Realização: IES parceiras: CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: Farmácia
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE SOROCABA - UNISO
AUTOR(ES): PAULA GUIMARÃES FERREIRA, GABRIEL FERREIRA DOS SANTOS
ORIENTADOR(ES): MARTA MARIA DUARTE CARVALHO VILA, VICTOR MANUEL CARDOSO FIGUEIREDO BALCÃO
1. RESUMO
O teste com Allium cepa (cebola) é considerado uma ferramenta útil para pesquisa do potencial genotóxico e citotóxico de diversos produtos químicos. O teste é realizado através da análise de células meristemáticas provenientes de pontas de raízes que são deixadas em contato com substâncias potencialmente tóxicas. No entanto, é necessário estabelecer condições ideais para a germinação das sementes para produção das raízes. Neste sentido, objetivou-se determinar as melhores condições de germinação de sementes de Allium cepa. Os parâmetros avaliados foram: desinfeção das sementes, hidrocondicionamento, presença ou ausência de luz e diferentes temperaturas. Considerando os resultados obtidos em relação ao porcentual de germinação pode-se afirmar que as melhores condições foram: ausência de luz, desinfecção por radiação ultravioleta, sem hidrocondicionamento, não havendo diferença significativa em relação as temperaturas estudadas.
2. INTRODUÇÃO
O uso do teste de Allium cepa para verificar a potencial genotoxicidade de vários tipos de agentes químicos, físicos e biológicos tem uma longa história na literatura científica. Para este teste, são empregadas plantas pertencentes a espécie Allium cepa L. conhecidas popularmente como cebolas, pois são uma das espécies vegetais adequadas para detectar o potencial genotóxico dos compostos alvos (BONCIU et al., 2018).
O teste com Allium cepa é considerado uma ferramenta útil para a para a pesquisa básica do potencial genotóxico e citotóxico de produtos químicos, de substâncias complexas como os extratos de plantas, dejetos industrias e águas contaminadas, determinando-se a diminuição do índice mitótico e a formação de aberrações cromossómicas (CUCHIARA, BORGES; BOBROWSKI, 2012). A análise de alterações cromossômicas serve como um teste de mutagenicidade e, é um dos poucos métodos diretos para medir danos em sistemas expostos a possíveis mutagênicos ou carcinogênicos.
Para avaliar a mutagenicidade o teste Allium cepa utiliza parâmetros como Índice mitótico (IM) e Índice de danos (ID). Índice mitótico é o número total de divisão de células no ciclo celular (IM= número de células em mitose, número total de células analisadas). O Índice de danos são as aberrações cromossômicas relacionadas com
a divisão celular (ID = número de danos, número de divisões celulares) (DIZDARI; KOPLIKU, 2013).
As vantagens de se utilizar o sistema Allium cepa estão ligados ao seu baixo custo, rapidez, facilidade de manipulação, possibilidade de utilização de amostras sem prévio tratamento, confiabilidade e equivalência com outros testes de citogenotoxicidade (CUCHIARA, BORGES; BOBROWSKI, 2012). O ensaio Allium cepa é validado pelo Programa Internacional de Segurança Química (IPCS, WHO) e o Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP), sendo considerado como instrumento de elevada eficiência para o monitoramento in situ da genotoxicidade de substâncias químicas (LESSA et al., 2017). No entanto, várias etapas ainda carecem de padronização, como é o caso das etapas envolvidas na germinação das sementes. Neste sentido, é fundamental definir as melhores condições de germinação visando padronizar bioensaios, os quais utilizam sementes de Allium cepa como organismo teste.
3. OBJETIVO
Estabelecer as melhores condições de germinação das sementes de Allium cepa.
4. METODOLOGIA
Trata-se de uma pesquisa experimental onde foi observado o crescimento de radículas após submeter sementes de Allium cepa em diferentes condições ambientais. Foram avaliadas as condições de hidrocondicionamento, desinfeção, presença ou ausência de luz e temperatura para a verificação do efeito na germinação. Os experimentos foram avaliados em função da percentagem de capacidade de germinação ou germinabilidade e os resultados foram analisados através dos testes estatísticos t e F.
5. DESENVOLVIMENTO 5.1. Material Biológico
A sementes de cebola comum (cultivar Baia Periforme) foram adquiridas em lojas especializadas em vendas de sementes. As sementes foram pré-selecionadas visando tamanho uniforme. Cada amostra continha 50 sementes.
