitos.
O índice de preferência refletiu a proporção de mosquitos atraídos ou não atraídos de cada estímulo testado (Figura 22). A meia impregnada com odor de pé foi adotada como uma referência na comparação com mãos.
Somente a atratividade dos mosquitos de campo apresentou diferenças entre os tratamentos (Figuras 20, 21, 22 e Tabelas 2). Ao contrário disso, fêmeas de F1 responderam de modo mais discreto.
A análise de espermateca de uma parcela dos mosquitos de campo (dados não publicados) mostrou que 90% das fêmeas estavam inseminadas.
Esses dados sugerem que há que padrões de comportamento distintos para fêmeas de An. darlingi inseminadas e não inseminadas, já que fêmeas F1 não copulam espontaneamente em laboratório e por isso foram consideradas como não inseminadas.
Dados recentes de Paixão et al (2014) mostram diferenças na atratividade de machos e fêmeas copulados e não copulados de Ae. aegypti ao odor humano em olfatômetro de dupla escolha e sugerem que atratividade é mais alta para fêmeas inseminadas do que para fêmeas virgens.
Judson (1967) atribuiu a diferença no comportamento de fêmeas de Aedes aegypti inseminadas e não inseminadas a presença do fluído seminal das glândulas acessórias transferido para a fêmea pela macho durante a cópula.
Klowden e Lea (1979) também mostraram que a inibição da busca por hospedeiro em fêmeas inseminadas de Aedes aegypti ocorreu horas após o repasto sanguíneo e durou até a oviposição. Ao contrário, fêmeas F1 não inseminadas que fizeram repasto continuaram motivadas a buscar hospedeiro.
Jones e Gubbins (1978) observaram diferenças na duração nos dois picos de atividade observados para An. gambiae. Eles concluíram que fêmeas virgens tinham o primeiro pico de atividade mais prolongado e que as inseminadas eram mais ativas no segundo pico. Eles sugeriram que o primeiro pico estaria relacionado a atividade de cópula e o segundo a alimentação sanguínea.
Rowland (1989) também observou resultado semelhante na alteração do pico de atividade entre fêmeas inseminadas e virgens de An. stephensi. Para fêmeas inseminadas foram observados curtos períodos de atividade ao longo da noite e também relacionou a busca de hospedeiro, ao contrario que aconteceu com as fêmeas não inseminadas que tiveram atividade de vôo mais cedo.
5 CONCLUSÕES
Os odores humanos de diferentes fontes, i.e., pés, mãos e meias impregnadas com odor de pés foram capazes de atrair An. darlingi a curta distância nas condições de laboratório utilizadas.
A origem dos mosquitos, i.e. campo ou F1, altera a atratividade de An. darlingi as fontes de odor humano testadas.
As metodologias de olfatometria vertical e de dupla escolha podem ser utilizadas na avaliação do comportamento de atração do An. darlingi.
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