OBTENÇÃO DE SUPORTE PARA ENGENHARIA DE TECIDOS UTILIZANDO-SE CIMENTO DE α-TRIFOSFATO DE CÁLCIO (α-TCP)
1J. L. M. Machado; 2G. Benderovics; 3L. A. Santos 1jefmac@gmail.com
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
RESUMO
O crescimento de células em "scaffolds" (suportes) tridimensionais porosos tem se tornado progressivamente ativo na engenharia de tecidos. Eles guiam o crescimento celular, sintetizam uma matriz extracelular e outras moléculas biológicas, e facilitam a formação de tecidos e órgãos funcionais. O objetivo deste trabalho foi a utilização de cimento de α-TCP na confecção desses suportes, através da variação da quantidade de líquido no cimento e da utilização de microesferas de parafina como geradoras de poros. Estas produzidas por suspensão em solução aquosa de poli (álcool vinílico) (PVA) e sulfato de sódio (Na2SO4). A fase líquida
utilizada no cimento corresponde a uma solução aquosa 2,5% de hidrogenofosfato disódico [Na2HPO4] em água deionizada. Foi analisada a porosidade aparente dos
suportes e o tamanho de partícula do cimento sintetizado. A porosidade dos scaffolds fabricados com esferas de parafina foi observada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A utilização de esferas de parafina permitiu a formação de poros com tamanho tal que possibilitam potencialmente o crescimento tecidual e celular.
Palavras-chave: Cimento de fosfato tricálcico, scaffolds, esferas de parafina. INTRODUÇÃO
Os scaffolds são os suportes nos quais são colocadas as células teciduais junto com fatores de crescimento, permitindo o crescimento do tecido até este substituir completamente o suporte (1), (2). Para cumprir essa função o scaffold deve
possuir propriedades como biocompatibilidade, alta porosidade e tamanho e formato de poros adequado para permitir o crescimento de tecidos (no caso de tecidos ósseos esse tamanho é entre 150 e 250µm) e grande área superficial, para que haja vascularização. Deve possuir taxa de degradação, fazendo com que haja perda de resistência mecânica, adequada para que os tecidos substituam o scaffold nem muito lentamente nem muito rapidamente. A resistência mecânica deve ser adequada, pois pode haver falha do material caso essa seja muito pequena, e interação com as células permitindo adesão, crescimento, migração e diferenciação celular (1).
Para a aplicação como scaffolds, normalmente são utilizados polímeros absorvíveis (2), (3) como o Poli (Ácido Glicólico) - [PGA], o Poli (Ácido Lático) - [PLA],
o Poli (Ácido Lático co-Ácido Glicólico) - [PLGA] que é um copolímero dos dois primeiros, o Poli Pirrol – [PPy] e a Poli Caprolactona [PCL]. Também existe a possibilidade de se fazer nanocompósitos de algum material polimérico com hidroxiapatita ou outro material cerâmico que pode ser algum fosfato de cálcio ou um biovidro (4), (5), (6).
Além dos polímeros, o uso de scaffolds de materiais cerâmicos como guias para o crescimento de tecidos ósseos tem revelado modos inesperados de como os scaffold e as células interagem, mostrando efeitos complexos de integração e de desintegração do scaffold. O modo pelo quais os scaffolds são absorvidos pelos osteoclastos, in vitro e in vivo, mostra processos mais complexos dos que os preditos pelo conhecimento a respeito da reabsorção óssea fisiológica. A investigação de novos materiais para engenharia de tecidos representa uma área essencial para o desenho das estratégias de engenharia de tecidos. Neste contexto situam-se os cimentos ósseos de fosfato de cálcio (CPCs). O termo "cimento de fosfato de cálcio” foi introduzido por Gruninger e colaboradores (7). Segundo eles, um cimento deste tipo pode ser preparado misturando um sal de fosfato de cálcio com água ou com uma solução aquosa para que se forme uma pasta que possa reagir à temperatura ambiente ou corporal dando lugar a um precipitado que contenha um ou mais fosfato de cálcio, ocorrendo a pega pelo intercruzamento dos cristais deste precipitado. Apesar da existência de diversos sistemas de CFC estudados, os baseados no alfa-fosfato tricálcico (α-TCP) são de especial interesse em função da obtenção durante a reação de pega de uma fase de hidroxiapatita deficiente em cálcio, similar à hidroxiapatita óssea: α-Ca3(PO4)2 + H2O --> Ca9(HPO4)(PO4)5OH. A
hidroxiapatita favorece o crescimento ósseo para os locais em que ela se encontra, estabelecendo ligações de natureza química entre a hidroxiapatita e o tecido ósseo (bioativo), permitindo a proliferação de fibroblastos, osteoblastos e outras células ósseas, sendo que as células não distinguem entre a hidroxiapatita e a superfície óssea, o que indica a grande similaridade química superficial (8). A principal vantagem do uso de cimentos de fosfato de cálcio é a facilidade de uso, permitindo a obtenção de formatos complexos. Como todo cimento de pega hidráulica, a adição de quantidades crescentes de água ao cimento aumenta a porosidade destes, permitindo a obtenção de materiais com porosidade controlada.