5.2. Condições de germinação
Hidrocondicionamento: Em placa de Petri, foram adicionados sobre as amostras de sementes 500 μL de água destilada e deixado em contato a temperatura ambiente por 24 horas, no escuro. A placa foi fechada com Parafilm® e envolta com papel alumínio Em seguida, as sementes foram submetidas à secagem em temperatura ambiente durante 24 horas, sobre papel toalha (XAVIER et al., 2017), com a placa semiaberta. Desinfecção: A desinfecção foi realizada com o uso de solução de hipoclorito de sódio 1,5 % durante 5 min (DORNA et al., 2013); radiação ultravioleta, onde as sementes foram expostas durante cinco minutos luz ultravioleta em cabine de segurança biológica de classe II tipo B2 (modelo 4SP-SBIIB2-1266/4, SP-LABOR, Presidente Prudente/SP, Brasil); solução de H2O2 a 3%, no qual as sementes foram submersas durante cinco minutos; associação da solução de H2O2 a 3% com posterior uso de radiação UV.
Presença ou ausência de luz: Uma vez definido qual o preparo mais adequado da amostra (com ou sem hidrocondicionamento e desinfetadas ou não) foram definidas as melhores condições de germinação considerando luz (PINHEIRO et al., 2014). Temperatura: O processo de germinação foi avaliado sob duas temperaturas diferentes, 20°C e 30°C em estufa.
5.3. Germinação
As sementes são consideradas como germinadas quando apresentam a radícula com comprimento maior de 5 mm (LELES, 2017). A percentagem de germinação foi calculada considerando G = (N/A) x 100 sendo que N = número total de sementes germinadas; A = número total de sementes colocadas para germinar (IGANCI et al., 2006). Todos os experimentos foram realizados com germinação das sementes sobre papel de filtro umedecido. Sobre uma placa de Petri estéril com diâmetro de 85 mm foi colocado um papel filtro autoclavado e umedecido com água mineral autoclavada (25 mL). As amostras de sementes foram colocadas sobre o papel filtro e com ajuda de uma pinça. Para evitar a dessecação da amostra, as placas de Petri foram seladas com Parafilm®. O tempo de germinação observado foi de 6 dias.
5.4. Análise estatística
Para a avaliação dos resultados foram empregados os testes t (SKOOG; WEST; HOLLER, 1996) e teste F (ECKSCHAGER, 1972), utilizando as equações 1 e 2.
𝑭 =
𝑺²𝑨𝑺²𝑩 (Equação 1) Onde: S2A = desvio padrão de A; S2B = desvio padrão de B.
𝒕 =
𝐗𝐚−𝐗𝐛√𝑺𝟐𝑨𝟐+𝐒𝟐𝑩𝟐 𝒏−𝟏
(Equação 2)
Onde: Xa= média aritmética de A; Xb = média aritmética de B; n= número determinações; S2A = desvio
padrão de A; S2B = desvio padrão de B.
6. RESULTADOS
Os resultados referentes a influência da luz, hidrocondicionamento e desinfecção com hipoclorito de sódio encontram-se apresentados nas Tabelas 1 e 2. Considerando-se os resultados obtidos em relação ao porcentual de germinação pode-se afirmar que as sementes germinadas sob a luz apresentaram baixa germinação. Na desinfecção, observou-se que o hipoclorito de sódio prejudicava a germinação, mas por outro lado, a não desinfecção causava o crescimento de fungos. Assim, numa segunda etapa de ensaios, optou-se por avaliar outros processos de desinfecção (luz ultravioleta, peróxido de hidrogênio e luz ultravioleta mais peróxido de hidrogênio).
Tabela 1. Resultados obtidos em relação a porcentagem de germinação* das sementes de
Allium cepa em diferentes condições usando os testes estatísticos de t de Student e
teste F. Germinação (%) Desvio médio Valor calculado de t Valor calculado de F Com Hidrocondicionamento 68 4 0,46 1,36 Sem Hidrocondicionamento 66 4,67 - - Desinfetadas
(com hipoclorito de sódio)
39,3 7,78 4,16 2,77
Não desinfetadas 66 4,67 - -
Com luz e desinfetadas (com hipoclorito de sódio)
Com luz e não desinfetadas
12 8 - -
Sem luz e desinfetadas (com hipoclorito de sódio)
10 0,67 25,60 28,00
Sem luz e não desinfetadas
75,4 3,55 - -
n=3; valor tabelado de t = 2,776 para = 4 e = 0,005; valor tabelado de F=19,00 para = 4 e = 0,005
Tabela 2. Resultados obtidos em relação ao tamanho das radículas das sementes de Allium
cepa em diferentes condições de germinação* usando os testes estatísticos de t de
Student e teste F. Tamanho das radículas Desvio médio Valor calculado de t Valor calculado de F Com Hidrocondicionamento 14,16 4,56 0,33 1,54 Sem Hidrocondicionamento 12,79 3,68 - - Desinfetadas (hipoclorito de sódio) 12,4 3,70 0,12 1,01 Não desinfetadas 12,79 3,68 - -
Com luz e desinfetadas ( hipoclorito de sódio)
15,24 4,39 0,61 1,42
Com luz e não desinfetadas 15,16 4,85 - -
Sem luz e desinfetadas ( hipoclorito de sódio)
16,40 5,73 0,78 1,65
Sem luz e não desinfetadas 21,55 7,35 - -
n=3; valor tabelado de t = 2,776 para = 4 e = 0,005; valor tabelado de F=19,00 para =4 e = 0,005
O hidrocondicionamento não afetou o processo de germinação como indicado. Contudo, outros autores apresentaram resultados diferentes indicando que o hidrocondicionamento de sementes de cebola pode favorecer a velocidade de emergência e a porcentagem de plântulas emergidas (HOLBIG; BAUDET; VILLELA, 2011).
De acordo com as regras para análises de sementes (RAS), as temperaturas de 15°C e 20ºC são recomendadas na realização do teste de germinação de Allium cepa (PINHEIRO et al., 2014). Entretanto, optou-se pela temperatura de 30ºC para verificar se as sementes poderiam ser deixadas em condições mais agressivas, com o objetivo de simplificar a etapa inicial do ensaio de genoxicidade de Allium cepa. Assim, as sementes de Allium cepa foram colocadas para germinar a 20° C e 30°C, tendo os resultados disponibilizados nas tabelas abaixo, considerando a porcentagem de germinação e o tamanho das radículas (Tabelas 3 e 4).
Tabela 3. Resultados obtidos em relação a porcentagem de germinação* das sementes de
Allium cepa, nas condições de temperatura, usando os testes estatísticos de t de
Student e teste F.
Dados Temperatura 20° C Temperatura 30° C
Média () 14,67 10,33 Desvio médio (S) 3,78 3,55 % de germinação 29,33 20,67 F calculado 1,18 0,84 t calculado
n=3; valor tabelado de t = 2,776 para = 4 e = 0,005; valor tabelado de F=19,00 para =4 e = 0,005
Tabela 4. Resultados obtidos em relação ao tamanho das radículas das sementes de Allium
cepa, nas condições de temperatura, usando os testes estatísticos de t de Student
e teste F.
Dados Temperatura 20° C Temperatura 30°C
Tamanho médio das radículas 10,41 19,95 Desvio médio (S) 2,33 7,13 F calculado 3,06 1,27 t calculado
n=3; valor tabelado de t = 2,776 para =4 e =0,005; valor tabelado de F=19,00 para =4 e = 0,005;
De acordo com os testes estatísticos F e t de Student, pode-se dizer que não houve diferença significativa entre os valores apresentados considerando a
porcentagem de germinação e o tamanho das radículas (Tabelas 3 e 4) frente as diferentes temperaturas estudadas. Quando o valor de t ou F calculado é maior do que o f tabelado, rejeita-se a hipótese nula em prol da hipótese alternativa ao risco de 5%. A hipótese nula afirma que não há diferença significativa entre os métodos de germinação e a hipótese alternativa indica que há diferença entre os métodos de germinação.
A desinfeção das sementes foi reavaliada, empregando-se outros agentes desinfetantes em função dos resultados negativos, definindo-se o uso de peróxido de hidrogênio, luz ultravioleta e a combinação de ambos.
O peróxido de hidrogênio, por ser um bom oxidante, possui boa atividade antimicrobiana contra agentes fitopatogênicos, sobretudo, associados a sementes (MEDEIROS, 2019).
A radiação ultravioleta tem alto grau de inativação de microrganismos patogênicos, em pouco tempo de contato, sem produção de resíduos tóxicos (MARQUES, 2003). Já a combinação da radiação ultravioleta e o peróxido pode ser considerado como um processo oxidativo avançado onde há degradação de espécies orgânicas pela ação do radical hidroxila.
Os resultados avaliados na descontaminação das sementes estão descritos nas Tabela 5 e 6, sendo em relação a porcentagem de germinação e tamanho de radículas, respectivamente.
Tabela 5. Resultados obtidos em relação a porcentagem de germinação* das sementes de
Allium cepa utilizado luz ultravioleta (UV), peróxido de hidrogênio (H2O2) e a
combinação de ambos usando os testes estatísticos de t de Student e teste F.