A razão para a utilização de cerâmicas porosas é fornecer local para o tecido ósseo crescer e fixar o implante biologicamente. O tecido responde diferentemente ao diâmetro do poro do material e é resumido na Tabela I.
Tabela I. Crescimento tecidual de acordo com o tamanho dos poros.(9) menor que 10 µm sem crescimento
entre 15 e 50 µm crescimento fibrovascular entre 50 e 150 µm formação de osteóide acima de 150 µm crescimento ósseo
Existem diversos métodos para a obtenção de cerâmicas porosas, sendo os mais usuais (10): controle da sinterização; sol-gel; replicação de estruturas poliméricas porosas; formação de espuma em suspensões cerâmicas; incorporação de materiais voláteis eliminados durante a queima, ou seja, a fração, tamanho e distribuição do volume de poros produzidos são determinados pela quantidade e tamanho da fase volátil, que pode ser naftaleno, cera, farinha, carvão, polímeros diversos.
Shum, A. W. T. et al. realizaram um estudo criando estruturas a partir de microesferas de parafina, porém utilizando PLGA ao invés de um material cerâmico
(11). As microeferas foram misturadas com uma solução de piridina contendo o PLGA
e então prensadas. Para a obtenção das microesferas de parafina foi aquecida uma solução de PVA em água (0,5% em massa) a uma temperatura entre 60 e 70°C. Vinte gramas de parafina, também aquecida a essa temperatura, foram adicionadas a solução sob forte agitação mecânica e, então, a mistura colocada em um recipiente contendo água fria. Após, as esferas foram colocadas em uma peneira de
100µm e lavadas com água destilada para retirar o PVA residual. Mizutani, Y. et al. prepararam microesferas de PLLA com um método parecido com o anterior, porém adicionando à solução Na2SO4 como agente coagulante, e a formação de esferas se
tornou mais eficiente (12).
MATERIAIS E MÉTODOS
O cimento de fosfato tricálcico foi sintetizado em laboratório utilizando-se como precursores químicos o carbonato de cálcio [CaCO3] e o pirofosfato de cálcio
[γ-Ca2P2O7](13). A homogeneização inicial entre os precursores foi realizada a seco com
o objetivo principal de promover uma boa mistura entre os reagentes. A mistura foi realizada em frasco plástico de polipropileno contendo elementos de moagem esféricos de 10 mm de diâmetro em alumina [Al2O3]. A mistura foi realizada por um
período de tempo de 1h com a proporção em massa de 1:4 entre carga e meios de moagem.
O tratamento térmico ao quais os precursores foram submetidos constitui-se de uma etapa de calcinação, seguida de uma etapa de resfriamento brusco. O processo de calcinação permitiu a reação dos dois precursores químicos, a fase gama do pirofosfato de cálcio [γ-Ca2P2O7] e carbonato de cálcio [CaCO3], que foram mantidos
em forno tipo mufla, sem controle de atmosfera, a temperatura de 1300°C durante um patamar de 15h.
O cimento de fosfato tricálcico após resfriamento foi desagregado manualmente com almofariz e pistilo de porcelana em capela provida de exaustão, mantendo-se sempre o cuidado de evitar qualquer tipo de contaminação ao pó. Esta desagregação manual visou a granulação da matéria-prima num tamanho suficientemente pequeno, passante em malha polimérica especificação 20 ABNT (abertura de 850µm), adequado para a próxima etapa de moagem a úmido.
A moagem a úmido foi efetivada utilizando álcool etílico absoluto [CH3CH2OH]
como meio em um frasco polimérico cilíndrico com capacidade volumétrica de um litro, contendo corpos moedores esféricos de alumina, com a finalidade de se minimizar contaminações oriundas do processo de desgaste entre os meios de moagem. Este frasco foi colocado em um gira-moinho e deixado sob agitação por 2h.
A composição resultante (cimento moído + álcool) foi então peneirada apenas para se separar os meios de moagem e logo em seguida alocada em um béquer, onde permaneceu 72h em estufa a 90°C para promover a evaporação total do álcool, restando apenas o pó de cimento moído e seco.
A fração líquida foi formulada com o objetivo de se obter uma solução aquosa semelhante à composição padrão, utilizada na mistura convencional de cimentos de fosfato de cálcio. A formulação mais difundida para a fração líquida corresponde a uma diluição de 2,5% de hidrogenofosfato disódico [Na2HPO4] em água deionizada,
sendo esta a utilizada.
Para a obtenção de parafina na forma de microesferas utilizou-se uma solução aquosa contendo 0,5g de poli (álcool vinílico) (PVA) e 1g de sulfato de sódio (Na2SO4) é aquecida à 100°C e colocada sob agitação mecânica (400 rpm). A
parafina foi adicionada juntamente à solução, aguardando-se a sua total fusão. Após a formação de uma espuma consistente, foi desligado o aquecimento e resfria-se rapidamente com a adição de água fria. A mistura foi então colocada em uma torre de peneiras, e as esferas lavadas com água destilada e separadas em três faixas de granulometrias. As esferas foram secas ao ar à temperatura ambiente e foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura e uma fotomicrografia das esferas pode ser vista na Figura 1.
Para fins de comparação, peças de cimento foram fabricadas modificando-se a quantidade da fase líquida utilizada de 0,6mL à 1,8mL para cada grama de cimento, variando-se de 0,3mL, e analisando a microestrutura por microscopia eletrônica de varredura, densidade à seco e absorção de água. Para isso foram utilizados 6 corpos-de-prova conformados. A massa seca foi determinada após secagem dos corpos-de-prova por um período de tempo não inferior a 24h em estufa a 100ºC.
O cimento, a fase líquida e a parafina foram misturados nas seguintes proporções: 1g de cimento, 0,6mL de fase líquida e 1,5g de esferas parafina; e obtidos corpos para análise da microestrutura. Essa proporção foi seguida após um estudo realizado no sentido de saber qual proporção obteria corpos com poros interconectados, mantendo resistência mecânica para o manuseio.
O molde de conformação dos corpos-de-prova foi confeccionado em aço inoxidável contendo cavidades de 6mm ± 0,1mm de diâmetro e 12mm ± 0,1mm de altura para moldagem plástica dos corpos-de-prova. Mesmo sendo todas as cavidades internas devidamente polidas, o molde foi lubrificado manualmente com uma fina camada de vaselina sólida para facilitar a desmoldagem dos corpos-de-prova para todas as formulações. Os corpos-de-corpos-de-prova foram desmoldados após as 24h de cura e então submetidos a um tratamento térmico à 600°C para extração da parafina. O tamanho de poros, a interconectividade entre os poros foram examinados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV Jeol 6505).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Como todo cimento de pega hidráulica, a adição de quantidades crescentes de água ao cimento aumenta a porosidade destes, e isto pode ser verificado a partir dos valores densidade a seco, como mostra a Figura 2. À medida que aumenta a fração líquida no cimento, a densidade diminui, assim como aumenta a fração de vazios dentro do corpo. Pelos valores de Porosidade Aparente pode-se ter uma idéia da quantidade de vazios (Figura 3). Como a porosidade aberta é considerada um fator favorável à osteocondução, permitindo o crescimento de osso no interior dos poros, pode-se dizer que todas as formulações possuem tendência de favorecerem este comportamento biológico tendo em vista que todas as formulações apresentaram porosidade aparente superior a 50%. A resistência mecânica também diminuiu com o aumento da quantidade de fase líquida adicionada, sendo mostrada
essa tendência no gráfico da Figura 4.
Figura 3: Gráfico mostrando a variação da porosidade aparente com o volume de fase líquida utilizado.
Figura 2: Gráfico mostrando a variação da densidade a seco com o volume de fase líquida utilizado. 52,2 61,2 63,9 65,8 68,1 50,0 55,0 60,0 65,0 70,0 75,0 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9
Volume de fase líquida por grama de cimento (mL)
Por o si da de Ap ar e n te ( % ) 1,190 0,830 0,764 0,700 0,922 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000 1,100 1,200 1,300 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9
Volume de fase líquida por grama de cimento (mL)
D e nsi d ad e a S e c o ( g /c m 3 )
Figura 4: Gráfico mostrando a variação da resistência mecânica com o volume de fase líquida utilizado.