Dados H2O2 + UV H2O2 UV Média () 10,67 6,67 28,67 Desvio médio (S) 2,22 1,55 3,78 % de germinação 21,33 13,33 57,33 F calculado 1,6 2,29 0,94 t calculado 6,44 8,01 1,73
Tabela 6. Resultados obtidos em relação ao tamanho das radículas das sementes de Allium
cepa utilizado luz ultravioleta (UV), peróxido de hidrogênio (H2O2) e a combinação de
ambos usando os testes estatísticos de t de Student e teste F.
Dados H2O2 + UV H2O2 UV Tamanho médio das radículas 11,56 13,81 11,77 Desvio médio (S) 3,34 4,56 3,28 F calculado 2,2 1,61 2,24 t calculado 1,24 0,89 1,21
n=3; valor tabelado de t = 2,776 para =4 e =0,005; valor tabelado de F=19,00 para =4 e =0,005
Na desinfecção das sementes, pode-se observar que houve melhor germinação na descontaminação por radiação ultravioleta. Talvez a luz ultravioleta, seja menos agressiva que o peróxido de hidrogênio, mas ao mesmo tempo eficiente para a degradação dos esporos fúngicos. Em geral, a radiação ultravioleta tem se mostrado como a forma rápida, confiável, efetiva, econômica e ambientalmente segura no tratamento de diversos produtos e materiais (ALEXANDRE; FARIA; CARDOSO, 2008).
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Considerando os resultados obtidos em relação ao porcentual de germinação pode-se afirmar que as melhores condições de germinação das pode-sementes foram: ausência de luz, desinfecção por radiação ultravioleta (UV), sem hidrocondicionamento, não havendo diferença significativa entre os valores apresentados nas duas diferentes condições de germinação, referentes à temperatura.
8. FONTES CONSULTADAS
ALEXANDRE, F. A.; FARIA, J.A.F.; CARDOSO, C.F. Avaliação da eficiência da radiação ultravioleta na esterilização de embalagens plásticas. Ciência e Agrotecnologia v. 32, n. 5, p. 1524-1530, 2008
BONCIU, E. et al. An evaluation for the standardization of the Allium cepa test as cytotoxicity and genotoxicity assay. International Journal of Cytology, Cytosystematics and Cytogenetics v. 71, n. 3, p. 191-209, 2018.
CUCHIARA, C.C.; BORGES, C.S.; BOBROWSKI, V.L. Sistema teste de Allium cepa como bioindicador da citogenotoxicidade de cursos d'água. Tecnologia & Ciência Agropecuária, v.6, n 1, p 33-38, 2012.
DIZDARI, A.M.; KOPLIKU, D. Cytotoxic and genotoxic potency screening of two pesticides on Allium cepa L. Procedia Technology v.8, p. 19- 26, 2013.
DORNA, H. et al. Germination, vigour and health of primed Allium cepa L. seeds after storage. Acta Scientiarum Polonorum Hortorum Cultus v.12, n. 4, p. 43-58, 2013.
ECKSCHAGER, K. Errors, Measurement and Results in Chemical Analysis. London: Van Nostrand Reinhold, 1972.
HOLBIG, L. S.; BAUDET, L.; VILLELA, F. A. Hidrocondicionamento de sementes de cebola. Revista Brasileira de Sementes v.33, n.1, p.171-176, 2011.
IGANCI, J.R.V. et al. Efeito do extrato aquoso de diferentes espécies de boldo sobre a germinação e indice mitótico de Allium cepa L. Arquivos do Instituto Biológico v.73, n.1, p.79-82, 2006
LELES, L. Avaliação ecotoxicológica de efluente têxtil com corante utilizando sementes de Lactuca sativa e Allium cepa. Monografia para conclusão do Curso de Engenharia Ambiental da Universidade Federal de Goiás, Goiás, 2017.
LESSA, L.R. et al. Fundamentos e aplicações do Allium cepa L. como bioindicador de mutagenicidade e citotoxicidade de plantas medicinais. Revinter, v. 10, n.3, p. 39-48, 2017.
MARQUES, A. Desinfecção de efluentes provenientes de lagoa anaeróbia com o uso de ultravioleta e peróxido de hidrogênio. Dissertação de Mestrado, Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2003.
MEDEIROS, J. G. F. et al. Qualidade sanitária e fisiológica de sementes de soja (Glycine max (L.) Merrill) tratadas com peróxido de hidrogénio. Revista de Ciências Agrárias, v. 42, n. 4, p. 982-990, 2019.
PINHEIRO, G. S et al. Efeito da temperatura sobre a germinação de sementes de cebola. Scientia Plena, v. 10, n. 11, p 1-6, 2014.
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XAVIER, F.M. et al. Germination of Allium cepa L. seeds subjected to physiological conditioning and drying. Revista de Ciências Agrárias de Portugal v. 40, n. 4, p.693- 702, 2017.