Através da microscopia eletrônica de varredura pode-se observar uma microestrutura extremamente porosa para as formulações e também uma verificação do tamanho de poro. A Figura 5a mostra uma fotomicrografia de uma amostra de cimento com 0,6mL de fase líquida para cada grama de cimento. A Figura 5b, uma amostra de cimento com 1,8mL de fase líquida para cada grama de cimento.
Figura 5: Fotomicrografias de cimento mostrando tamanho de poro.
Através das fotomicrografias percebe-se a formação de hidroxiapatida na forma acicular. Essa hidroxiapatita se origina por precipitação após a cura do cimento, travando a estrutura, o que possibilita o aumento da resistência mecânica da amostra. O tamanho de poro encontrado é extremamente pequeno, assim, segundo
0,68 0,37 0,24 1,30 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 0,40 0,70 1,00 1,30
Volume de fase líquida (mL)
RM (
M
Pa
)
a literatura (9), poderá haver somente crescimento fibrovascular, ou simplesmente, não haver crescimento tecidual.
As amostras feitas com parafina apresentaram estrutura de poro bastante homogênea, devido ao formato das microesferas. A Figura 6a mostra uma fotomicrografia de uma amostra de cimento após a extração das esferas de parafina. A faixa de tamanho de esferas utilizada foi de 250 - 350µm. A Figura 6b mostra uma fotomicrografia de uma amostra de cimento após a extração das esferas de parafina. A faixa de tamanho de esferas utilizada foi de 100 - 250µm.
Figura 6a: Fotomicrografia de scaffold (esferas de 250 - 350µm / 25X). Figura 6b: Fotomicrografia de scaffold (esferas de 100 - 250µm / 50X).
Percebe-se que o tamanho de poro ficou adequado ao crescimento tecidual, embora não exista grande interconectividade entre os poros. Para avaliar se tal tamanho de poros e interconectividade são adequados, está em processo de análise, a avaliação deste material in vitro e in vivo, em solução de plasma simulado para avaliação de solubilidade e utilizando células tronco mesenquimais para avaliação de crescimento celular e tecidual.
CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos é possível inferir as seguintes conclusões: • foi possível obter cimento com composição de fosfato tricálcico;
• foi possível a obtenção de esferas de parafina em diferentes faixas de granulometrias através de suspensão da parafina líquida em uma
solução contendo de poli (álcool vinílico) e sulfato de sódio em agitação mecânica e posterior resfriamento;
• obteve-se corpos porosos de cimento com a adição das esferas de parafina e posterior extração das mesma após a cura, utilizando-se um método térmico;
• para os corpos feitos sem a adição de esferas de parafina, as formulações segue a tendência de diminuição da densidade e aumento na absorção de água e porosidade aparente, com o aumento da fase líquida adicionada ao cimento;
• os corpos sem a adição de esferas de parafina obtiveram tamanho de poros relativamente pequenos, que, segundo a literatura, impossibilitam a formação tecidual;
• a formulação dos corpos porosos com esferas de parafina, se mostrou eficaz na obtenção de interconectividade dos poros, apesar desta interconectivadade não ser acentuada;
• estudos in vitro e in vivo são necessários para avaliar o potencial uso dos materiais obtidos como scaffolds.
REFERÊNCIAS
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α-TRICALCIUM PHOSPHATE (α-TCP) AS SCAFFOLD FOR TISSUE ENGINEERING
The growth of cells in three-dimensional porous scaffolds has been extensively studied for use in tissue engineering. They guide grow of cells, synthesize extra cellular matrix and other biological molecules, and facilitate the formation of functional tissues and organs. The objective of this work was the use of the α-TCP cement for making these scaffolds, through the variation of the amount of liquid phase in the cement and of the use of paraffin spheres as pore source. These spheres were produced by suspension in water solution of poly (vinyl alcohol) and sodium sulphate (Na2SO4). The used liquid phase in the cement corresponds to a
watery solution 2.5% of disodium hydrogen phosphate [ Na2HPO4 ] in deionised
water It was analyzed the apparent porosity of the scaffolds and the size of particles of the synthesized cement. The porosity of scaffolds manufactured with paraffin spheres was observed by Scanning Electron Microscopy (SEM). The use of paraffin spheres allowed the formation of pores size able to permit tissue growth.
